JP2001523649A - Ｒｐｏｓ正の表現型を有する免疫原性弱毒ウイルスを含む組換えワクチン - Google Patents

Ｒｐｏｓ正の表現型を有する免疫原性弱毒ウイルスを含む組換えワクチン

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Abstract

(57)【要約】 Rpos＋表現型を有する弱毒免疫原性バクテリア、特に、Rpos＋表現型サルモネラエンテリカ血清型Typhiと、その調製方法を開示する。Rpos‐表現型に加えて、サルモネラには、微生物を弱毒化させる一つ以上の遺伝子における不活性化突然変異と、所望のタンパク質を発現させる組換え遺伝子とがある。サルモネラは弱毒化され、高い免疫原性を有するのでワクチンに、及び遺伝子及び遺伝子生産物のデリバリービークルとして利用可能である。さらに、ワクチンデリバリービークルの調製方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 発明の分野 本発明は、弱毒化された微生物に係り、より詳細には、ワクチン及び遺伝子及
び遺伝子生産物のデリバリービークルとして使用されるＲｐｏＳ＋表現型を有す
る新規な弱毒化バクテリアと、それらの調製方法に関する。本発明は、特に、サ
ルモネラエンテリカ（salmonella enterica）血清型Typhi（腸チフス菌（Salmon
ella typhi）という）のようなサルモネラ菌に利用可能である。 関連技術の説明 生存する弱毒化サルモネラ菌株は、組換え抗原又は他のタンパク質のデリバリ
ービークルとして働く。抗原キャリアとして、組換えサルモネラは生きたワクチ
ンに有用であることが示されている（Curtissらによる、Essentials of Musocal
Immunology, KagnoffとKiyono編集., Academic Press、サンディエゴ、1996, p
p. 599-611; DoggettとBrown, Mucosal Vaccines, Kiyonoらによる編集., Acade
mic Press, サンディエゴ, 1996 pp. 105-118を概観にために参照；Hoplinsらに
よるInfect Immun. 63: 3279-3286, 1995; SrinavasinらによるVaccines 95, R.
N. Chanockらにより編集Cold Spring Harbor Laboratory Press, Painview, NY
, p 273-280, 1995）。
【０００２】 理想的には、生存する弱毒化ワクチン菌株は、弱毒化（attenuation）と免疫 原性の二つの性質の間にバランスを有している。かかるワクチン菌株は疾患を引
き起こさず、正常な宿主生理学又は成長を損傷させ、弱毒化させて、同時に、経
口投与の際に腸管及び消化管に関連するリンパ系組織に、又は他の数多の経路に
より投与した際に他のリンパ系器官にコロニーを形成させ、免疫原性を有する。
しかしながら、実際問題として、かかる理想的なバランスは達成されていない（
Curtiss, New Generation Vaccines Woodrow and Levine, Eds., Marcel Dekker
, Inc., New York, 1990, pp. 161-188）。これは、高い免疫原性のある菌株を 産出するよりも菌株の弱毒化成分を改善させるサルモネラワクチン成長における
効果に、ほとんど専ら集中する結果である。
【０００３】 ワクチンに利用される微生物における弱毒化を達成させることに向けた研究は
、生合成遺伝子、調節遺伝子及び/又はビルレンスに関係する遺伝子における突 然変異を弱毒化させるように利用される（DoggettとBrownによる上記文献）。弱
毒化を達成させるための手段として突然変異させたかかる一つの調節遺伝子は、
rpoSを有していた。rpoS遺伝子は、３０遺伝子以上の定常期発現を調節すること
で公知である別のσ因子をコード化する（LowenとHengge-Aronis, Annu Rev Mic
robiol 48: 53-80, 1994を概観にために参照）。rpoS遺伝子は、染色体だけでな
くプラスミド‐ボーン（plasmid-borne）遺伝子（Fangらによる., Proc Natl Ac
ad Sci 89: 11978-11982, 1992; NorelらによるFEBS Microbiol Lett 99: 271-2
76, 1992; Kowarzらによる., J Bacteriol 176: 6852-6860, 1994）のRpoS調節 により、マウスにてサルモネラエンテリア血清型チフィムリウム（Typhimurium ）（ネズミチフス菌ともいわれる）のビルレンスに寄与することが示された。同
様に、Rposは、微生物がサルモネラチフィムリウムに存在するビルレンスプラス
ミドを有しない限り、ビルレンスの染色体遺伝子決定因子に作用にすることによ
り、ヒトにて腸チフス菌のビルレンスに寄与すると考えられている（Robbe-Saul
eらによる.,FEMS Microbiol Let 126: 171-176, 1995; Coynaultらによる., Mol
Microbiol 22: 149-160, 1996）。突然変異rposネズミチフス菌株は弱毒化され
、マウスにて防御免疫を誘導させることが可能である（NickersonとCurtiss, Ab
srtracts of the 96th General Meeting of the American Society for Microbi
ology B-141:179, 1996; Coynaultらによる., Mol Microbiol 22: 149-160, 199
6）。結果として、rpos突然変異体は、ワクチンの開発の有力の候補であると提 案されている（NickersonとCurtissの上記文献）。
【０００４】 腸チフス菌の弱毒化された菌株は、組換え抗原デリバリービークルとして利用
した際に、腸チフス熱だけでなく異種抗原に対して、ヒトワクチンとして利用さ
れる（Forrest, in CRC Press Inc., 1994, pp. 59-80; Levineらによるin New
Generation Vaccines WoodrowとLevine編集., Marcel Dekker, Inc., New york,
1990, pp. 267-287）。Typhi菌株を基礎とする上記ワクチンは、Ty2菌株、特に
、他の突然変異に沿ったga1E突然変異を含むTy２１aから、専ら誘導された。Ty ２及びTy２１a誘導ワクチン菌株は、rpoS突然変異体であることが示され、この 突然変異体は、少なくともある部分、Ty21aで、及びrpoS遺伝子生産物により制 御された染色体ビルレンス遺伝子のダウンレギュレーションによるTy2から誘導 されたと思われる他のワクチン菌株で観測された弱毒化を説明する。Ty21aワク チンは、弱毒化されているが、Ty21aワクチンが低ワクチン効力を有していると 判明した点で、Ty2から誘導されたワクチンの典型であり、約１０１０cfuの３回
の高い投与量を必要とし、約３分の２のワクチン接種された個体にて防御免疫を
誘発させた（Forrestの上記文献）。よって、低ビルレンスだけでなく宿主への 所望の遺伝子生産物のデリバリーに適するワクチンに利用される高免疫原性をも
示す腸チフス菌株に対する継続した必要性が存在している。
【０００５】 腸チフスの他の菌株は報告されているが、機能性rpoS遺伝子を有しているが、
これは報告のときには理解されていなかった。例えば、ヒトワクチンは２７V及 びISP1820菌株に基づいて報告された（Reitman, J Infect Dis 117: 101- 107,
1967; Levineらによる., J Infect Dis 133: 424-429,1976; Tacketらによる.,
Infect Immun 60: 536-541, 1992）。上記菌株は組換え遺伝子を含有しておらず
、さらにワクチン組成物の組換え遺伝子を運ぶように利用されてもいなかった。
【０００６】 組換えrpoS+腸チフス菌の報告の中で、Coynaultらは、微生物にRpoS＋表現型 を付与する組換えrpoS遺伝子を含むTy２誘導体の構築を開示した。しかしながら
、このTy2誘導体は研究室用の研究にのみ利用され、さらなる組換え遺伝子は導 入されず、ワクチン組成物に上記誘導体の使用を教示するものではなかった。最
後に、腸チフス菌株ISP1820及びISP1822（米国特許第５，３８７，７４４号及び
５，２９４，４４１号とPCT出願第WO/９４２４２９１号）及び腸チフス菌株５３
１Ty（米国特許第４，８３７，１５１号）は、誘導ワクチン菌株を構築するため
に利用された。本願にて報告する研究により、ISP1820、ISP1882および531TyはR
poS＋であることが判明し、このことは上記刊行物が公知になった時点では知ら れていなかった。さらに、上記参考文献では、ワクチン調製にて高い免疫原性を
達成させる際に機能性rpoS遺伝子の存在の重要性を全く認識していなかった。結
果として、上記参考文献は、RpoS＋表現型の存在に基づくワクチン菌株の選択を
開示していなかった。
【０００７】 本明細書の上記及び下記に引用する全参考文献は、本願の参考文献として編入
される。本願の参考文献の開示は、上記文献の著者らによる主張を要約すること
を意図したものであり、特許適格性に重要である引用文献若しくは何れかの文献
の正確さ又は関連性に関して、承認するものではない。 本発明の要約 本発明によれば、本願の発明者らは、機能性rpoS遺伝子及びRpoS＋表現型の存
在により高い免疫原性の性質をサルモネラに付与するという点で、サルモネラワ
クチン菌株の機能性rpoS遺伝子のかなりの重要性を発見することに成功した。結
果として、RpoS＋表現型が、rpoS遺伝子の突然変異以外の一つ以上の不活性突然
変異とともに存在するときに、微生物を弱毒化させ、弱毒化と高免疫原性の新し
く、かつ、効果的なバランスが達成される。本発明は、特に、腸チフスを基礎と
するワクチンに利用可能であるが、パラチフス菌A、B及びCのような他のサルモ ネラだけでなく、チフィムリウム（Typhimurium）、エンテリチディス（Enterit
idis）、デュブリン（Dublin）及びコレラエスイス（Choleraesuis）のようなサ
ルモネラエンテリカ(Salmonella enterica) の他の血清型にも利用可能である。
さらに、本発明はrpoS遺伝子若しくはその機能的均等物を有する他のバクテリア
にも利用可能であり、そのrpoS遺伝子若しくはその機能的均等物は、赤痢菌、大
腸菌、並びにサルモネラ‐赤痢菌ハイブリッド、サルモネラ‐大腸菌ハイブリッ
ド又は赤痢菌‐大腸菌ハイブリッドのようなかかるバクテリア間のハイブリッド
を含み、ヒト組織にコロニーを形成させることが可能である。
【０００８】 本発明の一つの実施例では、ヒトへ所望の遺伝子生産物をデリバリーする方法
を提供する。その方法は、（ｉ）RpoS＋表現型、（ｉｉ）菌株を弱毒化させる一
つ以上の不活性突然変異、及び（ｉｉｉ）遺伝子生産物をコード化する組換え遺
伝子を有する菌株に基づいて、腸チフス菌のようなバクテリアの菌株を選択する
ことからなる。RpoS＋表現型に関する選択段階には、全体として又は一部に、そ
のRpoS＋表現型を決定する菌株をテストすることが含まれる。よって、その選択
された菌株が、次にヒトに投与される。菌株を弱毒化させる一つ以上の不活性突
然変異には、一つの遺伝子における突然変異若しくは二つ以上の遺伝子の夫々で
の突然変異を含む。
【０００９】 サルモネラ若しくは他のバクテリアのRpoS＋表現型活性度は、染色体rpoS遺伝
子により、及び/又は菌株に導入された組換え遺伝子により生じる。したがって 、別の実施例では、その方法は、（ａ）RpoS＋表現型、（ｂ）組換えrpoS＋遺伝
子、（ｃ）前記微生物を弱毒化させる一つ以上の不活性突然変異と、（ｄ）所望
の生成物をコード化する第二の組換え遺伝子とを有する生存する弱毒菌株をヒト
に投与することからなる。組換えrpoS＋遺伝子又は野生型rpoS遺伝子とは、機能
性rpoS遺伝子生産物を産出することが可能であるrpoS遺伝子のことを意味する。
【００１０】 本発明の弱毒微生物には、所望の遺伝子生産物を発現可能であり、ヒトへのそ
の遺伝子生産物のキャリア若しくはデリバリービークルとして利用可能である少
なくとも一つの組換え遺伝子が含まれる。本発明の微生物により運搬可能な遺伝
子生産物の例には、以下のものに限定されないが、ヒト病原体からの、又はヒト
自身からの自己免疫応用に利用される抗原があり、例えば、生殖体‐特異抗原、
多糖類、リポタンパク質、糖タンパク質及び糖脂質のような抗原を合成する酵素
、ヒトのアレルゲン、免疫抑制分子、及び薬理学的活性なポリペプチドがある。
所望の遺伝子生産物のデリバリーとは、遺伝子生産物もしくはその生成物をコー
ド化するポリヌクレオチドの何れかがヒトに運ばれることを意味する。弱毒化さ
れたバクテリアが組換えrpoS遺伝子を含む実施例では、所望の遺伝子生産物は第
二の組換え遺伝子によりコード化される。
【００１１】 別の実施例では、本発明はヒトへ所望の遺伝子生産物のデリバリー用のキャリ
ア微生物の菌株を産出する方法を提供する。その方法は、（１）腸チフス菌の菌
株又はRpoS＋表現型を有する他のバクテリアに対して選択し、（２）菌株を弱毒
化させるようにRpoS＋菌株における一つ以上の不活性突然変異を生じさせ、（３
）菌株に所望の遺伝子生産物のコード化する組換え遺伝子を導入することからな
る。全体として若しくは一部に、選択段階には、RpoS表現型を決定するように菌
株をテストすることが含まれる。段階（１）から（３）は何れかの順序で実行さ
れる。
【００１２】 更なる実施例では、本発明はヒトへ所望の遺伝子生産物をデリバリーさせるた
めのキャリア微生物を作出するための別の方法を提供する。その方法は、（ａ）
RpoS＋表現型と、（ｂ）組換えrpoS＋遺伝子と、（ｃ）微生物を弱毒化させる一
つ以上の突然変異と、（ｄ）所望の生成物をコード化する第二の組換え遺伝子と
を有する腸チフス又は他のバクテリアの生存する弱毒化された菌株を発生させる
ことからなる。
【００１３】 本発明の他の実施例は、ヒトへの所望の遺伝子生産物のデリバリーのためのキ
ャリア微生物を提供する。その微生物は、（ａ）RpoS＋表現型と、（ｂ）組換え
rpoS＋遺伝子と、（ｃ）前記微生物を弱毒化させる一つ以上の不活性突然変異と
、（ｄ）所望の生成物をコード化する第二の組換え遺伝子とを有する腸チフス又
は他のバクテリアの生存する弱毒化された菌株を含む。
【００１４】 別の実施例では、ヒトの免疫のためにワクチンが提供される、そのワクチンは
、（ａ）RpoS＋表現型と、（ｂ）組換えrpoS＋遺伝子と、（ｃ）前記微生物を弱
毒化させる一つ以上の不活性突然変異と、（ｄ）所望の生成物をコード化する第
二の組換え遺伝子とを有する腸チフス又は他のバクテリアの生存する弱毒化され
た菌株を含む。
【００１５】 さらに、本発明は、別の実施例にて、遺伝学工学的に操作された細胞を提供す
る。その細胞は、（ａ）RpoS＋表現型と、（ｂ）組換えrpoS＋遺伝子と、（ｃ）
前記微生物を弱毒化させる一つ以上の不活性突然変異と、（ｄ）所望の生成物を
コード化する第二の組換え遺伝子とを有する腸チフス又は他のバクテリアの生存
する弱毒化された菌株を含む。さらに、遺伝子工学的に操作された細胞とヒトへ
の投与に適する薬理学的に許容な配合で混合させることからなるワクチンの調製
方法をも提供する。
【００１６】 さらに、本発明は、遺伝子工学的に操作されたバクテリア、特に、野生型バク
テリアにおいて、RpoS若しくはその機能性均等物により調節された組換えビルレ
ンス遺伝子を含有する腸チフスと、ヒトへ所望の遺伝子生産物のデリバリー用の
遺伝子工学的に操作されたバクテリアを利用する方法をも提供する。組換えビル
レンス遺伝子は、消化間に関連するリンパ系組織（GALT）、鼻に関連したリンパ
系組織（NALT）若しくは気管支に関連したリンパ系組織（BALT）などの何れかに
侵襲とコロニー形成を容易にする遺伝子生産物を発現させることができる。遺伝
子工学的に操作された腸チフス菌又は他のバクテリアは、微生物を弱毒化させる
一つ以上の不活性突然変異だけでなく、所望の生成物をコード化する第二の組換
え遺伝子をも有することを、さらに特徴とする。
【００１７】 さらに別の実施例では、本発明はバクテリア菌株と，特にサルモネラの免疫原
生の指標として、RpoS表現型を評価する方法を提供する。研究室条件下で増殖さ
せ、維持された多くのバクテリア菌株は、rpoS突然変異を蓄積すると考えられる
。したがって、特にワクチンに利用するために開発しようとする菌株にとって、
サルモネラ若しくは他のバクテリアのRpoS表現型を評価する方法には有用である
。その方法は、RpoSにより調節された微生物の特性を評価することにより、バク
テリアのRpoS表現型を決定することを含む。増加免疫原性は、RpoS−表現型を有
する同系遺伝子系統の免疫原性と比較して、RpoS＋表現型の有無によりわかる。
同系遺伝子系統であるRpoS−菌株はRpoS＋表現型を示さないが、テスト菌株とし
ては、遺伝子的には同じバックグランドを有する。
【００１８】 上述したように、所望の遺伝子生産物をコード化するポリヌクレオチドをヒト
へデリバリーすることは、本発明の方法及び組成物の範囲内にある。さらに、Rp
oS＋表現型を有する微生物に基づく前記方法及び組成物に関係する実施例の夫々
は、遺伝子及びその部分のヒトの細胞へのデリバリーのための方法及び組成物を
含むものと理解される。遺伝子及びその部分は、ヒトの細胞へのデリバリーを意
図しているDNA又はRNAのいずれかの遺伝子情報を含む真核発現カセットを含む。
【００１９】 よって、本発明の一つの実施例では、ヒトの細胞に遺伝子又はその部分をデリ
バリーさせる方法を提供する。かかる一つの方法は、（ｉ）RpoS＋表現型と、（
ｉｉ）菌株を弱毒化させる一つ以上の突然変異と、（ｉｉｉ）遺伝子若しくはそ
の部分とを有する菌株に基づく腸チフス菌のようなバクテリアの菌株を選択する
ことを含む。遺伝子若しくはその部分は真核発現カセットの範囲内である。RpoS ＋ 表現型に関する選択段階は、全体として又は一部に、RpoS表現型を決定するよ
うに菌株をテストすることが含まれる。さらに、その方法は、ヒトの細胞へ、（
ａ）RpoS＋表現型，（ｂ）組換えrpoS+遺伝子と、（ｃ）前記微生物を弱毒化さ せる一つ以上の不活性突然変異と、（ｄ）遺伝子又はその部分とを有するバクテ
リアの生存する弱毒化された菌株をデリバリーすることを含む。遺伝子若しくは
その部分は真核発現カセットの範囲内である。
【００２０】 さらに、本発明は、所望の遺伝子若しくはその部分をヒトの細胞にデリバリー
させるキャリア微生物の菌株を作出する方法を提供する。かかる一つの方法は、
（１）RpoS＋表現型を有する腸チフス菌若しくは他のバクテリアの菌株を選択し
、（２）菌株を弱毒化させるようにRpoS＋菌株での一つ以上の不活性突然変異を
生じさせ、（３）遺伝子若しくはその部分を菌株に導入させることからなる。遺
伝子若しくはその部分は真核発現カセットの範囲内である。全体として若しくは
一部に、選択段階には、RpoS表現型を決定するように菌株をテストすること含ま
れ、その段階はいずれかの順序で実行される。さらにその方法は、（ａ）RpoS＋ 表現型と、（ｂ）組換えrpoS+遺伝子と、（ｃ）微生物を弱毒化させる一つ以上 の不活性突然変異と、（ｄ）所望の遺伝子若しくはその部分とを有する腸チフス
若しくは他のバクテリアの生存する弱毒化された菌株を作出させることを含む。
遺伝子若しくはその部分は、真核発現カセットの範囲内である。
【００２１】 遺伝子若しくはその部分をデリバリーさせるのに利用されるバクテリアは、弱
毒化されたバクテリア溶解物がターゲット宿主細胞内で核酸を放出する限り、弱
毒化されたサルモネラ、大腸菌、又は赤痢菌、あるいはサルモネラ‐赤痢菌ハイ
ブリッド、サルモネラ‐大腸菌ハイブリッド又は赤痢菌‐大腸菌ハイブリッドで
ある。
【００２２】 したがって、本発明により達成される数他の効果の中で、所望の遺伝子生産物
若しくは所望のポリヌクレオチドを、経口投与されると消化管に関連したリンパ
系組織で、鼻腔内投与されると鼻に関連するリンパ系組織で、他の経路で投与さ
れると他のリンパ系組織でコロニー形成し、上記組織へデリバリーすることがで
きるキャリア微生物を提供と、核酸分子が溶解し、放出するRpoS＋キャリアバク
テリア細胞を利用することに基づく、ヒトの細胞へ核酸分子をデリバリーする効
率的に、高価でない方法の提供と、弱毒化させることに伴い、高い免疫原性のあ
るワクチン調製の提供と、キャリア微生物を投与することにより、個体へ所望の
遺伝子生産物若しくはポリヌクレオチドをデリバリーし、免疫応答を誘発させる
方法の提供と、RpoS＋キャリア微生物及びワクチンの調製方法であって、そのワ
クチンは弱毒化されるだけでなく、高い免疫原性を有する調製方法の提供と、Rp
oS表現型を決定することにより、サルモネラ若しくは他のバクテリアの免疫原性
を評価する方法の提供は、注目に値する。 好適な実施例の詳細な説明 本発明は、ネズミチフス菌での発見に基づいており、ワクチンとして、並びに
キャリア微生物として有利に利用可能であり、高い免疫原性を示す機能性rpoS遺
伝子及びRpoS＋表現型を有するサルモネラである腸チフス菌のような他のサルモ
ネラでも予想される。かかるワクチン及びキャリア微生物は、抗原のこうな所望
の遺伝子生産物をヒトにデリバリーするだけでなく、核酸、DNA或いはRNAの何れ
かをターゲットヒト細胞へデリバリーするためのビークルとして働く。
【００２３】 RpoS遺伝子生産物は、ビルレンスの染色体遺伝子決定因子の発現を調節するこ
とにより、マウスの、少なくとも一部のネズミチフス菌のビルレンスに寄与して
おり、同様の反応機構によりヒトでの腸チフスビルレンスに寄与していると信じ
られている。ヒト免疫のための生存する腸チフスワクチンの開発を目指す多くの
研究は、マウスにてテストされたネズミチフスの菌株を利用した研究に頼ってき
た。上記ネズミチフス菌株により、ヒトの腸チフスに似ているり病性マウスでの
侵襲的感染を引き起こす（CarterとCollins, J. Exp. Med. 139: 1189-1203; Ho
hmannらによるInfect Immun 22:763-770, 1978; CoynautらによるMolecular Mic
robiol. 22: 149-160, 1996）。さらに、ネズミチフスの侵襲及びビルレンスに おけるrpoS遺伝子の役割は、ビルレンスプラスミドキュアネズミチフス菌の菌株
が野生型微生物の効率と同じ効率でパイエル板にコロニーを形成させたことが分
かった限りにおいて、ビルレンスプラスミドを欠く腸チフス菌の侵襲とビルレン
スに関係している（GuligとCurtiss, Infect Immun 55: 2891-2901, 1987; Hack
ettらによる.,J Infect Dis 153: 1119-1125, 1986）。ネズミチフス菌での研究
の結果、よって、腸チフスにも利用できるが、rpoS遺伝子生産物は、侵襲及びビ
ルレンスにとって重要である染色体にコード化させる遺伝子の発現を調製するこ
とが明らかとなった（NickersonとCurtiss, Infect and Immun 65:1814-1823,19
97; KowarzらによるJ bacteriol 176:6852-6860, 1994）。
【００２４】 以下に実施例に示す研究により、本願の発明者らは機能性rpoS遺伝子の存在が
パイエル板のレベルでのネズミチフスの初期段階では必要であり、しかも、rpoS
遺伝子生産物が染色体遺伝子との相互作用を介して作用することを発見した。特
に、ネズミチフス菌のrpoS突然変異体は野生型付着能力を示し、ヒト胚腸管上皮
細胞系統Int-407とマウスマクロファージ様細胞系統J774の細胞を侵襲すること を発見した。加えて、rpoS遺伝子における突然変異はJ774マクロファージ様細胞
又はラット骨髄誘導マクロファージの何れでも、ネズミチフスの細胞内生存に影
響を与えない。しかしながら、rpoS突然変異体は、野生型のビルレント親菌株と
比較すると、経口接種後のマウスのパイエル板にてコロニー形成する能力が減少
することを示した。
【００２５】 さらに、rpoS突然変異体のビルレンスプラスミドキュア誘導体は、同質遺伝子
系統野生型ネズミチフスのプラスミドキュア誘導体よりもマウスのパイエル板か
らはより少ない数で回収された。これは、染色体的にコード化された遺伝子のRp
oS調節がネズミチフスによるマウスヤギ関連リンパ系組織のコロニーかにとって
重要であることを示唆している。
【００２６】 マウスの経口感染後のパイエル板から取った組織セクションの微視的解析から
、野生型ビルレント親菌株とは異なり、同質遺伝子系統rpoS突然変異体はGALTの
小胞関連上皮を破壊しないことが判明した。さらに、rpoS突然変異体は、その野
生型親と比較して、マウスのパイエル板の組織セクションに付着する能力が低下
したことを示した。上記データはパイエル板の細胞とサルモネラとの相互作用に
関係するサルモネラにより、全身感染も初期段階におけるrpoS遺伝子が関係して
いることを暗示している。
【００２７】 パイエル板にてコロニー形成させるrpoS突然変異体の能力が低下した結果とし
て、初期の報告はrpoS遺伝子における不活性突然変異を有するサルモネラ菌株が
生存する経口弱毒ワクチンに利用できる魅力ある候補であることを示唆していた
（NickersonとCurtiss, 上記文献1996）。しかしながら、上記初期の研究とは 対照的に、本発明は別の遺伝子における弱毒化する突然変異に沿った機能性rpoS + 遺伝子を有するサルモネラ菌株及び他のバクテリアに関する。結果として、経 口投与の際に高い免疫原性を達成させるために侵衝細胞の破壊無しに、本発明の
菌株はパイエル板若しくは、例えば、ヒトのGALTの他のリンパ系組織を含む同様
な組織でコロニー形成が可能である。さらに、GALTの小胞管関連リンパ系組織の
M細胞は、結膜関連リンパ系組織（CALT）、気管支関連リンパ系組織（BALT）、 鼻関連リンパ系組織（NALT）だけでなく、直腸におけるリンパ系組織などの他の
