KR100749493B1 - 대장균에서 ｒｐｏＳ 유전자의 발현을 조절함으로서프로피온산에 대한 미생물 감수성을 증진시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장균에서 rpoS 유전자의 발현을 조절함으로서 프로피온산에 대한 미생물 감수성을 증진시키는 방법으로서, 보다 자세하게는 RpoS의 발현 또는 활성을 억제하는 경우 prpBCDE 유전자의 발현이 억제되어 프로피온산에 대해 미생물의 감수성이 증가되므로 식품 내에 첨가하는 프로피온산에 대한 내성에 관여하는 인자의 불활성화 또는 억제를 통하여 프로피온산 등의 방부제 첨가를 줄이는 데 유용하다.

프로피온산, RpoS 단백질, prpBCDE 유전자

Description

대장균에서 ｒｐｏＳ 유전자의 발현을 조절함으로서 프로피온산에 대한 미생물 감수성을 증진시키는 방법{Method for the regulation of rpoS gene expression and for the enhancement of microorganism susceptibility in Escherichia coli}

도 1은 야생형 MG1655 그의 rpoS 돌연변이 균주 JIL654 균주에서의 생장시간 별 prpBCDE 네 유전자의 전사발현 양상을 나타낸 도면이다:

A : MG1655; 및

B: JIL654.

도 2는 야생형 MG1655 및 그의 rpoS 돌연변이 균주 JIL654의 프로피온산 함유 최소배지에서의 생장곡선을 600 nm에서 흡광도를 측정한 그래프이다:

●: MG1655의 프로피온산 10 mM에서의 생장;

○: JIL654의 프로피온산 10 mM에서의 생장;

▼: MG1655의 프로피온산 20 mM에서의 생장; 및

▷: JIL654의 프로피온산 20 mM에서의 생장.

도 3은 pRpoS 재조합 플라스미드를 만드는 과정을 나타낸 도면이다.

도 4는 RpoS 인자의 분리 정제 및 prp 유전자의 프로모터 부위와 완전효소와의 결합 정도를 나타낸 도면이다:

(A) M: 마커;

lane 1: IPTG 유도후 단백질 발현 양상;

lane 2: Ni-NTA 아카로스 컬럼에 로딩한 후 세척한 후 단백질 정제도;

lane 3: 완전 정제된 모습;

(B) lane 1: 마커;

lane 2: 자유 프루브(free probe);

lane 3-9: DNA 프루브 및 완전효소 복합체의 이동양상.

본 발명은 대장균에서 rpoS 유전자의 발현을 조절함으로서 프로피온산의 세포 감수성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

프로피온산은 prpE 유전자에 의해 암호화되는 프로피오닐-CoA 합성화효소 (propionyl-CoA synthetase)의 작용으로 프로피오닐-CoA로 전환되며(Horswill and Escalante-Semerena. Microbiology 145:1381-1388, 1999), 프로피오닐-CoA는 prpC 유전자에 의해 암호화되는 메틸시트릭산 합성화효소(methylcitric acid synthase)에 의해 옥살로아세트산과 축합되어 2-메틸시트릭산으로 전환된다(Textor et al . Arch. Microbiol . 168:428-436, 1997). 2-메틸시트릭산은 prpD 유전자에 의해 암호화되는 2-메틸이소시트릭산 탈수소화효소(2-methylisocitrate dehydratase)에 의해 메틸-시스-아코닉산(2-methyl-cis-aconitic acid)을 거쳐 메틸이소시트릭산(2-methylisocitrate)로 전환된다. 최종적으로 메틸이소시트릭산은 prpB 유전자에 의해 암호화되는 2-메틸이소시트릭산 분해효소(2-methylisocitrate lyase)에 의해 피루브산(pyruvic acid)과 숙신산(succinic acid)으로 나누어지게 된다(Brock et al , Eur. J. Biochem . 269:6184-6194, 2002).

지난 몇 년간 진핵생물에서 프로피온산의 이화경로로 알려진 다양한 경로(아크릴레이트 경로, 메틸말로닐-CoA 경로, 말로닉 세미알데하이드-CoA 경로)가 규명되어 왔다(Textor et al. Arch. Microbiol. 168:428-436, 1997). 한편, 효모(Saccharomyces cerevisiae), 사상균(filamentous fungi)을 비롯, 그람음성균인 풋마름병 병원균(Ralstonia eutropha), 살모넬라(Salmonella typhimurium) 그리고 대장균(Escherichia coli) 등에서는 프로피온산의 산화에 관여하는 새로운 경로인 2-메틸시트릭산(2-methylcitric acid) 경로가 알려져 있는데 이 경로를 통해 프로피온산은 피루브산(pyruvic acid)으로 산화된다(Textor et al . Arch . Microbiol . 168:428-436, 1997; Miyakoshi et al . Agric . Biol . Chem. 51:2281-2387, 1987; Pronk et al . Microbiology 140:717-722, 1994; Horswill and Escalante-Semerena, J. Bacteriol. 179:928-940, 1997; Horswill and Escalante-Semerena J. Bacteriol. 181:5615-5623, 1999; Bramer and Steinbuchel, Microbiology 147:2203-2214, 2001). 이 경로를 구성하는 효소들은 prpBCDE 군으로 이루어진 유전자군에 의해 암호화되는데 이들 유전자는 살모넬라에서 맨 처음 규명되었다 (Horswill and Escalante-Semerena, J. Bacteriol . 181:5615-5623, 1999). 최근 대장균의 유전체 서열 분석이 완료되었는데 그 결과 대장균에서도 살모넬라와 비슷하게 프로피온산의 산화에 관여하는 유사 prpBCDE 유전자가 있음이 밝혀졌으며 이들 유전자들은 살모넬라의 유전자군과 적어도 76%의 상동성을 보임은 물론 유전자군 (operon)을 구성하고 있음이 밝혀졌다(Textor et al . Arch . Microbiol. 168:428-436, 1997; Blattner et al . Science 277:1453-1474, 1997).

