CN116947985B - 重组抗菌肽Sub168-1/3R、重组菌株、载体、制备方法及饲料添加剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组抗菌肽Sub168‑1/3R、重组菌株、载体、制备方法及饲料添加剂，属于基因工程及生物技术领域，所述的抗菌肽突变体Sub168‑1/3R的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供包含SEQ ID NO.2的重组载体和重组菌株。对比原始序列的抗菌肽，本发明抗菌肽突变体Sub168‑1/3R对革兰氏阴性菌的抗菌活性增强，且对胰蛋白酶、胃蛋白酶和pH的稳定性也得到提升。本发明涉及的突变体在制备新型抗菌剂及其应用方面具有很大的优势及潜力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及生物技术领域，具体涉及重组抗菌肽Sub168-1/3R、重组菌株、载体、制备方法及饲料添加剂。
背景技术
在动物养殖中，细菌性腹泻等细菌性疾病严重危害动物健康，对养殖造成重大损失。目前主要通过使用抗生素对其进行治疗及防治，但抗生素的过度使用及滥用不断造成耐药菌株及耐药性出现，进而威胁人类健康。抗菌肽(AMPs)是一类小分子的肽类物质，来源广泛，分子量小且具有广谱的抗菌活性。与传统的抗生素相比，抗菌肽属于天然的活性物质，无污染，不易产生耐药性，是一种极具潜力的抗生素替代品。但生物提取及化学合成等手段的制备方法成本高、效率低，不易实现大量制备，无法满足工业化生产的需求，因此实现抗菌肽的高效制备和生产的方法是研究的热点。
抗菌肽Sublancin168是枯草芽孢杆菌分泌的代谢物之一，具有特定的结构及一定的抗菌活性，但其抗菌特性还需进一步挖掘。其作为一种待开发的想应用于饲料行业的抗菌肽除需满足良好的抗菌活性外，还需具备较好的能够耐受工业化生产中造粒等高温加工过程的热稳定性、能够耐受动物胃蛋白酶从而发挥活性的消化酶稳定性、应用于动物饲料中生产和使用的安全性。因此，对畜禽动物养殖常见致病菌的抗菌活性、自身的热稳定性、胃蛋白酶稳定性及生产和自身的安全性均是抗菌肽应用为饲料添加剂的基础。
为满足工业化生产的需求，异源表达的制备方式被普遍采用。大肠杆菌、毕赤酵母等宿主工程菌株需要诱导剂诱导表达外源蛋白，生产的外源蛋白无法直接应用为饲料添加剂。而里氏木霉作为一种食品级安全菌株(GRAS)可以满足生产的外源蛋白的安全性要求，且还具有强启动子和蛋白质翻译后加工能力强等优点，可以为饲料添加剂的安全性奠定基础。大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌是影响仔猪和幼鸡健康的常见致病性细菌，需要开发和挖掘能够抑制上述三种细菌且具有良好特性的抗菌肽。
发明内容
本发明针对上述技术问题提供一种重组抗菌肽Sub168-1/3R、重组菌株、制备方法及其应用，以其作为饲料添加剂在饲料行业中的应用。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种重组抗菌肽Sub168-1/3R，所述重组抗菌肽Sub168-1/3R的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；具体为：RLRKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVACQ NY RQ FCR。
进一步，编码SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2是在原始氨基酸序列SEQ ID NO.3的抗菌肽Sublancin168基础上，翻译为编码的核苷酸序列，并进行该核苷酸片段的人工合成，对该人工合成的片段进行易错PCR反应获得的突变体，所述编码SEQ ID NO.3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述SEQ ID NO.2为agattgagaaaggctcaatgtgctgctttgtggttgcaatgtgcttcaggaggtac tattggatgtggaggtggagctgttgcttgtcaaaactacagacaattttgtaga。
SEQ ID NO.3：GLGKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVAC QNYRQFCR。