粘膜リンパ系組織と関連するM細胞と機能的、形態的及び構造的に同じである。 よって、サルモネラ菌での機能性rpoS+遺伝子の存在は、経口、鼻腔内、直腸を 含む経路により投与される際に、上記組織の侵襲及びコロニー形成において重要
な役割を果たすと考えられる。実際に、以下に実施例にて説明するように、外来
抗原を発現する非組換えと組換え双方のRpoS+ネズミチフス菌は、防御P免疫を付
与する点、及びNALT及びBALTのコロニー形成が非常に重要である際に鼻腔内にデ
リバリーされると、外来抗原に対して抗体応答を誘発する点において、同質遺伝
子系統のRpoS‐ネズミチフス菌よりも優れている。
【００２８】 本発明の範囲のサルモネラ及び他のバクテリア菌株は、機能性rpoS遺伝子生産
物を作出する機能性rpoS+遺伝子を有することに基づいて選択され得る。rpoS遺 伝子生産物は、飢餓に応答して、及び定常状態へ移行する間に発現される３０以
上の遺伝子のレギュロンの制御に関係する定常段階でのσ因子であることが公知
である。RpoSの制御下での遺伝子のタンパク質生成物は、DNA損傷に対する防御 を含む多くの細胞機能、形態変化の決定、ビルレンス、浸透保護（osmoprotecti
on）及び熱許容度（thermotolerance）の介在を調節する（LoewenとHengge-Aron
is, Annu. Rev. Microbiol. 48: 53-80, 1994）。本願にてRpoS表現型というと きは、微生物でのrpoS遺伝子発現により調節される細胞機能の発現(manifestati
on)を意味する。
【００２９】 RpoS調節により制御される多くの細部機能は、微生物のRpoS表現型を決定する
際に評価される。例えば、カタラーゼ生産の培養を解析することが可能である。
このテストは、ヒドロキシペルオキシダーゼIIカタラーゼを生産するkat遺伝子 のRpoSの正の調節に基づいている。定常段階に成長する野生型rpoS対立遺伝子を
有する菌株の培地は、過酸化水素の添加により激しく泡が発生するが、突然変異
体のrpoS対立遺伝子を有する菌株の定常段階の培地では最小の泡が発生する（Lo
wen, J. Bacteriol. 157:622-626, 1984; Mulveyらによる., Gene 73: 337-345,
1998）。弱毒化されたネズミチフス菌株のRpoS表現型は、栄養遮断酸又は酸化 的ストレス、欠損グリコーゲン生合成能力に対する感度を求めることにより、さ
らにアッセイされる。上記手法の変形として、RpoS表現型は、前述したカタラー
ゼ生産に対して誘導された微生物の後のテストにより、野生型ネズミチフスχ33
39へrpoS対立遺伝子のP22Htint媒介形質導入（transduction）により求められ得
る。
【００３０】 接合、トランスホーメーション、又はカタラーゼテストにてRpoS＋表現型をも
たらす機能性組換えrpoS＋遺伝子の形質導入を利用して、機能性rpoS＋遺伝子を
含まない金株を遺伝学的に変換させることも可能である。組換えrpoS＋遺伝子は
、適当な同種若しくは異種ソース、好ましくは同種ソースから得られる。
【００３１】 機能性rpoS＋遺伝子を含むサルモネラに、プラスミドレプリコンの別の機能性
組換えrpoS＋遺伝子を導入させること、或いはRpoSタンパク質により調節された
遺伝子の発現をさらに増大させるために、染色体に組込させることも可能である
。これは、例えば、減少したrpoS遺伝子発現を有する微生物、つまり、GALTの最
善でないコロニー形成を示す微生物、さらに望ましい正常発現よりも大きくはな
いが、rpoS遺伝子発現が減少していない微生物のような特定の状況では望ましい
ことである。
【００３２】 たとえ、機能性RpoSを発現させなくても、GALT若しくは他のリンパ系組織にて
効果的にコロニー形成可能であるサルモネラ又は他のバクテリアを提供すること
も可能である。例えば、RpoS‐表現型は、rpoS突然変異菌株に少なくとも一つの
組換えビルセンス遺伝子を導入させることにより、回避することができた。組換
えビルセンス遺伝子又は本願でいう組換えRpoSビルセンス遺伝子は、組換え遺伝
子が、生物学的に同じ機能を有する、つまり、RpoS により正常に調節された染 色体ビルレンス遺伝子の機能として、GALT若しくは他のリンパ系組織の効果的な
コロニー形成を容易にする遺伝子生産物を発現させることが可能であることを意
味している。しかしながら、導入された組換えビルレンス遺伝子の発現は、機能
性RpoSの存在に依存しない調節要素により制御され、よって、機能性RpoSの存在
しない組換えビルレンス生成物の発現を実現させる。例えば、機能性rpoS＋遺伝
子はパイエル板の組織コロニー形成に必要であり、パイエル板にサルモネラ菌を
付着させるために重要であることが示される。この付着の原因となる一つ以上の
遺伝子は、RpoSにより調節されると考えられている。RpoSにより調節されるパイ
エル板への付着を制御する候補の遺伝子のあるグループは、lpfフィムブリアオ ペロンである（Baumlerらによる., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93: 279-283,
1996）。とって、rpoS突然変異微生物の侵入及び免疫原性は、機能性RpoSに依 存しない調節用度の制御下にて、一つ以上のビルレンス遺伝子により微生物を形
質転換させることにより向上され得る。
【００３３】 本発明のある実施例では、rpoS＋バクテリア菌株、特に、rpoS＋サルモネラ菌
株は病原性菌株の弱毒誘導体である。誘導体若しくは誘導菌株とは、伝える親か
ら遺伝的に変質された菌株のことをいう。病原性とは、微生物が疾患を引き起こ
す、又は正常な生理学的機能を傷つけ得ることを意味する。本願にてアビルレン
ス又は弱毒化というときは、特定の微生物菌株がビルレント非弱毒化病原性相対
物と通常関連している疾患状態の全組の兆候を誘発させることができないことを
意味する。とって、アビルレンス又は弱毒化とは、減少したビルレンス状態又は
疾患状態を生じさせる能力をいい、必ずしも、弱毒化若しくはアビルレント微生
物が宿主の正常な生理学的機能に損傷を与える能力を完全に有しないことをいう
ものではない。加えて、弱毒化された若しくはアビルレント微生物は、必ずしも
、病原体として機能しないことではなく、利用される特定の微生物が、処置され
るべき特定の個体に関して弱毒化されていることである。
【００３４】 rpoS＋サルモネラ菌株を含む本発明のrpoS＋菌株は、微生物を弱毒化させる一
つ以上の遺伝子における弱毒化突然変異を含ませることにより弱毒化される。好
適な実施例では、菌株は少なくとも二つの突然変異を有し、それぞれは、組合わ
せて微生物を弱毒化させるように働き、重要なことは、微生物が野生型ビルレン
スに戻らない蓋然性を高めることである。突然変異とは、遺伝子の発現が減少す
る、並びにビルレンスが低下することに関する限り、挿入、部分的若しくは全体
を欠失などである。弱毒化突然変異は、生合成遺伝子、調節遺伝子及び/又はビ ルレンスに関係する遺伝子において存在する（DoggettとBrownの上記文献を参照
）。突然変異の例には、以下のものに限定されないが、pab遺伝子、pur遺伝子、
aro遺伝子、asd、dap遺伝子、nadA、pncB、gaIE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA 、hemA、cdt、cya、crp、phoP、rfc、poxR、galU及び上記の組合わせなどがある
。遺伝子の突然変異により微生物を弱毒化させる限りにおいて、適当な遺伝子突
然変異は本発明では利用できることは、当業者には容易に理解できるであろう。
【００３５】 突然変異を生じさせて、本発明の弱毒微生物を作出させる方法は、本技術分野
では公知である。例えば、トランスポゾンであるＴｎ10は、サルモネラ菌を含む
幅広い種類のバクテリアにて染色体欠失を生じさせるために利用され得る（Klec
knerらによる., J. Mol. Biol. 116:125-159, 1977; EPO刊行物No.315, 682; 米
国特許第5,387,744号）。
【００３６】 最近、新しい方法が利用可能になり、遺伝子の特定欠失を生じさせることがで
きるようになった。上記方法には、まず、欠失を発生させたい遺伝子を選択する
が含まれる。一つのアプローチでは、その遺伝子は、当業者には周知である方法
を利用して構築された、若しくは商業的に入手可能なゲノムライブラリーから選
択する（Sambrookらによる., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd E
d., 1989, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring harbor, NY）。遺伝子を含
有するクローンは、同じ遺伝子における突然変異を含む菌株の相補性により、ゲ
ノムライブラリーから分離された。あるいは、遺伝子のDNA配列が公知ならば、 ポリメラーゼチェインリアクション法（PCR）の選択プライマーが、バクテリア のサンプルから、若しくは精製ゲノムDNAからその遺伝子を増幅させ、しばしば 数多のフランキング配列を伴い、PCR生成物はクローニングベクターに挿入され る。
【００３７】 選択遺伝子での特定欠失は、二つの一般的方法の何れかにより生じさせること
が可能である。第一の方法により、制限酵素を利用して、ゲノムライブラリーに
含まれるクローンの集合から分離された遺伝子における欠失を生じさせ、第二の
方法により、PCR方法を利用して、公知の配列の遺伝子における突然変異を生じ させる。
【００３８】 第一の方法を利用して、ベクターの遺伝子の位置は、トランスポゾンタッギン
グ（transposon tagging）を用いて確認され、ベクターの組換えDNAの制限マッ プが作られる。トランスポゾンタッギングから導かれた情報により、公知の制限
酵素部位を利用して、全ての若しくは部分的な遺伝子がベクターから切除される
。
【００３９】 PCR法を基礎とする第二の方法は、遺伝子配列が公知の場合に利用可能である 。上記方法によれば、ダイバージェントPCRプライマーは、遺伝子から欠失され るべきDNAの特定セグメントにフランキングする上流及び下流領域を増幅させ、 クローニングベクターと、上流とヌクレオチド配列にフランキングする下流とな
らなるＰＣＲ生成物が生成する（Innesらによる編集., PCR Protocols, 1990,
Academic Press, New York）。上記方法の変形にて、PCR生成物は遺伝子の部分 を表わす又は配列にフランキングして生じ、その後クローニングベクターととも
に接合される。
【００４０】 突然変異遺伝子を含有するDNAは、化学的手段若しくはエレクトロポレーショ ンを利用して、組換えファージ感染又は接合により、バクテリア宿主へ導入され
得る。好適な実施例では、突然変異遺伝子は、例えば、感熱レピリコン（Hamilt
onらによる., J. Bacteriol. 171: 4617-4622, 1989）、recBC突然変異体の線形
変換（JasinらによるJ. Bacteriol. 159: 783-786, 1984）若しくはスイサイド ベクターとして公知である宿主制限レプリコン（Millerらによる., J. Bacterio
l. 170:2575-2583, 1988）を利用した方法のような、本技術分野においては周知
な多くの方法の何れかを利用して達成されるバクテリアの染色体へ導入される。
利用した特定の方法は、フザリン酸耐性又はスクロース耐性に続く、表現型特徴
、又はPCR、核酸ハイブリダイゼーションを利用して、又は免疫学的法に基づく 、突然変異体の対立遺伝子を含有するクローンのその後のスクリーニングのよう
な適切な逆選択方法と組合わせる。
【００４１】 本発明の弱毒化されたrpoS＋バクテリア菌株、特に、弱毒化された腸チフス突
然変異体は、ワクチンの形態で利用され、組換え抗原をヒト、又は核酸をヒトの
ターゲット細胞へデリバリーする。よって、本発明は、バクテリア、菌類、寄生
若しくはウイルス病に対して効果的な組換えワクチンの開発によって幅広い応用
を有することは明白であり、局所免疫は重要であり、防衛の第一線である。組換
えワクチンの調節の数多の例には、ペスト菌により発生する腺ペスト、淋菌によ
り発生する淋病、梅毒トレポネーマにより発生する梅毒、トラコーマクラミジア
により発生する性病及び目の感染がある。咽喉炎又は心臓病を引き起こす種であ
る溶血連鎖球菌には、髄膜炎菌、肺炎マイコプラズマ、インフルエンザ菌、百日
咳菌、ヒト型結核菌、らい菌、肺炎球菌、うし流産菌、コレラ菌、赤痢菌種、レ
ジオネラニューモフィラ菌、ボレリアブルグドルフェリ（Borrelia burgdorfei ）、リケッチア種、緑膿菌や、ETEC、EPEC、UTEC、EHECのような病原性大腸菌が
あり、EIEC菌株類は遺伝子により得られる本発明の範囲の微生物の追加の例であ
る。インフルエンザウイルスに対する作出された組換えアンチウイルスワクチン
は、さらに本発明の範囲に包含される。組換えアンチウイルスワクチンは、ピコ
ナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナ
ウイルス科、ラプドウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オ
ルソミクソウイルス科、バンヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科
、レトロウイルス科のようなRNAウイルスと、或いはヘパドナウイルス科（Hepad
naviridae）、パロウイルス科（Paroviridae）、パポバウイルス科、アデノウイ
ルス科、ヘルペスウイルス科又はポックスウイルス科のようなDNAウイルスとを 含むウイルスに対して生産される。さらに、病原性菌類、原生動物又は寄生体に
よる感染に対して防御するための組換えワクチンは、本発明により検討される。
【００４２】 よって、ある組の実施例では、本発明は病原性腸チフスのような病原性バクテ
リアの生存する弱毒化された誘導体を含むヒトの免疫に対するワクチンとして、
説明され、その誘導体は機能性rpoS遺伝子を含み、RpoS+表現型を発現する。さ らに、弱毒化されたバクテリアは、病原体である、又はヒトのアレルゲンを生産
する有機体から誘導された組換え遺伝子を発現させることができる。
【００４３】 ワクチンの免疫原性成分が宿主のアレルゲンである実施例にて、かかるワクチ
ンはアレルギー性宿主を特に脱感作させるように設計されたエクスポージャー養
生にて利用され得る。花粉、糸状菌胞子、昆虫類、動物のふけなどに対するアレ
ルギーは、空気吸引及び/又はかかるアレルゲンを含有する食物摂取に起因する 。生じるアレルギーは、ヒスタミンの放出のマスト細胞を活性化させるアレルゲ
ンに結合するIgE抗体の存在と関連している。周知なように、アレルゲンに対す る脱感作は、アレルゲンを含有する抽出物の繰返す非経口免疫化により達成され
る。同様に、花粉を含む生のハチ蜜の経口摂取が上記アレルゲンに対する耐性状
態を効果的に誘発させるために利用され得ることは公知である。かかるアレルゲ
ンの経口摂取は、一方で、アレルゲンの能力を阻害するSigA応答を誘発させて、
ＩｇＥ及びマスト細胞と反応させる、又は、十分な量が投与されるとIgE抗体の 合成を抑制し、つまり耐性を誘発する。多くのアレルゲンの特定のアレルゲン分
子が確認されており、ｃDNAはアレルゲンを特定するヌクレオチド配列を入手す るようにクローン化されているので、アレルゲンを発現するように異種宿主細胞
を遺伝子工学的に操作することが可能である（Valentaらによる.,Allergy 53: 5
52-561. 1998; Olssonらによる., Clin. Exp. Allergy 28: 984-991. 1998; Sol
datovaらによる., J. Allergy Clin. Immunol. 101: 691-698, 1998; Asturias らによる, Clin Exp Allergy 27: 1307-1313; Twardoszらによる, Biochem Biop
hys Res Commun 239: 197-204, 1997を参照）。したがって、本発明の弱毒化さ れたRpoS+サルモネラ菌はアレルゲンを発現するように遺伝子工学的に操作され 、可能ならば、修飾免疫原性形態であり、非アレルギー形態ではなく、耐性の状
態を誘発する又はアレルゲンに対するSigAの生産を積極的に促進する。本願で説
明する弱毒化されたRpoS+サルモネラ菌は、免疫応答を誘導されるには効果的で あることがわかり、よって、当然の結果として、修飾アレルゲンを発現するよう
にかかるRpoS+サルモネラ菌の使用することは、吸引若しくは摂取によりアレル ゲンがヒトに晒される結果を改善させるのに効果的である。
【００４４】 他の実施例では、組換え遺伝子は、個体が免疫される際に、坑生殖能力効果を
付与する免疫応答を誘導することができる生殖体特異抗原を発現する（米国特許
第5,656,488号）。
【００４５】 さらに、本発明の弱毒化された微生物は、さまざまな宿主タンパク質の合成用
のベクターとして利用される。本発明の弱毒化された微生物は、宿主導入後の消
化管関連リンパ系組織（GALT）、腸間リンパ節及び脾臓を含む多様な免疫担当構
造をトラバースすることができるので、かかる微生物は多様な免疫調節生成物を
ターゲットにするために利用できる。したがって、免疫調節タンパク失又はペプ
チドをコード化する一つ以上の遺伝子は、組換えて弱毒化された微生物に導入す
ることが可能であり、その微生物が存在するときには、適当な免疫担当組織での
存在が宿主での免疫応答を抑制、増大、修飾するための組換え生成物を発現する
ことが可能である。免疫調節分子の例には、以下のものに限定されないが、コロ
ニー刺激因子（マクロファージ、顆粒細胞又はその混合物）、マクロファージケ
モトキシン、マクロファージ阻害因子、白血球阻害因子、リンホトキシン、芽球
化因子、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、サイトカイン及
びリンホカインがある。
【００４６】 さらに、本発明の弱毒化された微生物は、さまざまな生理学的機能を刺激する
、又は抑制する薬理学的に活性な生成物を生産し、デリバリーする用途にも利用
できると考えられる（つまり、成長速度、血圧など）。かかる微生物では、組換
え遺伝子は前記薬理学的に活性な生成物をコード化する。
【００４７】 本発明の微生物の組換え遺伝子は、「平衡致死」システムに導入され、そのシ
ステムは微生物の生存と組換え遺伝子の継続的存在とを関連つけることにより、
組換え遺伝子を含み、及び発現させる微生物に対して選択される。このタイプの
「平衡致死」突然変異体は、細胞生存に必須である酵素を、好ましくはジアミノ
ピメリン酸（DAP）の生合成の段階に触媒作用を及ぼす酵素をコード化する機能 性ナイーブ染色体遺伝子、さらに好ましくはベータアスパラギン酸セミアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼ（AsD）をコード化する遺伝子を特徴とする。DAP経路酵素及
びAsDは細胞癖合成には必要である。さらに、突然変異体には、非機能性染色体 遺伝子を相補する働きののある第一の組換え遺伝子が含まれ、これは、所望の生
成物をコード化する第二の組換え遺伝子と構造的に関連つけられている。相補的
組換え遺伝子が存在しないと、DAPが存在しない環境下に細胞が存在することに なると、溶解により細胞死を招く。このストラテジーは、DAPが真核生物により 合成されないので、したがって免疫化宿主組織には存在しないので、特に有用で
ある。「平衡致死」微生物の上記タイプの調製方法は、米国特許第5,672,345号 に開示されている。
【００４８】 免疫原性剤とは、個体の免疫システムに刺激を与えるために利用される剤を意
味し、免疫システムの一つ以上の機能が向上し、免疫原性剤に向かって指向する
。免疫原性剤にはワクチンが含まれる。免疫原性剤は、本技術分野では公知技術
をい利用して、分離ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の双方の抗体の生
産に利用することができる。
【００４９】 抗原又は免疫源は、分泌、体液及び/又は抗原に特異な細胞免疫応答をする宿 主免疫システムに刺激を与え得る一つ以上のエピトープを含む分子を意味する。
【００５０】 エピトープとは、結合部位に特異な抗体に対する抗原に部位である。エピトー
プは空間的配置に３つのアミノ酸を含み、その空間的配置はエピトープに独特で
ある。通常、エピトープは少なくとも５つのアミノ酸と、あるいは少なくとも８
から１０のアミノ酸を含む。用語「エピトープ」とは、本願では用語「抗原決定
因子」と相互交換可能である。さらに、用語「エピトープ」とは、Tヘルパー細 胞エプトープを含み、抗原決定因子は、主要な組織適合性複合体クラスII分子と
の関連を介して、Tヘルパー細胞により認識される。加えて、用語エピトープに は、何れかの抗原と、エピトープと、あるいは細胞に存在する抗原の表面にMHC クラスI分子が提供された際に、細胞毒性T細胞により認識される抗原決定因子と
が含まれる。細胞毒性T細胞エピトープは約６乃至約１１のアミノ酸のアミノ酸 配列を含み、好ましくは８又は９のアミノ酸の配列を含む。
【００５１】 ワクチンとは、個体の免疫システムに刺激を与えるように利用される剤を意味
し、免疫システムにより自己抗原とは認識されない抗原に対して、防御を実現さ
せる。免疫とは、抗体及び/又は細胞免疫応答の継続した高いレベルを誘発させ るプロセスをいい、Tリンパ球は病原体を殺す、及び/又は他の細胞（例えば、食
細胞）を活性化させて、個体にて病原体を殺し、有機体が以前に晒された病原体
または抗原に対して指向する。フレーズ「免疫システム」とは、外来体の存在に
対する単細胞微生物の応答をも含み、本願では、そのフレーズは解剖学的特徴及
びメカニズムのことをいい、さらにより個体は個体の細胞に侵入する抗原材料、
又は個体の細胞外液体に対して抗体を生産し、さらに、細胞免疫応答を誘発させ
ることをも意味している。抗体生産の場合、そのように生産された抗体は何れか
の免疫学的クラスに属し、例えば、免疫グロブリンA、D、E、G又はMがある。特 に関心があるのは、温かい血液の動物の分泌システムにより生産されるのは、主
に免疫グロブリンであるので、免疫グロブリンA（IgA）の生産に刺激を与えるワ
クチンである。但し、本発明のワクチンはIgA生産に刺激を与えるものに限定さ れない。例えば、本願で説明するワクチンの性質は、IgA生成に加えて、例えば 、細胞及び体液免疫のような幅広い範囲の他の免疫応答を生じさせる。抗原に対
する免疫応答は十分に研究されており、幅広い報告がなされている。免疫学の調
査は、本願の参考文献に引用される、Elgert, Klaus D., Immunology, Wiley Li
ss, Inc., (1996); Stitesらによる., Basic & Ckinical Immunology; 7th Ed.,
Appleton & Lange, (1991)に記載されている。
【００５２】 本発明のワクチン処置される「個体」とは、本願では、ヒト宿主のことをいう
。
【００５３】 本願で使用する微生物には、バクテリア、原生動物及び単細胞菌類が含まれる
。本願で使用する用語「寄生」とは、プラズモディウムやトキソプラズマ種だけ
でなくエントアメーバ、リーシュマニアやトリパノソーマ種のような原生動物や
、吸虫類、条虫及び線虫類のようなぜん虫が含まれる。本願で利用するウイルス
には、例えば、ピコナウイルス科、カリチウイルス科、トガウイルス科、フラビ
ウイルス科、コロナウイルス科、ラプドウイルス科、フィロウイルス科、パラミ
クソウイルス科、オルソミクソウイルス科、バンヤウイルス科、アレナウイルス
科、レオウイルス科及びレトロウイルス科のようなＲＮＡウイルスと、例えば、
へパドナウイルス科、パロウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科
およびポックスウイルス科などのＤＮＡウイルスが含まれる。
【００５４】 組換え遺伝子というときは、同じ遺伝的材料を含む派生物へ再製を生じさせる
際に、第一の有機体から第二の有機体へ、ヒトを介在させて移動させる遺伝的材
料のことを意味する。一般には、第一の有機体から第二の有機体への遺伝材料の
かかる交換は、起こらない、又は稀に天然に発生する。
【００５５】 本願で使用さうる用語遺伝子とは、最も広義には、遺伝の生物学的短イを表わ
す。しかしながら、組換え遺伝子は親の有機体に存在し、例えば、機能性ポリペ
プチドのような高分子の生産を行う又は調節するように、完全な遺伝子である必
要はない。よって、組換え遺伝子は全ての又は一部の抗原生成物をコード化する
。さらに、組換え遺伝子はプロモータ、エンハンサー又はターミネータとして働
くＤＮＡ配列と、全ての又は一部の抗原をコード化する組換え遺伝子の発現を調
節するリプレッサ又はアクティベータをコード化するＤＮＡ配列とを含む。さら
に、組換え遺伝子とは、ポリペプチド融合生成物をコード化する遺伝子融合のこ
とをもいう。とって、コード化された遺伝子生産物は、親と正確に同じ形態では
存在しないものである。例えば、１００個のアミノ酸残基を含むポリペプチドを
コードする機能性遺伝子は部分的にキャリア微生物に移動し、たった７５、さら
には１０以上のアミノ酸残基を含むペプチドが、宿主細胞の細胞メカニズムによ
り生産される。しかしながら、この遺伝子生産物が抗原として働き、親の有機体
に存在する同様な抗原に対して抗体を生成させるならば、又はＴヘルパー細胞に
より認識されるＴ細胞エピトープとして生成するならば、その遺伝子は本発明の
定義する用語遺伝子の範囲内になるものとみなされる。あるいは、特定抗原又は
その断片のアミノ酸配列が公知ならば、ＤＮＡ断片又はその類似体を、自動遺伝
子シンセサイザーなどにより化学的に合成することも可能であり、前記ＤＮＡ配
列を適当な発現ベクターに導入させることも可能である。これは、サルモネラに