일반적으로 프로피온산은 음식물에 대하여 살균력과 보존력을 지니므로 식품의 저장에 이용되는 방부제 물질로서 사용되는데, 식품업계에서는 식품의 보존력을 유지하기 위해 식품에 프로피온산을 적정량 첨가하고 있는 실정이다.

이러한 프로피온산의 살균 및 보존력은 오염원이 되는 바실러스, 슈도모나스 및 대장균 등을 포함한 다양한 종류의 식품미생물의 생장 및 증식을 억제 또는 지연하여 발효와 부패를 막음으로써 획득되는데, 이러한 프로피온산에 대해 내성이 큰 균주 및 돌연변이주에 의한 오염을 완전 방지하기는 어려운 실정이다.

현재, 상기의 prpBCDE 유전자군을 조절하는 인자로는 NtrC-유사 단백질인 PrpR(prpR에 의해 암호화됨)이 알려져 있으며(Palacios and Escalante-Semerena. J. Bacteriol. 182:905-910, 2000; Shingler. Mol . Microbiol . 19:409-416, 1996), 이외에도 시그마-54(sigma-54) 및 인테그레이션 호스트 인자(integration host factor: IHF)가 prpBCDE 유전자의 전사발현에 양성적으로 작용함이 보고되었다(Horswill and Escalante-Semerena. J. Bacteriol. 179:928-940, 1997; Palacios and Escalante-Semerena. J. Bacteriol . 182:905-910, 2000; Tsang et al . J. Bacteriol. 180:6511-6518, 1998). 또한 최근에는 prpBCDE 와 prpR 프로모터가 대 장균과 살모넬라에 존재하는 cyclic AMP(cAMP)-cAMP 수용체 단백질(CRP) 복합체에 의해 조절됨이 보고되었다(Lee et al . J. Bacteriol. 187:2793-2800, 2005).

대장균에서 rpoS 유전자에 의해 암호화되는 RpoS 인자는 배양단계 중 세포정지기(stationary phase)에서 세포생장 및 다른 스트레스에 대한 방어에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌는데, 유전자는 세포정지기의 도입기에 극적으로 발현되어 세포내에 RpoS 인자의 양이 증가함이 보고되었다(Hengge-Aronis. Escherichia coli and Salmonella: ASM Press, Washington, D.C. pp.1497-1512, 1996).

본 발명에서는 prpBCDE 유전자의 전사발현에 미치는 또 다른 인자를 규명하기 위해 대장균에서 중요한 역할을 담당하는 RpoS 인자의 존재 여부에 의한 prpBCDE 유전자의 전사발현 양상을 조사하였다. 이를 통해 RpoS 인자의 전사 발현을 조절함으로 prpBCDE 유전자의 전사 발현이 억제되어 프로피온산에 대한 세포 감수성을 증가시킴을 확인함으로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 대장균의 RpoS 단백질의 발현을 조절함으로 프로피온산에 대한 세포 감수성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 세포 내의 RpoS 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 prpBCDE 유전자의 전사 발현을 조절하여 프로피온산에 대한 미생물의 감수성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 RpoS의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 미생물의 생장억제제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 프로피온산에 대한 미생물의 감수성을 증가시키는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세포 내의 RpoS 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 prpBCDE 유전자의 전사 발현을 조절하여 프로피온산에 대한 미생물의 감수성을 증가시키는 방법을 제공한다.

