CN116445378A - 一种高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株及应用 - Google Patents

一种高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116445378A
CN116445378A CN202211227373.3A CN202211227373A CN116445378A CN 116445378 A CN116445378 A CN 116445378A CN 202211227373 A CN202211227373 A CN 202211227373A CN 116445378 A CN116445378 A CN 116445378A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus licheniformis
gene
alkaline protease
genetically engineered
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211227373.3A
Other languages
English (en)
Inventor
路福平
史超硕
惠威
张会图
刘逸寒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN202211227373.3A priority Critical patent/CN116445378A/zh
Publication of CN116445378A publication Critical patent/CN116445378A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/1055—Levansucrase (2.4.1.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/0101—Levansucrase (2.4.1.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/10—Bacillus licheniformis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别涉及一种生产碱性蛋白酶的底盘菌株及其构建方法与用途。本发明提供了一种地衣芽孢杆菌基因工程菌株，该基因工程菌株不表达地衣芽孢杆菌基因组上的chiAB，PulA，AmyA，spo0A，sigF，eps，pgs，lchAC以及核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的SacB基因，同时过表达碱性蛋白酶基因aprE。本发明从实验和生产中的实际情况出发，通过对基因工程宿主的改造简化，最终获得了一种能够高产碱性蛋白酶的底盘菌株，并且为构建蛋白酶高产底盘菌株提供了新的思路。

Description

一种高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株及应用
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株及其构建方法与应用。
背景技术：
在众多的工业用酶中，主要产自微生物的碱性蛋白酶是能够在碱性条件下水解蛋白质肽键的一类酶，其最适pH一般为9～11，在洗涤剂、食品加工、皮革制造、纺织制造等工业中被广泛应用和研究。
B.licheniformis 2709工业微生物，来源于土壤等自然环境，进化过程中形成一系列未经驯化的不良特性，包括：1)发酵过程中易形成泡沫，导致极高的发酵污染风险；2)营养缺陷时易形成芽孢，影响目标产物的进一步积累并增加发酵设备的消杀成本；3)形成大量粘性物质，阻碍菌体生长和产物合成，在大规模化工业生产中增加搅拌与溶氧的需求；4)分泌合成大量的胞外蛋白等，这无疑严重影响目标产物的合成与积累，增加了工业化操作的要求与难度，不利于工业化生产的整体效益。
近年来，为获得性能优良的工业微生物细胞工厂，学者们在生产菌株的遗传改良方面开展了深入的研究。Zhang等人通过敲除影响泡沫形成的脂肽编码基因srfA，优化了未经驯化的野生菌株B.subtilis ATCC 6051a的生产性能；Illing等人通过删除芽孢形成关键控制基因sigE提高了酶的合成能力；模式菌B.subtilis WB800属于多重蛋白酶缺陷型菌株，这明显促进其它胞外分泌蛋白的积累。
基因组精简工程主要在原核细胞中进行，尤其是E.coli和B.subtilis等模式菌株，并取得了一定的成果。针对常用工业菌株B.licheniformis 2709基因组的精简工作，通过分析宿主的基因组发现，存在大量的孤岛基因、冗余基因、假基因等非必需基因，以及控制次级代谢产物合成的基因，这大大增加了细胞代谢负担和能耗，导致营养资源浪费，进而影响细胞的生长与发酵性能。因此，通过小基因组技术实现在特定培养基中底盘细胞的构建，是可行且有价值的。
对地衣芽孢杆菌基因组进行简化，在维持其基因稳定的同时，也能达到优化代谢网络，改善细胞的能量利用效率，提高细胞生理性能的预测性及可控性的目的，获得性能优秀的工业底盘。作为重要的工业菌株，地衣芽胞杆菌较强的蛋白分泌能力和蛋白酶耐受能力促使研究者们对其进行改造，不断优化地衣芽胞杆菌的表型，提升其蛋白酶生产能力。
发明内容：
针对上述问题，本发明的目的是通过对基因工程宿主的改造，提供能够高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌底盘菌株。