おける高レベル発現の好ましいコドンであるコドンを利用するためには望ましい
ことである。スペクトルの他端は、数多の遺伝子生産物をコードするＤＮＡの長
いセクションであり、それらの一つ又は全ては抗原である。例えば、かかるＤＮ
Ａの長いセクションはフィムブリエ抗原（フィンブリアエ（fimbriae））の合成
に必要５から１５のタンパク質をコードし、そのフィムブリエ抗原は宿主細胞へ
の病原体の付着を仲介する（Baumlerらの上記文献）。フィンブリアエに対する 免疫応答の導入により、病原体に対する防御が実現される。よって、本願で定義
され、主張される遺伝子は抗原を生産することができる遺伝の単位である。その
遺伝子は染色体、プラスミド又はウイルス起源である。本願で使用する用語遺伝
子は、ＤＮＡ配列が所望の遺伝子生産物をコード化する限りおいては、例えば、
ｃＤＮＡ分子にはよくあるようなイントロンがないＤＮＡ分子をさらに含む。さ
らに、用語遺伝子には、ＲＮＡウイルス又はかかるＲＮＡ分子の補体の遺伝子と
して働くＲＮＡ分子を意味する範囲のものをも含まれ、そのＲＮＡ分子又はその
補体は免疫原性があるウイルスタンパク質へ転写されるべきｍＲＮＡとしての働
きをする。本願で使用する用語遺伝子には、さらに、免疫原性があるウイルスタ
ンパク質へ転写されるべきｍＲＮＡとして働くウイルス鎖を特定するＤＮＡ配列
が含まれる。
【００５６】 遺伝子が免疫応答を引き出すのに効果的であるようにするために、遺伝子は発
現されなければならい。遺伝子の発現とは、遺伝子が配置される細胞の生化学的
反応機構により、遺伝子構造に固有な情報（ＤＮＡ塩基の配列）をＲＮＡ分子、
ポリペプチド又は他の生物学的分子の形態である物理的生成物へ転換される。そ
のように生産された生物学的分子は遺伝子生産物といわれる。本願でいう用語遺
伝子生産物とは、遺伝子の調節のもとで起こる生化学反応の結果として、生産さ
れる生物学的生成物又は生成物類のことである。遺伝子生産物は、例えば、ＲＮ
Ａ分子、ペプチド、あるいは酵素又は遺伝子の初期の生成物である分子、つまり
代謝生成物である他の分子である。例えば、遺伝子は、まず、リポソームの作用
により、遺伝子が発見されるオリジナル細胞への外部環境にて、グルカンの生成
を調節する酵素へ翻訳されるＲＮＡ分子の合成を制御する。ＲＮＡ分子、酵素、
グルカンは全て、本願で使用する遺伝生成物である。前記何れかだけでなく、糖
タンパク質、糖脂質及び多糖のような他の多くの遺伝子生産物は、個体の免疫シ
ステムに導入されると、抗原として作用する。糖タンパク質及びリポタンパク質
を含むタンパク質遺伝子生産物は、ワクチンの抗原としての用途の好ましい遺伝
子生産物である。
【００５７】 細胞免疫に刺激を与える際、若しくは抗体を生産する際にワクチンが効果的で
あるようにするために、細胞免疫の誘導を生じさせる及び/又はワクチン接種さ れた個体の抗体生産メカニズムを誘発するように、抗原材料が放出され及び/又 は存在する。したがって、遺伝子生産物の微生物キャリアは個体に導入されなけ
ればならない。消化管関連リンパ系組織（GALT）又は気管支関連リンパ系組織（
BALT）の好ましい応答を刺激するために、経口投与、胃挿管又はエーロゾルの形
での鼻腔内のような、微生物若しくは遺伝子生産物の消化管若しくは気管支への
直接導入が好ましい。但し、静脈、筋肉内、皮下注射若しくは乳内又は陰茎又は
膣または直腸投与などの他のワクチン投与方法も可能である。
【００５８】 弱毒化された微生物はキャリア微生物として利用可能であり、例えば、抗原用
に、又はDNAワクチンベクター用に利用でき、キャリア微生物が個体に存在する と、抗原は個体の免疫システムにて利用できるようになる必要がある。核酸分子
のデリバリー用のキャリア微生物の場合、核酸分子はターゲット細胞内で放出さ
れる必要がある。これは、キャリア微生物が死んだ際に達成され、抗原分子又は
核酸分子が放出される。もちろん、溶解せずに周辺細胞質の内容物を放出する「
漏れ易い」弱毒化された突然変異体の使用も可能である。
【００５９】 あるいは、細胞の死が訪れる前に、外部環境にキャリア細胞により利用される
であろう抗原の生産を調節する遺伝子が選択される。このようにして、ワクチン
接種された個体に、例えば、パイエル板若しくは他のGALT、NALTやBALTなどに存
在するであろう成育可能な微生物を利用することが可能であり、抗体の生産を継
続し、もって、連続的に抗体生成及び/又は細胞免疫応答を誘発する。上記のよ うな状況下での好ましい遺伝子生産物は、弱毒化されたキャリア微生物の細胞体
を経由して外部環境に移動する生産物であり、又は、外側細胞膜に付着する又は
埋め込まれるようになる生産物であり、全ての若しくは一部の遺伝子生産物はそ
の環境に晒される。遺伝子生産物の後者の典型的なタイプは、通常、防御が望ま
れている有機体の表面にて発見される抗原である。上記抗原が普通の方法でバク
テリア細胞表面に輸送されると、抗原に対する抗体生成が促進されるであろう。
【００６０】 核酸ワクチンは本技術分野では周知であり（Ulmerらによる., Amer. Soc. Mic
robol. News 62: 476-479, 1996; Ulmerらによる., Curr. Opinion. Immunol. 8
: 531-536, 1996; Robinson, H. L., Vaccine 15: 785-787, 1997参照）、DNAワ
クチンによりコード化されたタンパク質に対する免疫応答の後の刺激を有する、
弱毒化されたバクテリアによるDNAワクチンのデリバリーは説明されている（Siz
emoreらによるVaccine 15:804-806, 1997）。よって、本発明の弱毒化された微 生物もDNAワクチンに対するデリバリービークルとして利用できることが期待さ れる。通常、かかるDNAワクチンを含有するバクテリアは、DNAワクチンによりコ
ード化される遺伝子生産物を、それ自体では発現しないが、一つ以上のヒト組織
にDNAワクチンを放出し、そこでその後、遺伝子生産物が宿主細胞転写及び翻訳 機構により発現される。しかしながら、RNAウイルスに対する免疫化のDNAワクチ
ンを構築することが可能であり、そのRNAウイルスゲノムの複製、又はタンパク 質をコード化するその部分は、弱毒化されたバクテリアの細胞質で作られると考
えられる。かかるRNA分子はヒト組織、例えば、弱毒化されたバクテリアの溶菌 により放出され、そのような分子は免疫原生ウイルスタンパク質の合成用のｍRN
Aとして働く。
【００６１】 他の病原体からGALT又はBALTへの抗原のデリバリーされる病原体の使用は、も
しかかる病原体が上記組織にてコロニー形成する能力を維持させながら、弱毒化
させるという事実がないのならば、適当ではない。
【００６２】 組換え遺伝子が誘導される有機体はヒト病原体、又はアレルゲンを若しくはヒ
トが影響を受け易い抗原を生産する有機体である。アレルゲンはアレルギー反応
を引き起こす物質であり、この場合、アレルギー反応に対してヒトにワクチン接
種される。多くのさまざまな材料はアレルゲンであり、例えば、動物にふけや花
粉があり、個体のアレルギー反応は特定のアレルゲンによって異なる。アレルギ
ー反応を示す個体にアレルゲンに対する耐性を誘発させることが利用できる。耐
性を誘発させる方法は周知であり、通常、増加する投与量でアレルゲンを個体に
投与することを含む。耐性誘発のさらなる議論は、前述に引用したBarrettの教 科書に記載されている。最後に、宿主個体自身は、免疫調節遺伝子又は他の薬理
学的活性物質に対する遺伝子がベクターに発現される際に、遺伝材料のソースと
して働く。
【００６３】 個体へ前記開示したタイプの生存するワクチンの投与することは公知であり、
標準的な技法である。その投与方法には、経口摂取、胃挿管若しくは気管支‐鼻
‐眼球スプレーが含まれる。全ての上記方法により、生きたワクチンが容易にNA
LT、GALT又はBALT細胞に到達し、抗体生成と細胞媒介免疫を誘発するので、投与
としては好ましい方法である。他の投与方法には、例えば、静脈注射があり、キ
ャリア微生物は個体の血液の流れに乗り、そのような方法も許容される。静脈、
筋肉内又は乳管注射も本発明の他の実施例として可能であり、後述する。
【００６４】 多くの九通して利用される組換えDNA方法は、本発明の弱毒化された微生物を 生産するの際に利用され、その弱毒化された微生物は組換え遺伝子を発現するこ
とが可能である。プラスミド、ファージ又はコスミッドベクターへの連鎖に続き
、そのように生成された組換え分子は、エレクトロポレーションを含み、接合、
形質転換（カルシウムイオンのようなさまざまな化学物資の存在により人工的に
誘発される外部環境からの裸のDNAの摂取）のような多様な手段により,宿主細胞
へ移動される。形質導入のような他の方法も適し、その場合、組換えDNAは形質 導入ファージ又はコスミッドベクターのようなファージ内に収納される。組換え
DNAが一旦そのキャリア細胞に存在すると、分離した自律性レプリコンとして継 続して存在する、若しくは宿主細胞線セ奥体に挿入され、細胞分裂に際に染色体
に沿って複製される。
【００６５】 遺伝材料が移動すると、その移動した遺伝子材料を含有する微生物が選択され
る。
【００６６】 必要とされる免疫化投与量は、その遺伝子生産物の抗原性により変化し、免疫
応答を誘発するのに十分な量が必要とされる。通常の投与では必要な量は容易に
求められる。必要ならば、数回の投与が行われ、所望の防御が実現される。
【００６７】 ワクチンが懸濁される若しくは溶解される薬剤学的キャリア若しくは賦形剤は
、溶媒、固体、又はワクチンのライホライズ（lypholized）形用のカプセル材料
である。キャリアは接種個体に対して非毒性であり、微生物又は抗原遺伝子生産
物と適合性がある。適当な薬剤学的キャリアは本技術分野では公知であり、例え
ば、通常の生理食塩水や殆ど生理的濃度に近い他の非毒性塩のような液体キャリ
ア、タルクやスクロースのような固体キャリアがある。ゲラチンカプセルはライ
ホライズワクチン用のキャリアとしての役割を果たす。必要ならば、抗原性を向
上させるために、アジュバントが添加される。気管支管を経由して投与するよう
に利用される際には、ワクチンはエーロゾルの形態で存在していることが好まし
い。適当な薬剤学的キャリアとアジュバントと投与形態の調製は、例えば、Remi
ngton’s Pharmaceutical Science, 17 th Edition(Gennaro, Ed., Mavk Publis
hing Co., Eaton, Pa., 1985)に説明されている。
【００６８】 病原体誘導遺伝子生産物による個体の免疫化は、キャリアとして作用して病原
体からの組換え遺伝しにより特定される遺伝子生産物を発現する病原性微生物の
弱毒化された誘導体で免疫化される前にとともに利用される。かかる非経口免疫
化はブースターとして働き、病原体誘導遺伝子生産物の分泌免疫システムが、GA
LT又はBALTのリンパ系細胞に刺激を与えるようにその病原体誘導遺伝子生産物を
発現するキャリア微生物による免疫化が開始されると、分泌免疫応答の発現を促
進する。その促進応答は第二の、つまり、ブースターとして、既往応答して公知
であり、宿主の長期間の免疫防御をもたらす。ブースター免疫化は、有利な結果
をもたらし、幾度も繰り返される。
【００６９】 別の実施例では、本発明は、サルモネラのRpos表現型を決定することを含む、
サルモネラの免疫原性を評価する方法を提供する。さらに、この方法は赤痢菌や
大腸菌、サルモネラ‐赤痢菌ハイブリッド、サルモネラ‐大腸菌ハイブリッド及
び赤痢菌‐大腸菌ハイブリッドのような他のバクテリアにも利用可能である。Rp
os＋表現型の存在により、経口投与後のGALTや別の経路での投与後の NALT又はBALTのような他のリンパ系組織にて利用される特定の投与経路に関連す
るリンパ系組織に侵入し、コロニー形成する能力が微生物に付与される。これに
より、高レベルの免疫原性が招来する。よって、Rpos＋表現型の存在の検出する
ことは、Rpos‐であり、それ以外は遺伝的に同一である微生物と比較して、Rpos ＋ 表現型を有する微生物は高レベルな免疫原性を有することが分かる。
【００７０】 Rpos＋表現型は、その微生物の性質を決定することにより評価される。これは
、可能な多くの方法により実行される。例えば、カタラーゼ生産の培養を解析す
ることにより行われる。このテストは、ヒドロキシペルオキシダーゼIIカタラー
ゼを生産するkatE遺伝子のRposの正の調節に基づいている。野生型rpoS対立遺伝
子を有する菌株の培地は、過酸化水素を添加すると激しく泡が発生するが、突然
変異体であるrpoS対立遺伝子を有する菌株に培地では最小の泡しか発生しない（
Lowen, J. Bacteriol. 157:622-626, 1984; Mulveyらによる., Gene 73:337-345
, 1988）。さらに、弱毒化されたサルモネラ又は他のバクテリアのRpos表現型を
求めるために、他の方法に利用可能であり、それには養分遮断、酸若しくは酸化
的ストレス及び欠損グリコーゲン生合成能力に対する菌株の感度を決定すること
も含まれる。上記方法の変形において、rpoS対立遺伝子は野生型サルモネラに形
質導入され、その結果生成したサルモネラ誘導体も、Rpos表現型のテストを行っ
た。
【００７１】 微生物の遺伝子を求めることにより、Rpos＋表現型を評価することもでき、機
能性rpoS遺伝子生産物が生産可能な機能性rpoS+遺伝子の存在により、Rpos＋表 現型でることが判明する。
【００７２】 本発明の好適な実施例を以下に示す。本願の特許請求の範囲内の他の実施例は
、ここに開示する発明の明細書及び実施態様を考慮すれば、当業者には明白であ
ろう。実施例を伴う明細書は模範例を示しており、特許請求の範囲により明確に
される本発明の範囲及び精神内で理解される。
【００７３】 一般方法： 本研究にて利用されたバクテリア菌株は、以下の一般的原料及び方法を利用し
て構築された。菌株を構築する際に利用されたファージ、プラスミド及び微生物
を、表１及び表２に示す。
【００７４】
【表１】
【００７５】
【表２】
【００７６】
【表３】
【００７７】
【表４】
【００７８】
【表５】
【００７９】
【表６】
【００８０】
【表７】
【００８１】
【表８】 重複させて、バクテリア菌株は５％のグリセロールを含む１％のバクト‐ペプ
トン（Bacro-peptone）（Difco）に懸濁させた‐７０℃凍結培養として維持され
、通常使用用の１％バクト‐ペプトンと５０％グリセロール中にて‐２０℃で保
存させた。通常、バクテリアはL ブロス（Broth）（Lennox, Virology 1: 190-
206, 1965）若しくはルリアブロス(LuriaらによるBacteriol. 74:461-476, 1957
)にて培養された。寒天平板は１．５％Difco寒天を含有していた。炭水化物利用
は、１％の最終濃度の適当な炭水化物で、マッコンキー（MacConkey）(Difco)又
はエオシンメチレンブルー寒天ベース（Curtiss, Genetics 58:9-54, 1968）に より評価された。最小液体（ML）及び最小寒天（MA）は、Curtiss（J. Bacterio
l. 89:28-40, 196）に説明されたように調製され、最適レベルの養分で補充され
た。ゲラチン（BSG）のある緩衝生理食塩水は希釈剤として、通常利用されてい る（Curtissの1965の上記文献）。
【００８２】 バクテリオファージP22Htintは標準方法を用いて、形質導入に利用された（Da
visらによる., A Manual for Genetic Engineering‐Advanced Bacterial Genet
ics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,
1979）。ドナー菌株の一晩培養は１：２０に希釈され、予め温められたルリアブ
ロスに加え、３７℃で振とうさせながら１時間成長させ、その後、０．０１の感
染多重度（MOI）で、P22Htintにより感染させた。感染混合物を一晩、或いは約 １５時間振とうさせた。数滴のクロロホルムを添加してバクテリア細胞の溶解を
確実にし、さらに、混合物を３７℃で１０分間振とうさせた後、ソルバール（So
rvall）SS-34回転器で、１０分間7,000rpmで遠心分離させ、バクテリア砕片を除
去した。上澄液を抽出して取除き、きれいな試験管へ移動させて、１滴又は２滴
のクロロホルムを添加して、４℃で保存させた。一般に、前記方法により、χ30
00の約１０１０PFU/mlタイターを含有するファージ溶解産物が得られる。テトラ
サイクリンが12.5μｇ/ｍｌでプレートにて利用され、Tn10導入体、Tn10誘導突 然変異、又は染色体に組込ませたスイサイドベクターからのTn10誘導テトラサイ
クリン耐性遺伝子を発現する部分接合体菌株に対して選択された。Tn10トランス
ポゾンは低周波数で染色体から切除され、しばしばトランスポゾンにフランキン
グするゲノム部分を欠失する。さらに、切除される細胞はテトラサイクリンの影
響を受け易くなり、テトラサイクリン耐性をバクテリアを殺すフザリン酸を含有
する培地にて培養させることにより確認される（MaloyとNunn., J.Bacteriol. 1
45: 1110-1112, 1981）。テトラサイクリン耐性遺伝子と結合したプラスミドに 沿った組込み自殺プラスミドを失ったテトラサイクリンの影響を受ける菌株は、
さらにフザリン酸培地にて選択され得る。
【００８３】 テトラサイクリン耐性培養は、３７℃で一晩、ほぼ５ｘ１０８CFU/ｍｌの12.5
μｇ/mlテトラサイクリンを含有するLブロスにて成長させた。上記培養は１：４
０に希釈され、テトラサイクリンのない予め温めたＬブロスに移し、３７℃で酸
素を供給して約２ｘ１０９CFU/mlのタイターになり、連続的に、BSGへ希釈させ 、フザリン酸場位置の上記希釈から培養させた。フザリン酸耐性コロニーは、３
７℃４８時間のインキュベーション後に選択された。フザリン酸耐性コロニーは
、再度フザリン酸培地にストリークさせ、テトラサイクリンのある、及びテトラ
サイクリンのないペンアッセイ（Penassay）寒天（Difco）へパッチさせ、Tn10 誘導抗体耐性要素の損失を確認した。指摘する適当な培地にて、他の表現型も評
価した。アンピシリン耐性遺伝子を含有するスイサイドベクター、スクロース利
用カセット、及びincP可動化部位を構築した。上記プラスミドに導入された突然
変異体遺伝子は形質転換後にバクテリア染色体に導入され、好ましくは接合によ
り導入され、アンピシリン足し栄（100μg/ml）部分接合体が生じる。かかる部 分接合体は５％のスクロースを含有する培地にて成長させ、アンピシリン耐性及
びスクロース利用遺伝子に沿った組込みプラスミドの損失のために選択した。ア
ンピシリンの影響を受け易い菌株は適当な規定欠失突然変異対立遺伝子の存在に
より、表現型として特徴がある。
【００８４】 部分接合体の改良選択は、スイサイドベクターのアンピシリン耐性遺伝子に加
えて、クロラムフェニカール（chloramphenical）(40μg/ml)に耐性を付与するc
at遺伝子を導入させることにより達成される。部分接合体生成後、５％スクロー
スの培地の選択により、薬耐性遺伝子とスクロース利用遺伝子の双方の損失を引
き起こす。それから、上記組換え体は所望の対立遺伝子置換に対してスクリーニ
ングされた。
【００８５】 例１ 本実施例は、野生型親種であるχ3339と比較して、rpoS突然変異菌株χ4973を
利用してネズミチフス菌によるGALTの効率的な侵入とコロニー形成におけるrpoS
遺伝子の役割を説明する。
【００８６】 菌株構築 χ3339はGluigらにより説明されたネズミチフス菌株SL1344の野生型、ビルレ ントで、動物継代分離種である（Infect Immun 55: 2891-2901, 1987）。SF1005
はネズミチフス菌株ATCC1408sから誘導されたrpoS：：RR10突然変異体であり、r
poS：：RR10突然変異体対立遺伝子に結合したアンピシリン耐性を有する（Fang らによるProc. Nat’l. Acad. Sci., USA 89:11978-11982, 1992）。突然変異体
であるrpoS：：RR10対立遺伝子は、SF1005にて調製されたP22HTint導入ファージ
溶解産物を利用し、rpoS遺伝子のRR10挿入に結合したβ‐ラクタマーゼの存在に
よるアンピシリン耐性（Apｔ）に対して選択させて、χ3339に移動させた。SF10
05とχ3339間の対立遺伝子交換は、サザンブロット分析により確認され、結果生
じたχ3339rpoS：：RR10突然変異誘導体はχ4973と称す。導入体は、P22H5 であ
るクリアープラーク突然変異体によるクロスストリーキングによりP22HTintに対
する感度をスクリーニングした。偽溶原性コロニーは、エバンスブルー及びウラ
ニン（EBU）インディケータ寒天での非溶原性体から区別された（Sternbergらに
よる., Meth Enzymol. 204: 2-43, 1991）。χ4973に対して選択される必要があ
る際には、培地はml当たり５０μgのアンピシリンで補充された。
【００８７】 χ4973の滑面リポ多糖（LPS）は、Hitchcockらによる方法を利用して確認され
た（J. Bacteriol. 154: 269-277, 1983）。LPSはTsaiらによる方法で銀染色さ れた（Anal Biochem 119: 115-119, 1982）。本実験からrpoSでの突然変異はLPS
構造に影響を与えないことが分かった。
【００８８】 マウスにおけるRpoS突然変異体のビルレンス χ3339のビルレンスは、生後８乃至10週間のメスのBALB/ｃマウスに接種材料 を経口接種させたrpoS突然変異菌株χ4973のそれと比較した。致死量（LD50）の
５０％を決定させるための動物接種が、先に報告されたものに若干の変更を加え
て行われた（GuligらによるInfect Immun 55: 2891-2901, 1987）。マウスは経 口接種前の４乃至６時間、食と水を断った。胃の酸性度は感染前は中和されてい
なかった。３０日間評価した接種材料投与当たり、４ひきのマウスから得られた
結果を利用して、各菌株に対して、ReedとMuenchの方法により、LD５０タイター
を求めた（Am. J. Hyg. 27:493-497, 1938）。
【００８９】 RpoS突然変異菌株であるχ4973の経口LD50は、投与量当たり８ｘ１０９コロニ
ー形成単位以上であった。この値は、野生型親菌株であるχ3339にて観察された
経口致死投与量８ｘ１０５コロニー形成単位よりも４桁大きい値を示した。この
結果はFangらによる上記結果と一致し、彼は、rpoS＋親菌株であるATCC14028sと
比較して、SF1005の経口LD50投与量の３桁以上を報告している。さらなる研究が
行われ、なぜrpoS突然菌株はその野生型である親と比較して弱毒化されているか
を追求した。
【００９０】 付着、侵入及び生存の比較テスト ヒト胚腸上皮細胞系統であるInt-407（Henleらによる., J. Immunol. 79:54-5
9, 1957）と、マウスマクロファージ様細胞系統J774（Ralphらによる., Nature
257: 393-394, 1975）が、ネズミチフス菌の付着及び侵入能力に及ぼすrpoSの効
果を調べるために利用した。各細胞系統は、ハンク（Hank）バランス塩溶液（HB
SS; GibcoBRL）と、２ｍMのグルタミンと５％のCO2を含む雰囲気下での３７℃の
１０％のウシ胎児血清（FCS；HyClone, Logan, UT）を含有する最小必須培地（M
EM；GibcoBRL, Grand Island, NY）にて維持させた。細胞は２週間から３週間お
きに、培地を変化させて培養させた。感染アッセイに利用したマクロファージ単
層は、細胞件だ苦役を懸濁させ、２４ウエルマイクロタイタ皿の壁に接種させ、
５％CO2環境の３７℃でインキュベートさせた溶液にて培養細胞を優しくこする ことにより調製された。Int-407細胞を同じ方法で分布させたが、単層から除去 させるためにトリプシンで処理した。
【００９１】 ヒトの腸上皮細胞系統であるInt-407と、マウスマクロファージ様細胞系統で あるJ774からの細胞を利用してバクテリア付着及び侵入アッセイを、Galanらに よる方法に若干の変更を加えた方法で行った（Proc., Natl Acad Sci, USA 86:
6383-6387, 1989）。バクテリアは静置培養としてLブロス中で３７℃で中間対数
期まで成長させ、600nmでの光学密度は約0.5であった。細胞が定常期に入るにつ
れてrpoS及びRpoS調節遺伝子の発現が増えるので、対照培養も４日間静置させて
飽和まで成長させ、rpoS発現の最大レベルを確立させた。バクテリア培養を洗浄
し、単層の感染前にHBSSにすぐに再懸濁させた。Int-407単層付着及び侵入を、 ５％CO2雰囲気でのMEMとInt-407細胞当たり２から１０のバクテリア細胞間のMOI
で、３７℃２時間進めた。J774細胞を利用した付着及び侵入アッセイは、１時間
の付着及び侵入以外はInt-407細胞で行った。単層細胞によるバクテリア細胞の 食作用からの付着と区別するための対照として、J774細胞は、Leeらの方法によ り、バクテリア存在下４℃で監視した（Proc. Nat’l Acad. Sci., USA 87:4304
-4308, 1990）。
【００９２】 感染単層は、付着及び侵入インキュベーション後、３回等張性リン酸緩衝生理
食塩水（PBS）で洗浄され、その後、0.1％のデオキシコール酸ナトリウムを含有
するPBSで溶解させて、培養細胞に関連するバクテリアの全数を評価した。平行 して２回行った単層感染は、10μg/mlゲンタマイシンを含有するMEMでさらに２ 時間インキュベートさせ、溶解前の細胞外バクテリアを殺し、インターナライズ
バクテリアの数を数えた。生存可能なバクテリア細胞数は、L寒天の溶解単層の 希釈を培養し、１８乃至２４時間、３７℃でインキュベートすることにより得ら
れた。結果を以下の表４及び表５に示す。
【００９３】
【表９】
【００９４】
【表１０】 ネズミチフス菌株は指数関数的成長期へ成長したときに、rpoS：：RR10突然変
