CN113831395A - 一种重组抗菌肽TrSub、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组抗菌肽TrSub、制备方法及其应用，属于基因工程及生物技术领域，所述重组抗菌肽TrSub的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明还提供一种重组抗菌肽TrSub在里氏木霉中异源表达的制备方法，所述重组抗菌肽TrSub对大肠杆菌、沙门氏菌及产气荚膜梭菌均有抑制作用，且具有良好的热稳定性、耐酸和耐胃蛋白酶特性及较低的溶血活性，有利于其在制备饲料及饲料添加剂中的应用。

Description

一种重组抗菌肽TrSub、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及生物技术领域，具体涉及重组抗菌肽TrSub在里氏木霉中的制备方法及其应用。

背景技术

在动物养殖中，细菌性腹泻等细菌性疾病严重危害动物健康，对养殖造成重大损失。目前主要通过使用抗生素对其进行治疗及防治，但抗生素的过度使用及滥用不断造成耐药菌株及耐药性出现，进而威胁人类健康。在2020年中国推出禁止使用抗生素的政策，这使得抗生素替代品的出现和挖掘迫在眉睫。抗菌肽（AMPs）是一类小分子的肽类物质，来源广泛，分子量小且具有广谱的抗菌活性。与传统的抗生素相比，抗菌肽属于天然的活性物质，无污染，不易产生耐药性，是一种极具潜力的抗生素替代品。但生物提取及化学合成等手段的制备方法成本高、效率低，不易实现大量制备，无法满足工业化生产的需求，因此实现抗菌肽的高效制备和生产的方法是研究的热点。

抗菌肽Sublancin168是枯草芽孢杆菌分泌的代谢物之一，具有特定的结构及一定的抗菌活性，但其抗菌特性还需进一步挖掘。其作为一种待开发的想应用于饲料行业的抗菌肽除需满足良好的抗菌活性外，还需具备较好的能够耐受工业化生产中造粒等高温加工过程的热稳定性、能够耐受动物胃蛋白酶从而发挥活性的消化酶稳定性、应用于动物饲料中生产和使用的安全性。因此，对畜禽动物养殖常见致病菌的抗菌活性、自身的热稳定性、胃蛋白酶稳定性及生产和自身的安全性均是抗菌肽应用为饲料添加剂的基础。

为满足工业化生产的需求，异源表达的制备方式被普遍采用。大肠杆菌、毕赤酵母等宿主工程菌株需要诱导剂诱导表达外源蛋白，生产的外源蛋白无法直接应用为饲料添加剂。而里氏木霉作为一种食品级安全菌株（GRAS）可以满足生产的外源蛋白的安全性要求，且还具有强启动子和蛋白质翻译后加工能力强等优点，可以为饲料添加剂的高效生产和安全性奠定基础。且大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌作为仔猪和幼鸡腹泻中的常见致病性细菌，需要开发和挖掘能够抑制上述三种细菌且具有良好特性的抗菌肽。才能满足饲料预防动物常见疾病的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组抗菌肽TrSub在里氏木霉中的制备方法及其抗菌特性，所述重组抗菌肽TrSub对仔猪和幼鸡腹泻中的常见致病性细菌具有抗菌活性，且满足饲料制备和作为动物饲料的耐热性、胃蛋白酶稳定性和溶血活性的要求。

本发明的是通过以下技术方案予以实现：

一种重组抗菌肽TrSub，所述重组抗菌肽TrSub的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；具体为： GAGKAQCAAAWLQCASGGTLGCGGGAVACQNYRQFCR。

编码SEQ ID NO. 1所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述SEQID NO. 2是在原始氨基酸序列SEQ ID NO. 3的抗菌肽Sublancin168基础上，翻译为编码的核苷酸序列，并进行该核苷酸片段的人工合成，对该人工合成的片段进行易错PCR反应获得的突变体。

所述SEQ ID NO. 2为ggagctggaaaggctcaatgtgctgctgcttggttgcaatgtgcttcaggaggtactttgggatgtggaggaggagctgttgcttgtcaaaactacagacaattttgtaga。

SEQ ID NO. 3：GLGKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVAC QNYRQFCR。

本发明还提供包含上述抗菌肽基因的木霉重组表达载体。

本发明还提供包含上述抗菌肽的重组菌株，所述菌株为里氏木霉Tu6。

一种重组抗菌肽TrSub的制备方法，具体为：通过易错PCR反应扩增抗菌肽Sublancin168的基因片段，使用琼脂糖凝胶电泳检测该易错PCR片段，通过体外同源重组插入木霉表达载体，构建重组抗菌肽TrSub的重组表达载体；将重组表达载体采用聚乙二醇介导的原生质体转化法转入里氏木霉Tu6，筛选阳性转化子及验证后，通过发酵表达获得重组抗菌肽TrSub。