为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌底盘基因工程菌株，该基因工程菌株以地衣芽孢杆菌2709为宿主，对地衣芽孢杆菌2709基因组上的以下九个基因缺失表达：三种胞外杂蛋白基因chiAB、PulA、AmyA，二种与芽孢形成相关基因spo0A、sigF，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，地衣素编码基因lchAC，以及sacB基因；
所述eps基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第1967676-1983603位；
所述pgs基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第1805920-1808919位；
所述sigF基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第3898937-3899704位；
所述chiAB基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第909808-913767位；
所述pulA基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第2420607-2422739位；
所述amyA基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第582978-584516位；
所述lchAC基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第834378-849050位；
所述spo0A基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第3985067-3985867位；
进一步地，sacB基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
优选地，所述地衣芽孢杆菌底盘基因工程菌株对chiAB，PulA，AmyA，spo0A，sigF，eps，pgs，lchAC，以及sacB基因进行了敲除。
第二方面，本发明提供一种生产碱性蛋白酶的基因工程菌，是在上述底盘基因工程菌的基础上，内源性表达碱性蛋白酶基因aprE获得；
进一步地，aprE基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供上述生产碱性蛋白酶的基因工程菌的应用，特别是在生产碱性蛋白酶中的应用。
第四方面，本发明提供一种高效生产碱性蛋白酶的方法，所述方法是在适宜条件下培养上述生产碱性蛋白酶的基因工程菌，并从其培养物中收集碱性蛋白酶。
本发明的有益效果如下：
本发明通过对宿主地衣芽孢杆菌基因组上chiAB，PulA，AmyA，spo0A，sigF，eps，pgs，lchAC敲除的基础上，再对sacB基因进行敲除，获得一株能够高效表达碱性蛋白酶的工业菌株，sacB基因的敲除可以为高效表达异源蛋白奠定基础，推动碱性蛋白酶的高效表达以及工业化生产。
本发明提供了一种能够高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌底盘菌株，在携带碱性蛋白酶表达盒的情况下，经48h摇瓶发酵，发酵液酶活力高达20084±1492.8U/mL，以出发菌株BL-aprE为对比，酶活提高了0.2倍左右。较原始未敲除菌株BL2709-aprE酶活提高了0.43倍左右。
附图说明：
图1：敲除载体的构建过程；
图2：sacB基因敲除验证；
其中：A，敲除载体的构建流程，M是核酸Marker，泳道1和2是阳性克隆，正确条带大小约为2091bp；B，单双交换验证结果，M是核酸Marker，泳道与1和2为正确单交换菌株，正确条带大小约为1986bp，泳道3为阴性对照，条带不正确；双交换验证结果，M是核酸Marker，泳道4、5、7为正确双交换菌株，正确条带大小为689bp，泳道6为阴性对照，条带大小约为1470bp；
图3：在位置I整合aprE表达盒构建双表达盒突变体验证结果
其中：M是核酸Marker，泳道1和2是正确单交换的重组菌，730bp，3是阴性对照，条带不正确；5是采用引物对I-VF1/A-R验证的双交换突变体，700bp，4是阴性对照，无条带；7-9是采用引物对A-F/I-VR1验证的双交换突变体，730bp，6是阴性对照，无条带；
图4：位置I示意图；
图5：基因工程菌BLΔsacB-aprE表达碱性蛋白酶的酶活测定。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
第一方面，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌底盘基因工程菌株，以地衣芽孢杆菌2709为宿主，缺失对地衣芽孢杆菌2709基因组上的以下九个基因的表达：三种胞外杂蛋白基因chiAB、PulA、AmyA，二种与芽孢形成相关基因spo0A、sigF，胞外多糖基因簇eps，聚谷氨酸基因簇pgs，地衣素编码基因lchAC，以及SacB基因；同时以该底盘菌为宿主，内源性表达碱性蛋白酶基因aprE，获得一种生产碱性蛋白酶的基因工程菌。
所述的sacB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述碱性蛋白酶基因aprE，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