異体であるχ4973は、その野生型親種であるχ3339と同じ程度Int-407及びJ774 細胞に付着した（表３及び表４）。さらに、腸上皮細胞系統Int-407での双方の 菌株では、その侵入割合は同じであった（表３）。しかしながら、侵入結果から
、野生型親種と比較して、マクロファージ細胞系統J774でのrpoS：：RR10突然変
異体で僅かに減少していることがわかる（表４）。上記データは、ネズミチフス
菌が指数関数的成長段階にあるときは、rpoS遺伝子は細胞への付着又は侵入のバ
クテリアの能力には殆ど又は全く寄与していないことがわかる。しかしながら、
バクテリア細胞が定常期にあるときには、結果ははっきりしなかった。Int-407 細胞で定常期へ成長したrpoS：：RR10突然変異体により付着及び侵入は僅かに増
加したが、J774細胞で定常期へ成長したrpoS：：RR10突然変異体では付着は若干
減少した（それぞれ、表３及び表４）。示さないが、さらなる研究にて、アッセ
イを４℃で行ったところ、J774細胞への付着若しくは侵入には、上記菌株では全
く差異が無かった（提示しないデータより）。上記データにより、ネズミチフス
菌の指数関数的成長及び定常成長中にて、腸上皮細胞及びマクロファージ様さ行
棒へのインビトロでの付着及び侵入には、rpoS遺伝子生産物は殆ど若しくは全く
効果がなく、ネズミチフスLT-２からの修飾rpoS対立遺伝子を含むSL1344誘導ネ ズミチフス菌にて報告された結果と一致すること示している（Wilmes-Riesenber
gらによる., 65: 203-210, 1997）。
【００９５】 RpoS突然変異を有するネズミチフスバクテリアは、J774マウスマクロファージ
様細胞又はラット髄液誘導マクロファージにてインターナライズされると、生存
することができる。ラット髄液誘導マクロファージはスプラキードーレイラット
(Harlan Spraque Dawley, Indianapolis, IN)の大腿骨及びけい骨から入手でき 、10日間10％のウシ胎児血清（FCS）、100ユニットペニシリン/ml及び100μgス トレプトマイシン/mlを含ませたデュルベッコ最小必須培地（DMEM; GibcoBRL, G
rand Island, NY）を含有する75cm2フラスコにて成長させた。それから、５％の
CO2を含む環境下で３７℃で２４時間、10％のウシ胎児血清（FCS）と、５％のウ
シ血清（HS; Sigma, St. Louis, MO）と、１０％のL細胞調製培地と、１ｍMのグ
ルタミンと、１％のペニシリンを含有するDMEM中にてマクロファージを培養させ
た。非付着細胞を除去し、消費場位置を交換し、細胞をさらに５日間インキュベ
ートさせた。マクロファージをフラスコの表面から優しくこすり、10％のFCSと 、５％のHSと、抗生物質のない10％のL細胞調製済培地を補充させたフレッシュ なDMEMで再懸濁させ、ラット骨髄誘導マクロファージ、J774細胞それぞれ、ml当
たり５ｘ１０５、１ｘ１０６細胞の濃度で、感染実験前に２４ウエルマイクロタ
イタープレートの壁に種をつけるため利用した。
【００９６】 χ3339又はχ4973は前述のように定常期へ成長させ、Buchmeierらによる方法 を僅かに変更させて、J774細胞又はラット骨髄誘導マクロファージでの細胞内生
存アッセイに利用した（Infct. Immun., 57: 1-7, 1989）。細胞当たり２乃至１
０バクテリアの感染多重度（MOI）で前記調製された単層の感染前に、バクテリ アは３０分間、10％の正常マウス血清でオプソニン化された。感染単層は２０分
間インキュベートされ、侵入又は食作用を可能とし、それから２回PBSで洗浄し て、溶液相に残存するバクテリアを除去した。10μg/mlの下駄マイシンを含有す
るフレッシュな成長培地が添加され、感染単層を洗浄し、細胞代バクテリア成長
を阻害した。感染単層はゲタマイシン添加後、指定時間インキュベートし、洗浄
して少量の抗生物質を除去し、その後、PBS中の0.1％のデオキシコール酸ナトリ
ウムで溶解させた。溶解物の希釈液をL寒天で培養し、３７℃で２４乃至３６時 間インキュベートし、生存する細胞内のバクテリアを数えた。
【００９７】 図１及び図２は、２４時間以上での３つのウエルから得られた細胞に関連する
バクテリア数の平均と標準偏差の対数を示す。χ3339とχ4973の双方は、最初の
２時間から４時間の間はバクテリア細胞数において減少を示したが、その後、J7
74での次の２０時間の間に、細胞数は増加した。しかしながら、上記バクテリア
の生存可能な数の減少はラット骨髄マクロファージでの４乃至２０時間で観測さ
れたが、rpoS野生型又はrpoS突然変異菌株間では、生存したバクテリアの数にお
いては殆どその差異はなかった。よって、ネズミチフス菌rpoS突然変異体はマウ
スマクロファージ様J774細胞、又はラット骨髄誘導マクロファージだけでなく、
それらの野生型親種においても生存可能であり、rpoS遺伝子生産物は、上記マク
ロファージにおいて微生物の生存には殆ど若しくは全く役割を果たしていないこ
とを示唆している。
【００９８】 感染後のrpoS突然変異の組織分布 rpoS：：RR10突然変異体と野生型菌株のGALTコロニー形成能力を比較するため
に、動物感染性の研究を行った。 上記研究に利用したバクテリアは、100ml体積のLブロス中３７℃で好気性に成
長させて、600nmでの光学密度は0.8であった。バクテリアは7,000rpmで10分間遠
心分離させて収穫した。細胞ペレットをゲラチンのある１ml緩衝生理食塩水（BS
G）で再懸濁させた。
【００９９】 Charles River Laboratories(Wilmington, MA)から購入した生後８乃至１０週
間のメスのBALB/cマウスを、χ4973rpoS突然変異体とχ3339野生型菌株の双方で
共感染させる、又は各菌株で個々の感染させた。それぞれの共感染及び個々の感
染実験では、3つのマウスを４つのグループのそれぞれに、ほぼ同数のバクテリ アで経口接種させた。経口接種３日後と５日後に、マウスは１時間で１度にCO2 窒息により安楽死させた。関心のある器官及び組織を無菌で取りだし、組織ホモ
ジナイザー（Brinkman Instruments）で均質化させた。パイエル板を表わす５乃
至１０のリンパ濾胞を各マウスから収集し、均質化させる前にまとめた。均質化
物はBSGにて希釈され、アンピシリンあり及び無しのマッコンキー（MacConkey）
の１％ラクトース寒天にて培養した。これにより、野生型及びrpoS突然変異体ネ
ズミチフス菌の双方の全数の比較が可能となり、rpoS突然変異バクテリアの全数
はうまく同じ組織でコロニー形成した。共感染及び個々の感染実験の結果を以下
の表５及び表６に、それぞれ示す。
【０１００】
【表１１】
【０１０１】
【表１２】 rpoS突然変異菌株であるχ4973及び野生型菌株であるχ3339は、混合（表５）
及び個々の（表６）の感染の双方で、３日後の腸管と関連するバクテリア数によ
り判断すると、同様な効率で胃腸管で、初期にはコロニー形成する。よって、生
存したrpoS突然変異体は、胃だけでなく野生型親菌株を経由して培養した。
【０１０２】 しかしながら、rpoS突然変異菌株χ4973は、その野生型親菌株であるχ3339と
比較すると、パイエル板でコロニー形成させるにはあまり効率的ではない（表５
及び表６）。rpoS菌株の上記欠点は、脾臓においてより鮮明となる（表５）。よ
って、rpoS突然変異対立遺伝子体のあるネズミチフス菌株は、免疫応答が引き出
される二つの主要なリンパ系器官であるGALT及び脾臓にてコロニー形成する能力
において瑕疵がある。
【０１０３】 生成物を染色体的にコード化する遺伝子の発現を、rpoS遺伝子生産物が調節す
るかどうかを決定することは、パイエル板の腸チフスコロニー形成によって重要
であり、野生型χ3339及びrpoS突然変異体χ4973菌株はそれらのビルレンスプラ
スミドを治療し、それぞれ、プラスミドキュア同質遺伝子系誘導体χ3340とχ81
25が生成する。パイエル板にてコロニー形成する上記誘導体菌株の能力は、以下
のχ3340とχ8125を１：１の割合で経口投与させて調べ、その結果を次の表７に
示す。
【０１０４】
【表１３】 表７に示すように、rpoS突然変異菌株であるχ4973のビルレンスプラスミドキ
ュア誘導体であるχ8125は、野生型χ3339菌株のビルレンスプラスミドキュア誘
導体であるχ3340のコロニー形成能力と比較して、感染５日後のパイエル板でコ
ロニー形成能力が減少した（約５．１倍）。上記データにより、RpoSが、経口接
種後のマウスパイエル板でうまくコロニー形成させるために重要である、生成物
を染色体的にコード化する遺伝子の発現を調節することを示している。
【０１０５】 パイエル板の組織学に及ぼすRpoS‐の効果 パイエル板は、χ3339又はχ4973で経口接種後のさまざまな時間で、マウスの
腸管壁から除去され、その直後に、pH 7.4の0.1Mのリン酸ナトリウム緩衝液中の
1.5％のグルタルアルデヒドと1.5％のパラホルムアルデヒドの氷冷却溶液に固定
し、続いて、さらにpH 7.4のリン酸ナトリウム緩衝液中の2.5％グルタルアルデ ヒドに室温で１時間固定した。固定させた組織の厚くスライスした部分をエポキ
シ組織染色（Electron Microscopy Science, Fort Washington, PA）で染色して
、パイエル板のドームを配置させた。薄くスライスさせた部分は、７５ｋVの加 速電圧で動作させた日立H-600透過型電子顕微鏡（TEM）で調べた。
【０１０６】 光又はTEM顕微鏡での観察から、野生型ビルレント菌株χ3339で経口接種させ た１日後の早い段階でパイエル板の上皮の完全性において、大きな形態上の変化
が起きていることがわかる（図3E及び図3F）。χ3339による経口接種３日後及び
５日後での小胞関連上皮（FAE）の破壊、図3G及び図３Hではより鮮明となった。
エンテロサイト（enterocyte）はドーム上皮から完全に脱皮されており、広範囲
での表皮壊死症が観測された。加えて、χ3339によるマウスの経口接種５日後に
は、パイエル板のリンパ系小胞組織の細胞濃度に劇的な減少が観測された（図３
H及び図４C）。
【０１０７】 対照的に、感染していない又はrpoS突然変異菌株χ4973で感染させたマウスか
らのパイエル板では、χ3339感染により発生する組織形態上の劇的な変化は観測
されなかった。代わりに、ドーム上皮の完全性は傷つかず、基礎となるリンパ系
組織の細胞密度の減少は、経口接種１日、３日及び５日後で殆ど観測されなかっ
た（図３B乃至図３D）。
【０１０８】 rpoS突然変異体χ4973による経口接種前及び接種５日後のパイエル板のTEM分 析から、FAEは無傷のままであるが（図５A及び図５B）、FAEが経口接種１日後の
早い段階で、χ3339感染させたパイエル板にて完全に破壊された（図５F）。
【０１０９】 基礎となるリンパ組織での劇的な形態上の変化は、TEMで観測した場合に、さ らに明白となった。χ4973で感染５日後、パイエル板の小胞内のリンパ系細胞は
健康そうであり、非感染のマウスからのパイエル板の形態と同様であった（図５
A及び図５B）。対照的に、χ3339により感染させた後、５日後のパイエル板リン
パ系細胞では、全体の形態において広範囲な変化が観測された（図５C）。
【０１１０】 上記結果から、ネズミチフス菌のrpoS突然変異体はGALTに効率的に侵入せず、
さらにコロニー形成も効率的にしないことが分かった。結果として、rpoS突然変
異体は、GALTのコロニー形成に依存する一般の粘膜免疫応答に刺激を与えるには
欠陥があると期待されるであろう。さらに、GALTは腸間膜リンパ節及び脾臓に入
る玄関口であるので、突然変異体は上記の深いリンパ系組織に侵入し、そこでコ
ロニー形成するには非効果的であると予想される。これは、腸間膜リンパ節及び
脾臓のコロニー形成に左右される全身、体液免疫だけでなく細胞免疫応答に刺激
を与える点でその突然変異体は欠陥があると予想される。対照的に、野生型rpoS
対立遺伝子を含有する菌株は、GALT及びより深いリンパ系組織に、より効率的に
侵入し、コロニー形成をし、結果として、粘膜、体液及び細胞免疫応答を引き出
す際により効果的である。
【０１１１】 一方、rpoS‐菌株はパイエル板組織を破壊し、かかる菌株をワクチンには理想
的でない候補にしてしまう。したがって、突然変異を減少させる少なくとも一つ
のビルレンスで、rpoS＋微生物を変質させることが望ましく、その微生物はパイ
エル板組織を破壊することなく、パイエル板に侵入し、そこでコロニー形成可能
である。
【０１１２】 例２ 本例は、rpoS+ ネズミチフス菌株及び腸チフス菌株と、ヒト用ワクチンとして
使用するのに適当なその他のバクテリアとを与えるために遺伝子に明確な欠失突
然変異を構築する際に使用され得る方法を実証する。
【０１１３】 トランスポゾンTn10を用いる染色体欠失の発生は、サレモネラ菌を含む多種類
のバクテリアにおいて知られている（Kleckner et al., J. Mol. Biol. 116:125
-159, 1997; EPO Pub. No.315,682; U.S. Patent No.5,387,744を参考のため引 用する）。近年、特異突然変異を遺伝子に導入する新しい方法が利用できるよう
になった。突然変異させられる遺伝子は、クローニングベクターにおいて構築さ
れたゲノムＤＮＡライブラリに含まれるクローンの集団から選択され、或いは、
全部若しくは一部の遺伝子を含む増幅生成物をクローニングすることにより選択
される。このような遺伝子若しくは遺伝子の一部分に導入された突然変異は、明
確な欠失として公知であり、以下の２通りの汎用的な方法の中の一方を用いて作
成される。
【０１１４】 一方の方法は、組み換えベクターから分離された遺伝子の全部若しくは一部を
取り除くため制限酵素を利用する。この方法は、ＤＮＡ配列情報を利用すること
ができない遺伝子の突然変異が可能にする。しかし、この方法は、遺伝子中、若
しくは、クローン化された遺伝子の隣にあるＤＮＡ中に存在する制限部位を使用
する点で制限されている。
【０１１５】 もう一方の方法は、欠失させられる遺伝子内若しくは遺伝子の側面にあるＤＮ
Ａ内のいずれかで既知のＤＮＡ配列に基づいて合成された分散ＰＣＲプライマー
を利用する。プライマーは、クローン化された遺伝子を含むベクターと混合され
、逆ＰＣＲ反応をうけ、標的遺伝子の全部若しくは一部を欠失した完全なプラス
ミドの増幅を生じる(Innis et al., infra)。ＰＣＲ反応は、クローン化された 遺伝子から失われるべきＤＮＡの指定されたセグメントの隣にある上流及び下流
の領域を増幅し、クローニングベクターと、上流及び下流のフランキング配列と
を含む生成物を発生する。逆ＰＣＲ法は、既知のＤＮＡ配列内の任意の位置で任
意のサイズの突然変異を置換し、作られるべき新規制限部位を、他のクローン化
された配列を次に挿入するため使用され得るＰＣＲプライマー若しくは標的ＤＮ
Ａに導入することができるので、好ましい方法である。明確な欠失を発生する別
のＰＣＲ法は、遺伝子若しくはフランキングＤＮＡ配列の部分を表現する増幅さ
れたＰＣＲ生成物に依拠する。これらは、明確な欠失突然変異を作るため、クロ
ーニングベクター内で一つに連結される。
【０１１６】 ゲノムライブラリは、任意の数のクローニングベクターにおいて構築すること
ができる(Sambrook et al., supra)。欠失が発生されるべき遺伝子を含むクロー
ンは、同一遺伝子に突然変異を含むバクテリア菌株内の相補性によってゲノムラ
イブラリから分離される。
【０１１７】 たとえば、野生型ネズミチフス菌UK-1（χ3761）は、ユニークな８塩基カッタ
ー：AsCI、PacI及びPmeIに対する単一部位を担うpUC19誘導体であるpNEB-193(Ne
w England Biolabs)のような適当なクローニングベクターにおいて作成すること
ができる。一般的に、ゲノムＤＮＡは標準的な方法によって分離される(Sambroo
k et al., Molecular Cloning/A Laboratory Manual Second Edition, Cold Spr
ing Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York 1989)。一部消化されたゲノ
ムＤＮＡであるSau3Alは、アガロースゲル上で選別され、Promega、Quiagen又は
Bio101からキット形式で市販されている方法を用いて抽出される。２kbから６kb
のＤＮＡ断片は、分離され、プラスミドに連結される。プラスミドは、製造元の
指示に従って、最初にBamHI若しくはBglIIを用いて消化され、次に、アルカリホ
スファターゼを用いて脱リン酸化される。得られたプラスミドライブラリは、ゲ
ノムライブラリを増幅し、２kb乃至６kbのサイズの範囲内のランダムゲノムＤＮ
Ａ挿入を含む組み換えプラスミドの集団を得るため、適切な大腸菌株に導入され
る。関連したクローンは、大腸菌株若しくはネズミチフス菌株の相補性によって
ゲノムライブラリから分離される。
【０１１８】 遺伝子のＤＮＡ配列がわかっている場合、ＰＣＲプライマーが合成され、遺伝
子と、屡々、一部のフランキング配列がＰＣＲ法を用いてバクテリアのサンプル
から直接に、若しくは、精製されたゲノムＤＮＡから増幅され、生成物はpNEB-1
93のようなプラスミドにクローン化される。かくして、配列がわかっている場合
、ゲノムライブラリの選択は不要である。
【０１１９】 明確な欠失がベクター上に存在し、選択可能な遺伝標識に連結される限り、実
質的に任意のクローニングベクターが本発明の菌株を作成するため使用される。
明確な欠失突然変異を染色体に導入するため、感熱性レプリコン(Hamilton et a
l., J. Bacteriol. 171:4617-4622, 1989)、recBC突然変異の連鎖形質転換(Jasi
n et al., J. Bacteriol. 159:783-786, 1984)、及び、スイサイドベクターとし
て知られている宿主制限レプリコン(Miller et al., J. Bacteriol. 170:2575-2
583, 1988)を含む多数の異なる方法が利用可能である。これらの方法は、いずれ
も、対立遺伝子置換を生じ、これにより、ベクター上に構築された突然変異対立
遺伝子は、染色体上の野生型対立遺伝子を置換し、或いは、その逆に野生型対立
遺伝子が突然変異対立遺伝子を置換する。
【０１２０】 pir依存性R6Kレプリコンは、多数の研究者によって使用され、対立遺伝子置換
として利用可能な最も信頼できるスイサイドベクターの一つである。R6Kプラス ミドの複製は、pir遺伝子生成物を必要とする。pir依存性プラスミドは、pir-宿
主バクテリア内で複製されないので、pir依存性プラスミド上の明確な欠失突然 変異は、プラスミドがプラスミド上に構築された欠失の隣にある相同性領域内の
宿主染色体に組み込まれる稀な事象の選択を可能にさせる。プラスミドが複製で
きない場合でも、組み込み事象によってプラスミド上の要素の安定保持のメカニ
ズムが得られるので、この事象は、プラスミドが組み込まれた菌株に一部の選択
可能な表現型を与える。抗生物質抵抗性要素は、組み込まれたプラスミドを残す
選別のため一般的に使用され、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコ
ール、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、及び、その他
の周知の物質に対する抵抗性をエンコードする遺伝子から選択される。組み換え
スイサイドベクターと共に明確な欠失を含む宿主菌株は、同一遺伝子の２個の異
なる対立遺伝子を含むので、部分二倍体として特徴付けられる。一般的に、ベク
ター上に形成された欠失は、遺伝子欠失を表現し、染色体上で組み込まれた生成
物は、組み込まれたベクターの一端の隣にある野生型対立遺伝子と、ベクターの
他端の明確な欠失突然変異対立遺伝子の存在によって特徴付けられた構造を有す
る。その他の構造は従来技術において周知である。
【０１２１】 スイサイドベクターが染色体から摘出されたバクテリアは、抗生物質抵抗性標
識(マーカー)と共に、特殊培地上で選択され得る。２通りのこのような対抗選択
方法が抗生物質感受性菌株を識別するため利用される。例１に記載された一方の
方法は、テトラサイクリン抵抗性菌株のフザリン酸感受性に基づいている。フザ
リン酸プレート上に現れるコロニーは、テトラサイクリン抵抗性を取り除き、突
然変異対立遺伝子を残すため選別される。もう一方の対抗選択方法は、５％のス
クロースの存在下でレバノスクラーゼ(levanosucrase)の発現がsacB遺伝子を保 持する細胞に対し有毒であるsacRBシステム(Kaniga et al., Gene 109:137-141,
1991)を使用するスクロース感受性の利点を利用する。
【０１２２】 任意の明確な欠失突然変異対立遺伝子を菌株に導入した後、突然変異遺伝子に
関連した表現型は、周知の標準化されたテストを用いて表わされる。これらのテ
ストの中には、表現型復帰頻度の判定、サザンブロット若しくはＰＣＲによる欠
失の確認、Ｏ−グループ特定抗血清による凝集反応、完全LPSの生成、鞭毛Ｈ抗 原の存在、運動性、プラスミド含有量、及び、栄養要求性が含まれる。
【０１２３】 突然変異菌株は、欠失が引き起こされた領域に対応した遺伝的素質の損失がサ
ザンブロットによって示される。これは、野生型及びプラスミドに作成された明
確な欠失突然変異対立遺伝子に対するＤＮＡの移動度のシフトによって現われる
。突然変異菌株のＰＣＲ分析は、ＤＮＡ分離が必要とされないので、明確な欠失
の存在を確認するために要する時間を著しく短縮し、その結果は１日未満に得ら
れる。ＰＣＲ法は、誤りのある組み換え事象の識別、及び、デリバリーベクター
配列の保持を可能にする。これは、ＰＣＲ生成物のゲル分析の際に予測されない
移動度シフト若しくは多数のＤＮＡ断片の生成として現れる。
【０１２４】 作成後、明確な欠失突然変異体を含む菌株は、突然変異と関連した特性、及び
／又は、菌株が免疫原性かつ弱毒性であるために重要な事項について完全に評価
される。たとえば、親野生型菌株と類似した全長LPSの生成は、銀染色ゲルを用 いて評価される。正しいＯ−抗原の確認は、突然変異細胞の抗血清凝集反応によ
り判定される。突然変異菌株は、希釈ポリＨ抗血清(Difco)を用いて陽性凝集反 応について評価され、柔らかい寒天培地運動性管内で、親菌株並びに鞭毛状では
ない対照菌株χ3420及びχ3422に対する運動性テストをうける。標準的な臨床AP
Iテストストリップは、親菌株と比較するための発酵及び生化学データを得るた め各突然変異菌株の分離の後に使用される。突然変異菌株の成長速度及びプラス
ミド含有量は、親菌株の成長速度及びプラスミド含有量と比較される。腸チフス
菌株の場合、ネズミチフス菌に存在する多量の毒性プラスミドは、腸チフス菌に
含まれないのでプラスミド含有量は評価されない(Gulig et al., Infect. Immun
. 56:3262-3271, 1987)。
【０１２５】 phoP、phoQ及びphoPQ遺伝子に明確な欠失を作成する方法 サルモネラphoPQオペロンは、phoP遺伝子と、隣の下流側のphoQ遺伝子とによ り構成される。オペロンのすべてのヌクレオチド配列及び一部のフランキング配
列はわかっているので、phoP遺伝子及びphoQ遺伝子中の明確な欠失は、逆ＰＣＲ
戦略を用いて構築され得る。ＤＮＡ配列は、遺伝子中に明確な欠失を作成する際
に役に立つ可能性のある制限部位の存在及び位置を明らかにする。遺伝子は、単
一の2,110塩基ペアＰＣＲ生成物上で分離され、プラスミドベクターにクローン 化される。phoPQ遺伝子カセットを含む組み換えベクターは、phoP遺伝子の大部 分を除くため制限酵素を用いて消化され、phoQ遺伝子はそのまま残される。phoP
Q遺伝子カセット上の明確なphoP欠失は、スイサイドベクターに挿入され、抗生 物質抵抗性部分二倍体(merodiploid)を生成するため野生型phoPQサルモネラの染
色体に導入され得る。抗生物質抵抗性部分二倍体は、抗生物質抵抗性標識と共に
組み込まれたプラスミドの損失を選択するため適切な培地上で成長させられる。
抗生物質感受性菌株は、寒天オーバーレイ法(Kier et al., J. Bacteriol. 130:
399-410, 1997)を用いてホスファターゼ酸活性の損失を選別することにより、適
当な明確な欠失phoP突然変異対立遺伝子の存在が表現型として表される。phoP若
しくはphoQのいずれかの突然変異は、PhoP-表現型を与えるために十分である。
【０１２６】 PhoQ中の明確な欠失突然変異、又は、phoP及びphoQの両方の明確な欠失突然変
異は、類似した戦略を使用し、phoQ、又は、phoPとphoQの両方からＤＮＡの明確
なセグメントを取り除くため制限酵素を使用し、部分二倍体を発生させるためス
イサイドベクター上で染色体に導入されることにより発生させられる。部分二倍
体は、適切な培地上で組み込まれたプラスミドの損失及び抗生物質抵抗性標識に
ついて対抗選択され、遺伝子型を検証するためＰＣＲを用いて関連した明確な欠
失突然変異対立遺伝子の存在について表現型的に選択される。
【０１２７】 cya遺伝子中の明確な欠失の構築 MacConkeyマルトース培地で成長した大腸菌突然変異菌株にマルトース陽性表 現型を与える組み換えベクターは、サルモネラcya遺伝子に明確な欠失を構築す るため使用される。既知のサルモネラcya遺伝子配列に基づく分散プライマーは 、ベクター及びＰＣＲプライマー位置によって指定された欠失したＤＮＡの一方
の端に接するＤＮＡを含む直鎖生成物を生ずるため、テンプレートとして相補的
な組み換えベクターとの逆ＰＣＲ反応で使用される。或いは、制限酵素は、組み
換えベクターから相補性cya遺伝子の全部若しくは一部を取り除くため使用され 得る。
【０１２８】 いずれかの方法を用いて構築された明確な欠失は、制限酵素を用いてクローニ
ングベクターから摘出され、抗生物質抵抗性標識を含有するスイサイドベクター
に導入される。明確な欠失cya対立遺伝子を含有する生成された組み換えスイサ イドベクターは、抗生物質抵抗性部分二倍体を作るため、野生型cyaサルモネラ 菌株の染色体に導入され得る。部分二倍体は、組み込まれたプラズマの損失を抗
生物質抵抗性標識と共に選別するため適切な培地で成長させられる。抗生物質感
受性菌株は、適切な明確な欠失Δcya-27突然変異対立遺伝子の存在を表現型とし
て表わす。MGM-232及びχ8217は、上記の方法（表１を参照せよ）によって構築 された明確なΔcya-27突然変異をもつ二つのネズミチフス菌UK-1菌株である。
【０１２９】 crp遺伝子中の明確な欠失の構築 サルモネラcrp遺伝子中の明確な欠失は、cya中に明確な欠失を構築するため使
用された戦略に類似した戦略を用いて構築され得る。MacConkeyマルトース培地 で成長した大腸菌crp突然変異菌株にマルトース陽性表現型を与える組み換えベ クターが選択される。分散ＰＣＲプライマーは、既知のサルモネラcrp遺伝子及 びフランキング配列を削除するため使用され、抗生物質抵抗性部分二倍体を生成
するため、得られた明確な欠失はスイサイドベクター上で野生型crpサルモネラ 菌の染色体に導入される。部分二倍体は抗生物質抵抗力の損失と組み込まれたプ
ラスミドを選別するため適切な培地上で成長させられ、抗生物質感受性菌株は、
適切かつ明確な欠失crp突然変異対立遺伝子の存在を表現型として表わす。
【０１３０】 Δcya Δcrp 二重突然変異の構築 cyaとcrpの両方に明確な欠失突然変異を含有する菌株を構築することも可能で
ある。たとえば、cya突然変異は上記の如く構築され、次に、明確な欠失突然変 異crp対立遺伝子は、適切な抗生物質培地上で選別された部分二倍体を生ずるた めスイサイドベクターに導入される。上記のようにフザリン酸若しくは５％スク
ロースのような適切な培地での部分二倍体の成長は、遺伝子からスイサイドベク
トルの損失を抗生物質抵抗性遺伝子を対抗選択するため使用され、適切な明確な
欠失crp突然変異は、２mMのcAMPを含有するMacConkeyマルトース培地上で表現型
的に識別され得る。その理由は、cya遺伝子によってエンコードされたアデニル 酸シクラーゼは、cya突然変異をMacConkeyマルトース寒天上で表現型cya+に変え
るからである。しかし、crp突然変異は、cya突然変異菌株がマルトースを発酵で
きないようにするので、マルトース培地上の選別によって、明確なΔcya及びΔc
rpの両方の突然変異をもつ菌株を簡単に検出できるようになる。MGN-431及びχ8
214は、このような方法で構築された明確なcya及びcrp欠失突然変異を含む２種 類の菌株である（表１を参照）。
【０１３１】 pmi及びcdt遺伝子中の明確な欠失の構築 サルモネラ菌を弱毒するため、cdt対立遺伝子及びpmi対立遺伝子を含む他の遺
伝子中の突然変異が示される。pmi遺伝子中の明確な欠失は、逆ＰＣＲ戦略又は 制限酵素を用いて構築される。MacConkeyマンノース培地で成長した大腸菌若し くはサルモネラ突然変異菌株にマンノース陽性表現型を与える組み換えベクター
は、制限酵素若しくは逆ＰＣＲのいずれかを用いて明確な欠失pmi対立遺伝子を 構築するため使用され得る。明確な欠失pmi対立遺伝子は、抗生物質抵抗性部分 二倍体を発生させるため、スイサイドベクターに挿入し、pmi+サルモネラ菌の染
色体に導入させることができ、この部分二倍体は、組み込まれたプラスミドの損
失を抗生物質抵抗性遺伝子と共に選別するため適当な培地上で成長させられる。
抗生物質感受性菌株は、反転可能な粗・滑表現型を選別し、マンノースの存在下
で成長したLPS Ｏ−抗原の合成に起因した滑表現型と、LPS Ｏ−抗原が存在す
るときに凝集が存在しないことにより検出されるマンノースの不在時に成長した
粗表現型とを検出することによって、適切な明確な欠失pmi突然変異対立遺伝子 の存在として表現型的に表わされる。
【０１３２】 Cdt-表現型をサルモネラ菌に与える明確な欠失は、サルモネラ菌cdt突然変異 を相補する組み換えベクターからこの表現型に関連したＤＮＡを除去するため制
限酵素を用いて構築され得る。この戦略を用いて構築された突然変異対立遺伝子
は、抗生物質抵抗性部分二倍体を生ずるため、スイサイドベクトルに挿入され、
cdt+サルモネラ菌の染色体に導入され得る。部分二倍体は、組み込まれたベクタ
ーの損失を抗生物質抵抗性標識と共に選別するため適切な培地で成長させられ、
抗生物質感受性菌株は、適切な明確な欠失cdt突然変異対立遺伝子の存在を表現 型的として表わす。
【０１３３】 例３ 本例は、菌株MGN-1191及びMGN-1256をそれぞれ生成するため、腸チフス菌ISP1
820及びTy2において明確なΔphoPQ23及びΔasdA16欠失を構築する方法を説明す る。
【０１３４】 ISP1820及びTy2の両方のバックグラウンド中の明確なΔphoPQ23 ΔasdA16 腸チフス菌株の構築には、ΔphoPQ23領域を含有するpMEG-213と、ΔasdA16領域 を含有するpMEG-006の２種類のスイサイドプラスミドの使用が関係する。
【０１３５】 ΔphoPQ23欠失は、PhoPのリン酸化に寄与するPhoPの末端とPhoQのHis領域とを
エンコーディングする1103 bp EcoRV−TthIII1断片を取り除くEcoRV及びTthII
II1を用いてpMEG-068を消化することによって得られる（図６を参照せよ）。直 鎖状プラスミドは、次に、T4 ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理され、pMEG-210
を生成するため再連結される（図６を参照せよ）。ΔphoPQ23欠失を含有するpME
G-210のBamHI-XbaI断片は、pMEG-213を生成するため、pir依存型スイサイドベク
ターpMEG-149に挿入される（図６を参照せよ）。pMEG-213は、アンピシリン抵抗
性の選択可能な標識と、対抗選択可能な標識でありスクロースに対する感受性を
生ずるレバノスクラーゼをエンコーディングする移動可能スイサイドベクターで
あるため、プラスミドは、アンピシリン抵抗性を好適に選択し、次に、スクロー
スが存在する場合に野生型phoPQ遺伝子のphoPQ23による置換を対抗選択する菌株
に共役させられる。pMEG-213のデリバリーの役目を担う宿主菌株は、MGN-758を 生成するため、pMEG-213をPir+ Asd-デリバリー宿主MGN-617に形質転換するこ とによって獲得された。
【０１３６】 ΔphoPQ23欠失の腸チフス菌ISP1820、χ3744、並びに、腸チフス菌Ty2、χ376
9への導入は、MGN-758を野生型腸チフス菌の親と共役させ、DAP（ジアミノピメ リン酸）を用いないで成長したアンピシリン分離を選別することにより行なわれ
た。この共役によって得られた分離は、ΔphoPQ23欠失の染色体への第１の組み 込みを表現し、突然変異ΔphoPQ23をもつ野生型遺伝子の複製を生成する。これ らの分離体MGN-1037及びMGN-1017は、次に、アンピシリン抵抗性スイサイドベク
ターの損失を選択するため、５％スクロースを含むルリア(Luria)寒天上で培養 される。この選択によって選られた分離体は、Kier他による寒天オーバーレイ法
を使用してホスファターゼ酸活性に関して選択された(J. Bacteriol. 130:399-4
10, 1977)。白色ホスファターゼ陰性コロニーは、ΔphoPQ23ホスファターゼ（−
）表現型について確認され、腸チフス菌ISP1820に対するMGN-1038及び腸チフス 菌Ty2に対するMGN-1018としてストックされた。
【０１３７】 明確なasd欠失の導入は、異種抗原のデリバリー用のワクチン菌株を得るため 必要とされる。pMEG-006上にある明確なasd欠失は、新しいユニークBglII部位を
含有するpMEG-006を生成すべく、219bpから1460bpの間でasd遺伝子のコーディン
グ領域の大半を取り除くため、pMEG-003上で逆ＰＣＲを実行することにより得ら
れる（図７を参照せよ）。pMEG-006は、トランスポゾンTn10からのpir依存型レ プリコン及びテトラサイクリン抵抗性遺伝子を有するが、共役が行なえる移動性
機能はない。
【０１３８】 明確なΔasdA16欠失を菌株に導入するためには、プラスミドＤＮＡを菌株に電
気穿孔させる必要があり、望ましくは、次に、テトラサイクリン抵抗性に関して
選択される。得られたテトラサイクリン抵抗性分離体は、スイサイドベクターの
テトラサイクリン抵抗性要素の損失を選択するための媒質を含有するフザリン酸
上で培養され(Maloy et al., J. Bacteriol. 145:1110-1112, 1981)、次に、Asd - DAP要求表現型に関しスクリーニングされる。MGN-1038及びMGN-1018は共に、
pMEG-006及び得られたテトラサイクリン抵抗性分離体とを用いて電気穿孔された
。次に、分離体は、５０μｇ DAP/mlを含有するフザリン酸で培養され、得られ
た分離されたコロニーは、スイサイドベクターのテトラサイクリン抵抗性要素の
損失についてスクリーニングされ、野生型asd遺伝子はΔasdA16突然変異によっ て置換された。分離体は、次に、テトラサイクリン感受性及びDAPの必要性につ いて確認された。各菌株の腸チフス菌ΔphoPQ23 ΔasdA16 誘導体は、MGN-119
1(ISP1820)及びMGN-1256(Ty2)と称される更なるワークに関して選択される（表 １を参照せよ）。
【０１３９】 例４ 本例は、サルモネラ菌株のRpoS+表現型のテスト方法を説明する。
【０１４０】 RosSは、ネズミチフス菌中のkatE遺伝子からヒドロペルオキシダーゼIIカタラ
ーゼの発現を積極的に要求するので、カタラーゼ活性のテストは、菌株のrpoS対
立遺伝子状態を判定する一つの方法を提供する。培養は、１００μｌの過酸化水
素(H2O2)を固定相まで成長した１ミリリットルの各菌株に加えることによって、
RpoS表現型の指標としてカタラーゼ生成物について分析される(Mulvey et al.,
Gene 73:337-345, 1988)。過酸化水素の添加後の固定相培養の活発なバブリング
は、菌株が野生型rpoS対立遺伝子を含有することを示し、一方、最低限のバブリ
ングは、菌株が欠損rpoS対立遺伝子を含有することを示す。
【０１４１】 弱毒サルモネラ菌株のRpoS表現型は、栄養欠乏と酸及び酸化ストレスとに対す
る菌株の感受性を評価することによっても判定され得る。サルモネラ菌rpoS突然
変異は、野生型の親よりもこれらのストレスに耐える能力が低下していることが
知られている(Fang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:11978-11982, 1992)。
延命した固定相生存の評価は、6日間に亘って３７℃の回転攪拌器上のM9培地内 で行なわれる。ｐH４．０に対する感受性は、固定相バクテリアをペレット状に して、クエン酸塩緩衝液でｐH４．０に調製されたＬ肉汁内に細胞を再懸濁させ ることによって判定される。酸化ストレスに対する菌株の感受性は、１５ｍＭの
最終濃度まで過酸化水素をＬ肉汁中の固定相バクテリアに添加することによって
判定される。上記のいずれの実験の場合も、バクテリアは生存細胞を計量するた
め、時間的に一定間隔で取り除かれ、希釈され、Ｌ−寒天上に培養された。
【０１４２】 上記の各ストレスに対するネズミチフス菌rpoS突然変異菌株の応答は、報告さ
れ、毒性のある親菌株と比較されている(Fang et al., supra)。特に、rpoSネズ
ミチフス菌突然変異体は、６日間に亘って３７℃の回転攪拌器上のM-9培地内に おいて、延長された固定相を生き残る能力が野生型の親よりも７分の１に減少し
ていることがわかった。同様に、rpoSネズミチフス菌突然変異体は、菌株の固定
相培養液がクエン酸塩緩衝液でｐH4.0に調製されたＬ肉汁中に再懸濁された後、
野生型の親よりもpH4.0によって死亡する可能性が１０倍高くなった。さらに、r
poSネズミチフス菌の９８％の接種物は、15mMの過酸化水素に晒されると６０分 以上生存できず、一方、野生型の親はこのような処理により影響を受けないこと
が分かった。
【０１４３】 RpoS表現型を判定するため使用できる別の方法は、グリコーゲンを合成するた
めサルモネラ菌の能力を評価する。rpoSヌル突然変異は、グリコーゲン陰性表現
型を生じることがわかった(Lang et al., Mol Microvbiol. 5:49-59, 1991)。特
に、glgS遺伝子は、グリコーゲン合成物に含まれるrpoS依存型遺伝子である。さ
らに、ヌルglgS突然変異は、rpoS突然変異よりも多量のグリコーゲンを蓄積する
ので、rpoSは、glgS誘導に加えてグリコーゲン合成に更なる影響を与える。した
がって、菌株がグリコーゲンを蓄積する能力を分析することによって、菌株のrp
oS対立遺伝子状態を判定することができる。
【０１４４】 グリコーゲンの蓄積は、0.06MのK2HLPO4、0.03MのKH2PO4、0.008Mの（NH4）2S
O4、0.0017Mのクエン酸ナトリウム、8.1x10-4MのMgSO4、1.9x10-4のヒスチジンH
Cl、1.5x10-5MのチアミンHCl、及び、0.056Mのグルコースを含有するＱ−３培地
上の単一のコロニー若しくはパッチとして細胞を成長させることによりテストさ
れる。栄養要求変異種菌株のグリコーゲン生合成能力を分析するとき、適当な栄
養補充がＱ−３培地に添加される。たとえば、メチオニン(20μg/ml)、トレオニ
ン(80μg/ml)、ロイシン(20μg/ml)、及び、ＤＡＰ(100μg/ml)は、Δasd菌株の
成長を維持するため、Q-3培地に添加される必要がある。さらに、腸チフス菌Ty2
及びISP1820は、それぞれ、cys及びcys trp突然変異体であるため、Q-3培地は 、20μg/mlの濃度のこれらの各アミノ酸が補充されるべきである。37℃で約20時
間の成長後、細胞はヨウ素及びヨウ化カリウムの溶液で処理される。野生型であ
り、グリコーゲン生合成に関して機能的である菌株は、ヨウ素処理後に茶色に変
化し、グリコーゲン生合成菌株が欠損している菌株は黄色に変化する。
【０１４５】 上記の方法の変形として、RpoS表現型は、最初に、P22HTint−介在形質導入を
用いて、テストされるべき対立遺伝子がrpoS突然変異を有すると予想される場合
にはχ3339のような野生型ネズミチフス菌に、或いは、対立遺伝子がrpoS+であ ると予想される場合にはrpos突然変異体χ4973にrPoS対立遺伝子を移し、次に、
誘導された微生物がRpos表現型であるかどうかを上記のいずれかのテスト法を用
いてテストする。rpoS対立遺伝子の対立遺伝子状態の最終的なプルーフは、ＰＣ
Ｒ法を用いるＤＮＡ配列決定によって達成され得る。
【０１４６】 例５ 本例は、GALTのバイエル板をクローニングする際に、対応したrpoS突然変異ネ
ズミチフス菌株の能力をクローニングするよりも、cya、aroA、又は、cyaとcrp の両方の遺伝子に弱毒性突然変異を有する弱毒されたネズミチフス菌rpoS+菌株 の優れた能力を示す。
【０１４７】 テストされた弱毒rpoS+ネズミチフス菌株は、Δcya/Δcrp突然変異体のMGN-43
1、ΔaroA突然変異体のχ3679、及び、Δcya突然変異体のMGN-232である（誘導 に関する表１を参照せよ）。
【０１４８】 SF1005上で増殖したバクテリオファージP22HTintは、χ8214、χ8215及びχ82
17を夫々発生させるべく、rpoS突然変異対立遺伝子を、MGN-431、χ3679、及び 、MGN-232に形質導入するため使用された。
【０１４９】 ドナー菌株の一晩中の培養液は、予め温められたＬ肉汁に１：２０で希釈され
、３７℃で６０分間に亘って攪拌させて成長させられ、0.01の多重度でP22Htint
を用いて感染させられた。感染混合物は、約15時間に亘り一晩中攪拌され、クロ
ロホルムが添加され、37℃で更に10分間攪拌され、バクテリア残骸を取り除くた
め、懸濁遠心分離された（Sorvall RC5C、 SS-34 ローター、7000回転、15分
間）。ファージ(Ca. 1010/ml)を含有する上澄み液はクロロホルムで4℃に保存 された。濃度50μg/mlまでのアンピシリンが不活性rpoS対立遺伝子を含有する導
入因子について選択するため使用された。
【０１５０】 ネズミチフス菌株のRpoS表現型は、例４に記載したようにカタラーゼとグリコ
ーゲンの合成活性をテストすることによって判定された。その結果は表８に掲載
されている。
【０１５１】
【表１４】 野生型rpoS遺伝子を有することが知られているこれらのサルモネラ菌はカタラ
ーゼ活性を示し、一方、rpoS遺伝子中に突然変異をもつそれらの菌株はカタラー
ゼ活性を示さなかった。グリコーゲン活性テストによる結果は、MGN-431を除い てカタラーゼテストと一致した。MGN-431は、rpoS遺伝子を有し、カタラーゼ陽 性であるが、グリコーゲンテストの結果は陰性であった。その原因は、グリコー
ゲン合成がcrp遺伝子機能にも依存しているためである。
【０１５２】 雌BALB/cマウス(生後６乃至１０週)(Charles River Laboratories, Wilmingto
n, Mass.)は、感染及び／又は免疫実験のため使用された。動物は、実験に使用 される前に隔離室に１週間収容された。実験用マウスは、ワイヤ床を備えたナル
ジン(Nalgene)フィルタ・ボンネット・カバー付きケージに入れられた。餌と水 は経口感染の前の４乃至６時間には与えられなかった。
【０１５３】 ネズミチフス菌の動物感染力は、経口接種の後に判定された。マウスに接種す
るためのバクテリアは、Ｌ肉汁中に37℃で静置培養として一晩に亘り成長させら
れた。これらの培養液は、1:200で予め温められた培養液中に希釈され、約４時 間に亘って37℃で0.8のOD600まで空気に晒された。細胞は、4℃のSorvall RC5C
遠心分離器内で10分間、7000rpmのGSAローターで遠心分離することにより50倍
に凝集され、次に、BSG内で懸濁させられた。滴定濃度を決めるため適当な希釈 液がＬ寒天上で培養された。ネズミチフス菌の全ての経口接種に対し、マウスは
、接種前の４乃至６時間には餌と水が奪われた。次に、マウスは、Pipetman P2
0を用いてBSG中に懸濁した20μlのネズミチフス菌が与えられた。餌と水は、経 口接種の30分後に戻された。
【０１５４】 rpoS+弱毒ネズミチフス菌株によるGALTと、特に、ペイエル板のコロニー形成 を評価するため、3匹ずつのマウスの3つのグループは、上記の条件に従って成長
させられた同量(約109のCFU)のrpoS+弱毒ネズミチフス菌株と、対応したrpoS::R
R10突然変異誘導体とが経口接種された。パイエル板の可変ネズミチフス菌の測 量は、以下の通り行なわれた。マウスは、経口感染の３、５及び７日後に安楽死
させられ、マウスのパイエル板が集められた。各マウスからのパイエル板は、無
菌状態で取り除かれ、Brinkmann組織ホモゲナイザ(Brinkmann Instruments)を用
いて均質化されたBSGを含むポリプロピレン管に収容され、氷冷された。ホモジ ネートの適当な希釈液は、アンピシリンを含む１％のラクトースとアンピシリン
を含まない１％のラクトースが補充されたMacConkey寒天上で培養された。菌株 の分化は、不活性rpoS::RR10対立遺伝子内にアンピシリン抵抗性標識が存在する
ことによって容易に行なわれた。プレートは、37℃で１２乃至１５時間に亘り定
温培養された。夫々のパイエル板内の滴定量は周期毎に判定され、サンプリング
毎に１グループ当たり３匹のマウスに対し幾何平均が計算された。
【０１５５】 表９には、経口感染後のマウスのパイエル板におけるΔcya/Δcrp、ΔaroA、 又は、Δcyaの突然変異を含有するrpoS+とrpoS::RR10の突然変異ネズミチフス菌
株の分布が示されている。
【０１５６】
【表１５】 Δcya/Δcrp突然変異体MGN-431を含有するrpoS+ネズミチフス株菌は、経口感 染の５日後にパイエル板をクローン化するため、そのrpoS::RR10誘導体菌株より
も非常に優れた能力を示した。経口感染の３日後及び５日後に、rpoS+ΔaroAネ ズミチフス菌株χ3679及びそのrpoS::RR10誘導体χ8215は、パイエル板をクロー
ン化する能力に有意な差を示さなかった。しかし、経口感染の７日後、rpoS::RR
10ΔaroA突然変異体は、パイエル板をクローン化するため、そのΔaroA親菌株χ
3679よりも非常に低い能力を示した。
【０１５７】 Coynault et al.によれば、rpoS ΔaroA誘導体は、rpoS+親菌株よりもマウス
のパイエル板をクローン化する能力に欠けるが、クローン化の低下は、経口感染
の７日後よりも早期の経口感染の２日後及び５日後に観察されたことが報告され
ている(Coynault et al., Mol. Microbiol. 22:149-160, 1996)。
【０１５８】 同様の研究はΔcya突然変異体を用いて行なわれた。表９に示されるように、 マウスに対し約1:1の比で経口投与されたとき、rpoS::RR10Δcya突然変異体菌株
χ8217は、３日後及び７日後にパイエル板をクローン化する能力が、その親菌株
MGN-232と比較して（夫々、６分の１及び７分の１に）低下することを示した。
【０１５９】 例６ 本例では、aroA若しくはcya突然変異体のいずれかを含む例５で説明したrpoS+ ネズミチフス菌株は、同質遺伝子rpoS-突然変異ネズミチフス菌株よりも、高い 免疫原性と低い毒力の優れたバランスをもつことが実証される。
【０１６０】 rpoS+表現型を有する弱毒ネズミチフス菌株によって導出された防御免疫性は 、対応したrpoS突然変異菌株を対照として、経口接種後のBALB/cマウスについて
以下のように判定された。最初に、１グループ当たり５匹のマウスは、弱毒ネズ
ミチフスrpoS+菌株又はその同質遺伝子rpoS突然変異誘導体の１０6、１０7、１ ０８及び１０9のCFUが経口接種された。免疫化の４週間後、マウスは、野生型SR
-11又はUK-1毒性親菌株の１０9CFUを用いて経口的に攻撃（免疫性テスト）され た。防御の程度は、攻撃の３０日後に生存しているマウスの数によって判定され
、そのデータは、以下の表１０及び１１に掲載されている。
【０１６１】
【表１６】
【０１６２】
【表１７】 表１０に掲載されたデータは、接種のため使用された投与量とは無関係に、rp
os+ΔaroA突然変異体χ3679を用いて経口的に免疫化されたマウスは、同質遺伝 子rpoS突然変異菌株χ8215で免疫化されたマウスよりも経口野生型攻撃に対しよ
り良く防護されることを示す。同様に、表１１には、Δcya突然変異体で弱毒さ れたrpoS+微生物による免疫化は、同質遺伝子rpoS突然変異誘導体による免疫化 よりも野生型攻撃に対し優れた防御性を生ずることが示されている。
【０１６３】 このように、この研究によれば、機能的rpoS遺伝子を有するネズミチフス菌株
は、野生型毒性サルモネラ菌株で経口的に攻撃されたとき、同質遺伝子rpoS突然
変異菌株よりも非常に優れた防御免疫性を提供することがわかる。すなわち、ネ
ズミチフス菌に機能的rpoS対立遺伝子が存在するとき、高いレベルの防護免疫性
の刺激が促進するように菌株の免疫原性が増大される。
【０１６４】 例７ 本例は、鼻腔内投与後のネズミチフス菌の弱毒RpoS+菌株が、同じ経路で投与 された対応したRpoS-菌株の免疫原性よりも優れた免疫原性を有することを実証 する。
【０１６５】 マウスに鼻腔内免疫化するためのバクテリアは、Ｌ肉汁において37℃で静置培
養として一晩中成長させられた。翌朝、この培養液は、Ｌ肉汁に1:200で希釈さ れ、0.8のOD600に達するまで37℃で空気に晒された。細胞は、4℃で10分間、700
0rpmのSorvall GSAローターで内で遠心分離により凝集され、次に、BSG内で懸 濁させられた。滴定濃度を決めるため適当な希釈液がＬ寒天上で培養された。
【０１６６】 生後８週目の雌BALB/Cマウスは、鼻腔内免疫化の約５時間前に餌と水が奪われ
た。弱毒バクテリアワクチン菌株毎に、各マウスがマイクロピペットを用いてBS
Gの0.01ml(10μl)の全容積中に１０9若しくは１０8CFUを受容するように鼻腔内 免疫化が行なわれた。免疫化は、各鼻孔に0.005ml(5μl)の懸濁液を接種し、対 照の場合には、バクテリアを含まないBSGを接種することによって行なわれた。 餌と水は、鼻腔内免疫化の30分後に戻された。
【０１６７】 鼻腔内免疫化マウスと、免疫化されていない対照は、鼻腔内免疫化の30日後に
１０8又は１０9CFUの野生型毒性ネズミチフス菌χ3339で経口的に攻撃された。 χ3339攻撃菌株は、Ｌ肉汁内で37℃の静置培養として一晩成長させられた。翌朝
、この培養液は、Ｌ肉汁に1:200で希釈され、0.8のOD600に達するまで37℃で空 気に晒された。細胞は、4℃で10分間、7000rpmのSorvall GSAローターで内で遠
心分離により凝集され、次に、BSG内で懸濁させられた。鼻腔内免疫化されるべ きマウスは、経口攻撃の約５時間前に餌と水を奪われた。マウスは、３０日間に
亘って罹患数と死亡数が観察された。この実験から得られたデータは表１２に報
告されている。
【０１６８】
【表１８】 上記表に示されるように、RpoS+微生物（χ8296）とRpoS-微生物（χ8308）の
両方の鼻腔内投与は、野生型菌株（χ3339）による攻撃に対しある程度の防御を
行なった。しかし、RpoS+菌株は16匹中の5匹が生存し、対応したRpoS-菌株は16 匹中の2匹が生存した点で、RpoS+菌株の方が効果的であった。
【０１６９】 本実験は、RpoS+(χ8296)若しくはRpoS-(χ8309)のいずれかであるネズミチフ
ス菌のΔcya Δcrp Δasd菌株を利用した。これらの微生物は、染色体Δasd突
然変異を機能的に置換するAsd+プラスミドベクターを含有しないので、ジアミノ
ピメリン酸を合成できないため鼻腔内免疫化後の24時間内に死亡することが予想
される。これは、次に、通常、ワクチン微生物に組み込まれるAsd含有プラスミ ドが付与されている微生物によって誘発された免疫応答を減少させることが予想