rpoS 유전자의 발현은 세포 정지기 도입부 이후에 발현되는 것으로 밝혀져 있으며, 약 50개 이상의 유전자 발현이 다양한 스트레스 및 pH 변화 등에 의해 RpoS 인자 의존적으로 조절받는 것으로 보고되어 있다(Jung and Kim, J. Biol . Chem. 278:22846-22852, 2003; Tanaka et al . Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:3511-3515, 1993; Hengge-Aronis, Escherichia coli and Salmonella . ASM Press, Washington, D.C. pp. 1497-1512, 1996). 본 발명자들은 RpoS 단백질 인자의 발현을 조절하여 prpBCDE 유전자에 미치는 영향을 조사하고자 대장균 K-12 유도균주 중 야생형 균주로 MG1655를 선택하여 사용하였고, Jung 등의 방법으로 rpoS 돌연변이 균주(JIL654 균주)를 제작하였다(Jung and Kim, Biochem . Biophys . Res . Commun. 301:915-922, 2003). 상기 야생형 균주와 제작한 rpoS 돌연변이 균주를 배양한 후 2,4,6시간대별로 RNA를 회수하여 prpBCDE 유전자의 전사 발현 양상을 RT-PCR로 조사하였다. 이 때 2시간은 지수기 배양을, 4시간은 정지기 도입 배입 부분을, 6시간은 세포정지기의 배양기를 대표하는 시간으로 설정하였다. 그 결과 야생형 균주인 MG1655에서는 prpE 및 prpBCD 유전자들은 모두 정지기에서 발현이 급격히 증가하였으며, 특히 prpBCD 유전자는 배양 후 6시간에 그 발현이 크게 증가하였다(도 1A 참조). prpBCDE 유전자의 전사발현 및 rpoS 유전자의 전사 발현이 세포정지기에서 유도된다는 점에서 입각하여 본 발명자들은 prpBCDE 유전자의 발현이 RpoS 인자의 조절하에 있는지 조사하였다. 이를 위해 rpoS 돌연변이 균주에서 RT-PCR을 수행한 결과, rpoS의 발현이 억제되었을 때에는 정지기에서 prpBCDE 유전자의 유도가 억제되었다(도 1B 참조). 이를 통해 RpoS가 prpBCDE 유전자의 전사 발현에 양성적으로 작용함을 알 수 있다. 상기에 기술한대로 약 50개 이상의 유전자가 RpoS 인자의 조절하에 있는데 본 실험 결과를 토대로 4개의 새로운 유전자, 즉 prpBCDE 역시 RpoS의 조절하에 있는 rpoS 레귤론(regulon)임이 증명되었다. 한편, prpR 유전자의 산물은 prpBCDE의 전자적 조절인자로 알려져 있다. 상기의 RpoS에 의한 prpBCDE 유전자의 발현 변화가 PrpR 인자의 변화 때문인지를 규명하기 위하여 RpoS의 존재 및 부재시 RT-PCR 방법으로 prpR의 전사 발현을 조사하였다. 그 결과 rpoS 유전자의 돌연변이로 인한 RpoS 활성 제거는 prpR 유전자의 전사 발현에 아무런 영향을 미치지 못하는 것을 확인하였다(도 1 참조). 이를 통해 RpoS 가 PrpR과는 독립적으로 prpBCDE 유전자의 전사 발현에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다.

이후 본 발명자들은 세포가 프로피온산을 탄소원으로 하여 생장할 때 RpoS 인자의 생리적 역할을 규명하기 위해 야생형 균주 MG1655와 rpoS 돌연변이 균주 JIL654를 유리한 탄소원으로 프로피온산을 함유한 M9 최소배지에서 배양하였다. M9 최소배지에는 10 mM 또는 20 mM의 프로피온산을 함유하여 상기 균주들을 각각 배양하였고 시간대별로 흡광도를 측정하여 세포의 생장을 비교하였다. 그 결과 야생형 균주 MG1655의 생장 속도보다 rpoS 돌연변이 균주 JIL654의 생장 속도가 1/3 정도로 현저히 감소함을 알 수 있다. 이를 통해 rpoS 돌연변이에 의한 RpoS 단백질의 발현 억제를 통해 대장균의 프로피온산에 대한 세포 감수성이 증가함을 알 수 있다(도 2 참조).

본 발명자들은 RpoS 인자에 의한 prpBCDE 유전자의 발현조절이 직접적인지 아닌지를 규명하기 위하여 재조합 RpoS 단백질을 생산 및 정제하였고, 완전효소를 제작한 후에 젤 이동변화 분석(EMSA)을 수행하였다. 다른 연구 그룹의 보고에 의하면 RpoS는 일반적으로 4개의 보존성 염기서열 (conserved nucleotides, -13C, -12T, -11A, -7T)를 인식하는데 이 염기서열은 염기서열 -14에서 -7 부위에 존재하는 것으로 알려져 있다(Lee and Gralla, J. Biol . Chem . 276:30064-30071, 2000; Becker and Hengge-Aronis, Mol . Microbiol . 39:1153-1165, 2001; Gaal, et al . Mol. Microbiol . 42:939-954, 2001). 이러한 보존성 서열에 기초하여 http://arep.med.harvard.edu/ecoli_matrices에서 무료로 제공되는 프로모터 분석 결과를 얻어 잠재적인 prpBCDE 상의 RpoS 결합부위를 예측하였다. 이를 토대로 디자인한 서열번호 13으로 기재되는 prp-1 및 서열번호 14로 기재되는 prp-2 합성 올리고머를 제작하여 이중가닥 DNA 절편을 제작한 후, 상기 이중가닥 DNA와 완전효소와의 결합 정도를 EMSA를 통하여 분석하였다. 그 결과, 완전효소의 농도가 증가할수록 사용된 이중가닥 DNA와 농도의존적으로 결합함을 볼 수 있었는데(도 4 참조), 이를 통해 RpoS를 포함한 완전효소가 prpBCDE의 프로모터 부위에 직접적으로 결합함을 알 수 있다.