一种重组抗菌肽TrSub在制备饲料和饲料添加剂中的应用。

本发明与现有技术相比的有益效果：

通过易错PCR方法得到了一种重组抗菌肽TrSub，构建其在里氏木霉中的重组表达载体突变库。

本发明将重组抗菌肽TrSub在里氏木霉Tu6中异源表达，获得该重组抗菌肽TrSub表达产物，具备重组抗菌肽TrSub在里氏木霉Tu6中的制备方法。

本发明表征了重组抗菌肽TrSub表达产物的抗菌活性，其对大肠杆菌、沙门氏菌及产气荚膜梭菌均有抑制作用。且对比原序列抗菌肽，重组抗菌肽TrSub具有更强的对革兰氏阴性菌的抗菌活性。

本发明所述的重组抗菌肽TrSub具有良好的热稳定性、耐酸和耐胃蛋白酶特性及较低的溶血活性，上述特性有利于其在饲料及饲料添加剂中的应用。

附图说明

图1为重组抗菌肽TrSub的基因扩增核酸电泳示意图；

图2为重组表达载体PCBHG- TrSub的构建示意图；

图3为重组抗菌肽TrSub的表达产物及纯化产物的蛋白电泳检测示意图；

图4为重组抗菌肽TrSub热稳定性示意图；

图5 为重组抗菌肽TrSub的胃蛋白酶稳定性示意图；

图6为重组抗菌肽TrSub对兔血红细胞的溶血活性示意图。

具体实施方式

实施例1 重组抗菌肽TrSub基因的易错PCR

以GenBank: ACE07988.1中公布的抗菌肽Sublancin168的氨基酸序列为原始序列，使用DNAMAN软件翻译为编码的核苷酸序列，并进行该核苷酸片段的人工合成。对该人工合成的片段进行易错PCR反应，使用的PCR扩增酶为PrimeSTAR^®高保真扩增酶，PCR反应体系（50 μL）为：5 × PrimeSTAR^® Buffer 10 μL；dNTP 4 μL；PrimeSTAR^® 0.5 μL；pf 2 μL；pr2 μL；合成模板 1μL；ddH₂O 30.5 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min预变性；95 ℃ 30 sec变性、56 ℃ 30 sec退火、72 ℃ 1 min延伸、35循环；72 ℃ 10 min总延伸；4℃。PCR反应完成后，经琼脂糖凝胶电泳检测抗菌肽TrSub的基因扩增目的条带，如图1所示。将验证的PCR产物进行模板消化，使用的酶为DpnI酶，消化体系为DpnI 1 μL、Fast Digest Buffer 5 μL，于37 ℃反应2 h。PCR消化产物使用Cycle Pure Kit PCR纯化试剂盒进行回收纯化，回收得到的产物为抗菌肽Sublancin168易错PCR基因片段。

实施例2 抗菌肽Sublancin168基因的易错PCR产物插入木霉Tu6表达载体，构建重组表达载体Sub168-PCBHG

使用木霉Tu6载体的线性化引物对F：5’-gctccgtggcgaaagcct-3’和R：5’-agcacgagctgtggccaag-3’通过PCR反应对其进行线性化，PCR使用的酶为Phanta^® Super-Fidelity DNA Polymerase，PCR反应体系（50 μL）为：5 × SF Buffer 25 μL；dNTP 1 μL；Phanta^® 0.5 μL；pf 2 μL；pr 2 μL；载体PCBHG1μL；ddH₂O μL；18.5 μL。PCR反应条件为：95℃ 3 min预变性；95 ℃ 30 sec变性、58 ℃ 30 sec退火、72 ℃ 8 min延伸、35循环；72 ℃10 min总延伸；4℃。经核酸电泳检验后，对其进行模板消化及使用Cycle Pure Kit PCR纯化试剂盒回收纯化，获得线性化载体回收片段。将实施例1中回收片段与线性化载体进行体外同源重组连接，使用的同源重组连接酶为Exnase Ⅱ，连接体系（50 μL）为：CE Ⅱ Buffer2 μL；Exnase Ⅱ 0.5 μL；线性化载体0.5 μL；Sublancin168易错PCR基因1 μL；ddH₂O 1 μL。连接条件为：37 ℃，30 min。之后将同源重组连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，涂布后于37 ℃培养14-16 h，挑取单菌落进行菌落PCR及测序验证，比对后完成重组表达载体Sub168-PCBHG的构建，其组成示意如图2所示。