SEQ ID NO.4：ggattgggtaaggctcaatgtgctgctttgtggttgcaatgtgcttcaggaggtactattg gatgtggaggtggagctgttgcttgtcaaaactacagacaattttgtaga。
本发明还提供包含上述重组抗菌肽Sub168-1/3R基因的里氏木霉重组表达载体。
本发明还提供包含上述重组抗菌肽Sub168-1/3R的重组菌株，所述菌株为里氏木霉Tu6。
本发明还提供所述重组抗菌肽Sub168-1/3R在饲料或饲料添加剂中的应用。
本发明还提供一种饲料添加剂，所述饲料添加剂中含有所述重组抗菌肽Sub168-1/3R。
本发明还提供所述重组抗菌肽Sub168-1/3R的制备方法，具体为：通过易错PCR反应扩增抗菌肽Sub168-1/3R的基因片段，使用琼脂糖凝胶电泳检测该易错PCR片段，通过体外同源重组插入木霉表达载体，构建重组抗菌肽Sub168-1/3R的重组表达载体；将重组表达载体采用聚乙二醇介导的原生质体转化法转入木霉Tu6，筛选阳性转化子及验证后，通过发酵表达获得重组抗菌肽Sub168-1/3R。
本发明与现有技术相比的有益效果：通过易错PCR方法得到了一种重组抗菌肽Sub168-1/3R，构建其在里氏木霉中的重组表达载体突变库；
本发明将重组抗菌肽Sub168-1/3R在里氏木霉Tu6中异源表达，获得该重组抗菌肽Sub168-1/3R表达产物，具备重组抗菌肽Sub168-1/3R在里氏木霉Tu6中的制备方法；
本发明表征了重组抗菌肽Sub168-1/3R表达产物的抗菌活性，其对大肠杆菌、沙门氏菌及产气荚膜梭菌均有抑制作用。且对比原始序列的抗菌肽，重组抗菌肽Sub168-1/3R具有更强的对革兰氏阴性菌的抗菌活性；
本发明所述的重组抗菌肽Sub168-1/3R具有良好的热稳定性、耐酸和耐胃蛋白酶特性及较低的溶血活性，上述特性有利于其在饲料及饲料添加剂中的应用。
附图说明
图1为重组抗菌肽Sub168-1/3R热稳定性示意图；
图2为重组抗菌肽Sub168-1/3RpH稳定性示意图；
图3为重组抗菌肽Sub168-1/3R的胃蛋白酶酶稳定性示意图；
图4为重组抗菌肽Sub168-1/3R的胰蛋白酶稳定性示意图。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
PDA固体培养基的成分及终浓度马铃薯浸粉5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂20.0g/L，氯霉素：0.1g/L。
实施例1重组抗菌肽Sub168-1/3R基因的易错PCR
以GenBank:ACE07988.1中公布的抗菌肽Sublancin168的氨基酸序列为原始序列，使用DNAMAN软件翻译为编码的核苷酸序列，并进行该核苷酸片段的人工合成。对该人工合成的片段进行易错PCR反应，使用的PCR扩增酶为高保真扩增酶，PCR反应体系(50μL)为：/>Buffer10μL；dNTP 4μL；/>0.5μL；pf2μL；pr 2μL；合成模板1μL；ddH2O30.5μL。PCR反应条件为：95℃3min预变性；95℃30sec变性、56℃30sec退火、72℃1min延伸、35循环；72℃10min总延伸；4℃。PCR反应完成后，经琼脂糖凝胶电泳检测抗菌肽Sub168-1/3R的基因扩增目的条带，将验证的PCR产物进行模板消化，使用的酶为DpnI酶，消化体系为DpnI 1μL、Fast Digest Buffer 5μL，于37℃反应2h。PCR消化产物使用Cycle Pure Kit PCR纯化试剂盒进行回收纯化，回收得到的产物为抗菌肽Sublancin168易错PCR基因片段。
实施例2抗菌肽Sublancin168基因的易错PCR产物插入木霉Tu6表达载体，构建重组表达载体Sub168-PCBHG。
使用木霉Tu6载体的线性化引物对F：5’-gctccgtggcgaaagcct-3’和R：5’-agcacgagctgtggccaag-3’通过PCR反应对其进行线性化，PCR使用的酶为Super-Fidelity DNAPolymerase，PCR反应体系(50μL)为：5×SF Buffer25μL；dNTP 1μL；/>0.5μL；pf2μL；pr2μL；载体PCBHG 1μL；ddH2OμL；18.5μL。PCR反应条件为：95℃3min预变性；95℃30sec变性、58℃30sec退火、72℃8min延伸、35循环；72℃10min总延伸；4℃。经核酸电泳检验后，对其进行模板消化及使用Cycle Pure KitPCR纯化试剂盒回收纯化，获得线性化载体回收片段。将实施例1中回收片段与线性化载体进行体外同源重组连接，使用的同源重组连接酶为ExnaseⅡ，连接体系(50μL)为：CEⅡBuffer 2μL；ExnaseⅡ0.5μL；线性化载体0.5μL；Sublancin168易错PCR基因1μL；ddH2O 1μL。连接条件为：37℃，30min。之后将同源重组连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，涂布后于37℃培养14-16h，挑取单菌落进行菌落PCR及测序验证，比对后完成重组表达载体Sub168-PCBHG的构建，其组成示意如图2所示。