される。それにも拘わらず、既に説明したように、RpoS+菌株χ8296で免疫化さ れた１６匹のマウスの中の５匹は、野生型ネズミチフス菌χ3339による攻撃後に
生き残ったが、RpoS-菌株χ8309で鼻腔内免疫化された１６匹のマウスは、その 中の2匹しか攻撃後に生き残らなかった。かくして、投与後の最初の２４時間内 でさえ、RpoS+菌株は防御免疫応答を誘発する優れた能力を示した。
【０１７０】 既に文献に報告されているように、組み換え弱毒サルモネラ菌ワクチン菌株は
、粘膜及び全身免疫性を刺激するため種々の経路で投与することができる。たと
えば、Srinivasan et al.(Vaccines 95, R. N. Chanock et al., Eds., Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY, p 273-280, 1995)と、Hopkins
et al. (Infect Immun. 63:3279-3286, 1995)は、経口及び胃内だけではなく、
鼻腔内、膣内、並びに、直腸からマウスを免疫化できることを報告している。Na
rdelli-Haefliger et al. (Infect Immun. 64:5219-5224, 1996)は、ボランティ
アが組み換え弱毒腸チフスワクチン菌株を用いて直腸から免疫化できたことを実
証している。近年、Galan et al. (Vaccine 15:700-708, 1998)は、RpoS-表現型
の組み換え弱毒腸チフス菌Ty2菌株がマウスに鼻腔内投与されたときに免疫応答 を誘発し得ることを報告している。Ｍ細胞が、小腸（GALTの一部であるいわゆる
パイエル板）だけではなく、直腸内、CALT内、BALT内、並びに、可能であれは粘
膜免疫応答を生ずる他の誘導部位内でも上皮リンパ組織の上に重なることは公知
である(Mucosal Immunology, 2nd Edition, Ogra et al., Eds. Academic Press
, San Diego, 1999)。上記例は、RpoS+サルモネラ菌がGALTのパイエル板内の上 皮ドームＭ細胞を侵襲し、コロニー形成し、経口経路による投与の後に免疫応答
を誘発することを示している。これらの結果に基づいて、RpoS+サルモネラ菌が 、rpoS+遺伝子の発現に関して欠損があるサルモネラ菌株（たとえば、表現型Rpo
S-）よりも、呼吸器系最上部内でリンパ組織の上に重なるＭ細胞、並びに、GALT
のＭ細胞に巧く付着し侵襲することができると推論することは論理的である。こ
れにより、RpoS+表現型を示す組み換え弱毒サルモネラワクチンによるヒトの免 疫化は、RpoS-表現型を示すワクチンよりも薬効がある。したがって、RpoS+弱毒
サルモネラ菌は、RpoS-弱毒サルモネラ菌よりも鼻腔内、経口、胃内、及び、直 腸免疫化に対して優れている。粘膜リンパ組織をコロニー形成するため外来抗原
を発現する弱毒サルモネラ菌を投与することは、粘膜免疫性を誘発する際に格別
に重要性があるので、腸チフス菌だけではなく、ヒトに制限されたパラチフス菌
A、パラチフス菌B、パラチフス菌Cを含む種々の抗原型のRpoS+弱毒サルモネラ、
並びに、ネズミチフス、腸炎、Dublin、及び、Choleraesuisのような他の抗原型
の弱毒誘導体を用いて行なわれる。
【０１７１】 例８ 本例において、発現外来抗原に対する粘膜IgA及び血清IgG抗体を誘発するため
の、対応するRpoS-サルモネラと比較して優れた能力を有するRpoS+組換え弱毒サ
ルモネラワクチンを説明する。
【０１７２】 これらの研究では、使用されたネズミチフス菌株は、Δcya、Δcrp及びΔasd 突然変異で弱毒化され、RpoS+表現型（χ8296；表１）又はRpoS-表現型（χ8309
；表１）のいずれかであった。これらの菌株はいずれも、文献（Schodel et al.
, Infect. Immun. 62:1669-1676, 1994）に記載される方法に従って、pYA3167（
Nardelli-Haefliger et al., supra, 1996）からプレＳ１，Ｓ２融合を用いてＢ
型肝炎ウイルスコア（HBVc）粒子を生産するために、遺伝学的に操作された。HB
VcプレＳ１，Ｓ２融合を特定するプラスミドは、χ8296及びχ8309の中へエレク
トロポレーションされ、得られた菌株はプレＳ１，Ｓ２エピトープを用いたHBVc
粒子の生産のために評価された。図８Ａは、クーマシーブルーで染色されたＳＤ
Ｓゲルを示し、図８ＢはプレＳ２エピトープに向けられたハイブリドーマ５５２
０からのモノクローナル抗体２Ａ４２を用いたウェスタンブロッティングによる
ゲルの分析結果を示す図である。図示されるように、いずれの構成も、クーマシ
ーブルーゲル及び以下のウェスタンブロッティング分析の両方で容易に検出可能
な融合タンパク質を生産した。
【０１７３】 ２つの菌株の相対的免疫原性を評価するため、雌BALB/cマウス（生後８週間）
のグループを、１０９cfuのpYA3167形質変換されたχ8296及びχ8309のワクチン
菌株誘導体により経口で免疫化した。Schodel et al (1994, supra)による免疫 化スケジュールにより、マウスは２の用量のワクチンを２日間あけて経口で免疫
化された。菌株は、Ｌ肉汁の中で３７℃で一晩静置培養で成長された。翌朝、Ｌ
肉汁への１：２００希釈液は、０．８のＯＤ600を達成するまで穏やかな通気下 で成長された。ワクチン用量が０．０２ｍｌ（２０μｌ）の体積中で投与されう
るよう、バクテリアは遠心分離によって沈降され、ＢＳＧ中で所望の濃度へ懸濁
された。食物及び水は、経口免疫化の約５時間前からマウスに与えず、免疫化の
３０分後から再び与える。最初の免疫化から４週間後及び６週間後に血清試料及
び膣洗液が採取された（この方法についてはZhang et al, Biol. Reprod. 56:33
-41, 1997を参照のこと）。膣洗液中の血清IgG抗体及びIgA抗体は、抗体を完全 な長さのプレＳタンパク質（ヒスチジン融合）まで測定するＥＬＩＳＡによって
検出される。
【０１７４】 ＥＬＩＳＡのためのプロトコルは以下の通りである。９６ウェルImmulon-1プ レート（Dynatech, Chantilly, VA）は、４℃で一晩に亘り、０．２Ｍ重炭酸塩 ／炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で１０μｇの組換えHBVプレＳタンパク質(awd)
/mlで覆われた。特定的でない結合部位は、室温で１時間に亘り、リン酸塩緩衝 塩水（ＰＢＳ）中の１％ＢＳＡ＋０．１％トゥイーン２０（ｐＨ７．４）（阻止
緩衝液）で阻止された。血清試料及び膣洗液は、阻止緩衝液中で夫々１：１００
及び１：１０に希釈された。１００マイクロリットルの希釈された試料がプレー
トに重複して加えられ、２時間に亘り３７℃で保温された。次に、プレートをＰ
ＢＳ＋０．１％トゥイーン２０で３回洗浄した。ビオチン標識化ヤギアンチマウ
スIgA又はIgGが夫々加えられ、一晩に亘り４℃で保温された。アルカリ性ホスフ
ァターゼ標識ExtrAvidin（Sigma）がプレートに加えられ、１時間に亘り室温で 保温された。０．１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ）９．８中にｐ−ニトロ
−リン酸フェニル（１ｍｇ／ｍｌ）を含む基質溶液（０．１ｍｌ）が加えられ、
自動化されたＥＬＩＳＡリーダ（BioTech, Burlington, VT）を用いて４０５ｎ ｍで得られた基質反応液の光学的濃度が読まれた。全ての試薬はSigma(St. Loui
s, MO)から購入されたものである。
【０１７５】 図９は、抗体力価決定の結果を示す図である。図示されるように、経口免疫化
後４週間及び６週間における血清及び膣分泌の中の両方において、RpoS+組換え 弱毒ワクチン菌株、χ8296は、組換えHBVcプレＳ１，Ｓ２抗原に対して、対応す
るRpoS-微生物、χ8309よりもかなり高い抗体力価を誘発した。従って、RpoS+表
現型の組換え弱毒サルモネラワクチン菌株は、上述の例７において示されたよう
にサルモネラに対する防御免疫を誘発することに関して優れているだけでなく、
発現外来抗原に対する免疫応答を誘発することに関しても優れている。
【０１７６】 例９ 本例において、RpoS+表現型を含むワクチン菌株のためのスクリーニングの方 法を説明する。
【０１７７】 RpoS+表現型のための菌株の評価は、RpoS+菌株の同定及び選択を可能とする。
かかる菌株は高い免疫原性を示すことが予期される。スクリーニングシステムに
おけるRpoS+表現型についての試験用の菌株は、いかなる源から得られるもので あってもよい。例えば、寄託所から得られた菌株は以下説明されるように試験さ
れうる。
【０１７８】 カタラーゼ及びグリコーゲン合成活性についての試験は、上述の例４に記載さ
れるようにして行われた。
【０１７９】 典型的な腸チフス菌株におけるカタラーゼ又はグリコーゲン合成活性について
の試験の結果は以下の表１３に示される。菌株χ8205及びχ8208は、これらの微
生物がrpoS突然変異体であるという従来の報告（Robbe-Saule et al., FEMS Mic
robiol. Lett. 126:171-176, 1995; Coynault et al., Mol Microbiol. 22:149-
160, 1996）と一致したカタラーゼ活性を示さなかった。カタラーゼ試験の結果 は、菌株χ8204及びχ8207がrpoS突然変異体も有しうることを示したが、グリコ
ーゲン試験はこれらの２つの菌株に対して陽性であり、２つの菌株が完全なrpoS
遺伝子を有することを示した。従って、これらの２つの菌株におけるrpoS対立遺
伝子状態に関する最終的な決定は、例４に記載されるような他の試験を用いるこ
とを必要とする。カタラーゼ及びグリコーゲン試験の両方において結果が得られ
た残る菌株は、両方の試験において対応する結果を示した。
【０１８０】
【表１９】 例１０ 本例において、対立遺伝子置換法を用いて、野生型rpoS対立遺伝子をχ3769、
MGN-1018又はχ8280といったRpoS-腸チフス菌株の中へ導入するために使用され うる方法を説明する。
【０１８１】 野生型rpoS遺伝子は、R6Kに基づくプラスミドpMEG-149又はその誘導体pMEG-37
5のスイサイド性質を用いた対立遺伝子交換によってχ3769、MGN-1018又はχ828
0の染色体の中へ導入されうる。プラスミドpMEG-149及びpMEG-375は、λpir依存
性R6Kレプリコンを運ぶ可動スイサイドベクターであり、従って複製を可能とす るためにtrans中に存在するpir遺伝子を有する宿主を必要とする。更に、pMEG-1
49はAprのための選択マーカー及び逆選択マーカー、レバノスクラーゼをコード 化する一方で、pMEG-375はクロラムフェニコール（Cmr）に対する耐性を特定す るcat遺伝子も含む。pMEG-149及びpMEG-375はpir遺伝子のない菌株中では複製で
きないため、Apr及びAprCmrのトランス接合個体の選択は夫々、通常は挿入され たフラグメントの相同性を通じて生ずる事象である染色体中へのプラスミドの組
込みを要求する。プラスミドpSK::rpoSは、pBluescript/SKのEcoRV部位へクロー
ン化された完全な１．７ｋｂのネズミチフス菌14028 rpoS遺伝子を含む。pSK::r
poSからの野生型rpoS対立遺伝子を含むEcoRI-HindIIIフラグメントは、T4 DNAポ
リメラーゼで処理され、スイサイドベクターpMEG-149のSmaI部位へクローン化さ
れる。λPir+Asd-デリバリー宿主菌株、MGN-617の中へ、pYA3433（図１１）と称
される野生型rpoS対立遺伝子を運ぶ得られた組換えベクターは、導入される。こ
の菌株は、IncP mob領域を含む全てのプラスミドを全てのAsd+受容体へ接合し、
続いてジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）のない全ての培地上のドナーを除去するこ
とを可能とする。
【０１８２】 ２つの薬剤耐性遺伝子のための二重選択は、Aprを単独で使用した場合にβ− ラクタマーゼが選択培地中のアンピシリンを急速に破壊する能力により生ずるこ
とがあるバックグランド成長を除去することによってスイサイドベクターを染色
体の中へ組み込んだ部分二倍体の選択を増強するため、発明者はアンピシリン耐
性だけでなくクロラムフェニコール耐性を特定するpMEG-375を用いてrpoS+遺伝 子を含むスイサイドベクターを作った。１．４０９ｋｂのネズミチフス菌UK-1 r
poS+遺伝子は、PmeI及びSmaIを用いた消化によってpMEG-328から回復され、同じ
２つの酵素を用いて消化されたpMEG-375の中へクローン化される。得られたスイ
サイドベクタープラスミド、pYA3467は、図１０に示される。
【０１８３】 野生型rpoS対立遺伝子を運ぶプラスミドpYA3467は、エレクトロポレーション によってMGN-617を介してΔphoPQ Δasd腸チフス菌Ty2菌株、MGN-617の中へ導入
された。形質転換細胞は、ＤＡＰ（１００μｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０μ
ｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（４０μｇ／ｍｌ）を補足されたＬ寒天プ
レート上に広げることによって選択され、続いて一晩に亘って３７℃に保温され
た。この形質転換過程から得られたアンピシリン耐性及びクロラムフェニコール
耐性分離体は、野生型rpoS対立遺伝子を含む完全なプラスミドを単一の交差過程
によって染色体の中へ組み込むことを表わす。かかる分離体はrpoS遺伝子の２つ
のコピー、即ち野生型及び突然変異されたrpoS対立遺伝子を含む。次に分離体は
ＤＡＰ（１００μｇ／ｍｌ）で補足され、第２の交差過程によるスイサイドベク
ターシーケンスの損失を選択するために５％のスクロースを含むLuria寒天上で スクリーニングされた。スクロース耐性分離体は、（カタラーゼ又はグリコーゲ
ン合成試験を用いて）アンピシリン及びクロラムフェニコールについての感受性
について、及び機能性rpoS対立遺伝子の有無についてスクリーニングされる。
【０１８４】 Bonifide rpoS+誘導体を同定した後、LPS、Vi抗原、全ての弱毒突然変異体の 有無、及び、MGN-1018親のRpoS+誘導体の特徴である全ての他の特徴の有無を確 認するよう完全な特徴化が行われる。１つのかかる誘導体はχ8434（表１）とし
て選択された。野生型腸チフス菌, Ty2菌株はRpoS+表現型が与えられれば組換え
弱毒サルモネラワクチンとして非常に良い属性を保有しうるため、野生型Ty2菌 株χ3769はまたRpoS+誘導体χ8438（表１）を発生するために上述の方法を用い てpYA3467からrpoS+遺伝子を与えられた。この菌株はここで、例２及び例３に記
載されるような様々な明確な欠失突然変異体を導入することによって弱毒化され
え、すると以下の例１１に記載されるように様々な抗原を発現する能力を与えら
れる。
【０１８５】 この方法を更に実証するため、pYA3467はドナーMGN-617によって候補組換え弱
毒ワクチン菌株χ8280[Ty2 ΔphoPQ23 rpoS ΔasdA16 (pYA3167)]へ転移される 。この菌株は、pYA3167の存在により、Ｂ型肝炎ウイルスコアをプレＳ１，Ｓ２ エピトープと合成する。上述の過程により、RpoS+誘導体が分離され、完全に特 徴付けられた。これはχ8435と称される（表１）。
【０１８６】 表１４は、グリコーゲンを合成し陽性カタラーゼ試験を与えるため、腸チフス
菌, Ty2及びその後代種の中に存在する欠陥rpoS突然変異体遺伝子を置換するよ う組換え野生型rpoS+遺伝子を導入することによって構成される上記３つのRpoS+ 菌株の能力を示す。
【０１８７】
【表２０】 この方法は、弱毒化と免疫原性との間のバランスを改善するために、組換え野
生型rpoS遺伝子を、ATCC 55117（χ3927；Δcya-12 Δcrp-11）又はATCC 44118 （χ4073；Δcya-12 Δ[crp-cdt]-10）といった様々なTy2由来ワクチン菌株へ導
入するためにも用いられる。
【０１８８】 例１１ 本例では、様々な感染症に対する経口ワクチンとして使用される外来抗原を発
現する組換え弱毒rpoS+腸チフス菌株の構築について説明する。
【０１８９】 rpoS+ワクチン菌株は、上述の例２及び例３に記載されるように明確な欠失を 用いてISP1820といった機能性rpoS遺伝子を含む腸チフス菌株に基づいて、又は 、上述の例８に記載されるように組換えrpoS遺伝子を有するTy2といった弱毒rpo
S突然変異体菌株に基づいて調製される。外来抗原を発現するワクチンを構築す るための望ましいアプローチは、組換えプラスミド上のクローン化された遺伝子
の安定した維持及び高いレベルの発現を与える平衡な致死宿主ベクター系を用い
ることである。このために、細菌細胞壁の堅い層の必須成分であり人体中で合成
されないジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）についての絶対要件を課すために、RpoS + 菌株の中にアスパラギン酸β−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼが導入され る。染色体Δasd突然変異は、野生型asd+遺伝子だけでなく所望の外来抗原をコ ード化する組換え遺伝子を保有するプラスミドクローン化ベクターによって補足
される。プラスミドの欠損は、DAP欠損死及び細胞溶解を生じさせる。かかる平 衡致死宿主ベクター組合せは、免疫化された動物宿主では数週間安定であり、ク
ローン化された遺伝子生成物に対し、また、サルモネラに対する免疫応答を引き
出す。
【０１９０】 染色体asd遺伝子の中の明確な欠失の構成は、上述の例３に記載されている。 このようにして、ΔphoPQ23及びΔasdA16突然変異を有するISP1820誘導体、MGN-
1191及びTy2誘導体、MGN-1256が生成された。所望の外来抗原をコード化する組 換え遺伝子を含むasd補足プラスミドは、米国特許第５，６７２，３４５号に記 載されるようにして構築されうる。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス抗原ヌクレオキャ
プシドプレＳ１プレＳ２（HBcAg-pre-S）粒子を発現しpYA3167と称される１つの
かかるプラスミドは、文献（Schodel, et al., 1996, in Novel strategies in
design and production of vaccines. S. Cohen and A. Shafferman, eds., Ple
num Press, New York）で報告されるようにして構築された。従って、腸チフスM
GN-1191及びMGN-1256はエレクトロポレーションによりプラスミドPYA3167と共に
形質転換された。MGN-1191及びMGN-1256から誘導された形質変換された弱毒腸チ
フス担体の中のハイブリッドコアプレＳ遺伝子の発現のレベルを決定するために
、HBVプレＳ２特定モノクローナル抗体を用いた免疫ブロッティング分析が用い られた。ΔphoPQ Δasd突然変異体腸チフス菌株の中のハイブリッドHbcAgプレS 抗原の発現は以下のようにして決定された。一晩の培養後の全細菌細胞ライゼー
トからのタンパク質は、１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−１２％）を用
いてポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離され、クーマシーブリ
リアントブルーで染色された。結果は図１２に示される。MGN-1191の３つの形質
転換細胞及びMGN-1256の３つの形質転換細胞が研究され、その全てが組換え抗原
の位置においてバンドを示した（図１２中の矢印を参照）。MGN-1191形質変換細
胞＃１（レーン３）はχ8281と称され、MGN-1256形質変換細胞＃１（レーン７）
はχ8280と称される。両方の菌株は、Vi抗血清（Difco）による正の凝集によっ て決定されるようにVi莢膜抗原を発現する。
【０１９１】 更に、組換え抗体の発現は免疫ブロッティングによって評価された。免疫ブロ
ッティングのため、一晩培養された細胞は２Ｘ試料緩衝液の中に入れられ、細胞
を溶解するために１０分間煮沸された。タンパク質は続いてニトロセルロースへ
移され、HBVプレＳ２に特定的なモノクローナル抗体と共に保温され、ペルオキ シダーゼ結合ヤギアンチマウス免疫グロブリンＧ（IgG）（Ｈ鎖及びＬ鎖）で現 像され、化学発光基質（ＥＣＬ；Amersham）と共に保温された後にＸ線フィルム
（Kodak）上に視覚化された。結果は図１３に示される。クーマシー染色で分か ったように、χ8281（レーン３）を含むMGN-1191の３つの形質転換細胞及びχ82
80（レーン７）を含むMGN-1256の３つの形質転換細胞は全て、組換え抗原の位置
においてバンドを示した（図１３の矢印参照）。
【０１９２】 免疫スクリーニングは、以下の手順を用いて行われうる。細菌コロニーは、ニ
トロセルロース濾紙上に載せられ、１％ＳＤＳ中で３０分間に亘り７０℃で溶解
された。ニトロセルロース上の自由結合部位は、トリスHCl緩衝塩水中の１０％ ウマ血清によって遮断される。続いて、免疫スクリーンは免疫ブロットのように
扱われ、２次ヤギアンチマウスIgG（Ｈ鎖及びＬ鎖）はニトロブルートトラゾリ ウム−５−ブロモ−４−クロロ−３インドリルホスフェートトルイジニウム（Pr
omega）を用いて視覚化される。
【０１９３】 外来抗原を発現する腸チフス菌rpoS+菌株はまた、アンピシリン及びテトラサ イクリンといった薬剤に対する耐性を与える遺伝子を含むAsd+以外の選択マーカ
ーを伴うプラスミドベクターを用いて構築されうる。更に、所望の外来抗原をコ
ード化する組換えベクターは、ベクターが相同的組換え又は転位によって細菌染
色体の中へ挿入されるような周知の技術を用いて構築されうる。
【０１９４】 例１２ 本例において、免疫応答を有益に抑制し、変更し、又は増大させるよう外来タ
ンパク質を発現する組換え弱毒ワクチン菌株を構築するために使用されうる方法
を説明する。
【０１９５】 生きている弱毒細菌ワクチンはＴヘルパーリンパ球記憶機能を導入することに
よって長持ちする免疫性を誘導することが周知である。マウスのネズミチフス菌
感染は主にTh-1型の応答を生じさせるが、粘膜分泌液中のSIgAの生成、並びに、
サルモネラに対する血清抗体及び外来発現抗原に対する血清抗体を伴うTh-2応答
もまた誘導される。IL-10は、Th-2応答の発生を示すレベルにおいて検出されう る（Van Cott et al., J. Immunol. 156:1504-1514, 1996）。また、組換え弱毒
ネズミチフス菌ワクチンが外来抗原に対するCD-8+細胞を含むCTL応答を誘発しう
ることが公知である（Sadoff et al., Science 240:336, 1988）。しかしながら
、多くの場合、組換え弱毒サルモネラワクチンが、SIgAの生成によって粘膜免疫
性を増強するためにTh-2型の応答を、そのSIgA生成のために細胞記憶応答を主に
引き出すことが望ましい。リンホカインIL-4及びIL-5は生成されると、かかるTh
-2応答を増強させる。一方、他の場合に、その抗体が組換え弱毒サルモネラワク
チンによって発現される任意又は絶対的な細胞内寄生体に対する防御免疫を与え
ることが特に重要であり得るTh-1型の応答を誘導するため組換え弱毒サルモネラ
の能力を最大化することが望ましい。免疫応答を、主なTh-1型へ又はTh-2型へ移
すことは幾分は、組換え弱毒サルモネラ菌株を通じてリンホカインを発現するこ
とによって達成されうる。従って、Th-1型の応答を増強すると共に弱毒サルモネ
ラワクチンをある種の癌と戦うときに（Saltzman et al., Cancer BioTher. Rad
iol. Pharm. 11:145-153, 1996; Saltzman et al., J. Pediatric Surg. 32:301
-306, 1997）防御的であるよう設計するのに重要であるCTL応答を増強するIL-2 を発現するサルモネラ菌株を構築した。主にTh-2応答を誘導するためにサルモネ
ラを発生させることは、Whittle外によって（1997, J.Med. Microbiol. 46:1029
-1038）によって後者のリンホカインについて成されたのと同様に菌株にIL-4及 びIL-5を発現させることによって達成されうる。IL-4は、組換えaroA弱毒サルモ
ネラワクチンによって発現されたが、分泌されなかったため有効ではなかった（
Denich et al., Infect. Immun, 61:4818-4827, 1993）。Hahn外（FEMS Immunol
. Med. Microbiol. 20:111-119, 1998）によって記載されるような方法は、弱毒
サルモネラによってリンホカインのかかる分泌された発現の中で成功することが
可能である。また、SIgAの分泌を刺激することが報告されている因子Ｐといった
ペプチドを共発現することが可能である。多くの異なるリンホカイン、サイトカ
イン、及び免疫応答を調節するよう作用する他のペプチド又はタンパク質分子を
指定するcDNAのための遺伝子が獲得された。これらのペプチド又はタンパク質は
、特定の病原体から又は腫瘍細胞系からの或る抗原又は感染症に対して保護する
ため又は免疫化されたヒトの全身病を治療するために免疫応答を誘発する免疫応
答を標的とする或る他の分子を発現する組換え弱毒サルモネラワクチン菌株によ
って共発現されうることが予期される。このようにIL-6が発現され、幾つかの場
合は組換え弱毒サルモネラによって分泌される（Dunstan et al., Infect Immun
64:2730-2736, 1996; Hahn et al., FEMS Immunol Med Microbiol 20:111-119,
1998）。マウスマイクロファージ抑制因子（MIF）のための遺伝子は、Leishman
ia主要感染（Xu et al., J. Immunol. 160:1285-1289, 1998）に対する免疫応答
を変更するよう組換え弱毒サルモネラによって個々にクローン化され発現される
。TGF-βもまた、IL-2及びINF-γの内因性の合成を抑制するがIL-10の合成を増 大させることによって（Ianaro et al., Immunology 84:8-15, 1995）、炎症性 応答を減少させるために組換え弱毒サルモネラワクチンの中に発現された。上述
の例に示されたデータに基づき、所望の方法で免疫応答を抑制し、強調し、及び
／又は調製するためのサイトカイン及び他の免疫活性分子を発現することに関し
て、RpoS+表現型の組換え弱毒サルモネラワクチンはRpoS-表現型のワクチン菌株
に対して優れていることが明らかである。
【０１９６】 例１３ 本例において、自己抗原を発現するため及び避妊のために、高い免疫原性及び
低い病原性を有する弱毒RpoS-サルモネラ菌株を使用することを説明する。
【０１９７】 上述において、生殖力のない状態を生じさせるよういかにして自己抗原を発現
するために組換え弱毒サルモネラ菌株を使用するかを説明した。この技術は米国
特許第５，６５６，４８８号に開示されている。更に、Srinivasan外（Biol. Re
product. 53:462-471, 1995）は、生殖力のない状態を生じさせるためにマウス 内での精子−卵子相互作用を効果的に阻止するようその精子抗原に対する抗体を
生じさせるよういかにして組換え弱毒サルモネラから精子特定抗原を発現するか
を記載している。特定の抗原は、マウスcDNAシーケンスによって特定され、組換
えサルモネラはマウス内でその自己抗原に対する免疫応答を誘発することが可能
であった。同様に、Zhang外（1997, Biol. Reproduct 56:33-41）は、弱毒ネズ ミチフス菌株の中に透明体抗原、ZP-3をコード化するマウスcDNAシーケンスを発
現した。この自己抗原を発現するサルモネラで免疫化されたマウスは、ZP-3に対
する免疫応答を増している。ZP-3に対する抗体は子房内の卵の表面を覆い、精子
がかかる卵子を受精させる可能性を効果的に減少させた。また、宿主に対して異
種の担体抗原に自己抗原を融合させることにより、自己抗原だけでなく異種担体
を認識する免疫応答の誘発を生じうることが周知である。受精した場合、かかる
免疫化ストラテジーは、避妊用ワクチンの発生を生じうる。
【０１９８】 例１４ 本例において、アレルゲンを発現し、そのアレルゲンの効果を改善する免疫応
答を誘発するために弱毒RpoS+サルモネラワクチンを使用することについて説明 する。
【０１９９】 花粉、カビ胞子、昆虫の部分、動物のふけ等に対するアレルギーは、かかるア
レルゲンを含む空気の吸入及び／又は食物の摂取による。結果として生ずるアレ
ルギーは、ヒスタミンの放出のためにマスト細胞を活性化するアレルギーに結合
するIgE抗体の存在に関連する。周知のように、アレルゲンに対する脱感作は、 アレルゲンを含む抽出物を反復的に非経口的に免疫化することによって達成され
うる。同様に、花粉を含む未加工の蜂蜜の経口摂取もまたこれらのアレルゲンに
対する耐性の状態を効果的に生ずるために行われることが公知である。かかるア
レルゲンの経口摂取は、アレルゲンがIgE及びマスト細胞と反応する可能性を阻 止しうるSIgA応答を誘導し、又は十分な量が投与されれば耐性を誘導するIgE抗 体の合成を抑制する役割を果たしうる。多くのアレルゲンの中の特定のアレルギ
ー性分子が同定されており、アレルゲンを特定するヌクレオチドシーケンスを獲
得するためにcDNAがクローン化されているため、アレルゲンを発現させるために
異種の宿主細胞を遺伝子工学的に操作することが可能である（例えば、Valenta
et al. Allergy 53:552-561. 1998; Olsson et at., Clin. Exp. Allergy 28:98
4-991. 1998; Soldatova et al., J. Allergy Clin. Immunol. 101:691-698, 19
98; Asturias et al, Clin. Exp. Allergy 27:1307-1313; Twardosz et al, Bio
chem. Biophys. Res Comm. 239:197-204, 1997）。従って、本発明の弱毒RpoS+ サルモネラは、耐性の状態を誘導するため又はアレルゲンに対するSIgAの生成を
活性的に促進するために、変更された免疫原性を有するが非アレルギー性の形で
アレルゲンを発現するよう操作されうる。本願に記載されるRpoS+弱毒サルモネ ラは免疫応答を引き出すことに関して効果的であることが示され、従って、変更
されたアレルゲンを発現するためにかかるRpoS+サルモネラを用いることは、人 間が吸入又は摂取によってアレルゲンにさらされることによる結果を改善するこ
とについて効果的である可能性が高い。
【０２００】 例１５ 本例において、所望の外来抗原を発現する組換え弱毒RpoS+腸チフス菌担体菌 株を含む生きた経口ワクチンの安全性、免疫原性、及び効能を試験するために用
いられる手順を説明する。
【０２０１】 試験される菌株は、組換えrpoS遺伝子を含むISP1820及びISP1822の弱毒誘導体
又はTy2菌株χ8438（表１）の弱毒誘導体である。
【０２０２】 被研究個体：被研究個体は性別を問わない１８才から４０才の健康な成人した
ヒトであるボランティアである。ボランティアは、研究の前にスクリーニングさ
れる。包含規準は、 １．全般的に良好な健康状態であること； ２．病歴の評価； ３．正常且つ規則的な腸習慣； ４．正常な理学的検査； ５．以下のものを含む正常な臨床検査結果： 正常な検尿結果、 正常な完全血球算定及び白血球百分率算定、 正常な血液化学（SGPT、アルカリ性ホスファターゼ、BUN、クレアチニン 、空腹時血糖）、 HIV-1に対するELISAが陰性、 妊娠反応が陽性（女性）、 ６．良い衛生状態、毎日の記録の続行、便採取を行うことを含む必要な手順を
理解し承諾することができること、 を含む。
【０２０３】 除外規準は、 １．胆嚢疾患の病歴がある； ２．胃塩酸欠乏症（制酸薬、H2遮断薬又はB12を頻繁に使用）である； ３．免疫不全の病歴がある； ４．妊娠反応が陽性である（女性）； ５．プロトコルに従うことを妨げる医学的、精神医学的、職業上の条件がある
； ６．下痢性の病気がある； ７．免疫化の前の７日以内に抗生物質による治療歴がある； ８．薬物アレルギー又はワクチンに対する深刻な副作用があること、 を含む。
【０２０４】 ボランティアはスクリーニングされ、書面によるインフォームドコンセントが
得られた。
【０２０５】 研究計画：各菌株及び投与量について５人又は６人のボランティアが研究され
る。第１のボランティアグループでは、被験者は弱毒ワクチンの１０5 CFUの単 一の投与量を受ける。このグループが疾患の臨床的な症状を発生しなければ、最
大の安全性及び最小の免疫原性投与量を確立するよう次のグループでは投与量が
増加される。次のグループは１０9 CFUの最大投与量に達するまで、１０6 CFU以
上の投与量を受ける。
【０２０６】 ワクチン接種材料の調製：腸チフス菌候補ワクチン菌株の保存培養は、−７０
℃で５％グリセロールを含む１％バクトペプトーン（Difco）中の細胞懸濁液と して貯蔵される。菌株の接種材料を作るために、懸濁液は解かされ、続いて特定
の染料のための適当なCFU/mlへ希釈される。
【０２０７】 ボランティアへの接種：ボランティアへの接種の日に、血液、尿、及び便の試
料が採取され、臨床検査パラメータについての基線値が決定される。更に、血清
試料及び便試料の中の免疫グロブリンが測定される。被験体は、接種前９０分間
は何も口に入れない。２グラムのNaHCO3が５オンスの蒸留水に溶解される。被験
体は、４オンスの重炭酸水を飲み、１分後に、被験体は残る１オンスの重炭酸水
の中に験濁されたワクチンを摂取する。被験体は接種後９０分間は食べ物又は水
を口にしない。
【０２０８】 ボランティアの臨床監視：ボランティアは、最低でも２週間は入院患者として
継続管理され、その後は全体で４週間まで通院患者として継続管理される。この
期間中、発熱、頭痛、悪寒、嘔吐、下痢、及び腹痛を含むがこれらに限られない
全ての副作用について観察される。試験期間中に血液試料及び便試料が得られ、
培養及び抗体の決定が行われる。更に、ワクチン菌株に対するPCRが血清上で行 われる。研究中の時間に体温が１００．８°Ｆになったボランティアは便試料及
び血液が培養のために採られ、体温が１２時間に亘って上昇したままである場合
及び／又は血液培養が陽性であれば、１０日間クールの経口抗生物質が与えられ
る。
【０２０９】 検体収集の手順。
【０２１０】 便検体：ワクチン接種後１４日間に亘りボランティアから排泄された全ての便
の数、硬さ、及び記述についての記録が取られる。便の体積が測定され、便は５
点システム上で等級分けされる。
【０２１１】 等級１ 硬い便（正常） 等級２ 柔らかい便（正常） 等級３ 濃い液体（異常） 等級４ 不透明な水状（異常） 等級５ 重湯状（異常） 便培養は、便の試料（又は便が排泄されなければ直腸スワブ）に対して陰性が１
となるまでサルモネラについて連続する毎日行われる。
【０２１２】 瀉血：スクリーニング前の評価のために血清（２０ｍｌの血液）が採取される
。抗体の決定のための血清（１０ｍｌの血液）は、０，７，１４及び２８日目に
得られる。ELISPOTによる抗体分泌細胞アッセイのためのリンパ球分離のための ヘパリン化血（３０ｍｌ）はボランティアの副集合から０，７，１４及び２８日
目に得られる。副集合は、グループ３，４及び５の中の２人のボランティアから
なる。ボランティアはコンピュータによってランダムに選択される。血液（１０
ｍｌ）は、従来の培養及びPCRの両方によって生存可能なワクチン生体を検出す るため免疫化後観察期間中に陰性となるまで毎日培養のために得られる。全体で
、２ヶ月の期間中にいずれのボランティアからも４５０ｍｌを越える血液は採取
されない。陽性の血液培養の中の細菌はワクチン菌株の遺伝子型及／発現型に従
って評価される。
【０２１３】 細菌学：便及び直腸スワブはセレナイト−システイン肉汁の中へ接種される。
便は４８時間以内に処理されねばならない。一晩に亘り３７℃でインキュベート
させた後、XLT-4寒天上に継代培養が作られる。サルモネラと一致して出現する コロニーは、腸チフス菌O,H及びVi抗血清による凝集によって作られる同定及び 確認のAPI-20系を通じて処理される。これらの分離体は、（例えば、プラスミド
が存在する場合、PCRを用いた特定のDNA配列が存在しない又は存在する場合、又
はクローン化された遺伝子のための遺伝子プローブを用いたサザンブロッティン
グの場合の）更なる分析のために５％グリセロール−１％ペプトン中で−７０℃
で保存される。
【０２１４】 血液培養（１０ｍｌ）は、５０ｍｌのセプタチェック瓶の中で接種される。陽
性の培養が分析され、上述のように保存される。
【０２１５】 免疫学：血清検体は、IgA,IgM及びIgGからELISAによって測定される腸チフス 菌O,H及びVi抗原まで試験される。Ｈ抗体は、S. Virginiaを抗原として用いてウ
ィダール管凝集によって測定される（S. manhattenもまた腸チフス菌として同一
の鞭毛抗原を共用するが、体細胞抗原を共用しない）。末梢血単核細胞が収集さ
れ、サルモネラ抗原に対する抗体を生成する細胞のためのELISPOTを用いた抗体 分泌細胞（ASC）アッセイのために分離される。腸チフス菌O, H, 又はVi抗原に 対するIgG, IgA, 又はIgMを分泌するリンパ球が測定される。
【０２１６】 PCR：サルモネラinvA遺伝子セグメントは、血液検体中の腸チフス菌の有無を 確認するためにポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。また、invAシーケン
スはサルモネラにユニークであり（Galan and Curtiss, 1991）、PCR法による侵
入サルモネラの存在のための診断に用いられる（Rahn et al., 1992）。
【０２１７】 ワクチン菌株の排出：ワクチン菌株の排出はワクチンを投与した後の１週間以
内に止まることが予期される。排出が７日間以上続けば、排出が続いているボラ
ンティアに対してシプロフロキサシンが投与される（１２時間毎に７００ｍｇ）
。放出のためにａ≧２の連続する日に亘って陰性の培養が必要とされる。
【０２１８】 例１６ 本例では、優れた粘膜及び全身免疫応答を引き出すために鼻腔内投与のための
様々な血清型の弱毒RpoS+サルモネラエンテリカの潜在的な用途について説明す る。かかる候補ワクチンはまた、経口で、結膜から、又は直腸から投与されうる
。
【０２１９】 サルモネラエンテリカ血清型は、望ましくは公知の弱毒化アプローチで弱毒化
され、例えば、pab遺伝子、pur遺伝子、aro遺伝子、asd、dap遺伝子、nadA、pnc
B、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rf
c、poxR、galU又はこれらの遺伝子の組み合わせの中に欠失突然変異体を発生さ せることによって行われる。更に、微生物は、例４に記載されるカタラーゼ試験
又はグリコーゲン合成試験によって決定されるようなRpoS+表現型を有すること になる。RpoS+弱毒サルモネラエンテリカ菌株は、Typhi、Paratyphi A、Paratyp
hi B、Paratyphi C、Typhimurium、Enteritidis、Dublin、又はChleraesuisの血
清型でありうる。広い宿主域、S. enterica 血清型、Typhimurium及びEnteritid
isでは、またより宿主に適応した血清型、Dublin及びCholeraesuisでは、細胞内
生体内環境におけるより急速な成長によって免疫原性を増大させるサルモネラ病
原性プラスミドを保有することが望ましい（Gulig in Excherichia coli and Sa
lmonella, Vol 2, F. Neidhardt et al., Editor, American Society for Micro
biology, Washington DC, pp.2774-2787, 1996）。
【０２２０】 ヒトに対する安全性及び効能を試験するための研究計画は、サルモネラの血清
型が投与されること及び鼻腔を通る免疫化の経路以外は、上述の例１５において
記載されている。表１５は、異なる血清型を有する親ワクチンベクター菌株と、
RpoS+表現型を示すためのカタラーゼ及びグリコーゲン合成についての試験結果 を列挙するものである。
【０２２１】
【表２１】 S choleraesuisχ3246はグリコーゲンを合成するのには使用できないが、カタ
ラーゼ試験によってRpoS+であると試験されることに注意されたい。S. paratyph
i A、χ8219は、RpoS+表現型を示すグリコーゲンを合成するが、RpoS遺伝子によ
って調節されるカタラーゼを欠く。これらの菌株のいずれも例２及び例３に記載
される方法で弱毒化されえ、更に例１１に記載されるようにＢ型肝炎ウイルスコ
アプレＳ１／プレＳ２融合を特定するpYA3167として外来抗原のためにコード化 を行うAsd+ベクターを使用するためにasd突然変異体と共に変更される。これら の菌株の全てはRpoS+表現型を表わす。
【０２２２】 例１５に記載される手順との他の差異は、免疫化の経路である。鼻腔内免疫化
は、個体が頭部を後ろに反らせてうつぶせに寝ているときに適当な投与量のワク
チン菌株を含む点鼻薬を投与することによって行われる。或いは、鼻腔内免疫化
は噴霧器を用いた鼻孔の中へのエアゾール投与によって行われうる。投与される
投与量は噴出回数によって決定される。
【０２２３】 他の投与経路もまた試験されうる。例えば、直腸免疫化は、Hardelli-Haeflig
er外（Infect Immun, 1996）によって記載される手順によって行われうる。結膜
内免疫化は点眼薬の投与によって行われうる。免疫化される被験者の及び適当な
免疫応答を引き出すための監視及び利点は例１５に記載される通りである。
【０２２４】 例１７ 本例では、ヒトに対してDNAワクチンベクターを運ぶために用いられるRpoS+サ
ルモネラ、赤痢菌／大腸菌及びサルモネラ／大腸菌のハイブリッドの調製方法を
説明する。
【０２２５】 様々な病原体の抗原をコード化する環状プラスミドDNAは、抗原遺伝子が誘導 された抗原に対する免疫性の誘発を刺激するために動物宿主の中へ導入されうる
（Ullmer et al., ASM News 62:476-479, 1996; Ullmer et al., Curr. Opin. I
mmunol 8:531-536, 1996; Whalen, Emerg. Infect. Dis. 2:168-175, 1996, Rob
inson, Vaccine 15:785-787, 1997）。DNAワクチンは、或る病原体の抗原を特定
する遺伝子情報が転写及び翻訳のための宿主機械を用いて免疫化された宿主によ
って発現されるよう発現系を用いる。最初に、DNAワクチンは筋肉組織の中へ注 射することによって投与されたが、他の注射部位もまた用いられた。最近は、DN
Aワクチンは皮膚又は粘膜組織の中へのDNA被覆金ビーズの進入を加速するため粒
子銃を用いて投与された。DNAワクチンベクターは、発酵槽の中で成長された組 換え大腸菌株の中で増殖され分離される。
【０２２６】 Sizemore外（Science, 270:299-302, 1995; Vaccine 15:804-807, 1997）は、
赤痢菌flexneri 2a菌株を、大腸菌β-ガラクトシダーゼを発現するよう操作され
たDNAワクチンベクターが住んでいるΔasd突然変異体と共に使用することについ
て記載している。赤痢菌株は、真核細胞への侵入時にジアミノピメリン酸が存在
しないことにより死をもたらすΔasd突然変異体によって弱毒化される。菌株は 、DNAワクチンベクターを、培養中の真核細胞の細胞質、又は免疫化されたマウ スへ付着、侵入、又は溶解した後に細胞内で運ぶことができる。最近では、その
他のものがDNAワクチンベクターを保有するネズミチフス菌株を使用し、自発手 段による溶解を生じさせた（Powell et al., WO96/34631, 1996; Pasenal et al
., Behring. Inst. Mitt. 98:143-152, 1997; Darji et al., Cell 91:765-775,
1997）。溶解が自発性であった場合、細菌の菌株が、菌株を弱毒化させる１つ 以上の欠失突然変異体を保有することが必要であった。赤痢菌、サルモネラ、及
び侵入的大腸菌は、GALTの上にあるＭ細胞に付着し侵入する能力が、腸上皮細胞
（エンテロサイト）に付着し侵入する能力よりも高いことが公知である。Ｍ細胞
層を有するNALT、BALT、CALT、及びGALT中での外来抗原の運搬又は外来抗原の生
産は、粘膜免疫応答だけでなく全身免疫性の誘導を生じさせる。粘膜免疫応答は
粘膜表面上にコロニーを形成するか又は粘膜表面を通って侵入する感染症薬剤の
殆どに対して防御的であるため、DNAワクチンベクターはRposS+サルモネラ、赤 痢菌、大腸菌又はこれらの属のうちのいずれか２つのハイブリッドによって運ば
れうることが予期される。これらの微生物はNALT、CALT、BALT、及びGALTのリン
パ組織の上のＭ細胞に付着し侵入する優れた能力を有することになる。RpoS+微 生物を用いた経口及び鼻腔内免疫化はいずれも免疫応答を高めるため、RpoS+表 現型を表わす弱毒細菌DNAワクチンベクトル菌株は、鼻腔内で又は経口で、及び 粘膜免疫応答を刺激する他の経路で投与された場合、免疫応答を高める。
【０２２７】 発明者は、外来抗原を発現するためにDNAワクチンベクターpCMVβの誘導体を 使用した。pCMVβは大腸菌の中での増殖のための複製のpUC起点と、アンピシリ ンへの耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子と、CMV及びSV40ウイルスからのプロ
モーター及びエンハンサーと、転写されたmRNAのポリアデニル化を達成するため
のSV40シーケンスとを保有する（MacGregor et al., Nucleic Acid Res. 17:126
5, 1989）。pCMVβは幾つかの研究において試験抗原として用いられてきた大腸 菌β−ガラクトシダーゼのためのコード化シーケンスを含む。β−ガラクトシダ
ーゼをコード化するlacZ遺伝子は、特にウイルス性、菌類、及び寄生体の病原体
から、多様な抗原をコード化するDNAの置換によって容易に除去されうる。抗生 物質耐性遺伝子をワクチンの部分として免疫化された動物及びヒト宿主へ導入す
ることはやはり関心となるため、pCMVβ-asdを生成するためにpCMVβの中のアン
ピシリン耐性遺伝子をネズミチフス菌asd遺伝子で置換した（図１４）。これは 、Δasd突然変異体を有する大腸菌宿主が、精製されたDNAワクチンベクターを潜
在的に汚染しうる加えられた高価な抗生物質が存在しない場合に発酵槽の中で増
殖しうる平衡致死宿主ベクター系を生み出すための使用を可能とする。更に、ネ
ズミチフス菌asd遺伝子は、DNAワクチンベクターの免疫原性を大きく増強させる
２つの自然CpGシーケンスを保有する（Kreig, J. Lab. Clin. Med 128:128-133,
1996）。かかるシーケンスは、現在、DNAワクチンの中のアンピシリン耐性遺伝
子の代わりにしばしば用いられるカナマイシン耐性遺伝子の中には存在しない。
かかるDNAワクチンベクターの中でのネズミチフス菌asd遺伝子の使用については
、米国特許第５，８４０，４８３号に記載されている。
【０２２８】 商業上の有用性： 本願に記載される細菌菌株は、様々なバクテリア性、ウイルス性、菌類protaz
oal病原体によって生ずる疾患を防止するためにワクチンを含む免疫原性組成の 生産に直接的又は間接的に適している。例えば腸チフス菌株でありうるこれらの
担体細菌菌株は、全てRpoS+表現型を有し、目標組織に対して遺伝子生産物の発 現のための異種タンパク質又は拡散分子を運ぶための担体として作用しうる。微
生物は弱毒化されるだけでなく、従来使用されてきた組換え弱毒細菌と比較して
リンパ組織をコロニー化する能力が改善されているため、高い免疫原性も示す。
本発明の菌株は、細菌細胞の中の組換え遺伝子上でコード化された発現生産物の
生産のための担体微生物としてもまた有用である。更に、高い安全性と改善され
た免疫原性で使用されうる菌株は、弱毒化された免疫原性細菌の中に発現されう
る組換え抗原に対する抗体の生産において非常に効果的である。
【０２２９】 寄託： 以下の菌株及びプラスミドは、ブタペスト条約の条項に基づき、American Typ
e Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MDに寄託されてい る。以下に示される受託番号は、生存試験が成功した後に、必要な手数料が支払
われた。培養及びプラスミドは本願の係属中は、37 CFR 1.14及び35 USC 122に 基づき長官によって権利を付与された者によって利用されうる。公衆に対する培
養及びプラスミドの利用可能性に対する全ての制限は、本願に基づいて特許が許
可されると同時に最終的に取り除かれる。更に、指定された寄託は、寄託日から
３０年間、又は、寄託の最後の要求から５年間、又は米国特許の実施可能な年数
のうちの最も長いものに亘って維持される。培養又はプラスミドが生育不可能と
なったとき又は不注意により全滅したとき、又は菌株を含むプラスミドの場合は
そのプラスミドが損失された場合、生育可能な培養によって置換される。本願に
記載される寄託された材料は便宜上例示されたものであって、本明細書の点から
本願を実施するために必要とされるものではなく、更に、これらの材料はここに
参照として組み入れられる。
【０２３０】 寄託 寄託日 受託番号 菌株： MGN-1191 １９９７年１１月１４日 202054 MGN-1256 １９９７年１１月１４日 202053 χ8280 １９９７年１１月１４日 202055 χ8281 １９９７年１１月１４日 202056 χ8438 １９９７年１１月 プラスミド： pYA3433 １９９７年１１月１４日 209462 上述に関連して、本発明の幾つかの利点が達成されること及び他の有利な結果
が得られることが分かる。
【０２３１】 本発明の範囲を逸脱することなく上述の方法及び組成について様々な変更がな
されうるため、本明細書に含まれ添付の図面に示される全ての事項は例示のため
であり、本発明を制限するものではないと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 rpoS+ネズミチフス菌であるχ3339と、同質遺伝子系統rpoS突然変異ネズミチ フス菌であるχ4973のJ774マウスマクロファージ様細胞内での生存の経時変化を
示す。
【図２】 rpoS+ネズミチフス菌であるχ3339と、同質遺伝子系統rpoS突然変異ネズミチ フス菌であるχ4973のラットの骨髄誘導マクロファージ内での生存の経時変化を
示す。
【図３】 図３Aは、約２００倍の正常マウスのパイエル板組織の顕微鏡写真を示す（以 下の顕微鏡写真も全て約２００倍である）。図３Bは、χ4973を経口感染後１日 目のマウスのパイエル板組織の顕微鏡写真を示す。図３Cは３日後、図３Dは５日
後の顕微鏡写真を示す。図３E及び図３Fは、それぞれ、χ3339で経口感染後のマ
ウスのパイエル板組織とその１日後の顕微鏡写真を示し、図３Gは感染後３日後 の顕微鏡写真を示し、図３Hは５日後の顕微鏡写真である。
【図４】 図４Aは、正常マウスにパイエル板のリンパ系組織の約２００倍の透過型電子 顕微鏡写真を示し（図４A中のバーは５μｍを表わす）、図４B及び図４Cは、そ れぞれ、χ4973とχ3339で経口感染させた後５日目のマウスのパイエル板のリン
パ系組織の約２００倍の透過型電子顕微鏡写真を示す。
【図５】 図５Aは、正常マウスのパイエル板の組織の約２００倍の透過型電子顕微鏡写 真（図５A中のバーは５０μｍを表わす）を示し、図５B及び図５Cは、それぞれ 、χ4973とχ3339で経口感染させた後５日目のマウスのパイエル板組織の約２０
０倍の透過型電子顕微鏡写真を示す。
【図６】 明確なΔphoPQ23突然変異によるプラスミドベクターとバクテリア菌株の構築 を説明する図である。
【図７】 明確なΔasdA16突然変異によるプラスミドベクターとバクテリア菌株の構築を
説明する図である。
【図８】 Asd＋ベクターであるpYA3167を含み、Asd+ベクターをネズミチフスχ8296（Δ
cys Δcrp Δasd）とχ8309（Δcys Δcrp Δrpos）へ導入させることによ り構築されたHBVコア‐プレS抗原を発現するネズミチフスΔcya Δcrp Δasd R
poS+とRpoS-菌株による組換えHBVコア‐プレSタンパク質の発現を示し、（A）は
クーマシーブルー染色された１２％ドデシルスルホン酸ナトリウム、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（PAGE）にて調べ、（B）以下のゲルのレーンでpre３２エ
ピトープに指向されたモノクローナル抗体によりウエスタンブロットで調べた：
レーン１、分子マーカ；レーン２ χ8296（Δcya-27 Δcrp-28 ΔasdA16 cfs
Rpos+）； レーン３及びレーン４、pYA3167を含むχ8296（HBVコア‐プレ‐S Agを発現するasd+ベクター）；レーン５、χ8309（Δcya-27 Δcrp-28 Δas
dA16 cfs rpos）；レーン６及びレーン７、χ8309プラスpYA3167(HBVコア‐プレ
‐S Agを発現するAsd+ベクター)。
【図９】 ネズミチフスであるSL1344菌株により発現されたHBVコア‐プレ‐Sタンパク質
への抗体タイターの誘導を説明する図であり、マウスは１０９CFU若しくはpYA31
67(HBVコア‐プレ‐Sを特定するAsd+ベクターを含むχ8296（Δcya Δcrp Δas
d Rpos+）又は対応するRpos−誘導体であるχ8309 （pYA3167を含むΔcya Δcrp
Δasd Rpos+）にて経口にて免疫されており、（A）は血清抗体タイターを、（
B）はコーティング抗原（ｎ＝４）として全長プレ‐S配列を表わす組換えポリペ
プチドを利用して、ELISAにより免疫化された後４及び６週間後に求めた膣洗浄 液中のIgA抗体を示す。
【図１０】 pYA3467プラスミドを説明する図である。
【図１１】 pYA3433プラスミドを説明する図である。
【図１２】 １２％ドデシルスルホン酸ナトリウム（SDS）、ポリアクリルアミドゲル電気 泳動（PAGE）のクーマシー染色を表わし、腸チフスΔphoPQ Δasdワクチン菌株
での組換えハイブリッドHbcAg-プレ-S抗原の発現を示し、矢印は組換え抗原の位
置を指し、レーン１、ポリペプチドSDS-PAGEサイズ標準；レーン２、MGN-1191；
レーン３、MGN-1191/ｐYA3167、トランスホーマ♯１（χ8281）；レーン４、MGN
-1191/ｐYA3167、トランスホーマ♯３；レーン６、MGN-1256；レーン７、MGN-12
56/ｐYA3167、トランスホーマ♯１（χ8280）；レーン８、MGN-1256/pYA3167、 トランスホーマ♯２；レーン９、MGN-1256/ｐYA3167、トランスホーマ♯３；レ ーン１０、χ6212/ｐYA3167である。
【図１３】 SDS-１２％PAGEに続いてアンチ‐HBV‐プレ‐Sモノクローナル抗体で免疫染色
させたものを表わし、腸チフスΔphoPQ Δasdワクチン菌株での組換えハイブリ
ッドHbcAg-プレ-S抗原の発現を示し、矢印は組換え抗原の位置を指し、レーン１
、ポリペプチドSDS-PAGEサイズ標準；レーン２、MGN-1191；レーン３、MGN-1191
/ｐYA3167、トランスホーマ♯１（χ8281）；レーン４、MGN-1191/ｐYA3167、ト
ランスホーマ♯３；レーン６、MGN-1256；レーン７、MGN-1256/ｐYA3167、トラ ンスホーマ♯１（χ8280）；レーン８、MGN-1256/pYA3167、トランスホーマ♯２
；レーン９、MGN-1256/ｐYA3167、トランスホーマ♯３；レーン１０、χ6212/ｐ
YA3167である。
【図１４】 ｐCMVベータ‐asdプラスミドを説明する図である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１月１４日（２０００．１．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１０８】 rpoS突然変異体χ4973による経口接種前及び接種５日後のパイエル板のTEM分 析から、FAEは無傷のままであるが（図５A及び図５B）、FAEが経口接種１日後の
早い段階で、χ3339感染させたパイエル板にて完全に破壊された（図５C）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２３０】 寄託 寄託日 受託番号 菌株： MGN-1191 １９９７年１１月１４日 202054 MGN-1256 １９９７年１１月１４日 202053 χ8280 １９９７年１１月１４日 202055 χ8281 １９９７年１１月１４日 202056 χ8438 １９９７年１１月１８日 202182 プラスミド： pYA3433 １９９７年１１月１４日 209462 上述に関連して、本発明の幾つかの利点が達成されること及び他の有利な結果
が得られることが分かる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ニッカーソン，チェリル エイ アメリカ合衆国 ミズーリ 63017 チェ スターフィールド ピーチ・ヒル・コート 15516 710号 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA31 BA32 BA80 CA01 CA04 DA03 DA05 EA04 GA11 GA14 GA25 HA17 4B065 AA46X AA95X AA95Y AA96Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA16 CA24 CA45 4C084 AA13 NA14 ZB132 ZB322 ZB332 ZB352 ZB382 4C085 AA03 BA02 BA07 BA24 BA49 BA51 BB03 CC07 DD62 EE01 GG10 4C087 AA01 AA02 BC35 CA12 MA59 ZB13 ZB32 ZB33 ZB35 ZB38

Claims (90)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトに所望の遺伝子生産物をデリバリーする方法であって、 （ａ）（ｉ）RpoS+表現型と、（ｉｉ）菌株を弱毒化させる一つ以上の不活性 化突然変異と、（ｉｉｉ）所望の遺伝子生産物をコード化する組換え遺伝子とを
    有するバクテリア菌株に対して選択し、 （ｂ）菌株をヒトに投与することを含む方法。
  2. 【請求項２】 バクテリア菌株を選択することはサルモネラ菌株を選択する
    ことを含む請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 サルモネラ菌株を選択することは腸チフス菌株を選択するこ
    とを含む請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 腸チフス菌株は、pab遺伝子、pur遺伝子、aro遺伝子、asd、
    dap遺伝子、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya 、crp、phoP、phoQ、rfc、poxR、galU又は上記の組合わせでの不活性化突然変異
    を含む請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 腸チフス菌はMGN‐1191から誘導される請求項４記載の方法 。
  6. 【請求項６】 腸チフス菌株は、病原体から前記ヒトへの生産物をコード化
    する組換え遺伝子を発現することが可能である請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記病原体はウイルス、バクテリア、原生動物、寄生菌又は
    真菌である請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 腸チフス菌はχ8281である請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 腸チフス菌株は、前記ヒトの免疫応答を抑制し、調節し、又
    は増大させることができる生産物をコード化する組換え遺伝子を発現させること
    ができる請求項４記載の方法。
  10. 【請求項１０】 腸チフス菌株は自己抗原をコード化する少なくとも一つの
    組換え遺伝子を含む請求項４記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記自己抗原は生殖体特異抗原である請求項１０記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 第二の組換え遺伝子は前記ヒトへのアレルゲンをコード化
    する請求項４記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ヒトに所望の遺伝子生産物をデリバリーする方法であって
    、（ａ）RpoS+表現型と、（ｂ）組換えrpoS+遺伝子と、（ｃ）微生物を弱毒化さ
    せる一つ以上の不活性化突然変異と、（ｃ）所望の遺伝子生産物をコード化する
    第二の組換え遺伝子とを有する生きた弱毒化バクテリアの菌株をヒトに投与する
    ことからなる方法。
  14. 【請求項１４】 バクテリア菌株を投与することには、サルモネラ菌株を投
    与することを含む請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 サルモネラ菌株を投与することには、腸チフス菌株を投与
    することを含む請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 腸チフス菌株はχ8438から誘導される請求項１５記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】 腸チフス菌株は、pab遺伝子、pur遺伝子、aro遺伝子、asd
    、dap遺伝子、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cy
    a、crp、phoP、phoQ、rfc、poxR、galU又は上記の組合わせでの不活性化突然変 異を含む請求項１５記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記第二の組換え遺伝子は病原体から前記ヒトへの遺伝子
    生産物をコード化する請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記病原体はウイルス、バクテリア、原生動物、寄生菌又
    は真菌である請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記第二の組換え遺伝子は前記ヒトでの免疫応答を抑制し
    、調節し、又は増大させることができる生産物をコード化する請求項１７記載の
    方法。
  21. 【請求項２１】 前記第二の組換え遺伝子は自己抗原をコード化する請求項
    １７記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記自己抗原は生殖体特異抗原である請求項２１記載の方
    法。
  23. 【請求項２３】 前記組換え遺伝子は前記ヒトへのアレルゲンをコード化す
    る請求項１７記載の方法。
  24. 【請求項２４】 ヒトへ所望の遺伝子生産物をデリバリーするキャリア微生
    物の菌株を生産する方法であって、 （ａ） 前記菌株のRpoS表現型を決定するためのテストを実行することにより
    、RpoS+表現型を有するバクテリア菌株に対して選択する段階と、 （ｂ） 前記菌株を弱毒化させる一つ以上の不活性化突然変異を生じさせる段
    階と、 （ｃ） 所望の遺伝子生産物をコード化する組換え遺伝子を菌株に導入する段
    階を含み、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の段階の何れかの順序からなる方法。
  25. 【請求項２５】 バクテリア菌株に対して選択することには、サルモネラ菌
    株に対して選択することを含む請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 サルモネラ菌株に対して選択することには、腸チフス菌株
    に対して選択することを含む請求項２５記載の方法。
  27. 【請求項２７】 腸チフス菌株は、pab遺伝子、pur遺伝子、aro遺伝子、asd
    、dap遺伝子、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cy
    a、crp、phoP、phoQ、rfc、poxR、galU又は上記の組合わせでの不活性化突然変 異を含む請求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 腸チフス菌はMGN‐1191から誘導される請求項２７記載の 方法。
  29. 【請求項２９】 腸チフス菌株は病原体から前記ヒトへの遺伝子生産物をコ
    ード化する組換え遺伝子を含む請求項２７記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記病原体はウイルス、バクテリア、原生動物、寄生菌又
    は真菌である請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 腸チフス菌はχ8281である請求項３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 腸チフス菌株は前記ヒトでの免疫応答を抑制し、調節し、
    増大させることができる生産物をコード化する組換え遺伝子を含む請求項２７記
    載の方法。
  33. 【請求項３３】 腸チフス菌株は自己抗原をコード化する少なくとも一つの
    組換え遺伝子を含む請求項２７記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記自己抗原は生殖体特異抗原である請求項３３記載の方
    法。
  35. 【請求項３５】 前記組換え遺伝子は前記ヒトへのアレルゲンをコード化す
    る請求項２７記載の方法。
  36. 【請求項３６】 ヒトへ所望の遺伝子生産物をデリバリーするためのキャリ
    ア微生物を生産する方法であって、（ａ）RpoS+表現型と、（ｂ）組替えrpoS+遺
    伝子と、（ｃ）微生物を弱毒化させる一つ以上の不活性化突然変異と、（ｃ）所
    望の遺伝子生産物をコード化する第二の組換え遺伝子とを有するバクテリア菌株
    を発生させることからなる方法。
  37. 【請求項３７】 バクテリア菌株を発生させることは、サルモネラ菌株を発
    生させることを含む請求項３６記載の方法。
  38. 【請求項３８】 バクテリア菌株を発生させることには、腸チフス菌株を発
    生させることを含む請求項３７記載の方法。
  39. 【請求項３９】 腸チフス菌株はχ8438から誘導される請求項３８記載の方
    法。
  40. 【請求項４０】 腸チフス菌株は、pab遺伝子、pur遺伝子、aro遺伝子、asd
    、dap遺伝子、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cy
    a、crp、phoP、phoQ、rfc、poxR、galU又は上記の組合わせでの不活性化突然変 異を含む請求項３８記載の方法。
  41. 【請求項４１】 第二の組換え遺伝子は病原体から前記ヒトへの遺伝子生産
    物をコード化する請求項３９記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記病原体はウイルス、バクテリア、原生動物、寄生菌又
    は真菌である請求項４１記載の方法。
  43. 【請求項４３】 第二の組換え遺伝子は前記ヒトでの免疫応答を抑制し、調
    節し、又は増大させることができる生産物をコード化する請求項３９記載の方法
    。
  44. 【請求項４４】 第二の組換え遺伝子は自己抗原をコード化する請求項３９
    記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記自己抗原は生殖体特異抗原である請求項３９記載の方
    法。
  46. 【請求項４６】 前記組換え遺伝子は前記ヒトへのアレルゲンをコード化す
    る請求項３９記載の方法。
  47. 【請求項４７】 ヒトへ所望の遺伝子生産物をデリバリーするためのキャリ
    ア微生物であって、（ａ）RpoS+表現型と、（ｂ）組換えrpoS+遺伝子と、（ｃ）
    微生物を弱毒化させる一つ以上の不活性化突然変異と、（ｃ）所望の遺伝子生産
    物をコード化する第二の組換え遺伝子とを有する生きた弱毒化バクテリア菌を含
    むキャリア微生物。
  48. 【請求項４８】 前記バクテリアはサルモネラ菌を含む請求項４７記載のキ
    ャリア微生物。
  49. 【請求項４９】 前記サルモネラ菌は腸チフス菌を含む請求項４８記載のキ
    ャリア微生物。
  50. 【請求項５０】 腸チフス菌株はχ8438から誘導される請求項４９記載の方
    法。
  51. 【請求項５１】 弱毒化腸チフス菌は、pab遺伝子、pur遺伝子、aro遺伝子 、asd、dap遺伝子、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cd
    t、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、poxR、galU又は上記の組合わせでの不活性化突
    然変異を含む請求項４９記載のキャリア微生物。
  52. 【請求項５２】 前記第二の組換え遺伝子は病原体から前記ヒトへの遺伝子
    生産物をコード化する請求項５１記載のキャリア微生物。
  53. 【請求項５３】 前記病原体はウイルス、バクテリア、原生動物、寄生菌又
    は真菌である請求項５２記載のキャリア微生物。
  54. 【請求項５４】 前記第二の組換え遺伝子は、前記ヒトでの免疫応答を抑制
    し、調節し又は増大させることができる生産物をコード化する請求項５１記載の
    キャリア微生物。
  55. 【請求項５５】 前記第二の組換え遺伝子は自己抗原をコード化する請求項
    ５１記載のキャリア微生物。
  56. 【請求項５６】 前記自己抗原は生殖体特異抗原である請求項５５記載のキ
    ャリア微生物。
  57. 【請求項５７】 前記組換え遺伝子は前記ヒトへのアレルゲンをコード化す
    る請求項５１記載のキャリア微生物。
  58. 【請求項５８】 （ａ）RpoS+表現型と、（ｂ）組換えrpoS+遺伝子と、（ｃ
    ）微生物を弱毒化させる一つ以上の不活性化突然変異と、（ｃ）所望の遺伝子生
    産物をコード化する第二の組換え遺伝子とを有する生きた弱毒化バクテリア菌株
    を含むヒトの免疫化用のワクチン。
  59. 【請求項５９】 前記バクテリア菌はサルモネラ菌を含む請求項５８記載の
    ワクチン。
  60. 【請求項６０】 前記サルモネラ菌は腸チフス菌を含む請求項５９記載のワ
    クチン。
  61. 【請求項６１】 腸チフス菌株はχ8438から誘導される請求項６０記載の方
    法。
  62. 【請求項６２】 腸チフス菌は、pab遺伝子、pur遺伝子、aro遺伝子、asd、
    dap遺伝子、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、hemA、cdt、cya 、crp、phoP、phoQ、rfc、poxR、galU又は上記の組合わせでの不活性化突然変異
    を含む請求項６０記載のワクチン。
  63. 【請求項６３】 前記第二の組換え遺伝子は病原体からヒトへの遺伝子生産
    物をコード化する請求項６２記載のワクチン。
  64. 【請求項６４】 病原体はウイルス、バクテリア、原生動物、寄生菌又は真
    菌である請求項６３記載のワクチン。
  65. 【請求項６５】 前記第二の組換え遺伝子は自己抗原をコード化する請求項
    ６２記載のワクチン。
  66. 【請求項６６】 前記自己抗原は生殖体特異抗原である請求項６５記載のワ
    クチン。
  67. 【請求項６７】 前記第二の組換え遺伝子は前記ヒトへのアレルゲンをコー
    ド化する請求項６２記載のワクチン。
  68. 【請求項６８】 腸チフス菌の弱毒化菌株は薬剤学的に許容なキャリア内に
    存在する請求項５８記載のワクチン。
  69. 【請求項６９】 （ａ）RpoS+表現型と、（ｂ）組換えrpoS+遺伝子と、（ｃ
    ）微生物を弱毒化させる一つ以上の不活性化突然変異と、（ｃ）所望の遺伝子生
    産物をコード化する第二の組換え遺伝子とを有する生きた弱毒化バクテリア菌株
    を含む遺伝子工学的に操作された細胞。
  70. 【請求項７０】 バクテリア菌株はサルモネラ菌株を含む請求項６９記載の
    遺伝子工学的に操作された細胞。
  71. 【請求項７１】 サルモネラ菌株は腸チフス菌株を含む請求項７０記載の遺
    伝子工学的に操作された細胞。
  72. 【請求項７２】 腸チフス菌株はχ8438から誘導された請求項７１記載の方
    法。
  73. 【請求項７３】 腸チフス菌の弱毒化菌株は、pab遺伝子、pur遺伝子、aro 遺伝子、asd、dap遺伝子、nadA、pncB、galE、pmi、fur、rpsL、ompR、htrA、he
    mA、cdt、cya、crp、phoP、phoQ、rfc、poxR、galU又は上記の組合わせでの不活
    性化突然変異を含む請求項７１記載の遺伝子工学的に操作された細胞。
  74. 【請求項７４】 前記第二の組換え遺伝子は病原体から前記ヒトへの遺伝子
    生産物をコード化する請求項７３記載の遺伝子工学的に操作された細胞。
  75. 【請求項７５】 前記病原体はウイルス、バクテリア、原生動物、寄生菌又
    は真菌である請求項７４記載の遺伝子工学的に操作された細胞。
  76. 【請求項７６】 前記第二の組換え遺伝子は前記ヒトでの免疫応答を抑制し
    、調節し又は増大させることができる生産物をコード化する請求項７３記載の遺
    伝子工学的に操作された細胞。
  77. 【請求項７７】 前記第二の組換え遺伝子は自己抗原をコード化する請求項
    ７３記載の遺伝子工学的に操作された細胞。
  78. 【請求項７８】 前記自己抗原は生殖体特異抗原である請求項７７記載の遺
    伝子工学的に操作された細胞。
  79. 【請求項７９】 前記組換え遺伝子は前記ヒトへのアレルゲンをコード化す
    る請求項７３記載の遺伝子工学的に操作された細胞。
  80. 【請求項８０】 薬剤学的に許容なキャリアにより、請求項６９記載の遺伝
    子工学的に操作された細胞を混合することを含むワクチン調製方法。
  81. 【請求項８１】 ヒトへ所望の遺伝子生産物をデリバリーする方法であって
    、（ａ）消化管関連リンパ系組織の侵入及びコロニー形成を容易にする遺伝子生
    産物を発現させることができる組換えビルレンス遺伝子と、（ｂ）微生物を弱毒
    化させる一つ以上の不活性化突然変異と、（ｃ）所望の生産物をコード化する第
    二の組換え遺伝子とを有する生きた弱毒化バクテリア菌株をヒトへ投与すること
    を含む方法。
  82. 【請求項８２】 バクテリア菌株はサルモネラ菌株である請求項８１記載の
    方法。
  83. 【請求項８３】 サルモネラ菌株は腸チフス菌株である請求項８２記載の方
    法。
  84. 【請求項８４】 （ａ）消化管関連リンパ系組織の侵入及びコロニー形成を
    容易にする遺伝子生産物を発現させることができる組換えビルレンス遺伝子と、
    （ｂ）微生物を弱毒化させる一つ以上の不活性化突然変異と、（ｃ）所望の生産
    物をコード化する第二の組換え遺伝子とを有する生きた弱毒化バクテリア菌株を
    含む遺伝子工学的に操作させた細胞。
  85. 【請求項８５】 バクテリア菌はサルモネラ菌を含む請求項８４記載の遺伝
    子工学的に操作させた細胞。
  86. 【請求項８６】 サルモネラ菌は腸チフス菌を含む請求項８５記載の遺伝子
    工学的に操作させた細胞。
  87. 【請求項８７】 バクテリア菌のRopS表現型を決定することを含むバクテリ
    アの免疫病性を評価する方法であって、RpoS−表現型を有する同質遺伝子系統バ
    クテリア菌と比較して、RopS+表現型の存在により、免疫原性が増大しているこ とを示す方法。
  88. 【請求項８８】 バクテリア菌はサルモネラ菌を含む請求項８７記載の方法
    。
  89. 【請求項８９】 サルモネラ菌は腸チフス菌を含む請求項８８記載の方法。
  90. 【請求項９０】 RpoS表現型は、カタラーゼ活性及び腸チフス菌のグリコー
    ゲン生合成活性の何れか若しくは双方を評価することにより決定される請求項８
    ９記載の方法。
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