根据本发明，缺失对上述基因表达的方式可以采取本领域常规手段，例如，通过本领域常规手段使该基因失活或者将该基因敲除，优选的方式为基因敲除。敲除的方式可以采取本领域常规手段，例如，通过同源重组的方式，构建敲除载体并电转化入地衣芽孢杆菌中，经过单双交换将上述基因从基因组上敲除，优选的，所述敲除载体是pQ-T2质粒(也即T2(2)-ori质粒)。
根据本发明，过表达aprE基因的方式可以采取本领域常规手段，例如，通过本领域常规手段使碱性蛋白酶基因aprE的表达盒插入在地衣芽孢杆菌的基因组中，或者通过本领域常规手段将包含有碱性蛋白酶基因aprE表达盒的表达载体转入地衣芽孢杆菌中。
根据本发明，所述过表达是指该基因表达产物的表达量显著高于原有水平。
根据本发明一种优选的实施方式，所述碱性蛋白酶基因aprE的内源表达是通过将包含有碱性蛋白酶基因aprE表达盒插入在地衣芽孢杆菌的基因组中实现的。
在本发明中，出发菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709，全基因组GenBank编号:CP033218.1，是本领常用的工业地衣芽孢杆菌宿主菌。根据本发明一种具体实施方式，上述底盘菌的构建方法包括：在出发菌株地衣芽孢杆菌2709中，敲除eps、pgs、chiAB、pulA、amyA、spo0A、sigF、lchAB，得到菌株BLΔepsΔpgsΔchiABΔpulAΔamyAΔsigFΔlchACΔspo0A，再敲除sacB基因，得到菌株BLΔepsΔpgsΔchiABΔpulAΔamyAΔsigFΔlchACΔspo0AΔsacB。
进一步地，将含有碱性蛋白酶基因aprE的表达盒插入到菌株BLΔepsΔpgsΔchiABΔpulAΔamyAΔsigFΔlchACΔspo0AΔsacB基因组上，得到高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌命名为BLΔsacB-aprE。
根据本发明一种更为优选的实施方式，所述构建方法包括如下步骤：
(1)敲除目的基因、获得各敲除菌株
以目的基因sacB基因为例，按照如下步骤敲除(其余基因均可按照此方法进行敲除)：
1)通过PCR扩增获得目的基因两侧同源序列UP端与DOWN端；
2)通过双酶切与琼脂糖核酸凝胶电泳获得线性的敲除质粒载体；
3)通过无缝克隆技术连接目的基因两侧同源序列与线性载体获得敲除质粒；
4)通过甲基化诱导使敲除质粒被甲基化修饰；
5)将甲基化修饰的敲除质粒电转化入地衣芽孢杆菌感受态细胞中；
6)通过单、双交换筛选出敲除菌株，并通过测序验证序列；
上述各步骤的具体操作方法根据本领域人员容易获得的技术手册、教科书或文献报道均可以实现。
(2)表达碱性蛋白酶基因的构建
将携带有碱性蛋白酶基因aprE的表达盒分别插入①菌株BLΔepsΔpgsΔchiABΔpulAΔamyAΔsigFΔlchACΔspo0A、②底盘菌株BLΔepsΔpgsΔchiABΔpulAΔamyAΔsigFΔlchACΔspo0AΔsacB和③出发菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)2709基因组中，得到产碱性蛋白酶的基因工程菌株BL-aprE、BLΔsacB-aprE、BL2709-aprE，上述菌株通过摇瓶发酵产碱性蛋白酶，国标法测定碱性蛋白酶酶活力。
根据本发明一种优选的实施方式，所述携带有碱性蛋白酶基因aprE的表达盒的整合载体通过同源重组的方式，经过单双交换将上述基因整合至基因组上。
第三方面，本发明提供上述地衣芽孢杆菌基因工程菌株在高产碱性蛋白酶中的应用。
根据本发明一种优选的实施方式，所述基因工程菌株BLΔsacB-aprE用于发酵生产碱性蛋白酶的用途，所述基因工程菌株的发酵液中碱性蛋白酶的酶活最高达到20084±1492.8U/mL，以BL-aprE为对比，酶活提升了0.2倍左右。
第四方面，本发明提供一种高效生产碱性蛋白酶的方法，所述方法是在适宜条件下培养上述地衣芽孢杆菌基因工程菌株，并从其培养物中收集碱性蛋白酶。
根据本发明一种优选的实施方式，所述适宜条件是指培养温度35℃-37℃，200-220rpm,培养48h-50h及采用如下发酵培养基组成：玉米粉64-70g/L，豆饼粉40-44g/L，磷酸氢二钠4-4.5g/L，磷酸二氢钾0.3-0.4g/L，高温淀粉酶0.7-0.9g/L，其余为水，pH＝7.5左右。
以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。如无特别说明，以下实施例中：
种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；
发酵培养基：玉米粉64-70g/L，豆饼粉40-44g/L，磷酸氢二钠4-4.5g/L，磷酸二氢钾0.3-0.4g/L，高温淀粉酶0.7-0.9g/L，其余为水。
芽孢杆菌感受态制备培养基：
LBS培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，山梨醇9.1085g/L，其余为水；
复苏培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，山梨醇9.1085g/L，甘露醇6.92246g/L，其余为水。
碱性蛋白酶的酶活力测定方法参照GB/T 23527-2009附录B福林酚法进行，即1个酶活力单位(U/mL)定义为1mL酶液在40℃、pH 10.5条件下反应1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。每一样品设三次重复，结果取平均值。
实施例所涉及的菌株及质粒见于表1和表2：
表1
质粒 用途 抗性
pQ-T2 敲除载体 Kana