实施例3抗菌肽Sub168-1/3R的木霉重组表达载体的转化。
将里氏木霉宿主菌株在PDA+U固体培养基平板上传代培养，条件为30℃5-6天。将成熟的里氏木霉宿主菌株接种至YEG+U培养基，30℃、180rpm的条件下培养20h作为表达宿主。过滤培养成熟的菌液，收集滤布上的菌丝体至灭菌的锥形瓶中，加入裂解酶后在30℃、90rpm的条件下裂解2h，期间每间隔30min于无菌工作台中取样，使用血球计数板在显微镜下观察裂解生成原生质体的形态和数目，直至达到108CFU/mL时停止裂解。锥形瓶中的裂解液过滤并离心，用1M的山梨醇溶液重复洗涤并重悬3次，收集最终的原生质体沉淀。
实施例4抗菌肽Sub168-1/3R在木霉中的发酵表达。
将实施例2中构建的重组质粒使用E.Z.N.A.Plasmid Mini KitⅠ试剂盒进行质粒提取，将提取的重组质粒转移至制备的木霉原生质体中进行混合，混合液中加入聚乙二醇溶液并于冰上孵育30min，之后于PDA固体培养基中在30℃条件下培养5-6天。
PDA固体培养基中生长的转化子挑取至新的平板上进行筛选，生长出菌丝及孢子后进行基因组提取并对其目的基因进行验证，筛选的阳性转化子接种至木霉发酵培养基中于30℃、180rpm的条件下发酵表达5-6天，期间在菌体明显生长后调低温度。将发酵产物于96孔板中进行初步筛选，具体筛选过程为：初步以大肠杆菌为指示菌，将其培养至生长对数期并使用LB液体培养基稀释至菌浓度为105CFU/mL，取1ml稀释后的菌悬液加入等量的抗菌肽发酵产物中，将96孔板置于37℃摇床中培养14h左右，使用肉眼观察澄清度并测定其OD600nm，初步筛选得出OD600nm值较低且肉眼观察较为澄清的样品，即筛选出一株重组菌，所述重组菌产重组抗菌肽Sub168-1/3R，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。将其产物过滤并收集，使用SDS-PAGE进行检测及分析。选择其中的样品进行后续的纯化及蛋白浓度测定。
实施例5抗菌肽Sub168-1/3R的抗菌活性测定。
最小抑菌浓度(MIC)的测定。本实施例所使用的指示菌为大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌。
MIC的具体测定方法为微量二倍稀释法：将三种细菌使用其液体培养基培养至生长对数期，并收集各菌体稀释至菌体浓度为105CFU/mL备用，此步骤为菌悬液的制备。将纯化收集的抗菌肽Sub168-1/3R溶液在96孔板的第一列中与菌悬液的液体培养基一起等量混合至抗菌肽样品起始浓度为200μg/mL，在后续列中进行连续二倍稀释，呈浓度梯度。在96孔板浓度梯度的样品中均加入等量的稀释后的菌悬液，并于37℃培养箱中孵育16h，培养之后肉眼观察各孔洞的浑浊程度，其中能使孔洞澄清的最小浓度为抗菌肽Sub168-1/3R对各细菌的MIC。结果如表1所示，抗菌肽Sub168-1/3R对三种细菌均有较好的抑制活性，且对比原序列抗菌肽，抗菌肽Sub168-1/3R对革兰氏阴性菌的抑制活性更强，对大肠杆菌的MIC为37.5μg/mL，而原序列抗菌肽对其的抗菌活性大于100μg/mL；
表1重组抗菌肽Sub168-1/3R不同细菌的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度
最小杀菌浓度(MBC)的测定：根据MIC测定过程的结果，抗菌肽Sub168-1/3R能使各细菌呈现澄清的浓度分别取样涂至各细菌相应的固体培养基中，培养16h后观察平板上生长的菌落，能抑制99.9％细菌生长的样品浓度为抗菌肽Sub168-1/3R对各细菌的MBC，结果如表1所示。
实施例6抗菌肽Sub168-1/3R的热稳定性测定。
将抗菌肽Sub168-1/3R样品在沸水中分别加热处理5min，10min，15min，20min，25min，30min，经过热处理的样品作为待测样品，未经热处理的样品作为对照。将三种指示菌分别培养至生长对数期并稀释至菌浓度为105CFU/mL备用。经过不同时间热处理的抗菌肽样品与稀释后的各菌悬液混合，于37℃下孵育18h，并在600nm处测定其吸光值，以未经热处理的样品为对照，计算热处理不同时间后样品对各细菌的抑制率。