RpoS 단백질의 발현 또는 활성 억제는 당업계에서 알려진 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 보다 구체적으로 RpoS 단백질의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, RpoS 단백질에 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 활성억제제를 유효성분으로 포함하는 세포 생장억제제를 이용하여 수행할 수 있다.

안티센스 뉴클레오티드

안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해한다. 표적 서열에 특이성이 있게 하는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다(Rothenberg et al., J. Natl . Cancer Inst ., 81:1539-1544, 1999). 올리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착, 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스 뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태의 치료제로 고려되고 있다. 본 발명의 RpoS에 대한 안티센스 뉴클레오티드는 당업자에게 알려진 방법으로 제작될 수 있으며(Brummelkamp et al ., Science, 296:550-553, 2002; Shen et al ., FEBS Lett., 539:111-113, 2003; Xia et al ., Nat Biotech , 20:1006-1010, 2002), RpoS에 대한 안티뉴클레오티드에 의해 RpoS의 발현이 억제됨은 당업자에게 자명하다.

펩티드 미메틱스( Peptide Mimetics )

RpoS 결합 도메인을 억제하는 미메틱스(예, 펩티드 또는 비펩티드성 약제)를 제작하여 RpoS의 활성을 억제할 수 있다.

비가수분해성 펩티드 유사체의 주요 잔기로는 β-턴 디펩티드 코어(Nagai et al . Tetrahedron Lett 26:647, 1985), 케토-메틸렌 슈도펩티드류(Ewenson et al. J Med Chem 29:295, 1986; 및 Ewenson et al . in Peptides: Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), 아제핀(Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 벤조디아제핀(Freidinger et al . in Peptides; Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), β-아미노알콜(Gordon et al . Biochem Biophys Res Commun 126:419 1985) 및 치환 감마 락탐환(Garvey et al . in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshell ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988) 을 사용하여 생성할 수 있다.

본 발명은 상기 RpoS 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 미생물의 생장억제제를 제공한다. 본 발명의 미생물 생장억제제는 RpoS의 mRNA와 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, RpoS 단백질에 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 세포 생장억제제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 미생물 생장억제제는 대장균(E. coli)(Brock, M. et al ., Eur J. Biochem. 268:3577-3586, 2001), 살모넬라균(Salmonella)(Horswill, A. R. and Escalante-Semerena, J. C. Journal of Bacteriology 928-940, 1007) , 바실러스(Bacillus), 스타필로코코스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 사상균(filamentous fungi)(Brock, M. et al ., Eur J. Biochem. 268:3577-3586, 2001), 효모(yeast), 레지오넬라(Legionella), 로도피레루라(Rhodopirellula), 아퀴펙스(Aquifex), 크로모박테리움(Chromobacterium), 여시니아(Yersinia), 쉬겔라(Shigella), 비브리오(Vivrio ) 등은 rpoS 유전자를 보유하고 있으므로 프로피온산에 대한 산화를 방지하여 미생물의 생장을 효과적으로 억제할 수 있는며, 특히 식품에 처리시 프로피온산 등의 방부제 첨가를 줄일 수 있다.

본 발명의 미생물 생장억제제는 프로피온산을 처리하는 식품에 함께 처리할 수 있다.

본 발명은 프로피온산에 대한 미생물 감수성을 증가시키는 물질 스크리닝 방법으로 제공한다: 1) RpoS 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 표적 물질로 이용하여 시험 대상 물질을 접촉시키는 단계; 및 2) 시험 대상 물질이 표적 물질의 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 감소시키는지 여부를 결정하는 단계. 상기 방법은 대장균의 RpoS 단백질의 전사를 억제하여 prpBCDE 유전자의 발현을 억제하는 물질을 찾는 것을 특징으로 한다. 상기 스크리닝 방법으로는 RT-PCR, 면역어세이 등이 이용될 수 있으며, 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질의 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 프로피온산에 대한 미생물 감수성을 증가시키는 물질 스크리닝 방법을 제공한다: 1) 재조합 RpoS 단백질과 시험 대상 물질을 반응시키는 단계: 2) 단계 1)에서 반응시킨 재조합 RpoS 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 3) 대조군과 비교하여 재조합 RpoS 단백질의 활성을 감소시키는 시험 대상 물질을 선별하는 단계. 상기 단계 2)의 재조합 RpoS 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업자에게 알려진 방법을 사용할 수 있으며, SDS-PAGE, 형광물질 증의 리포터 유전자를 이용한 형광 측정 방법, high throughput system의 일환인 DNA chip 또는 Protein chip 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 본 발명의 방법은 RpoS 단백질의 특이적 인식 DNA 단편을 점적한 microarray(DNA chip)에 시험 대상 물질과 상기 재조합 RpoS 단백질을 동시 또는 순차적으로 처리하고 세척한 다음 상기 DNA 단편에 결합한 RpoS 단백질의 양을 정량함으로써 상기 시험 대상 물질이 RpoS와 RpoS 특이적 인식 DNA 사이의 결합을 저해했는지 여부를 조사함으로써 수행될 수 있다. 이때 상기 RpoS 단백질의 정량 방법으로는 RpoS 단백질 직접 형광 물질로 직접 표시할 수 있으며, RpoS 단백질을 인지하는 항체에 형광 물질을 표지하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 방법은 RpoS 단백질을 점적한 microarray(Protein chip)에 시험 대상 물질과 RpoS 단백질의 특이적 인식 DNA 단편을 동시 또는 순차적으로 처리하고 세척한 다음 상기 RpoS 단백질에 결합한 RpoS 단백질의 특이적 인식 DNA 단편을 정량함으로써 상기 시험 대상 물질이 RpoS와 RpoS 특이적 인식 DNA 사이의 결합을 저해하는지 여부를 조사함으로써 수행될 수 있다. 이때 상기 RpoS 단백질의 특이적 인식 DNA 단편의 정량 방법으로는 DNA 단편에 형광표지를 할 수 있으며, 최근 개발된 골드 나노입자와 bar-code DNA를 이용하여 상기 DNA 단편을 정량할 수 있다(Sicence 301:1884,2003; J. Am . Chem . Soc . 126:5932, 2004). 그에 더하여 상기 DNA 단편에 바이오틴을 부착하여 바이오틴과 아비딘의 결합력을 이용하여 정량할 수 있다(Science 264:415, 1994). 또한 SPR(Surface Plasmon Resonaance)를 이용하여 상기 표적 물질인 RpoS 단백질과 결합하는 단백질을 조사할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 프로피온산에 대한 미생물 감수성을 증가시키는 물질 스크리닝 방법을 제공한다: 1) rpoS 인식부위를 포함하는 프로모터의 유전자 컨스트럭트와 리포터 유전자를 구축하는 단계; 2) 단계 1)의 유전자 컨스트럭트를 세포에 형질전환하는 단계; 3) 단계 2)의 세포에 시험 대상 물질을 처리하는 단계; 4) 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및 5) 대조군과 비교하 여 rpoS 유전자의 발현을 감소시키는 시험 대상 물질을 선별하는 단계. 상기 단계 1)의 유전자 컨스트럭트를 구축하는 방법 및 단계 2)의 세포에 형질전환하는 방법은 당업자에게 공지된 모든 방법을 사용할 수 있으며, 상기 단계 2)의 세포로는 대장균 또는 살모넬라를 사용할 수 있다. 단계 4)의 리포터 유전자의 활성을 측정하는 방법으로는 형광 측정 장치, 방사능 측정 정치, 및 발색반응 측정 장치를 이용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 프로피온산에 대한 미생물 감수성을 증가시키는 물질 스크리닝 방법을 제공한다: 1) 세포에 시험 대상 물질을 처리하는 단계: 2) rpoS 유전자의 전사 발현을 측정하는 단계: 3) 및 대조군과 비교하여 rpoS 유전자의 전사 발현을 감소시키는 시험 대상 물질을 선별하는 단계. 상기 단계 1)의 세포는 대장균 또는 살모넬라를 이용할 수 있다. 상기 단계 2)의 rpoS 유전자의 전사 발현을 측정하는 방법으로는 RT-PCR, 노던 블롯 등을 이용할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 전사체의 양을 측정하는 방법은 모두 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> prpBCDE 유전자의 생장시간별 발현 비교 및 RpoS 인자의 역할 규명

< 실시예 1-1> 역전사 분석( reverse transcription assay)

본 발명자들은 대장균 K12 균주를 사용하였으며 야생형으로는 MG1655균주(rph-)를 사용하였고, 상기 균주는 미국의 예일대학교에 위치한 E. coli genetic stock center(관련 홈페이지: http://cgsc.biology.yale.edu/top.html)에서 분양받아 사용하였으며, rpoS 돌연변이 유도체로는 본 발명자들이 개발한 JIL654(mg1655, rpoS::Tn10)을 사용하였다(Jung and Kim, Biochem . Biophys . Res . Commun . 301:915-922, 2003). 돌연변이 균주는 P1-transduction 방법에 의해 제작하였다(Miler JH, A short course in bacterial genetics, 263-274, 1972). 돌연변이를 함유한 P1 파아지를 야생형 균주에 도입한 후 적절한 항생제를 함유한 LB 배지에 도말한 후 여기서 자라난 콜로니의 표현형을 시험함으로써 rpoS 돌연변이 균주 JIL654를 제작하였다. 각 균주의 세포 배양은 LB 배지(배지 1 ℓ당 Bacto tryptone 10 g, Bacto yeast extract 5 g, NaCl)를 이용하여 수행하였으며, 세포 배양은 LB 배지 20 ㎖을 함유한 250 ㎖ 삼각 플라스크에서 실시하였으며 효과적인 산소의 공급을 위해 200 rpm에서 진탕 배양하였다.

이 후 역전사 분석을 수행하기 위하여 RT-PCR 방법을 수행하였으며, 이를 위한 RNA는 야생형 대장균 MG1655 및 그의 rpoS 돌연변이주 JIL654를 배양하여 2시간(지수기 배양), 4시간(정지기 도입기), 6시간(세포 정지기) 간격으로 RNA extraction kit(Quiagen, USA)를 이용하여 회수하였다.

상기 추출된 RNA 중 prpBCDE의 전사량을 분석하기 위해, 먼저 cDNA 합성 키트 및 랜덤 핵사머(MBI Fermentas, USA)를 이용하여 상기 RNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 이용하여 PCR(Polymerization chain reaction)을 수행하였으며, prpB(5’-TAC ACT CTC CAG GTA AAG CGT TT-3':서열번호 1; 5’-AAC AGG TTG TCG AGC TTC TCT TC-3':서열번호 2), prpC(5’-ACA GTA CCC ATG TCA TTA AAC CG-3':서열번호 3; 5’-GTT GTC CTG ACG TTG TTC GAT AA-3':서열번호 4), prpD(5’-TTG ATC GTG AAA TCG TTG ATA TC-3':서열번호 5; 5’-GGA TCT TCA AAG CAA TTG ATC TT-3':서열번호 6), prpE(5’-CTC TTC GGA AAC AGA AGA AGA GC-3':서열번호 7; 5’-GAT CTT CCA GAC TGT CGC TCT CT-3':서열번호 8), 및 prpR(5’-ACG ACA AAC CGG TTA TCT GGA C-3':서열번호 9; 5’-ACG TCC TTG CTG CAT ATC TTC T-3':서열번호 10)의 프라이머를 이용하였다. PCR의 반응 조건은 95℃에서 60초, 56℃에서 60초, 72℃에서 100초를 1회 반응으로 하여 총 23회 반복하여 증폭하였다. 상기 조건으로 증폭된 DNA를 전기영동법에 의해 1% 아가로오스 젤 상에서 확인하였다.

그 결과, 도 1에서 보듯이, prpE 및 prpBCD 유전자들은 모두 정지기에서 그의 발현이 급격히 증가하였는데, 특히 prpBCD 세 유전자는 배양 후 6시간에 그의 발현이 크게 증가하였다(도 1A). rpoS 돌연변이 균주의 경우 정지기에서 prpBCDE 유전자의 유도가 억제되었는데 이는 RpoS가 prpBCDE 유전자의 전사 발현에 양성적으로 작용함을 알 수 있다(도 1B).

prpR 유전자 산물은 prpBCDE의 전사적 조절인자로 알려져 있다. 상기 RpoS에 의한 prpBCDE 유전자의 발현 변화가 PrpR 인자의 변화인지 확인하기 위하여 야생형 균주와 돌연변이 균주에서 전사발현 양상을 조사하였다. 그 결과, rpoS 유전 자의 돌연변이로 인한 RpoS활성의 제거는 prpR 유전자의 전사발현에 아무런 영향을 미치지 못함을 확인하였다(도 1).

< 실시예 1-2> rpoS 돌연변이 균주의 프로피온산 민감도 조사

세포가 피로피온산을 탄소원으로 하여 생장할 때 RpoS 인자의 생리적 역할을 규명하기 위하여 야생형 균주와 그로부터 유도된 rpoS 돌연변이 균주를 유일한 탄소원으로 프로피온산을 함유한 M9 최소배지에 배양하였다. 이를 위해 LB 배지에서 밤새 배양된 세포들을 M9 최소배지로 세척하여 준 후, 10, 20 mM 프로피온산을 함유한 M9 최소배지에 접종하여 배양시간별로 그의 흡광도를 측정하여 세포 생장 양상을 비교 분석하였다.

그 결과, 야생형 대장균 MG1655는 생장 속도가 약 0.0111인데 비하여, rpoS 돌연변이주의 생장속도는 0.0035로서 rpoS 돌연변이 균주는 야생형 균주에 비하여 프로피온산에서의 생장이 약 1/3 정도로 현저히 감소하였다(도 2). 또한 rpoS 돌연변이 균주에서 흡광도를 이용하여 분석한 최종 세포생산량은 600 nm에서 0.07 이하였는데, 이는 RpoS가 세포의 정상적인 생장에 필수적으로 작용함을 의미한다.

< 실시예 2> prpBCDE 전사발현에 미치는 RpoS 의 역할 규명

RpoS 인자에 대한 prpBCDE 유전자 발현조절이 직접적인지 아닌지를 규명하기 위하여 RpoS 단백질과 완전효소(holognzyme)를 제작한 후, 젤 이동변화 분석(EMSA: electrophoretic gel mobility shift assay)을 수행하였다.

isopropyl-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 이용한 RpoS 단백질의 유도 및 효과적인 분리 정제를 위해 trc 프로모터 및 6X histidine(His-Tag)이 결합되어 있는 pProEX-Hta(Invitrogen, Netherland) 벡터를 사용하였다. rpoS 유전자(993 bp)를 클로닝하기 위해 HL PCR PreMix(Bioneer, Korea) 키트와 서열번호 11로 기재되는 rpoS 정방향 프라이머(5'-CGG AAT TCA TGA GTC AGA ATA CGC T-3') 및 서열번호 12로 기재되는 rpoS 역방향 프라이머(5'-CCC AAG CTT GGG TTA CTC GCG GAA-3')(밑줄은 각각 EcoRI 과 HindIII 의 제한효소 위치를 나타냄)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 Perkin-Elmer사의 DNA thermal cycler 기기를 이용하여 수행하였으며, 94℃에서 60초, 54℃에서 60초, 72℃에서 60초를 1회 반응으로 하여 총 18회 반복하여 증폭하였다. 상기 조건으로 증폭된 DNA를 제한효소 EcoR Ⅰ 및 Hind Ⅲ로 절단한 후 동일 제한효소로 절단된 pProEx-Hta 벡터와 라이게이션(ligation)을 수행하였다. 그 결과 제작된 새로운 재조합 발현벡터 pRpoS(도 3)을 CaCl₂ 방법(Molecular cloning, 2ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)으로 대장균 DH5a에 도입하기 위해 100 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)을 포함하는 LB 배지에 도말하여 16시간 배양하였으며 이렇게 도입된 플라스미드의 분리는 alkaline lysis 방법(Molecular cloning, 2ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)을 통해 수행하였다. 상기 플리스미드를 염기서열 분석(Molecular cloning, 2ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)을 통해 rpoS 유전자 및 그의 프로모터 부분을 확인하였다.

상기 rpoS 재조합 발현벡터를 도입한 대장균주를 IPTG 0.1 mM을 함유한 LB 배지에서 배양하고 600 nm에서의 흡광도가 0.5에 이를 때까지 배양하여 RpoS 단백질의 과발현을 유도하였다. 이후 과발현된 RpoS 단백질은 SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 확인하였다. 과발현이 유도된 RpoS 단백질을 수득한 후, lysis buffer[950 mM Tric-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 8 M Urea, fresh 0.1 mM PMSF(Phenylmethylsulphonyl fluoride, protease inhibitor)]에 현탁하였고, 이 현탁액을 초음파분쇄(ultrasonification)하여 세포를 파쇄하였다. 상기 세포현탁액을 원심분리한 후 그 상등액을 영하 20도에서 보관하여 단백질 분리에 사용하였다.

상기 상등액에 Ni-NTA 아가로오스 레진을 혼합한 후 고정 Ni^{2 +}-흡착 크로마토그래피(immobilized Ni^{2 +}-absorption chromatography)의 컬럼에 로딩한 후 결합되지 않은 단백질들을 시간당 18 ㎖의 속도로 제거하여 주었다. 이후, 컬럼을 세척 버퍼(washing buffer: 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0), 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole)로 상기와 동일한 속도로 제거하여 주었다. 레진에 결합에 결합된 단백질은 최종적으로 용출 버퍼(elution buffer: 50 mM NaH₂PO₄(pH 8.0), 300 mM NaCl, 250 mM Imidazole)를 이용하여 분리하였다. 이렇게 용출된 단백질의 양은 단백질 분석 키트(protein assay kit, Sigma)로 정량하였으며 정제된 RpoS 단백질은 SDS-PAGE(8% 아가로오스 젤)를 사용하여 확인하였다(도 4A).

상기의 분리 정제된 RpoS 단백질은 RNA 폴리머레이즈 완전효소(holoenzyme)를 구성하는 인자 중 핵심효소(core enzyme)를 제외한 나머지 시그마 인자(sigmafactor)에 상응하는 단백질로서 상기의 시그마 인자 RpoS 단백질을 핵심효소와 결합시켜 활성있는 완전효소(holoenzyme)를 제작하고자 하였다. 이를 위해 RNA 폴리머라제 핵심효소(Epicentre, USA)와 정제된 RpoS 인자를 0.02 ㎖ 결합 버퍼(binding buffer, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glycerol)와 혼합한 후 상온에서 30분간 방치하여 완전효소를 제작하였다.

상기 제작된 RpoS 완전효소와 DNA 절편과의 결합 여부 및 그 정도를 분석하기 위해 사용되는 젤 이동 변화 분석(EMSA)은 기존의 방법에 따라 수행하였다(Oh et al ., Biophys . Res . Commun. 288:1052-1058, 2001). 7.5 pmole의 이중가닥 올리고머(prp-1: 5'- AAA TTA AAC ATT TAA TTT TAT TAA GGC AAT TGT GGC AC-3':서열번호 13; prp-2: 5'-GTG CCA CAA TTG CCT TAA TAA AAT TAA ATG TTT AAT TT-3':서열번호 14) 및 상기에서 제작된 완전효소를 농도별로 첨가한 0.02 ㎖의 반응액(10 mM Tris-Cl(pH 7.5), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glycerol)에서 완전효소와 DNA 절편과의 결합 정도를 조사하였다. 이 반응액을 상온에서 40분간 방치한 후 모든 시료를 1% 아가로오스 젤 상에서 전기영동하였다. 이 후 DNA-단백질 결합 복합체의 존재 및 젤 상에서의 이동 여부는 젤을 브롬산 에티디움(ethidium bromide)으로 염색함으로써 확인하였다.

그 결과 완전효소의 농도가 증가할수록 사용된 이중가닥 DNA와 농도의존적으로 결합함이 확인되었다(도 4). 상기 결과를 통해 RpoS를 포함한 완전효소가 prpBCDE의 프로모터 부위에 직접적으로 결합함을 알 수 있다.

본 발명의 rpoS 돌연변이를 통한 rpoS의 발현을 억제시키는 경우 prpBCDE 유전자의 발현이 억제되었으며, 또한 프로피온산에 대한 세포 감수성을 증가시키므로, 식품 내에 첨가하는 프로피온산에 대한 내성에 관여하는 미생물 유전자의 불활성화 또는 억제를 통하여 프로피온산 등의 방부제 첨가를 줄이는 데 유용하다.

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Claims (15)

1. 세포 내의 RpoS(RNA polymerase sigma(38) subunit) 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 rpoS 레귤론인 prpBCDE 유전자의 발현을 억제함으로써 프로피온산에 대한 미생물의 감수성을 증가시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서, RpoS 단백질의 발현 억제는 rpoS 뉴클레오티드에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드 또는 siRNA를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서 RpoS 단백질의 활성 억제는 RpoS 단백질의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, RpoS 단백질에 결합하는 소형 화합물, 상기 RpoS 단백질에 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 물질을 혼합하여 구성되는 RpoS 활성 억제제를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 미생물은 대장균(E. coli), 살모넬라균(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 스타필로코코스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 사상균(Filamentous fungi), 효모(yeast), 레지오넬라(Legionella), 로도피레루라 (Rhodopirellula), 아퀴펙스(Aquifex), 크로모박테리움(Chromobacterium), 여시니아(Yersinia), 쉬겔라(Shigella), 비브리오(Vivrio ) 로 이루어진 군 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 프로피온산 및 RpoS 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 미생물의 생장 억제제.
6. 제 5항에 있어서, 상기 활성 억제제는 RpoS 단백질의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, RpoS 단백질에 결합하는 소형 화합물, 상기 RpoS 단백질에 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 물질을 혼합하여 구성되는 것을 특징으로 하는 미생물의 생장 억제제.
7. 1) RpoS 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 표적 물질로 이용하여 시험 대상 물질을 접촉시키는 단계; 및

   2) 시험 대상 물질이 표적 물질의 유전자 발현 또는 단백질 활성을 감소시키는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 프로피온산에 대한 미생물의 감수성을 증가시키는 물질 스크리닝 방법.
8. 삭제
9. 제 7항에 있어서, 상기 시험 대상 물질은 RpoS 단백질의 전사를 억제하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
10. 제 7항에 있어서, 상기 시험 대상 물질은 prpBCDE 유전자의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
11. 제 7항에 있어서,

    1) 재조합 RpoS 단백질과 시험 대상 물질을 반응시키는 단계;

    2) 단계 1)에서 반응시킨 재조합 RpoS 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및

    3) 대조군과 비교하여 재조합 RpoS 단백질의 활성을 감소시키는 시험 대상 물질을 선별하는 단계를 포함하는 프로피온산에 대한 미생물의 감수성을 증가시키는 물질 스크리닝 방법.
12. 제 11항에 있어서, 단계 2)의 활성 측정은 DNA chip 또는 Protein chip을 이용하는 것을 특징으로 하는 프로피온산에 대한 미생물의 감수성을 증가시키는 물질 스크리닝 방법.
13. 제 7항에 있어서,

    1) rpoS 인식부위를 포함하는 프로모터의 유전자 컨스트럭트와 리포터 유전자를 구축하는 단계;

    2) 단계 1)의 유전자 컨스트럭트를 세포에 형질전환하는 단계;

    3) 단계 2)의 세포에 시험 대상 물질을 처리하는 단계;

    4) 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및

    5) 대조군과 비교하여 rpoS 유전자의 발현을 감소시키는 시험 대상 물질을 선별하는 단계를 포함하는 프로피온산에 대한 미생물의 감수성을 증가시키는 물질 스크리닝 방법.
14. 제 7항에 있어서,

    1) 세포에 시험 대상 물질을 처리하는 단계;

    2) rpoS 유전자의 전사 발현을 측정하는 단계; 및

    3) 대조군과 비교하여 rpoS 유전자의 전사 발현을 감소시키는 시험 대상 물질을 선별하는 단계를 포함하는 프로피온산에 대한 미생물의 감수성을 증가시키는 물질 스크리닝 방법.
15. 제 13항 또는 14항에 있어서, 세포는 대장균 또는 살모네라인 것을 특징으로 하는 프로피온산에 대한 미생물의 감수성을 증가시키는 물질 스크리닝 방법.

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