注：T2(2)-ori质粒(本申请采用pQ-T2质粒作为代称)，公开于CN201810898060.8一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株及构建方法和应用
实施例所涉及的引物信息如表2所示：
表2
注：下划线部分是限制性内切酶。
实施例1：基因工程菌株的构建
(1)敲除目的基因
1)扩增目的基因同源序列
根据地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148基因组数据设计并通过PCR进行扩增获得待敲除的目的基因(eps、pgs、chiAB、pulA、amyA、spo0A、sigF、lchAB、sacB)序列两端的同源臂序列up端与down端，分别以目的基因-L-F、目的基因-L-R和目的基因-R-F、目的基因-R-R两组引物(参见引物表表2)，以2709即TCCC11148基因组为模板进行PCR扩增；扩增反应体系如下：
引物F 2μL
引物R 2μL
DNA模板 2μL
PrimerStar酶 25μL
ddH2O 19μL
扩增程序的设置为：预变性：95℃5min；变性：95℃30s；退火：56℃45s；延伸：72℃25s；反应30个循环；延伸：72℃，10min。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，up端和down端电泳条带大小在750bp至1000bp之间，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，即目的基因上下游同源臂片段。
2)敲除载体的线性化
提取pQ-T2质粒，其提取过程参照试剂盒的操作手册。经XbaI和SmaI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，再由DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到了线性化载体序列。
双酶切体系如下：
ddH2O 25μL
质粒模板 15μL
Q.cut Buffer 5μL
限制性内切酶XbaI 2.5μL
限制性内切酶SmaI 2.5μL
混匀后，37℃水浴酶切2h，反应完成后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，4260bp，再由小量DNA回收试剂盒回收酶切产物：线性pQ-T2质粒。
3)载体的构建
将酶切获得的线性载体片段和目的基因的上下游同源臂通过无缝克隆连接形成重组质粒，如sacB基因的敲除载体pQ-T2-ΔsacB(其他基因同理)。
无缝克隆酶反应体系如下：
无缝克隆酶 5μL
线性载体 2μL
up端片段 1.5μL
down端片段 1.5μL
4)敲除载体的甲基化修饰以及电转化入地衣芽胞杆菌感受态细胞
将构建的敲除载体通过化转转化入EC135.P.Bam.感受态细胞中，当培养液OD600值为0.2时，加入50mg/mL阿拉伯糖水溶液80μL进行甲基化诱导，于30℃摇床过夜培养。
通过使用电转仪将经甲基化修饰的敲除载体电转入地衣芽胞杆菌2709感受态细胞中，并使用敲除载体验证引物XbaI-F、SmaI-R进行菌落PCR进行验证如图2A所示。
5)单交换验证
挑选成功电转的单克隆在45℃下培养3-4代后，经稀释涂布，挑单菌落进行菌落PCR验证，由于单交换过程中上游或下游同源序列均有可能发生单交换，因此使用两组引物XbaI-F、目的基因-VR/VF、SmaI-R进行验证，如图2B。
6)双交换验证
最终挑选成功单交换的单克隆在37℃下培养6-9代，经稀释涂布，挑单菌落进行菌落PCR验证(如图2B)，所使用引物为目的基因-VR/VF。
chiAB，PulA，AmyA，spo0A，sigF，eps，pgs，lchAC的基因敲除方法同上述sacB敲除的步骤，所用引物不同，其引物如序列表2。单双交换验证正确后的菌株分别命名为：菌株BLΔepsΔpgsΔchiABΔpulAΔamyAΔsigFΔlchACΔspo0A(敲除eps、pgs、chiAB、pulA、amyA、spo0A、sigF和lchAB基因)和菌株BLΔepsΔpgsΔchiABΔpulAΔamyAΔsigFΔlchACΔspo0AΔsacB(敲除eps、pgs、chiAB、pulA、amyA、spo0A、sigF、lchAB和sacB基因)。
实施例2：aprE基因双拷贝菌株的构建
1)扩增目的基因表达盒与待整合位点两侧同源序列
根据地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148基因组数据设计并通过PCR进行扩增获得待整合的目的基因aprE表达盒序列(SEQ ID NO.2)以及整合位点两端的同源臂序列UP端与DOWN端，分别以aprE-F、aprE-R、IL-F、IL-R和IR-F、IR-R三组引物(参见引物表2)，以2709即TCCC11148基因组为模板进行PCR扩增；扩增反应体系如下：
引物F 2μL
引物R 2μL
DNA模板 2μL
PrimerStar酶 25μL
ddH2O 19μL
扩增程序的设置为：预变性：95℃5min；变性：95℃30s；退火：55℃45s；延伸：72℃35s；反应33个循环；延伸：72℃，10min。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，整合位点up端和down端电泳条带大小在750bp至1000bp之间，aprE基因电泳条带大小在1500bp至2000bp之间，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，即目的基因片段和整合位点上下游同源臂片段。
2)整合载体的线性化