热稳定性结果如图1所示，抗菌肽Sub168-1/3R经不同时间的高温处理对各细菌的抑制率几乎无明显的变化，沸水中处理20min时对各细菌的抑制率几乎没有变化，处理25min时对各细菌的抑制率仍能达到80％左右，说明重组抗菌肽Sub168-1/3R具有良好的热稳定性，且能够耐受工业化加工过程的高温处理过程。
实施例7抗菌肽Sub168-1/3R的pH稳定性测定。
将抗菌肽Sub168-1/3R样品分别在pH＝1，2，3，4，5，6，7，8，9，10条件下处理30min，作为待测样品。将指示菌培养至生长对数期并稀释至菌浓度为105CFU/mL备用。经过不同pH处理的抗菌肽样品与稀释后的各菌悬液混合，并使抗菌肽样品浓度达到MIC，于37℃下孵育18h，并在600nm处测定其吸光值，以未经热处理的样品为对照，计算不同pH处理后样品对各细菌的抑制率。
pH稳定性结果如图2所示，抗菌肽Sub168-1/3R经不同pH处理对各细菌的抑制率几乎无明显的变化，说明重组抗菌肽Sub168-1/3R具有良好的pH稳定性，且能够耐受强酸强碱环境。
实施例8重组抗菌肽Sub168-1/3R的胃蛋白酶稳定性测定。
对重组抗菌肽Sub168-1/3R进行消化酶稳定性测定，评价其对消化酶的耐受性。本实施例使用的消化酶为胃蛋白酶，使用pH为2.0的Gly-HCl缓冲液稀释胃蛋白酶至3000U/mL。抗菌肽Sub168-1/3R溶液使用稀释制备的胃蛋白酶溶液稀释至其MIC。将稀释后的抗菌肽Sub168-1/3R溶液置于37℃下孵育30-180min作为待测样品。待测样品与稀释的菌悬液混合后置于37℃培养18h，并在600nm处测定其吸光值，以未经胃蛋白酶处理的样品为对照，计算胃蛋白酶处理不同时间后对指示菌的抑制率。
经过测定，重组抗菌肽Sub168-1/3R对胃蛋白酶的稳定性较好，经胃蛋白酶处理后对各细菌的抑制率能仍保持较高水平(80％以上)(图3)。对胃蛋白酶良好的耐受性意味着重组抗菌肽Sub168-1/3R具有通过动物的胃消化道进而发挥抗菌活性的潜力，这是其想要应用为饲料添加剂的基础。
实施例9重组抗菌肽Sub168-1/3R的胰蛋白酶稳定性测定。
对重组抗菌肽Sub168-1/3R进行消化酶稳定性测定，评价其对消化酶的耐受性。本实施例使用的消化酶为胰蛋白酶，使用pH为6.8的PBS缓冲液稀释胰蛋白酶至3000U/mL。抗菌肽Sub168-1/3R溶液使用稀释制备的胰蛋白酶溶液稀释至其MIC。将稀释后的抗菌肽Sub168-1/3R溶液置于37℃下孵育30-180min作为待测样品。待测样品与稀释的菌悬液混合后置于37℃培养18h，并在600nm处测定其吸光值，以未经胰蛋白酶处理的样品为对照，计算胰蛋白酶处理不同时间后对指示菌的抑制率。
经过测定，重组抗菌肽Sub168-1/3R对胰蛋白酶的酶解具有一定的稳定性。与原始抗菌肽相比，重组抗菌肽Sub168-1/3R在经胰蛋白酶处理120min后，仍能保持70％以上对细菌的抑制率(图4)。对胰蛋白酶良好的耐受性意味着重组抗菌肽Sub168-1/3R可以耐受肠道中的胰蛋白酶，对动物胃肠道中的致病菌也能有较好的抑制效果。
Claims (6)
1.一种重组抗菌肽Sub168-1/3R，其特征在于，所述重组抗菌肽Sub168-1/3R的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根据权利要求1所述的重组抗菌肽Sub168-1/3R，其特征在于，编码SEQ ID NO. 1所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.权利要求1所述重组抗菌肽Sub168-1/3R在制备饲料或饲料添加剂中的应用。
4.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中含有权利要求1所述重组抗菌肽Sub168-1/3R。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述SEQ ID NO.2核苷酸序列。
6.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株包含权利要求5所述重组表达载体，所述菌株为里氏木霉Tu6。
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