实施例3 抗菌肽TrSub的木霉重组表达载体的转化

将里氏木霉宿主菌株在PDA+U固体培养基平板上传代培养，条件为30 ℃5-6天。将成熟的里氏木霉宿主菌株接种至YEG+U培养基，30 ℃、180 rpm的条件下培养20 h作为表达宿主。过滤培养成熟的菌液，收集滤布上的菌丝体至灭菌的锥形瓶中，加入裂解酶后在30℃、90 rpm的条件下裂解2 h，期间每间隔30 min于无菌工作台中取样，使用血球计数板在显微镜下观察裂解生成原生质体的形态和数目，直至达到10⁸ CFU/mL时停止裂解。锥形瓶中的裂解液过滤并离心，用1M的山梨醇溶液重复洗涤并重悬3次，收集最终的原生质体沉淀。

实施例4 抗菌肽TrSub在木霉中的发酵表达

将实施例2中构建的重组质粒使用E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit Ⅰ 试剂盒进行质粒提取，将提取的重组质粒转移至制备的木霉原生质体中进行混合，混合液中加入聚乙二醇溶液并于冰上孵育30 min，之后于PDA固体培养基中在30 ℃条件下培养5-6天。

PDA固体培养基中生长的转化子挑取至新的平板上进行筛选，生长出菌丝及孢子后进行基因组提取并对其目的基因进行验证，筛选的阳性转化子接种至木霉发酵培养基中于30 ℃、180 rpm的条件下发酵表达5-6天，期间在菌体明显生长后调低温度。将发酵产物于96孔板中进行初步筛选，具体筛选过程为：初步以大肠杆菌为指示菌，将其培养至生长对数期并使用LB液体培养基稀释至菌浓度为10⁵ CFU/mL，取1 ml稀释后的菌悬液加入等量的抗菌肽发酵产物中，将96孔板置于37 ℃摇床中培养14 h左右，使用肉眼观察澄清度并测定其OD_600nm，初步筛选得出OD_600nm值较低且肉眼观察较为澄清的样品，即筛选出一株重组抗菌肽TrSub，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，编码的核苷酸如SEQ ID NO. 2所示。将其产物过滤并收集，使用SDS-PAGE进行检测及分析。选择其中的样品进行后续的纯化及蛋白浓度测定。SDS-PAGE检测如图3所示。

实施例5 抗菌肽TrSub的抗菌活性测定

最小抑菌浓度（MIC）的测定

本实施例所使用的指示菌为大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌。

MIC的具体测定方法为微量二倍稀释法：将三种细菌使用其液体培养基培养至生长对数期，并收集各菌体稀释至菌体浓度为10⁵ CFU/mL备用，此步骤为菌悬液的制备。将纯化收集的抗菌肽TrSub溶液在96孔板的第一列中与菌悬液的液体培养基一起等量混合至抗菌肽样品起始浓度为200 μg/mL，在后续列中进行连续二倍稀释，呈浓度梯度。在96孔板浓度梯度的样品中均加入等量的稀释后的菌悬液，并于37 ℃培养箱中孵育16 h，培养之后肉眼观察各孔洞的浑浊程度，其中能使孔洞澄清的最小浓度为抗菌肽TrSub对各细菌的MIC。结果如表1所示，重组抗菌肽TrSub对三种细菌均有较好的抑制活性，且对比原序列抗菌肽，重组抗菌肽TrSub对革兰氏阴性菌的抑制活性更强，对大肠杆菌的MIC为37.5 μg/mL，而原序列抗菌肽对其的抗菌活性大于100 μg/mL。

表1 重组抗菌肽TrSub不同细菌的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度

细菌种类	MIC (μg/mL)	MBC (μg/mL)
			革兰氏阴性细菌
大肠杆菌	37.5	37.5
			沙门氏菌	37.5	75
革兰氏阳性细菌
			产气荚膜梭菌	25	25

最小杀菌浓度（MBC）的测定

根据MIC测定过程的结果，抗菌肽TrSub能使各细菌呈现澄清的浓度分别取样涂至各细菌相应的固体培养基中，培养16 h后观察平板上生长的菌落，能抑制99.9%细菌生长的样品浓度为抗菌肽TrSub对各细菌的MBC，结果如表1所示。

实施例6 重组抗菌肽TrSub的热稳定性测定

将重组抗菌肽TrSub样品在沸水中分别加热处理5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min，经过热处理的样品作为待测样品，未经热处理的样品作为对照。将三种指示菌分别培养至生长对数期并稀释至菌浓度为10⁵ CFU/mL备用。经过不同时间热处理的抗菌肽样品与稀释后的各菌悬液混合，于37 ℃下孵育18 h，并在600 nm处测定其吸光值，以未经热处理的样品为对照，计算热处理不同时间后样品对各细菌的抑制率。