提取pQ-T2质粒，其提取过程参照试剂盒的操作手册。经XbaI和SmaI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，再由DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到了线性化载体序列。
双酶切体系如下：
混匀后，37℃水浴酶切2h，反应完成后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，4260bp，再由小量DNA回收试剂盒回收酶切产物：线性pQ-T2质粒。
3)载体的构建
将酶切获得的线性载体片段、目的基因片段和整合位点(位置I)上下游同源臂通过无缝克隆连接形成重组质粒。
无缝克隆酶反应体系如下：
无缝克隆酶 5μL
线性载体 2μL
up端片段 1μL
down端片段 1μL
AprE表达盒片段 1μL
4)整合载体的甲基化修饰以及电转化入地衣芽胞杆菌感受态细胞
将构建的整合载体通过化转转化入EC135.P.Bam.感受态细胞中，当培养液OD600值为0.2时，加入50mg/mL阿拉伯糖水溶液80μL进行甲基化诱导，于30℃摇床过夜培养。
通过使用电转仪将经甲基化修饰的整合载体电转入实施例1构建的菌株BLΔepsΔpgsΔchiABΔpulAΔamyAΔsigFΔlchACΔspo0A和菌株BLΔepsΔpgsΔchiABΔpulAΔamyAΔsigFΔlchACΔspo0AΔsacB以及原始菌株2709感受态细胞中，并使用整合载体验证引物XbaI-F、SmaI-R进行菌落PCR进行验证如图3所示。
5)单交换验证
挑选成功电转的单克隆在45℃下培养3-4代后，经稀释涂布，挑单菌落进行菌落PCR验证，由于单交换过程中上游或下游同源序列均有可能发生单交换，因此使用两组引物XbaI-F、I-VR1/VF1、SmaI-R进行验证。
6)双交换验证
最终挑选成功单交换的单克隆在37℃下培养6-9代，经稀释涂布，挑单菌落进行菌落PCR验证，所使用引物为IL-F、IR-R。双交换验证正确后的菌株分别命名为BL-aprE、BLΔsacB-aprE和BL2709-aprE。
实施例3：基因工程菌株生产碱性蛋白酶的用途
摇瓶发酵：将基因工程菌株BL-aprE、BLΔsacB-aprE和BL2709-aprE，在LB平板上进行三区划线，37℃倒置培养过夜，挑取活化的单菌落于5mL LB培养基中，37℃,220r/min振荡培养12h，以2％的接种量转接于50mL LB液体培养基至OD600达0.8-1.0，再以2％的接种量转接于100mL发酵培养基的挡板瓶中，37℃，220r/min振荡培养48-60h。根据实验需求定点取样，4℃，12000r/min离心2min，取发酵液上清液，适当稀释后按照国标法测定碱性蛋白酶活力。经48h摇瓶发酵，BLΔsacB-aprE发酵液酶活力高达20084±1492.8U/mL，BL-aprE发酵液酶活力16839.8±641U/mL，BL2709-aprE发酵液酶活力14002.6±666.2U/mL，BLΔsacB-aprE较BL-aprE酶活提升20％左右，较BL2709-aprE酶活提升了43％左右(图5)。
发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L，其余为水。
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

Claims (8)

1.一种地衣芽孢杆菌底盘基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株以地衣芽孢杆菌2709为宿主，对地衣芽孢杆菌2709基因组上的以下九个基因缺失表达：chiAB、PulA、AmyA、spo0A、sigF、eps、pgs、lchAC，以及sacB基因。
2.如权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌底盘基因工程菌株，其特征在于，所述eps基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第1967676-1983603位；
所述pgs基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第1805920-1808919位；
所述sigF基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第3898937-3899704位；
所述chiAB基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第909808-913767位；
所述pulA基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第2420607-2422739位；
所述amyA基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第582978-584516位；
所述lchAC基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第834378-849050位；
所述spo0A基因位于GenBank CP033218.1中的地衣芽孢杆菌2709即TCCC11148全基因组序列上第3985067-3985867位。
3.如权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌底盘基因工程菌株，其特征在于，sacB基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的一种地衣芽孢杆菌底盘基因工程菌株，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌底盘基因工程菌株对chiAB，PulA，AmyA，spo0A，sigF，eps，pgs，lchAC，以及sacB基因进行了敲除。
