CN104073458A - 一株可高效表达外源分泌蛋白酶的枯草芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株可高效表达外源分泌蛋白酶的枯草芽孢杆菌。一个表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌，该表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌中两种外分泌蛋白酶---枯草杆菌碱性蛋白酶的基因apr和枯草芽孢杆菌中性金属蛋白酶的基因npr以及产孢子基因spoIIAC被敲除。所得到的枯草芽孢杆菌宿主菌能够应用于基因工程手段高产外源蛋白。在此基础上，本发明成功构建了一株分泌普鲁兰酶的基因工程菌，能够高产普鲁兰酶，经过发酵工业研究在工业化生产中具有广阔的发展前景。

Description

一株可高效表达外源分泌蛋白酶的枯草芽孢杆菌

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一株可高效表达外源分泌蛋白酶的枯草芽孢杆菌。 

背景技术

枯草芽孢杆菌在生物工程和酶制剂工业中是一种极其重要的出发菌种。如今，它的理化特性已知，基因改造方法也已比较成熟；另外它是美国FDA承认的非致病菌种，可广泛用于食品工业相关酶制剂的发酵生产。枯草芽孢杆菌的自然菌种具有较高的外分泌蛋白酶的浓度，大大限制了它在发酵工程中的应用，特别是一些对蛋白酶敏感的酶种。本发明利用基因工程的手段构建了一株外源分泌蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌，另外，为了适应大规模工业化发酵，调控产孢子基因sigF也被敲除。为了证明该方案的有效性，我们以该基因工程菌为母株构建了一株产普鲁兰酶的工程菌，并经发酵研究获得了酶的高效表达。 

普鲁兰酶（pullulan6-glucanohydrolases,EC3.2.1.41）是一类脱支酶，它可以特异的水解淀粉、支链淀粉中的α-1,6-糖苷键。淀粉必须先在淀粉酶的水解作用下切开α-1,4-糖苷键变成麦芽糊精，再在普鲁兰酶的作用下转化成葡萄糖或者麦芽糖。 

目前已经从植物和微生物中发现了很多产生糖化酶和支链淀粉酶的物种，在微生物领域已报道产生普鲁兰酶的菌种：包括肺炎克雷柏氏菌、芽孢杆菌、高温放线菌等。其中从嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(bacillus acidopulluticus)中得到的普鲁兰酶最具商业价值。这些分离的普鲁兰酶具有如下特征：耐低pH值；最佳酶活条件在65℃。这些特性与糖化生产工业中的标准糖化条件完美匹配。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一个表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌。 

本发明的另一目的是提供该枯草芽孢杆菌宿主菌的应用。 

本发明的又一目的是提供利用该枯草芽孢杆菌宿主菌构建的高产普鲁兰酶基因工程菌株。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一个表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌，该表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌中两种 外分泌蛋白酶---枯草杆菌碱性蛋白酶的基因aprE和枯草芽孢杆菌中性金属蛋白酶的基因nprE以及调控产孢子基因sigF被敲除。 

其中，所述的aprE基因敲除后aprE位点序列如SEQ ID NO.2所示。 

所述的nprE基因敲除后nprE位点序列如SEQ ID NO.3所示。 

所述的sigF基因敲除后sigF位点序列如SEQ ID NO.4所示。 

本发明所述的枯草芽孢杆菌宿主菌在通过基因工程手段表达外源蛋白中的应用。 

一株高产普鲁兰酶基因工程菌株，用普鲁兰酶基因表达框来代替所述的表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌基因组原有α‐淀粉酶基因amyE表达框。 

其中，所述的普鲁兰酶基因表达框： 

（1）该表达框架使用大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭质粒pYF‐tsDE，整个普鲁兰酶表达框利用重组技术环化被BglII线性化的pYF‐tsDE质粒，构建好的温敏型质粒命名为pYF‐tsINT‐puI；所述的pYF‐tsDE质粒，其构建方法：pUC57‐KS‐erm（质粒由Genscript公司提供）经由BglII酶切后，回收3.8kbp的片段再用T4连接酶(NEB公司提供)自连。这个自连而得到的3.8kbp的质粒命名为pYF‐tsDE。该质粒转入大肠杆菌TOP10增殖后作为下面所有的基因操作的骨架。 

（2）该表达框架具有来自于枯草芽孢杆菌（B.subtilis），地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）和解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）的三个串联重复天然启动子，见SEQ ID NO.5； 

（3）该表达框架含有合成核糖体结合位点序列，见SEQ ID NO.6； 

（4）该表达框架普鲁兰酶基因来源于嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(B.acidopulluticus)，见SEQ ID NO.1； 

（5）该表达框架含有合成的终止子序列，见SEQ ID NO.7； 

（6）该表达框架在普鲁兰酶编码基因的起始密码子上游插入了一个强自然信号肽序列，见SEQID NO.8； 

（7）在构建的工程菌中，该表达框架用普鲁兰酶基因表达框来代替原有淀粉酶基因表达框。 

所述的普鲁兰酶基因表达框中的普鲁兰酶基因来源于嗜酸普鲁兰芽胞杆菌，序列为SEQID NO.1。 

所述的高产普鲁兰酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于包含如下步骤： 

（1）敲除枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶aprE和中性金属蛋白酶nprE的两个外分泌蛋白酶以及调控产孢子基因sigF； 

（2）选定了几组控制普鲁兰酶表达必须的序列如SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8所示，将上述序列及普鲁兰酶基因序列如SEQ ID NO.1所示按照启动子，核糖结合位点，强自然信号肽序列，普鲁兰酶基因序列和合成终止子序列无缝串联得到普鲁兰酶基因表达框； 

（3）选定枯草芽孢杆菌中原有α‐淀粉酶基因amyE为新质粒的插入位点，将amyE基因上游同源片段（SEQ ID NO.10）和下游同源片段（SEQ ID NO.11）通过直接合成手段加到普鲁兰酶表达框两侧；将所得序列组装到线性化的pYF‐tsDE质粒，构建好的温敏型质粒命名为pYF‐tsINT‐puI； 

（4）将（3）中所得质粒用于转化至（1）中蛋白酶敲除、不产孢子的枯草芽孢杆菌中，用普鲁兰酶基因表达框来代替原有α‐淀粉酶基因amyE表达框； 

（5）通过红色普鲁兰平板观察透明消化圈确认是否成功构建了普鲁兰酶产生菌株； 

（6）PCR结果进一步表明表达框确实插入设定位点。 

有益效果： 

本发明提供了一个表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌，利用原产a‐淀粉酶的枯草芽孢杆菌（CICC20632，中国微生物菌种库购得）为原始菌种，敲除了枯草芽孢杆菌基因组中影响异种酶分泌的枯草杆菌碱性蛋白酶的基因aprE和枯草芽孢杆菌中性金属蛋白酶的基因nprE以及调控产孢子基因sigF，所得到的枯草芽孢杆菌宿主菌能够应用于基因工程手段高产外源蛋白。在此基础上，本发明成功构建了一株分泌普鲁兰酶的基因工程菌，能够高产普鲁兰酶，经过发酵工业研究在工业化生产中具有广阔的发展前景。 

附图说明

图1pYF‐tsDE质粒图谱。 

图2pUC57‐KS‐erm质粒图谱。 

图3敲除aprE，nprE及sigF的枯草杆菌细胞PCR鉴定结果。 

泳道1和2:BSΔ4用两边的引物扩增aprE敲除情况；泳道3:BSwt扩增AprE；泳道5和6：BSΔ4用两边的引物扩增sigF敲除情况；泳道7:BSwt扩增sigF；泳道9和10：BSΔ4用两边的引物扩增nprE敲除情况；泳道11:BSwt扩增nprE；泳道4、8、12：天根markerIII。 

具体实施方式

下面结合实例对本发明的构建过程做进一步阐释，下述说明中相关实例是说明性质的，不能限定本发明的保护范围。 

一株高产普鲁兰酶的基因工程菌，利用原产a‐淀粉酶的枯草芽孢杆菌（CICC20632，中国微生物菌种库购得）为原始菌种，构建新型高产菌株。在本发明中，枯草芽孢杆菌用于基因操作的受体菌株。目前，外源载体转化枯草杆菌菌株的技术已经很成熟，如感受态化学转化法，电转化法和原生质体转化法，都可以成功实现枯草杆菌的基因导入。本发明中，一个普鲁兰酶表达框被成功整合到枯草杆菌的基因组中，成功表达了普鲁兰酶。普鲁兰酶表达框主要包含以下几个部分：一个或多个天然启动子串联在一起，一个合成的核糖体结合位点，一个高效的信号肽序列，一个普鲁兰酶编码基因和一个合成的转录终止子。这样的设计大大提高了宿主菌的基因表达水平和普鲁兰酶分泌水平。将普鲁兰酶编码基因插入指定的枯草杆菌染色体位点可通过质粒介导的单交换同源重组来实现。枯草杆菌蛋白酶aprE和枯草芽孢杆菌中性金属蛋白酶nprE这2个主要的胞外蛋白酶的基因被预先删除，使普鲁兰酶基因得以高效地完全表达。 

实施例1．pYF‐tsDE质粒的构建 

pYF‐tsDE（图1）是发明人设计的大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭质粒。其构成主要包括在30℃有复制活性的热敏的复制起点和红霉素抗性基因。红霉素抗性浓度在大肠杆菌中为300ug/ml；在枯草杆菌中的浓度为5ug/ml。37℃时，质粒的复制起点无法复制从而使得质粒通过设计的位点融入宿主基因组中并通过红霉素抗性基因进行筛选。pYF‐tsDE质粒的构建描述如下： 

pUC57‐KS‐erm（质粒由Genscript公司构建）（图2，序列见SEQ ID NO.9）经由BglII酶切后，回收3.8kbp的片段再用T4连接酶(NEB公司提供)自连。这个自连而得到的3.8kbp的质粒命名为pYF‐tsDE。该质粒转入大肠杆菌TOP10增殖后作为下面所有的基因操作的骨架。 

实施例2．构建外源分泌蛋白酶及产孢子缺失的枯草芽孢杆菌菌株 

枯草杆菌本身的胞外蛋白酶活性对异种酶的分泌是不利的。已经证实的两种胞外蛋白酶：枯草杆菌碱性蛋白酶aprE和枯草杆菌中性金属蛋白酶nprE构成了枯草杆菌85%的胞外蛋白酶活性。此外，产生芽孢在发酵过程中能形成休眠细胞这将导致生产效率成倍的降低。sigF基因编码控制芽孢形成的sigma‐F因子，该因子在指导RNA聚合酶转录和表达产物在芽孢形成的专一性起关键作用。 

本发明里，以上3个基因的删除都是以顺序方向由单一交叉的坎贝尔类型机制通过同源插入目的基因中。具体操作如下： 

2.1pYF‐tsDE经由BglII酶切后用CIP处理来抑制自连； 

2.2基因敲除 

（1）为了能够获得每个基因缺失片段，以枯草杆菌基因组DNA为模板用PCR的方法从要缺失的基因两侧各扩增大约500bp的同源序列。枯草芽孢杆菌的单克隆经过98℃,5分钟预变性后可以作为基因组DNA模板直接在PCR反应中使用。 

用于PCR反应的引物是由Genscript公司合成的。引物序列如下： 

扩增apr基因上游序列的引物为： 

pksb‐apr‐czF1  GGTATCGATAAGCTTCCTGCAGATCTCTCAGGAGCATTTAACCT 

pksb‐apr‐R1  GCACCTACTGCAATAGTAAGGAACAGATTGCGCAT 

扩增apr基因下游序列的引物为： 

pksb‐apr‐F2  ATGCGCAATCTGTTCCTTACTATTGCAGTAGGTGC 

pksb‐apr‐czR2  AATATGGCGGCCGCGAATTCAGATCTCTAATGCTGTCTCGCGTT 

扩增npr基因上游序列的引物为： 

pksb‐npr‐czF1  GGTATCGATAAGCTTCCTGCAGATCTCATCTTCCCCTTGAT 

pksb‐npr‐R1  CAGTCTTCTGTATCGTTACGCTTTTAATTCGGCT 

扩增npr基因下游序列的引物为： 

pksb‐npr‐F2AGCCGAATTAAAAGCGTAACGATACAGAAGACTG 

pksb‐nprcz‐R2  TATGGCGGCCGCGAATTCAGATCTCCTGGCCAGGAGAATCT 

扩增sig基因上游序列的引物为： 

pksb‐sig‐czF1  GGTATCGATAAGCTTCCTGCAGGAACAATCTGAACAGCAGGCACTC 

pksb‐sig‐R1  TTGTCAAACCATTTTTCTTCGCCCGATGCAGCCGATCTG 

扩增sig基因下游序列的引物为： 

pksb‐sig‐F2  CAGATCGGCTGCATCGGGCGAAGAAAAATGGTTTGACAA 

pksb‐sig‐czR2  ATATGGCGGCCGCGAATTCAGATCTGTTCATGATGGCAAGACAC 

PCR扩增体系为50ul，反应程序如下： 

（1）枯草芽孢杆菌B.subtilis168单克隆预变性98℃，8分钟； 

（2）96℃，15秒； 

（3）58℃，15秒； 

（4）72℃，30秒；重复2‐4步骤25‐30次； 

（5）终延伸72℃，2分钟。 

PCR产物用0.8%琼脂糖胶电泳检测后用爱思进试剂盒纯化。 

2.3重叠PCR方法扩增内部大约400‐500bp序列缺失的目的基因 

基因内部缺失片段是用重叠PCR方法（overlap extension PCR，SOE）获得的，具体操作如下： 

（1）分别回收2.2中各基因上游、下游PCR片段并纯化； 

（2）以各目的基因的上、下游同源序列片段1:1摩尔比混合后作为模板，用引物XX‐CZ‐F1和XX‐CZ‐R2（“XX”代表apr、npr或sig）PCR扩增获得内部缺失片段的aprE基因、nprE基因或sigF基因。 

上述片段随后用Clone‐EZ克隆试剂盒（Genscript公司提供）重组进经过BglII线性化的pYF‐tsDE载体中，获得的重组质粒分别命名为：pYF‐tsDE‐Apr,pYF‐tsDE‐Npr,pYF‐tsDE‐SpoII。这些重组质粒为温敏型质粒，其中包含的apr基因、npr基因或spo基因相对于完整基因来说缺失了内部大约400‐500bp的序列。 

不同等位基因的替换可通过同源重组来实现。方法参见CN102124112A，也可使用本领域的其他公知的同源重组的方法。 

2.4质粒转化 

本实验采用将敲除质粒转化到枯草杆菌感受态细胞中方法及筛选过程如下： 

（1）将温敏型质粒pYF‐tsDE‐Apr,pYF‐tsDE‐Npr,pYF‐tsDE‐Sig转化枯草杆菌（CICC20632）感受态细胞； 

（2）在30℃的条件下，在LB（每升含蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g）培养基上用红霉素（5ug/ml）抗性来筛选阳性克隆菌株； 

（2）再将阳性克隆菌株转移到37℃的条件下培养，使该温敏质粒能够融合到宿主基因组上。为了使基因在设定的位点发生替换，挑选几个克隆同时接种于2×YT培养基中连续培养24小时后重新继代一次，整个过程继代4‐5次（一般需要5‐7天）。 

（3）筛选红霉素敏感的枯草杆菌细胞进行PCR鉴定.可同时用1%的脱脂牛奶LB平板观察透明水解圈，敲除后的菌种应显示显著缩小的水解圈。 

鉴定所用PCR引物： 

aprE：00131‐seqF1/00131‐seqR3 

sigF：00309‐seqF1/00309‐seqR3 

nprE：00327‐seqF1/00327‐seqR3 

00131‐SeqF1：TTGCTTGGCGAATGTTCATC 

00131‐SeqR3：GCGCTGAATGCCTATGTTAC 

00309‐seqF1：TCGTGCTGAACTTGGAGGAC 

00309‐seqR3：GCATGGCCACATATTGATCG 

00327‐SeqF1：CGCCAGAACAACAATTGACC 

00327‐SeqR3：GAGACGTTAAGCTGGACTCA 

PCR鉴定结果见图3。由图3可知最后获得的枯草芽孢杆菌阳性克隆中aprE、nprE及sigF基因已被敲除。基因敲除后，aprE，sigF及nprE位点序列依次见SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。 

实施例3．普鲁兰酶产生菌株构建 

3.1普鲁兰酶表达框架构建 

一个典型的普鲁兰酶表达框有以下几个部分构成： 

（1）两至三个串联天然启动子（可选用来自枯草芽孢杆菌（B.subtilis），地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）天然启动子）；序列为SEQ ID NO.5； 

（2）合成的核糖体结合位点序列，见SEQ ID NO.6； 

（3）该表达框架在普鲁兰酶编码基因的起始密码子上游插入了一个强自然信号肽序列，见SEQ ID NO.8； 

（4）该表达框架普鲁兰酶基因来源于嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(B.acidopulluticus)，见SEQ IDNO.1； 

（5）该表达框架含有合成的终止序列，见SEQ ID NO.7； 

上述序列的合成由Genscript公司来完成，将上述序列依次无缝串联得到普鲁兰酶表达框。本框架中信号肽序列是从枯草芽孢杆菌中筛选出的，能够有效的提高酶的分泌。 

选定α‐淀粉酶基因amyE为新质粒的插入位点，将amyE基因上下游同源片段（SEQ IDNO.10&SEQ ID NO.11）分别通过基因合成的手段加到普鲁兰酶表达框两侧。上述序列的合成和质粒构建都是由Genscript公司来完成的。 

3.2质粒转化 

将上述整个普鲁兰酶表达框（包含amyE基因上下游同源片段）利用重组技术环化BglII线性化的pYF‐tsDE质粒（重组试剂盒由Genscript公司提供），构建好的温敏型质粒命名为pYF‐tsINT‐puI。该质粒用于转化至蛋白酶基因敲除、不产孢子的枯草芽孢杆菌中，用普鲁兰酶基因表达框来代替原有淀粉酶基因表达框。 

3.3红色普鲁兰平板确认 

工程菌划线递传两代，通过红色普鲁兰平板(1%蛋白胨，0.1%氯化氨，0.1%Sigma普鲁兰,2%琼脂粉)观察透明消化圈确认是否成功构建了普鲁兰酶产生菌株。 

3.4PCR验证 

挑取经红色普鲁兰确认的阳性克隆，经PCR及测序验证，鉴定所用PCR上游引物是由插入位点的基因组上游固有序列和表达框内部序列组成，鉴定所用PCR下游引物是由表达框内部序列和插入位点的基因组下游固有序列组成，引物序列如下： 

0531‐SeqF1 GAAGCTGGCTTACAGAAGAG 

0531‐SeqR1 CCGGTCGCTACCATTACCAG 

0531‐SeqF2 CGCAAGTGTACAGGCAGGTG 

0531‐SeqR2 CCTTCCAGGGTATGTTTCTCTT 

由0531‐SeqF1/0531‐SeqR1扩增后测序结果如SEQ ID NO.12所示，由0531‐SeqF2/0531‐SeqR2扩增后测序结果如SEQ ID NO.13所示，PCR结果进一步表明表达框确实插入设定位点。 

实施例4、高产普鲁兰酶的发酵工艺 

1.选用高产实施例3构建成功的普鲁兰酶的枯草杆菌工程菌001BS‐Ⅲ‐C‐10为试验株。对照菌种为以pYF‐tsINT‐puI转化的野生菌种为出发菌株，该菌种只含普鲁兰酶表达框，枯草杆菌碱性蛋白酶的基因aprE和枯草芽孢杆菌中性金属蛋白酶的基因nprE以及调控产孢子基因sigF，未被敲除。 

2.培养基组份（g/L） 

A.斜面培养基： 

胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉20，自然pH，37℃培养8小时 

B.种子培养基（g/L） 

麦芽糖浆40.0，蛋白胨20.0，酵母粉1.0，磷酸二氢钾6.0，37℃，220rpm培养16小时 

C.发酵培养基（g/L） 

麦芽糖浆60.0，蛋白胨10.0，酵母粉10.0，磷酸二氢钾2.0，自然pH 

D.补料培养基（g/L） 

麦芽糖浆480.0，蛋白胨60.0，酵母粉80.0 

3.工艺 

A.选用10升自控发酵罐，初始装液量为5升，接种量2.5%（v/v）初始搅拌转速为300rpm，通风量为1:0.5，在培养过程中，调节转速与通风量，使溶氧不小于30%，直至发酵结束。 

B.从4h开始补料，直至发酵结束。 

C.工程菌001BS‐Ⅲ‐C‐10生产与产酶情况（表1） 

表1生长与产酶 

D．对照菌种的生产与产酶情况 

普鲁兰酶活力的测定 

1.酶反应体系 

1ml稀释后的发酵液，1ml溶于pH4.5乙酸‐乙酸钠缓冲液中的0.5%普鲁兰糖溶液，60℃反应30min，生成还原糖采用3,5‐二硝基水杨酸法测定。 

2.普鲁兰酶活测定 

在上述条件下，每分钟产生相当于1umol葡萄糖还原力的酶活为一个酶活单位。 

3试剂和溶液 

3.1乙酸‐乙酸钠缓冲液 

准确称取无水乙酸钠4.92g溶于水中，加冰乙酸4.0ml，用蒸馏水溶解并定容至1000ml，配好后用pH计校正至4.5。 

3.2DNS试剂 

准确称取3,5‐二硝基水杨酸6.3g放于盛有500ml蒸馏水的烧杯中，加氢氧化钠21g加热至50℃全溶，称取酒石酸钾钠182g放于300ml水中，加热溶解倒入前溶液中，加重蒸苯酚5g，加无水亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后定荣至1000ml，过滤，贮存于棕色瓶中放置7天后使用。 

3.30.5%普鲁兰糖溶液 

准确称取普鲁兰多糖0.5g，用pH4.5的缓冲液溶解定容至100ml（低温保存可用三天）。4葡萄糖标准曲线的绘制 

分别吸取0.1%标准葡萄糖液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4ml，依次加入到刻度试管中，用蒸馏水补加至2.0ml。配制成每毫升分别含有葡萄糖100，200，300，400，500，600，700ug的标准液。各加入DNS试剂3ml，于沸水中沸腾10min（样品放入重新沸腾时算起），取出后立即加入蒸馏水10ml，混匀，冷却后，在分光光度计550nm比色测定，用空白管液体调零点，记录光密度值，以光密度为纵坐标，以对应的标准葡萄糖为横坐标，绘制标准曲线。 

空白的制作：以0.5ml蒸馏水代替0.5ml标准葡萄糖液。 

5.测定步骤 

1ml适当稀释后的发酵液加1ml0.5%普鲁兰糖溶液于试管中，60℃反应30min，立即加入DNS试剂3ml，在沸水中煮沸7min，冷却后加蒸馏水10ml混匀，以煮沸7min的灭活酶液加 1ml0.5%的普鲁兰糖反应30min做对照，按标准曲线时同样的操作测定光密度值（OD₅₅₀）。6酶活力的计算 

酶活（u/ml）=OD/(K*30*180)*n*2 

式中： 

OD‐‐‐样品与空白光密度值之差 

180—葡萄糖的分子量 

30‐‐‐‐反应时间 

K‐‐‐‐曲线斜率 

n‐‐‐‐‐稀释倍数 

2‐‐‐‐反应体积。 

Claims (10)

1.一个表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌，其特征在于该表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌中两种外分泌蛋白酶---枯草杆菌碱性蛋白酶的基因aprE和枯草芽孢杆菌中性金属蛋白酶的基因nprE以及调控孢子形成的sigma-F因子基因sigF被敲除。 

2.根据权利要求1所述的表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌，其特征在于所述的aprE基因敲除后aprE位点序列如SEQ ID NO.2所示。 

3.根据权利要求1所述的表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌，其特征在于所述的nprE基因敲除后nprE位点序列如SEQ ID NO.3所示。 

4.根据权利要求1所述的表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌，其特征在于所述的sigF基因敲除后sigF位点序列如SEQ ID NO.4所示。 

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌宿主菌在通过基因工程手段表达外源蛋白中的应用。 

6.一株高产普鲁兰酶基因工程菌株，其特征在于用普鲁兰酶基因表达框来代替权利要求1所述的表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌基因组原有α‐淀粉酶基因amyE表达框。 

7.根据权利要求6所述的高产普鲁兰酶基因工程菌株，其特征在于所述的普鲁兰酶基因表达框： 

（1）该表达框架具有来自于枯草芽孢杆菌（B.subtilis），地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）的三个串联重复天然启动子，序列如SEQ ID NO.5所示； 

（2）该表达框架含有合成核糖体结合位点序列如SEQ ID NO.6所示； 

（3）该表达框架普鲁兰酶基因来源于嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(B.acidopulluticus)，序列如SEQ IDNO.1所示； 

（4）该表达框架含有合成的终止子序列如SEQ ID NO.7所示； 

（5）该表达框架在普鲁兰酶编码基因的起始密码子上游插入了一个强自然信号序列如SEQ IDNO.8所示。 

8.根据权利要求7所述的高产普鲁兰酶基因工程菌株，其特征在于所述的来自于枯草芽孢杆菌（B.subtilis），地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）的三个串联重复天然启动子、核糖体结合位点、强自然信号序列、普鲁兰酶基因、终止子依次无缝串联得到普鲁兰酶基因表达框。 

9.根据权利要求7所述的高产普鲁兰酶基因工程菌株，其特征在于将SEQ ID NO.10所示的amyE基因上游同源片段和SEQ ID NO.11所示的下游同源片段分别加到普鲁兰酶表达框两侧；所得序列利用重组技术环化被BglII线性化的pYF‐tsDE质粒，得质粒pYF‐tsINT‐puI；将质粒 pYF‐tsINT‐puI转化至权利要求1所述的表达外源蛋白的枯草芽孢杆菌宿主菌中，得高产普鲁兰酶基因工程菌株。 

10.权利要求6所述的高产普鲁兰酶基因工程菌株的构建方法，其特征在于包含如下步骤： 

（1）敲除枯草芽孢杆菌中碱性蛋白酶aprE和中性金属蛋白酶nprE的两个外分泌蛋白酶基因以及调控产孢子基因sigF； 

（2）获得普鲁兰酶表达框：由启动子、核糖体结合位点、强自然信号序列、普鲁兰酶基因、终止子依次无缝串联得到；优选由SEQ ID NO.5所示的来自于枯草芽孢杆菌（B.subtilis），地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）的三个串联重复天然启动子、SEQ ID NO.6所示的核糖体结合位点、SEQ ID NO.7所示的强自然信号序列、SEQ ID NO.1所示的普鲁兰酶基因以及SEQ ID NO.8所示的终止子依次无缝串联得到。 

（3）选定枯草芽孢杆菌中原有α‐淀粉酶基因amyE为新质粒的插入位点，将SEQ ID NO.10所示的amyE基因上游同源片段和SEQ ID NO.11所示的下游同源片段分别加到普鲁兰酶表达框两侧；所得序列利用重组技术环化被BglII线性化的pYF‐tsDE质粒，得质粒pYF‐tsINT‐puI； 

（4）将（3）中所得质粒用于转化至（1）中蛋白酶敲除、不产孢子的枯草芽孢杆菌中，用普鲁兰酶基因表达框来代替原有α‐淀粉酶基因amyE表达框； 

（5）通过红色普鲁兰平板观察透明消化圈确认是否成功构建了普鲁兰酶产生菌株； 

（6）PCR结果进一步表明表达框确实插入设定位点。