热稳定性结果如图4所示，重组抗菌肽TrSub经不同时间的高温处理对各细菌的抑制率几乎无明显的变化，沸水中处理20 min时对各细菌的抑制率几乎没有变化，处理25min时对各细菌的抑制率仍能达到80%左右，说明重组抗菌肽TrSub具有良好的热稳定性，且能够耐受工业化加工过程的高温处理过程。

实施例7 重组抗菌肽TrSub的胃蛋白酶稳定性测定

对重组抗菌肽TrSub进行消化酶稳定性测定，评价其对消化酶的耐受性。本实施例使用的消化酶为胃蛋白酶，使用pH为2.0的Gly-HCl缓冲液稀释胃蛋白酶至3000 U/mL。抗菌肽TrSub溶液使用稀释制备的胃蛋白酶溶液稀释至其MIC，此处及后续实例，未经说明均指对大肠杆菌的MIC。将稀释后的抗菌肽TrSub溶液置于37 ℃下孵育30 - 180 min作为待测样品。待测样品与稀释的三种菌悬液混合后置于37 ℃培养18 h，并在600 nm处测定其吸光值，以未经胃蛋白酶处理的样品为对照，计算胃蛋白酶处理不同时间后对各细菌的抑制率。

经过测定，重组抗菌肽TrSub对胃蛋白酶的稳定性较好，经胃蛋白酶处理后对各细菌的抑制率能仍保持较高水平（80%以上）（图5）。对胃蛋白酶良好的耐受性意味着重组抗菌肽TrSub具有通过动物的胃消化道进而发挥抗菌活性的潜力，这是其想要应用为饲料添加剂的基础。

实施例8 重组抗菌肽TrSub的溶血活性测定

使用购买的兔血红细胞进行重组抗菌肽TrSub的溶血活性测定。使用PBS溶液对兔血细胞进行洗涤及重悬2-3次，收集最终的血细胞与在96孔板中连续二倍稀释的抗菌肽TrSub溶液进行混合，并置于37 ℃孵育1 h。孵育后的混合样品在1200 rpm下离心10 min，收集并转移上清液至新的96孔板中，在570 nm处测定其吸光度。本实施例使用0.1% TritonX-100为阳性对照，其溶血率为100%；使用PBS溶液为阴性对照，其溶血率为0。根据公式定义，溶血率（%）=（TrSub的OD570 nm – PBS的OD570 nm）/（0.1% Triton X-100的OD 570 nm– PBS的OD 570 nm）*100%。

结果如图6所示，重组抗菌肽TrSub在MIC浓度及2MIC浓度时的溶血活性在10%以下，说明筛选得到的重组抗菌肽TrSub具有较低的溶血活性，该特性使得其应用的安全性进一步提升。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种重组抗菌肽TrSub、制备方法及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ala Gly Lys Ala Gln Cys Ala Ala Ala Trp Leu Gln Cys Ala Ser

1 5 10 15

Gly Gly Thr Leu Gly Cys Gly Gly Gly Ala Val Ala Cys Gln Asn Tyr

20 25 30

Arg Gln Phe Cys Arg

35

<210> 2

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggagctggaa aggctcaatg tgctgctgct tggttgcaat gtgcttcagg aggtactttg 60

ggatgtggag gaggagctgt tgcttgtcaa aactacagac aattttgtag a 111

<210> 3

<211> 37

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 3

Gly Leu Gly Lys Ala Gln Cys Ala Ala Leu Trp Leu Gln Cys Ala Ser

1 5 10 15

Gly Gly Thr Ile Gly Cys Gly Gly Gly Ala Val Ala Cys Gln Asn Tyr

20 25 30

Arg Gln Phe Cys Arg

35

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctccgtggc gaaagcc 17

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcacgagct gtggccaag 19

Claims (6)

1.一种重组抗菌肽TrSub，其特征所述重组抗菌肽TrSub的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.编码SEQ ID NO. 1所示氨基酸的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ IDNO. 2所示。

3.含有权利要求2所述核苷酸序列SEQ ID NO. 2的里氏木霉重组表达载体。

4.含有权利要求2所述核苷酸序列SEQ ID NO. 2的重组菌株，其特征在于菌株为里氏木霉Tu6。

5.一种重组抗菌肽TrSub的制备方法，其特征在于所述方法为通过易错PCR反应扩增抗菌肽Sublancin168的基因片段，使用琼脂糖凝胶电泳检测该易错PCR片段，通过体外同源重组插入里氏木霉表达载体，构建重组抗菌肽TrSub的重组表达载体；将重组表达载体采用聚乙二醇介导的原生质体转化法转入里氏木霉Tu6，筛选阳性转化子及验证后，通过发酵表达获得重组抗菌肽TrSub。

6.权利要求5所述重组抗菌肽TrSub在制备饲料和饲料添加剂中的应用。

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