5.权利要求1-4任意一项所述地衣芽孢杆菌底盘基因工程菌株的应用。
6.一种生产碱性蛋白酶的基因工程菌，其特征在于，是在权利要求1所述底盘基因工程菌的基础上，表达碱性蛋白酶基因aprE获得。
7.如权利要求书6所述的一种生产碱性蛋白酶的基因工程菌，其特征在于，aprE基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
8.权利要求6所述生产碱性蛋白酶的基因工程菌的应用。
CN202211227373.3A 2022-10-09 2022-10-09 一种高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株及应用 Pending CN116445378A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211227373.3A CN116445378A (zh) 2022-10-09 2022-10-09 一种高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211227373.3A CN116445378A (zh) 2022-10-09 2022-10-09 一种高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116445378A true CN116445378A (zh) 2023-07-18

Family

ID=87130840

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211227373.3A Pending CN116445378A (zh) 2022-10-09 2022-10-09 一种高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116445378A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107400677B (zh) 一种基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体及其制备方法
CN112522173B (zh) 一种生产异源碱性蛋白酶的工程菌及其构建方法
CN110055204B (zh) 一种敲除spoⅡQ和pcf基因提高地衣芽孢杆菌发酵产酶的方法及应用
CN111926013B (zh) 适用于地衣芽胞杆菌的启动子及其在高效表达目的产物中的应用
CN104073458A (zh) 一株可高效表达外源分泌蛋白酶的枯草芽孢杆菌
WO2021143696A1 (zh) 调控里氏木霉蛋白表达效率的因子、调控方法及应用
CN111763676B (zh) 一种提高角蛋白酶异源表达酶活的启动子及其应用
CN113151270A (zh) 一种高效表达碱性蛋白酶的启动子及其应用
CN113913357B (zh) 一种生产碱性蛋白酶的底盘菌株及其构建方法与应用
CN114107146A (zh) 一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用
CN105505931B (zh) 一种强启动子及其在提高纳豆激酶表达的应用
CN112239742B (zh) 一株生产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌及其应用
CN114058606B (zh) 缺失xpt基因的地衣芽孢杆菌在异源蛋白生产中的应用
CN113881618B (zh) 一种分泌乳酪蛋白的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN116445378A (zh) 一种高产碱性蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株及应用
CN102575253A (zh) 经过修饰的启动子
CN107779465A (zh) 一种降低芽孢杆菌发酵液粘度的方法
CN110878293B (zh) 缺失yceD基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用
CN109868253B (zh) 抑制菌体自溶的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用
CN116042497B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌底盘菌株及其应用
CN116240153A (zh) 一种缺失羊毛硫肽基因簇的地衣芽孢杆菌及其应用
CN107475140B (zh) 一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体
CN102533841B (zh) 一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法
CN112239743B (zh) 一种地衣芽孢杆菌宿主细胞及其遗传改造方法与应用
CN117487735A (zh) 一种缺失yycI基因的底盘菌株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination