KR100262681B1 - 환경 손상인자의 고감도 검출법 - Google Patents

환경 손상인자의 고감도 검출법

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Abstract

이제는 환경 스트레스의 미세한 변화를 치사량 미만의 수준에서 환경 스트레스에 대한 유전자 반응으로서 검출 및 측정할 수 있다. 본 발명은 환경 스트레스 수준의 변화를 검출하는 방법을 제공한다. 스트레스 변화는 유전자 조작된 미생물의 발광량의 변화로서 나타난다. 본 발명에서, 발광 유전자 복합체는 스트레스 유도성 프로모터의 조절하에 있다.

Description

[발명의 명칭]
환경 손상인자의 고감도 검출법
[발명의 분야]
본 발명은 세포 대사를 손상시키는데 필요한 것 미만의 수준에서 환경 손상인자를 검출하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 환경 손상인자가 리포터 유전자의 발현을 유도하도록, 리포터 유전자 또는 유전자 복합체에 작동가능하게 연결된 스트레스 유도성 프로모터를 포함하는 DNA 구조물을 함유하는 형질전환된 세균 숙주를 제공한다. 바람직한 리포터 유전자는 세균의 생물 발광을 담당하는 것이다.
[배경]
증가하는 대중의 관심 및 가중되는 정부의 규제로 인해 토양 및 지하수중의 오염물질을 검출할 수 있는 환경 감지 시스템의 개발이 촉진되어 왔다. 기체 크로마토그래피법 및 질량 분석법 같은 분석 수단을 포함하는 고감도의 특이적인 검출 시스템이 수년간 알려져 왔지만; 이들 시스템에는 값비싼 장치 및 숙련된 작동자가 필요하다. 또한, 샘플 제조 및 데이타 분석은 때때로 까다롭고 시간도 많이 걸린다. 미합중국의 표준 수질 독성 시험에 사용되는, 물벼룩(Daphnia)같은 생물체를 포함하는 독성 시험은 좀더 간단하지만; 이들 시험은 비특이적이고 특히 신속하지 않다. 다소 더 신속한 것은 감지 요소로서 세균 세포를 포함하는 세포계 독성 시험이다. 이들 시스템에서는 통상적인 자동화 분석 시스템에 세균 세포를 시약으로서 사용한다. 예를 들어, RODTOX 시스템[센트랄 가가꾸(Central Kagaku.), 일본국 도꾜]은 세균의 산소 소비를 측정하는 회분식 시험법이며, 하수 식물에 사용하도록 고안되었다. GBITOXALARM 시스템[게노센샤프트 베를리너 인게니유이르콜렉티브(Genossenschaft Berliner Ingenieuirkollective), 독일 베를린] 같은 다른 세균계 시스템은 특정 화합물의 존재를 측정한다. GBI TOXALARM은 샘플중 01ppm 정도의 시안화칼륨의 존재도 검출해낼 수 있는 것으로 알려져 있다. 이들 검출 시스템은 유용하지만, 까다롭고 복잡한 검출 시스템이기 때문에 곤란한 경우가 있다. 최근에는, 세균의 생체발광 현상이 더욱 간단하고 더욱 민감한 검출 방식의 환경 감지 시스템을 제공하는 것으로 간주되어 왔다.
생체발광 현상은 1885년, 라펠 두보이스(Raphel Dubois)가 발광성 딱정벌레 피로프루스(Pyrophrus) 및 발광성 대합조개 폴라스(Pholas)로부터 수득한 무세포 추출물이 상온에서 혼합될 때 시험관내에서 발광 반응을 나타내는 것을 관찰한 이후 최초로 심각한 과학적 관심사가 되었다. 그 이후 보통의 개똥벌레, 해수 강장동물, 물고기, 육상 및 담수 벌레, 및 세균류, 조류 및 진균류를 비롯한 다수의 상이한 생물체에서 생체발광 시스템이 확인 및 시험되었다.
세균의 생체발광은 5개의 구조 유전자(luxA, luxB, luxC, luxD 및 luxE)의 생성물이 함께 작용하여 광을 발생시키는 현상이다. luxD 생성물은 선구물질로부터 C14 지방산을 생성시킨다. C14 지방산은 ATP 의존성 반응에서, 세균의 생체발광을 세포의 에너지 상태로 연결시키는 luxE 생성물의 작용을 통해 아실-효소 결합체로 활성화된다. 아실-효소(luxE 생성물)는 아실기를 luxC 생성물로 공여하는 전달제로서 작용한다. 이어 아실-LuxC 2성분 복합체는 NADPH가 아실 결합체를 C14 알데이드로 환원시키는 전자쌍 및 양성자 공여체로서 작용하는 반응에서 환원된다. 이 반응으로 인해 세포의 환원력이 세포의 발광으로 연결된다. 루시퍼라제(luciferasd; luxA 및 luxB의 생성물)에 의해 촉매되는 발광 반응은 광을 생성시킨다. 발광에 필요한 에너지는 알데히드에 의해 지방산 전환 및 FMNH2산화로 제공되어 발광과 세포 에너지 상태를 다시 연결시킨다.
최근, 천연의 생체발광 생물체는 독성 시험의 감지 요소로서 사용되어 왔다.MICROTOX 시스템[마이크로빅스 코포레이션(Microbics Corp.),캐나다 칼즈바드]이 그 예이다. MICROTOX 시스템은 포토박테리움 포스포륨(Photobacterium phosporeum)의 천연적인 기준 발광을 측정하고 이를 생물체 주위의 환경의 손상정도와 연관짓는다. 포토박테리움 포스포륨에서의 발광에는 발광 및 에너지 발생의 중추대사와 ATP수준, NADPH 수준 및 FMNH2수준 사이의 3가지 연결이 필요하기 때문에, 이들 대사산물의 이용 및 상호작용을 방해하는 임의의 손상인자는 생체발광(lux) 시스템의 활성을 감소시키게 되어 생물체에 의한 발광을 감소시키게 된다.
생체발광 시스템의 주요 특성은 발광량의 감소가 신속하여 손상인자에 노출된 후 수분내에 발생되는 것이다. 이들 시스템의 다른 중요한 이점은 광 검출이 매우 민감할 수 있으며(단일 광자 수준 미만까지) 휴대용 옥외 장치에 용이하게 적용될 수 있는 것이다. 뿐만 아니라, 광 검출 방법은 검출기를 습윤성 생물 샘플과 접촉시킬 필요가 없다. 이렇게 습윤성 생물 샘플과 접촉시키는 것은 다른 기술(예컨대 이온-선택성 전극)에서의 주된 약점이며, 이로 인한 검출기 오염 및 부식은 상당한 고장시간의 원인이 된다.
최근 재조합 DNA 기술의 발전함에 따라 푸시퍼라제(lux) 유전자 복합체가 이종 유전자 생성물로서 발현될 수 있게 되었다. 일반적으로 lux 구조 유전자 복합체를 숙주 프로모터의 조절하에 둠으로써 이를 달성할 수 있다. 따라서, 예를 들면 cDNA를 코딩하고 있는 개똥벌레 루시퍼라제가 lacZ 프로모터의 조절하에 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되었으며[다쯔미(Tatsumi) 등, Biochem. Biophys Acta., 1131, (2), pp 161-165, (1992)], luxAB 융합 유전자를 강력한 Pxyn 프로모터의 조절하에 둠으로써 이. 콜라이에서 수득할 수 있는 것에 상당하는 수준으로 바실러스(Bacillus)에서 이를 발현시켰다[제이콥스(Jacobs) 등, Mol. Gen. Genet, 230(1-2), pp 251-256, (1991)].
세균을 시험의 발광 요소가 되도록 형질전환시키는 재조합 유전공학을 이용하는, MICROTOX 시스템의 대체 시스템을 개발하였다. 라이쳐트(Rychert)등 [Enuiron. Toxic. Water Qual., 6(4), pp 415-422, (1991)]은 lux 유전자 복합체를 함유하는 플라스미드 pJE202를 갖는 재조합 이. 콜라이가 ,Zn2+, 에티디움 브로마이드, 나트륨 펜타크로피에이트, Cu2+및 2,4-디클로로페옥시아세트산에 민감하다는 것을 보여주었다. 이 시험에서의 반응은 형질전환된 이. 콜라이에 의해 방출되는 기준 광량의 감소로 기록되었다.
MICROTOX 및 유사 시스템이 유용하기는 하지만, 이들 시스템의 감도는 세포를 죽이거나 대사면에서 무능력하는 수준의 손상인자를 검출하는 것으로 제한된다. 이들 시스템에 의해 검출되기 위해서는 손상인자가 세포의 중추대사를 방해하거나 또는 Lux 단백질을 불활성화시키기에 충분한 수준에 도달하여야 한다.
흔히, 세포 대사에 영향을 끼치는데 필요한 것보다 적은 수준에서 손상인자를 검출할 수 있어야 한다. 치사 농도의 오염물질이 유용한 미생물 개체군을 박멸시켜 막대한 비용 및 시설 고장시간을 초래할 수 있는 폐수 처리 설비의 경우가 그렇다. 바람직한 감지 시스템은 유용한 미생물 개체군이 해를 입기 전에 치사량 미만의 수준에서 손상인자의 존래를 검출할 수 있는 것이다. 이러한 초기 경고는 신속하게 개선 작용을 실행하여 자생하는 미생물 개체군을 구하도록 이용될 수 있다.
최근, lux 구조 유전자를 화학물질 반응성 세균의 프로모터에 융합시킨 후 이 키메라를 적절한 숙주에 위치시킴으로써 재조합 세균을 개발하였다. 이들 재조합 세균은 특정 자극에 대해 반응하여 발광하는 감지 생물체이다. 이러한 형태의 유전자 융합의 예는 벌래지(Burlage)등의 문헌[J. Bacteriol, 172(9) pp 4749-4757 (1990)](여기에서는, 나프탈렌 분해 경로에 대한 프로모터를 함유하는 플라스미드 NAH7로부터의 DNA 단편을 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)의 lux 유전자에 융합시켜 슈도모나스(Pseudomonas)균주를 형질전환시키는데 사용함)에 기재되어 있다. 생성된 형질전환체는 나프탈렌의 존재하에서 발광량의 증가를 나타내었다. 생체발광의 유도는 형질전환된 생물체에 의한 나프탈렌 분해와 동시에 발생하는 것으로 증명되었다.
수은(Hg)에 대해 특이적으로 반응하는 다른 시험 시스템은 몰더즈(H. Molders)에 의해 기재되어 있다(EP 456667호). 여기에서는, 생체발광을 담당하는 세균의 루시퍼라제(lux AB) 유전자 복합체에 융합된, Hg 이온에 의해 특이적으로 유도될 수 있는 mer 프로모터를 함유하는 인디케이터 세균 균주가 제공된다(벡터에 의해 매개되는 유전자 전달에 의해). 몰더즈의 시험 시스템은 수은의 존재에 의한 mer 프로모터의 유도 및 시험 결과를 위한 재조합 세균으로부터의 후속 발광량 증가에 기초를 두고 있다.
벌래지 등과 몰더즈의 방법은 발광량 증가 방법에 의해 단일 오염물질을 특이적으로 검출한다는 점에서 기존 기술에 비해 몇가지 이 점을 제공한다. 이들 시스템은 환경 샘플중 특정 화합물의 존재를 검출하는데 유용하지만, 포괄적인 세포 독성의 인디케이터로는 불량하다. 벌래지에 의해 사용된 프로모터는 나프탈렌 분해 경로에서 작용성이고 탄소원으로서 나프탈렌을 사용할 수 있는 숙주에 위치한다. 따라서, 이 검출 시스템은 임의적인 방식의 세포 독성과 관련이 없다. 유사하게, 몰더즈의 mer-프로모터는 이. 콜라이에 내재하지 않기 때문에 이. 콜라이에서의 독성의 천연 인디케이터가 아니다. 불명확한 손상인자의 1차 검출용의 더욱 일반적인 시험 시스템은 하나의 특징 화합물에 의해 활성화되는 것보다는 세포 독성 스트레스에 특이적으로 연결되는 프로모터를 사용한다.
세포 스트레스의 결과로서 활성화된 유전자는 환경 오염물질의 검출에 대한 유리한 대체 방법을 제공한다. 스트레스 유전자는 모든 세포에서 발견되며 정상적인 세포 대사를 변화시키는 임의의 형태의 스트레스의 결과로서 활성화되는 유전자라고 정의된다. 환경 스트레스는 종종 단백질의 중첩을 야기시킨다. 가장 잘 알려진 부류의 스트레스 유전자는 담백질의 재절첩, 재순환 및 재합성에서 역할을 하는 것으로 생각되는 세포 단백질 세트를 코딩하고 있는 열 쇼크 유전자이다. 열 쇼크 현상은 먼저 증가된 온도에 대한 반응으로 설명되었다. 이후의 연구에서는 파아지 감염, 거대파아지 환경, 및 유기분자 및 중금속의 존재를 비롯한 다양한 스트레스에 노출되어도 열 쇼크 반응을 촉발시킬 수 있는 것을 밝혀내었다. 일반적인 형태의 유도제는 일부 단백질이 세포 내에서 절첩되지 않는 것일 수 있다[라로싸 등, Mol. Micriobiol., 5(3), pp 529-534, (1991)]. 따라서, 이 반응을 통합하여 광범위한 환경 손상인자를 보고하였다. 반보겔렌(VanBogelen)등 [J. Bacteriol, 169(1), pp 26-32, (1987)]은 CdCl2, H2O2, 에탄올, 퓨로마이신 및 날리딕스산을 비롯한 다양한 화학약품이 이. 콜라이에서 열 쇼크 유전자를 유도할 수 있음을 증명하였다. 블롬(Blom)등[Appl. Environ. Microbiol., 58(1), pp 331-334, (1992)]은 벤젠, CdCl2, 클로로피리보스, 2,4-디클로로아닐린, 디옥틸프탈레이트, 헥사클로로벤젠, 펜타클로로페놀, 트리클로로에틸렌 및 테트라프로필벤조설포네이트에 이. 콜라이 배양물을 노출시키면 2차원겔 전기영동에 의해 분석한 결과 39개 이하의 상이한 스트레스 단백질이 유도됨을 기재하고 있다.
세포가 정상 상태를 유지하려고 하기 때문에, 촉발 인자로서 작용하는 어떠한 조건에서도 스트레스 반응은 최소 저해 농도 미만으로 활성화된다. 이러한 사실로 인해, 미생물 세포가 죽기 전에 손상인자가 검출되기 때문에 환경 감시 시스템에 스트레스 반응을 이용하는 것이 더욱 유리해진다. 이러한 시스템은 종종 미생물 개체군이 파괴된 후까지도 환경 오염물질이 검출되지 않는 폐수 처리 설비에 특히 유용하다.
지금까지 스트레스 반응의 유도는 환경 시험 분야에서 약간의 성공밖에 거두지 못하면서 이용되었다. 쾰러(Koehler0 등[Arch. Environ. Contam. Toxicol., 22(3), 334-8, (1992)은 중금속 및 살충제의 존재에 대해 반응하는 다양한 종류의 연체동물 및 민달팽이에서 HSP70 단백질의 수준을 검사하는 시험 시스템을 기재하고 있다. 이 시스템은 Pb2+의 존재에 대해 반응하여 HSP70의 수준 증가를 나타내지만, 이 기술은 까다롭고 감도가 낮다. 기재되어 있는 더욱 정교한 기술은 손더즈(Saunders)등(WO 9002947호)에 의한 것이다. 손더즈 등의 기술은 수성 환경중 오염물질에 노출되어 있는 생물체에서 HSP60 및 HSP70의 증가된 수준을 검출하는 것을 포함한다.
스트레스 반응이 다양한 환경 손상인자의 존재를 검출하는데 유용한 것으로 증명되었지만, 이는 여전히 민감하고 용이하게 검출되는 리포터에 관련된 것이었다. 따라서, 미생물 개체군을 죽이는데 필요한것 미만의 수준에서 광범위한 손상인자를 검출할 수 있는 용이한 검출 메카니즘을 이용하는 고감도 생물학적 시험 시스템이 필요하다. 본 발명의 목적은 이러한 요구를 충족시키는 것이다. 본 발명은 광범위한 적용성을 가질 것으로 예상된다. 기대되는 용도는 공기 및 수질 감시, 농업 및 약학 디자인, 제조 및 발효공정 제어, 공정 감시 및 독성 검색을 포함한다. 이들 용도는 화학약품, 음료, 식품 및 향료, 화장품, 농약, 환경, 관리 및 건강관리 산업을 비롯한 다수의 기업체에 유리할 수 있다.
[발명의 개요]
본 발명은, 발광량의 변화에 의해 환경 손상인자의 존재에 대해 반응할 수 있는 적합한 생체발광 검출 생물체를 배양하고; 환경 손상인자를 함유하는 것으로 생각되는 샘플에 상기 검출 생물체를 노출시키며; 검출 생물체에 의해 생성되는 발광량의 변화를 측정하고; 또한 상기 샘플중에 존재하는 환경 손상인자의 수준과 상기 발광량의 변화를 상호 연결하는 단계를 포함하는, 환경 손상인자의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 환경 손상인자의 존재에 대해 반응하여 발광량을 변화시킬 수 있는 형질전환된 생체발광성 세균 숙주세포(이 숙주세포는 상기 손상인자의 존재에 의해 활성화될 수 있는 이종 DNA 구조물을 함유함)를 제공한다.
또한, 본 발명은 lux 유전자 복합체를 코딩하고 있는 제2DNA 단편에 작동가능하게 또한 발현가능하게 연결된, 스트레스 유도성 프로모터를 코딩하고 있는 제DNA 단편을 포함하는 DNA 융합체를 제공한다.
[도면 및 미생물 기탁에 대한 간단한 설명]
제1도는 플라스미드 pGrpELux.3 및 pGrpELux.5의 제작 설명도이다.
제2도는 플라스미드 pRY006의 제작 설명도이다.
제3도는 플라스미드 pRY001 및 pYR002의 제작 설명도이다.
제4도는 에탄올의 존재에 반응하는 TV1060에 의한 발광량의 증가를 도시한 그래프이다.
제5도는 증가하는 농도의 에탄올의 존재에 대해 반응하는 TV1060에 의한 발광량의 증가를 도시한 그래프이다.
제6a도는 다양한 농도의 에탄올의 존재에 대해 반응하는 WM1021에 의한 발광량의 증가를 도시한 그래프이다.
제6b도는 다양한 농도의 에탄올의 존재에 대해 반응하는 WM1026에 의한 발광량의 증가를 도시한 그래프이다.
제7도는 pGrpE.Lux.5로 형질전환된 tolC+및 tolC-검출 세포를 펜타클로로페놀에 대한 상대적인 감도를 도시한 그래프이다.
하기 균주는 부다페스트 조약의 규정에 의해 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC)(미합중국 메릴랜드 20852, 록크빌, 팩클론 드라이브 12301)에 기탁되었다.
TV1060 (ATCC #69142)+WM1202 (ATCC #69313)*
TV1061 (ATCC #69315)*WM1021(ATCC #69141)+
TV1076 (ATCC #69314)*WM1026 (ATCC #69143)*
WM1302 (ATCC #69316)*
(*1993년 5월 13일자로 기탁됨)
(*1992년 12월 3일자로 기탁됨)
[발명의 상세한 설명]
하기 정의를 본원에 사용하며 이들은 특허청구범위를 명확히 하기 위해 언급되어야 한다.
용어 "프로모터" 및 "프로모터 영역"은 통상 구조 유전자의 단백질 코딩 서열의 상부(5'부터)를 일컬으며, RNA 플리머라제및/또는 올바른 부위에서 전사를 출발시키는데 필요한 기타 인자를 인식함으로써 코딩 영역의 발현을 조절한다. 프로모터 서열은 유전자의 발현을 일으키는데 필요하지만 항상 충분하지는 않다.
"단편"은 특정 영역의 DNA 서열의 분획을 구성한다.
"핵산"은 당, 인상염 및 퓨린 또는 피리미딘을 함유하는 단량체(뉴클레오티드)로 이루어진, 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드일 수 있는 분자를 일컫는다. 세균 및 고등 식물에서, "데옥시리보핵산"(DNA)은 유전물질을 일컫는 반면, "리보핵산"(RNA)은 DNA로부터의 정보를 단백질로 번역하는데 관련되어 있다.
"제어" 및 "제어한다"는주로, 그러나 배타적이지는 않게 유전자의 전사 출발점의 상부(5'에서)에 존재하는 DNA 서열 요소에 의해 조절되는 유전자 발현의 조작을 일컫는다. 제어로 인해 자극에 대해 완전히 반응하거나 또는 전혀 반응하지 않을 수 있거나, 또는 유전자 발현의 수준을 변화시킬 수 있다.
용어 "토딩 서열"은 전사를 개시시키는 제어 서열을 제외한, 단백질, 폴리펩티드 또는 그의 이부를 코딩하고 있는 유전자 부분을 일컫는다. 코딩 서열은 통상적으로 세포에서 발견되는 것일 수 있거나 또는 도입된 경우 세포 위치에서 통상적으로 발견되지 않는 것일 수 있으며, 후자의 경우, 이종 유전자라고 명명한다. 코딩 서열은 상이한 공급원, 특 천연 발생 또는 합성 공급원으로부터 유래된 분절의 복합물일 수 있다.
용어 "제작" 또는 "구조물"은 임의의 공급원으로부터 유래된 단일- 또는 이중-스트랜드 DNA 또는 RNA의 선형 또는 환형 플라스미드, 비루스, 독립 복제서열, 파아지 또는 뉴클레오티드 서열을 일컫는다. 이때, 다수의 뉴클레오티드 서열이 연결 또는 재조합되어 적절한 3' 비번역 서열을 따라 선택된 유전자 생성물의 프로모터 단편 및 DNA 서열을 세포 중으로 도입시킬 수 있는 독특한 구조물을 생성시킨다.
용어 "형질전환"은 핵산을 혼입시킨 후 세포에서 새로운 유전자를 획득하는 것을 일컫는다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 DNA 단편 2개를 적절하게 배향시켜 기능 RNA 중으로 전사될 판독 프레임으로 융합시키는 것을 일컫는다.
용어 "발현"은 유전자 생성물의 서열을 코딩하고 있는 유전자로부터 유전자 생성물로 전사 및 번역하는 것을 일컫는다. 발현시, 유전자 생성물의 서열을 코딩하고 있는 DNA 쇄를 먼저 종종 전령 RNA인 상보적인 RNA로 전사시킨 후 이렇게 전사된 전령 RNA를 상기 언급한 유전자 생성물(단백질인 경우)로 번역한다.
용어 "번역 개시 신호"는 단백질 합성의 개시를 지정하는 핵산중 3개 뉴클레오티드(코돈)의 단위를 일컫는다.
본원에 사용되는 용어 "플라스미드"는 세포의 중추 대사의 일부가 아닌 유전자를 종종 운반하며 통상 환상 이중-스트랜드 DNA 분자의 형태인 염색체의 요소를 일컫는다.
용어 "제한 엔도뉴클레아제"는 이중-스트랜드 DNA 내에서 특정 뉴클레오티드 서열을 결합 및 절단하는 효소를 일컫는다.
용어 "생체발광"은 임의의 살아있는 생물체로부터 광을 방출시키는 현상을 일컫는다.
용어 "lux"는 luxA, luxB, luxC, luxD 및 luxE를 포함하고 세균의 생체발광 현상을 담당하는 lux 구조 유전자를 일컫는다. lux 유전자 복합체는 함께 작용하는 독립적인 lux 유전자 모두 또는 luxA와 luxB가 복합체의 일부분이기만 하다면 lux구조 유전자의 임의의 세트를 포함한다.
용어 "스트레스" 또는 "환경 스트레스"는 환경 오염물질에 노출된 결과로서 세포에 형성된 상태를 일컫는다.
용어 "손상인자" 또는 "환경 손상인자"는 세균 세포 또는 세포의 개체군에서 정상적인 세포 대사를 변화시키는 임의의 성분 또는 환경 변화를 일컫는다. 환경 손상인자는 화학약품, 환경 오염물질, 중금속, 온도변화, pH 변화 및, 산화에 의한 손상, DNA 손상, 혐기성, 질산염 이용효율의 변화 또는 질병발생을 야기시키는 약제를 포함할 수 있지만 이들로 한정되지는 않는다.
용어 "스트레스 반응"은 검출가능한 수준의 스트레스 단백질을 유도시키거나 또는 다른 손상인자 또는 증가된 양의 환경 손상인자에 대한 노출이 더욱 허용될 수 있는 상태이도록 하는 세포 반응을 일컫는다.
용어 "스트레스 단백질"은 환경 스트레스에 의한 결과로서 또는 환경 손상인자의 존재에 의해 유도되는 임의의 단백질을 일컫는다. 전형적인 스트레스 단백질은 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 유전자 groEL, groES, dnaK, dnaJ, grpE, lon, lysU, clpB, clpP, uspA, katG, uvrA, frdA, sodB, soi-28, narG, recA, xthA, his, lac, phoA, glnA 및 fabA에 의해 코딩되어 있는 것을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
용어 "스트레스 유전자"는 환경 스트레스의 결과로서 또는 환경 손상인자의 존재에 의해 그 전사자 유도되는 임의의 유전자를 일컫는다. 전형적인 이.콜라이 스트레스 유전자는 groEL, groES, dnaK, dnaJ, grpE, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP, uspA, katG, uvrA, frdA, sodB, soi-28, narG, recA, xthA, his, lac, phoA, glnA, micF 및 fabA를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
용어 "열 쇼크 유전자"는 시그마-32 단백질(rpoH)을 코딩하고 있는 구조 유전자에 의해 그 합성이 긍정적으로 조절되는 임의의 유전자를 일컫는다.
용어 "스트레스 유도성 프로모터"는 스트레스 유전자를 활성화시키고 스트레스 유전자 생성물의 생성물의 발현을 증가시킬 수 있는 임의의 프로모터를 일컫는다.
용어 "검출 생물체"는 구조 유전자로 융합된 스트레스 유도성 프로모터를 이루어진 유전자 융합체를 함유하며 환경 손상인자에 대해 반응하여 lux 유전자 생성물을 발현시킬 수 있는 생물체를 일컫는다.
전형적인 검출 생물체는 세균을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
용어 "대수증식기" 또는 "대수증식기 생육"은 검출 세포수를 지수적으로 증식시킬 수 있는 조건하에서 생육되는 검출 생물체의 세포 배양물을 일컫는다.
용어 "상대 광 단위"는 약자로 "RLU"이며, 광도계에 독특한 내부 표준체에 대해 보정한, 광도계를 측정된 발광량의 척도를 일컫는다.
명칭 "ATCC"는 메릴랜드 록크빌에 소재하는 아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션(American Tissue Culture Collection)을 일컫는다. "ATCC번호"는 ATCC에 기탁되는 배양물에 대한 수납번호이다.
본 발명의 검출 생물체에 의해 검출될 수 있는 환경 손상인자는 공단, 폐수 및 농업 폐수에서 흔히 발견되는 다양한 유기 및 무기 손상인자를 포함한다. 이러한 화합물은 다중방향족 탄화수소(PAH), 할로겐화된 방향족 화합물, 및 납, 카드뮴, 구리, 아연 및 코발트 같은 중금속을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 본 발명의 방법에 의해 검출되는 것으로 증명된 화합물은 아트라진, 벤젠, 황산구리, 2,4-디클로로페녹시아세트산, 에탄올, 메탄올, 2-니트로페놀, 4-니트로페놀, 펜타클로로페놀, 페놀, 톨루엔, 디메틸설폭사이드, 질산납, 염화카드뮴, 염화나트륨, 아세트산염, 프로피온산염, 과산화수소, 퓨로마이신, 염화수은, 2,4-디클로로아날리, 프로판올, 부탄올, 이소프로판올, 메틸렌 클로라이드, 트리톤X100, 아크릴아미드, 메틸 비올로겐, 미토마이신 C, 메나디온, 에티디움 브로마이드, 세린 히드록사메이트 및 크실렌을 포함한다. 검출되는 다른 환경 스트레스는 낮은 수준의 인산염, 불량한 질소원, 불량한 탄소원 및 자외선 조사였다.
본 발명은 스트레스 유도성 프로모터와 구조 유전자 사이의 발현가능한 유전자 융합체를 함유하여 lux 유전자를 발현시키는 검출 생물체를 포함하는, 치사량 미만의 수준에서 환경 손상인자를 검출하는 방법을 제공한다.
검출 생물체는 다양한 원핵 및 진핵 생물체를 포함할 수 있으며, 세균 세포가 바람직하다.
본 발명은 환경 손상인자의 존재에 대해 민감한 스트레스 유도성 프로모터를 제공한다. 원핵 및 진핵 세포로부터의 스트레스 유도성 프로모터를 사용할 수 있으나, 세균으로부터의 프로모터가 바람직하고, 이. 콜라이로부터의 프로모터가 가장 바람직하다. 적합한 스트레스 유도성 프로모터는 "반응 유전자(responding genes)"라는 제하하의 유전자 목록으로부터 선택될 수 있지만, 이들로 한정되지는 않으며, 하기 표I에 기재되어 있다.
[표 1]
*그 발현이 상응하는 자극에 의해 증가되고 상응하는 제어 유전자(들)에 의해 조절되는 유전자.
a나이드하트(Neidhardt) 및 반 보겔렌(van Bogelen), E. Coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (나이드하르트 등 Eds., pp. 1334-1345, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)).
b워커(Walker), E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (나이드하르트 등 Eds., pp. 1346-1357, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)).
c크리스트맨(Christman)등, Cell 41: 753-762 (1985); 스토즈(Storz)등, Science 248: 189-194 (1990); 뎀플(Demple), Ann. Rev. Genet 25: 315-337(1991).
d뎀플, Ann. Rev. Genet. 25:31 337(1991).
e마그누손 (Magnuson)등, Microbiol. Rev. 57:522-542 (1993).
f나이스트륨(Nystrom) 및 나이드하르트, J. Bacteriol, 175:2949-2956(1993); 나이스트륨 및 나이드하르트 (Mol. Microbiol. 6: 3187-3198(1992).
g콜터(Kolter) 등, Ann. Rev. Microbiol. 47: 855-874(1993).
h카쉘(Cashel) 및 루드(Rudd), E. Coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (나이드하르트 등, Eds., pp. 1410-1438, American Sociery of Microbiology, Washington, DC(1987); 웡클러(Winkler), E. Coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (나이드하르트 등 Eds., pp. 395-411 American Society of Microbiology, Washington, DC (1987).
i나이드하르트, 잉그라함(Ingraham) 및 샤엑터(Schaecter). Physiology of the Bacterial Cell: A Molecular Approach, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1990), pp 351-388; 마가사닉(Magasanik) 및 나이드하르트, E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecualr Biology (나이드하르트 등 Eds., pp. 1318-1325, American Societh of Microbiology, Washington, DC(1987)
j 워너(Wanner), E. coli and Salmanella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (나이드하르트 등 Eds., pp. 1326-1333, American Society of Microbiology, Washington. DC (1987)).
k리쩌(Rietzer) 및 마가사닉, E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (나이드하르트 등 Eds., pp. 1302-1320, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)); 나이드하르트, 잉그라함 및 샤엑터. Physiology of the Bacterial Cell: A Molecular Approach, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1990), pp 351-388.
표 I은 특정 제어 유전자(들) 및 조절 회로와 반응 유전자(들)의 관계, 및 특정 자극에 의해 촉발되는 수반되는 세포 스트레스 반응을 나타낸다.
상기 표I에 나열된 스트레스 유전자의 대부분은 긍정적으로 제어되는 것으로 알려져 있으나, DNA 손상의 결과 나타나는 SOS 반응은 부정적으로 제어되는 회로를 나타낸다. 긍정적인 또는 부정적인 조절 메카니즘의 정의 에 대해서는, 벡퀴쓰(Beckwith)의 문헌[E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (나이드하르트 등 Eds., pp. 1439-1443, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)]을 참조하시오.
DNA 손상에 대한 SOS 반응은 이. 콜라이에서 잘 알려져 있다. lexA 유전자의 생성물(LexA 억제물질)은 17개 이상의 염색체 유전자의 발현을 조절하는 작동요소에 결합한다(워커, E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (나이드하르트 등 Eds., pp. 1346-1357, American Society of Microbiolgy, Washihgton. DC (1987)). DNA 손상되거나 DNA 복제가 방해되면, 알려지지 않는 SOS-유도 신호가 생성된다. 이 신호는 recA 유전자 생성물과 상호작용하여 이를 제한된 수의 억제물질 분자의 단백질 분해속도를 증가시키는 형태로 전환시킨다[리틀(Little), J. Bacteriol, 175:4943-4950]. 이들 억제물질 분자는 염색체의 lexA 유전자의 생성물이고, 억제물질은 프로파아지 보유 상태인 자외선-유도성 파아지 게놈에 의해 코딩되고 이로부터 발현된다. LexA 억제물질의 RecA 단백질-매개된 단백질분해에 의해 SOS 프로모터가 억제로부터 방출된다. SOS 반응성 프로모터는 recA 및 uvrA이다. 다중복사 플라스미드 상에서의 recA 프로모터-lux 융합에 의해 생체발광이 일어났으며, DNA 손상에 대한 반응으로 형질전환된 숙주세포에서 생체발광량이 증가하였음을 확인하였다. 이 결과의 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않지만, (1) 일부 부정적으로 제어된 회로가 다중복사 상태의 반응 유전자의 프로모터와 작동하며, (2) 부정적으로 조절된 프로모터를 단일 복사 상태에 두기 위한 수단 몇가지가 존재하기 때문에, 본 발명이 긍정적으로 조절된 구상 조절회로의 연구에만 한정되는 것이 아님은 명백하다[예를 들어, 오덴(Oden) 등, Gene 96:29-36 (1990); 사이몬즈(Symons)등, Gene 53:85-96(1987); 와이난즈( Winans)등, J Bacteriol, 161:1219-1221(1985); 압스(Arps) 및 윙클러, J. Bacteriol, 169:1061-1070(1987); 제이신(Jasin) 및 쉬멜(Schimmel), J. Bacteriol, 159:783-786 (1984)].
본 발명은 또한 Lux 단백질을 발현시키기 위하여 세균 숙주 세포를 형질전화시킬 수 있는 스트레스 유도성 프로모터-lux 유전자 융합체를 함유하는 형질전환 백터를 제공한다. 다양한 형질전화 백터를 사용할 수 있지만, 이 콜라이를 형질전환시킬 수 있는 것이 바람직하다. pGrpELux.3, pGrpELux.5, pRYool, pRY002 및 pRY006은 그 제작법이 하기 기재내용에서 상세하게 설명되는 적합한 형질전환 백터의 5가지 구체적인 예이다. 이들 백터는 스트레스 프로모터-lux 리포터 융합체를 숙주세포 중으로 도입하기 위한 목적으로 제조되는 전체 백터의 샘플만을 나타낸다. 그러나, 분자생물학 분야의 숙련자는 이들 제작법에 사용되는 방법 및 물질이 다른 모든 기재된 백터를 대표하는 것임을 용이하게 알게 될 것이다. 기타 바람직한 벡터는 실시예 10의 표 V에 나열되어 있다.
pGrpELux.3, pGrpELux.5는 grpE 프로모터를 함유하는 백터인 반면, pRYool, pRY002 및 pRY006은 dnaK 프로모터를 함유한다. pGrpELux.3, pGrpELux.5 및 pRY006은 모두 직접 클로닝 방법에 의해 제조되었지만, pRYool, pRY002의 제작방법의 일부로서 PCR 방법을 사용하였다. 이들과 같은 형질전환 백터는 통상적인 것이며, 당해 분야에 널리 공지되어 있는 수단에 의해 적합한 백터를 제작할 수 있다. lux 유전자의 바람직한 공급원은 프로모터가 없는 lux 유전자 복합체를 함유하는 선-존재 플라스미드이다. 유사하게, 형질전환 백터를 제작하기 위한 스트레스 유도성 프로모터 DNA 의 바람직한 공급원도 또한 산-존재 플라스미드이며, 이 경우, 스트레스 유도성 프로모터 DNA는 제한효소 분해에 의한 단리 적합한 편리한 제한 부위에 의해 또는 PCR 반응의 생성물에 의해 클랭크되어 있다.
이. 콜라이 스트레스 유전자 grpE 및 lux 유전자 복합체로부터 pGrpELux.3, pGrpELux.5를 제작한다. pGrpE4 는 pUC18(Pharmacia, Cat. No. 27-4949-01)로부터 유래된 이. 콜라이 벡터이다. pGrpE4 는 EcoRI 부위에 의해 5' 말단에서 또한 BbuI 부위에 의해 3'말단에서 결합된 프로모터를 포함하는 grpE유전자를 함유한다. 또한, grpE 프로모터는 PvuII 부위 및 EcoRI 부위의 바로 아래에 위치하는 HaeIII 부위에 의해 3'말단에서 결합된다(제1도). EcoRI 및 BbuI 제한 효소로 분해시켠 grpE에 상응하는 1.1kb 단편이 생성된다. PvuII 로 더욱 분해시면 2개의 단편이 생성되는데, 두 단편중 하나는 grpE 프로모터를 함유한다. 포스포릴화된 EcoRI 링커로 연결시킴으로써 grpE 프로모터 단편상의 3' PvuII 부위를 EcoRI 부위로 전환시킨다. HaeIII에 의해 더욱 분해시키면 5' HaeIII 부위 및 3' PvuII부위에 의해 편리하게 결합된 grpE 프로모터 단편을 생성시킨다(제1도).
lux 유전자 복합체를 함유하는 pUCD615 플라스미드는 로고스키(Rogowsky)등에 의해 완전히 기재되어 있다[J. Bacteriol, 169(11) pp 5101-512, (1987)]. 플라스미드 pUCD615는 카나마이신 및 암피실린 내성을 위한 유전자를 함유하고 프로모터가 없는 lux 유전자 오페론을 함유하는 17.6kb 플라스미드이다(제1도). pUCD615는 먼저 제한효소 EcoRI 및 SmaI로 분해시켜 플라스미드를 개방시킨 후 pgrpE IV 의 HaeIII 분해로부터의 DNA 단편과 연결시킨다.
전형적으로는, 먼저 적합한 숙주를 형질전환시키고 생체발광에 대해 검색함으로써 연결반응의 생성물을 검색한다. 다양한 숙주를 이용할 수 있으며, 이때 높은 형질전환 빈도를 갖는 숙주가 바람직하다. XL1Blue(Stratagene, LaJolla, CA) 및 DH5-a(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)가 이러한 두가지 숙주이다. 생체발광 검색의 바람직한 방법은 형질전환체의 그리딩된 배양물을 적합한 X-선 필름에 노출시킨 후 형상대로 현상된 필름을 육안으로 분석하는 것을 포함한다. 형질전환된 숙주 및 제한 분해물로부터 플라스미드를 재단리시킨후 겔 전기영동을 실행하여 올바른 플라스미드의 존재를 확인한다. 두가지 상이한 형질전환된 콜로니로부터 단리된 플라스미드 pGrpELux.3 및 pGrpELux.5는 제한 효소 분석을 기초로 해서는 구별할 수 없다. 몇몇 실험적인 조건하에서, pGrpELux.5로 형질전환된 세포는 pGrpELux.3 으로 형질전환된 세포보다 더 높은 기준 생체발광을 나타내며, 따라서 다수의 환경 손상인자를 검출하는데에는 pGrpELux.5가 바람직하다.
본 발명은 또한 환경 손상인자의 존재하에 발광량을 증가시킬 수 있는 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 다수의 적합한 세포가 이용가능하며, 이. 콜라이가 바람직하고, 이. 콜라이 균주 RFM443이 가장 바람직하다. RFM443은 바흐만(B. Bachmann)에 의해 문헌[E. coli and Salmonella typhimurium; Celular and Molecular Biology (나이드하이트 등 Eds., pp 1190-1220, American Sociey of Microbiology, Washington, D.C. (1987)]에 상세하게 기재된 W3102로부터 유래된다. pGrpELux.3 에 의해 RFM443을 형질전환시키면 부다페스트 조약의 규정에 의해 ATCC에 기탁된 새로운 균주 TV1060이 생성된다. pGrpELux.5에 의해 RFM443을 형질전환시키면 새로운 균주 TV1061이 생성된다. 균주 TB 1061로부터의 생체발광의 기준은 균주 TB1060을부터의 기준보다 더 크다. 이. 콜라이 TV1060의 ATCC 번호는 69142이고, TV1061의 ATCC 번호는 69315이다.
dnaK 프로모터를 함유하는 플라스미드 pRY006을 제작하는 방법은 pGrpELux.3과 유사한 방법을 따른다. 제한효소 EcoRI 및 BamHI로 분해시킴으로써 람다 파지 9E4로부터 danK 프로모터를 코딩하는 DNA를 수득하였다. 9E4는 코하라(Kohara)등에 의해 문헌[Cell 50, 495-1987]에 상세하게 기재되어 있으며, 이 문헌은 본원에 참고로 인용되어 있다. 제한효소 분해로 인해, BamHI 부위에 의해 5' 말단에 또한 EcoRI 부위에 의해 3' 말단에 결합된 dnaK 프로모터 영역을 포함하는 3.7kb DNA 단편이 생성되었다. pGrpELux.3의 제작에서와 같이, lux 유전자 복합체의 공급원은 pUCD615이다. 먼저 pUCD615를 BamHI 및 EcoRI 제한효소로 분해시킨 후 dnak 프로모터 단편과 연결시켜 플라스미드 pRY006을 제조하였다(제2도).
pRY001 및 pRY002의 제작은 9E4로부터의 dnaK 프로모터를 코딩하고 있는 DNA를 증폭시키기 위하여 PCR 방법을 사용한 것을 제외하고는 pRY006의 제작과 유사하다. 간단하게, 본원에 참고로 인용되어 있는 문헌[PNAS 82, 2679-2683, 1985]에서 카우잉(Cowing)등이 기재한 바와 같이 dnaK 프로모터 서열을 사용하여 9E4로부터의 dnaK 프로모터를 PCR 증폭시켰다.
제조자(Geneamp PCR Reagent Kit, Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)에 의해 기재되어 있는 바와 같이(그 내용은 본원에 참고로 인용되오 있음)증폭시켰다. dnaK 프로모터 영역에 상응하는 증폭된 생성물은 증폭 프라이머의 제작에 의해 결정된 편리한 BamHI 및 EcoRI로 미리 분해시킨 pUCD615에 dnaK 프로모터 영역을 연결시켰다.
연결시킨 DNA를 사용하여 이. 콜라이 균주 DH5를 형질전환시켰으며, 생성된 형질전환체를 X-선 필름에 노출시킴으로써, 제한 분해물에 의해, 이어 아가로스 겔 상에서 분석함으로써 생체발광 면에서 검색하였다. 높은 형질전환 빈도 때문에 균주 DH5-를 이 초기 검색을 위해 선택하였다. 2개의 독립적인 콜로니를 선택하였다. 이들 형질 전환체 pRY001 및 pRY002로부터 단리된 두가지 플라스미드는 독립적인 콜로니로부터 단리하였지만 제한효소 분석을 기초로 해서는 구별할 수 없으며, 본 발명의 목적 면에서는 동일한 것으로 생각된다. 몇몇 실험 조건하에서, pRY002로 형질전환된 세포는 pRY001로 형질전환된 세포보다 환경 손상인자에 대해 반응하여 더 높은 생체발광을 나타내었으며, 따라서 pRY002가 검출에 더 바람직하다. pRY001, pRY002 및 pRY006을 사용하여 RFM443을 형질전환시킴으로써 각각 이. 콜라이 균주 WM1021, WM1202 및 WM1026을 생성시켰다. 이. 콜라이 WM1021, WM1202 및 WM 1026은 부다페스트 조약의 규정에 의해 ATCC에 기탁되었다. 이. 콜라이 WM1021의 ATCC 번호는 69141이다. 이. 콜라이 WM1202의 ATCC 번호는 69313이다. 이. 콜라이 WM1026 의 ATCC 번호는 69143이다. 상기 언급한 바와 같이, lux 리포터로 융합된 다른 스트레스 유전자의 프로모터의 제작법은, 프로모터의 서열에 의해 해석한 PCR 프라이머 및 주형 DNA의 공급원이 상이한 것을 제외하고는 pRY001 및 pRY002의 제작법과 동일하였다. 프로모터 모두의 서열은 출판되었으며, 젠뱅크(Genbank)의 핵산 서열 데이타베이스를 통해 용이하게 입수할 수 있다.
소수성 화합물이 세포 외막에 의해 그램 음성 세균(예컨대 이. 콜라이)내에 효율적으로 들어가지 못하는 것은 널리 알려진 사실이다. 최근, 콜리신에 대해 내성(tolC-)을 갖도록 변이된 이. 콜라이 균주 몇개가 다양한 유기 분자에 대한 숙주세포 외막의 투과성을 증가시키는 예기치못한 부가적인 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다[쉬나이트맨(Schnaitman)등, J. Bacteriol, 172(9), pp 5511-5513(1990)]. 임의적으로는, 적합한 검출 생물체로서 변이를 갖는 형질전환된 세균 숙주를 제공하는 것도 본 발명의 영역에 속한다.
독성 유기물질에 대해 향상된 세포 외막 투과성을 갖는 고감도 검출 생물체를 생성시키기 위하여, tolC-변이를 이. 콜라이 균주 RFM443 내로 도입하였다.
이. 콜라이 형질도입체 DE112는 tolC 위치에서 변이된 것을 제외하고는 균주 RFM443과 동종이다. 공여체로서 균주 CS1562(tolC: :miniTn10][쉬나이트맨 등, J. Bacteriol, 172(9), pp 5511-5513, (1990)] 상에서 생육한 용균물을, 또한 수용체로서 균조 RFM443을 사용하여 파지 P1 매개된 일반화된 형질도입에 의해 이를 제작하였다. 생성된 테트라사이클린 내성 형질도입체를 소수성 화합물 크리스탈 바이올렛에 대한 과민감성 면에서 검색하였다.
상기 기재되어 있는 표준 형질전환 방법에 따라 pGrpELux.5 또는 pRY002로 DE112를 형질전환시켜 tolC-변이를 함유하는 검출 생물체 TV1076(grpE lux 융합체) 및 WM1302(dnaK lux 융합체)를 생성시킨다. TV1076 및 WM1302는 부다페스트 조약의 규정에 따라 ATCC에 기탁되었으며, 각각 ATCC 번호 69314 및 ATCC 번호 69316으로 명명된다.
스트레스 유도성 프로모터-lux 플라스미드는 독립적인 복제플라스미드로서 본 발명의 형질전환된 숙주에 존재하지만; 기술자는 스트레스 유도성 프로모터-lux 플라스미드가 형질전환된 숙주의 게놈 중으로 통합된 형질전환된 숙주도 제공할 수 있음을 알게 될 것이다. 이는 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 수단에 의해 달성될 수 있다. 스트레스 유도성 프로모터는 유전자 생성물의 발현을 일으킬 수 있으며, 이느 다시 lux 유전자 복합체의 발현을 활성화시킨다. 이 경우, 프로모터 및 lux 유전자 복합체는 상이한 유전요소 상에서 발생하게 된다.
예로서, 다수의 억제매카니즘중 임의의 것이 일어날 수 있다 [하트맨(Hartman) 및 로쓰(Roth), Advances in Genetics, 17:1-105(1973)]. 한가지 경우에서는, 염색체-통합된 lux 유전자 복합체가 luxC, luxD, luxA, luxB 또는 luxE에서 넌센스 변이를 함유하며 구성 프로모터에 의해 작동된다. 스트레스 유도성 프로모터가 넌센스 억제유전자의 발현을 일으키도록 하는 방식으로 융합된다. 스트레스의 부재시에는, 생물체가 5가지 필수적인 Lux 단백질을 합성할 수 없기 때문에 발광 현상이 관찰되지 않는다. 생물체가 스트레스를 받게 되면, 억제유전자가 전사된다. 억제유전자 생성물이 발현하면 5가지 필수적인 Lux 단백질이 발현되고 따라서 생물체가 광을 발생시키게 된다.
본 발명의 방법은 손상인자의 존재에 대해 반응하여 생체발광의 변화를 나타낼 수 있는 검출 생물체를 사용함으로써 환경 손상인자의 존재 면에서 샘플을 감시하도록 고안된다. 형질전환된 균주 TV1060, TV1061, TV1076, WM1021, WN1202, WM1302 및 WM1026은 모두 검출 생물체로서 사용하기에 적합하고 바람직하다. 바람직한 백터에서와 마찬가지로, 이들 검출 생물체는 환경 손상인자를 검출하기 위한 목적으로 생성된 전체 검출 생물체의 샘플만을 나타낸다. 그러나, 분자 생물학 분야의 숙련자는 이들의 제작에 사용된 방법 및 물질이 기재되어 있는 다른 모든 백터를 대표한다는 것을 용이하게 알게 될 것이다. 다른 바람직한 형질전환된 검출 생물체가 실시예 10의 표 V에 나열되어 있다. 최적 생육 조건에서, 발광의 기준 수준이 검출 생물체에 의해 생성된다. 활발하게 생육된 배양물에 환경 손상인자를 도입하면 스트레스 유도성 프로모터를 유도시키며, 이는 다시 lux 복합체를 활성화시켜 검출 생물체로부터 방출되는 광량을 증가시키게 된다. 방출되는 광량을 손상인자의 수준과 상호연결한다. 본 발명의 목적을 위해서는, 검출 생물체가 손상인자를 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 노출되기 직전의 대수증식기에서 또한 약 10클렛(Klett) 단위 내지 50클렛 단위(약 30클렛 단위가 가장 바람직함)의 세포 밀도에서 활성 생육시키는 경우가 가장 바람직하다. 육안 분석, 사진 필름으로의 노출, 섬광 계수 또는 광증식기 관을 포함하는 임의의 장치[다이나테크 코포레이션(DynaTech Corporation)에서 제조된 것과 유사한 광도계가 가장 바람직함]를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는, 광자를 검출할 수 있는 다양한 방법에 의해 광 방출을 감시할 수 있다.
한가지 실시태양에서는, 다양한 농도의 에탄올을 사용하여 검출 생물체에 스트레스를 가하였다. 제4도에 도시된 바와 같이, TV1060 배양물(grpE 프로모터 lux 융합체를 함유함)중 4% 에탄올의 최종 농도는 스트레스를 받은지 1000초 후에 발광량을 급격하게 증가시켰다. 유사하게 제5도에서는, 증가하는 농도의 에탄올이 스트레스 받은 배양물로부터 발광량을 상응하게 증가시켰다. 또한, 유기 오염물질, 아트라진, 펜타클로로페놀(PCP), 페놀, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 벤젠, 메탄올, 2-니트로페놀, 4-니트로페놀, 아트라진, 톨루엔, 디메틸설폭사이드, 아세트산염, 프로피온산염, 퓨로마이신, 2,4-디클로로아날린, 프로판올, 부탄올, 이소프로판올, 메틸렌 클로라이드, 트리톤 X100, 아크릴아미드, 메틸, 비올로겐, 세린 하이드록시메이트, 메나디온 에티디움 브로마이드, 미토마이신 C 및 크실렌, 및 중금속 구리의 염, 황산염, 질산납, 염화카드뮴, 및 구리염화수은을 본 방법에 의해 검출하였다. 또한 높은 삼투압 강도, 자외선(U. V.)조사 및 산화제인 과산화수소 및 제한된 인산염, 불량한 질소원 및 불량한 탄소원 같은 생육 조건도 검출하였다. 화학약품을 적절한 용매에 용해시키고 용해도 특성에 따라 시험 세포 배양물에 첨가하거나 또는 직접 생육배지에 첨가하였다. 벤젠, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 메틸렌 클로라이드, 디메틸 설폭사이드, 트리톤 X-100, 페놀, 톨루엔 및 크실렌은 LB 배지에 직접 첨가한 반면, 2-니트로페놀, 4-니트로페놀 및 아트라진은 LB 배지 중으로 희석시키기전에 먼저 메탄올에 용해시켰다. 황산구리, 질산납, 염화카드뮴, 염화수은, 염화나트륨, 아세트산나트륨, 프로피온산나트륨, 과산화수소, 퓨로마이신, 메틸 비올로겐, 아크릴아미드, 메나디온, 에티디움 브로마이드, 세린 히드록사메이트, 및 미토마이신 C는 LB 배지 중으로 희석시키기 전에 먼저 물에 용해시켰다. 펜타클로로페놀(PCP)2,4-디클로로페녹시 아세트산, 및 2,4-디클로로아날린은 먼저 에탄올에 용해시키고 마지막으로 시험하기 위해 LB 배지 중으로 희석시켰다. 모든 경우에서, 에탄올 또는 메탄올의 최종 농도 또는 물을 사용한 배지 희석액은 상당한 반응을 유도시키지 않을 정도였다.
제7도, 밑 표 II 및 III에 나타낸 데이타는 본 검출 시스템의 두가지 요지를 나타낸다. 첫번째로, 본 방법에 의해 유기 및 무기 오염 물질이 저농도에서도 검출될 수 있으며, 두번째로, tolC-변이를 함유하는 숙주 검출 생물체를 이용함으로써 시스템의 감도를 향상시킬 수 있는 것이다.
제7도는 tolC-변이를 갖거나 또는 갖지 않은 GrpE.Lux.5 융합체로 형질전환된 검출 생물체의, 펜타클로로페놀의 존재에 대한 상대적인 감도를 비교한 것이다. 데이타에 의해 알 수 있는 바와 같이, tolC-변이주는 tolC+모균주보다 PCP 존재에 대해 상당히 더 높은 감도를 나타낸다. 표 III(실시예 9)은 tolC-변이를 갖거나 또는 갖지 않는 pYR002 융합체로 형질전환된 검출 생물체의, PCP, 2,4-D, 페놀, 아트라진, 에탄올, 메탄올, 2-니트로페롤 및 황산구리의 존재에 대한 상대적인 감도를 비교한 데이타를 기재하고 있다. 유사하게도, PCP 및 2,4-D는 tolC-변이 숙주에 의해 주로 검출되는 것이 확실하다. tolC-숙주는 또한 PCP 및 2,4-D에 대해서보다는 적은 한도이긴 하지만 페놀에 대해서도 더욱 민감한 것으로 나타난다. tolC-변이는 황상구리 같은 비유기성 오염물질에 대한 검출 생물체의 감도에 대해서는 거의 효과를 갖지 않는 것으로 밝혀졌는데, 이는tolC-변이가 소수성 화합물에 대해서만 숙주 세포 외막 투과성을 증가시키는 것으로 알려져 있는 사실에 비추어 예측되는 바와 같다.
임의적으로는, 본 발명의 방법을 이용하여 검출 생물체에 의해 생성된 기준 발광량의 감소를 측정함으로써 손상인자의 치사량을 검출할 수 있다. 치사량의 손상인자는 검출 생물체의 중추 대사 또는 lux 단백질 기능을 방해하는데, 이는 배양물로부터의 발광량의 감소에 의해 표시된다.
제6a도 및 제6b도는 다양한 농도의 에탄올의 스트레스에 대한 형질전환체 WM1021 및 WM1026(dnaK 프로모터 lux 융합체를 함유함)의 감도를 도시하고 있다. 1% 내지 4%의 치사량 미만의 에탄올 농도에서는 발광량이 TV1060 배양물과 유사한 방식으로 증가하였다. 대조적으로, 8% 내지 16%의 에탄올 치사농도는 검출 배양물로부터의 발광량을 감소시켰다. 마찬가지로, 보다 높은 농도의 PCP는 균주 TV1076에서의 발광량을 감소시킨다(제7도). 따라서, 본 발명의 방법은 이중방식으로 작용할 수 있음을 알 수 있다. 한가지 방식에서는, 스트레스 유도성 프로모터의 유도 및 검출 생물체로부터의 후속 발광량 증가라는 메카니즘을 통해 치사량 미만의 손상인자를 검출할 수 있다. 다른 한가지 방식에서는, 생체발광이 에너지 및 환원력 의존성 현상이고 중추 대사의 방해로 인해 기준 발광량이 감소될 수 있기 때문에 중추 세포 대사를 방해할 수 있는 손상인자의 수준도 검출할 수 있다. 또한, 스트레스 프로모터-lux 융합체로부터의 발광 유도는 발광량의 감소에 필요한 농도보다 더 낮은 오염물질의 농도에서 일어남이 명백하다.
하기 비제한적인 실시에는 본 발명을 에시하는 의미이고, 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하지 않는다.
[물질 및 방법]
제한 효소 분해, 포스포릴화, 연결 및 형질전환은 샘브록(Sambrook, J.) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있는 바와 같이 수행하였다. 퀴아겐(Qiagen)컬럼에 사용된 아가로스 겔로부터의 제한 단편의 단리는 제조사에 의해 지정된 바와 같이 수행하였다. 제조자에 의해 기재된 바와 같이, 제한 분해물로부터 효소를 제거하는 데에는 스트라타클린(Strataclean; Stratagene, LaJolla, CA) 및 제네클린(GeneClean; Bio101)을 사용하였다. 약자의 의미는 다음과 같다: "h"는 시간을 의미하고, "min"은 분을 의미하며, "sec"는 초를 의미하고 "d"는 일을 의미한다.
[실시예]
[실시예 1]
플라스미드 pGrpELux.3 및 pGrpELux.5의 제작 및 RFM443의 형질전환
상기 플라스미드를 제작하는 데 사용되는 도식의 개요가 제1도에 나타나 있다. 제1도는 상기 제작의 과정을 나타내려는 것이며, DNA 구조물은 실측대로 도시되지 않았다.
플라스미드 pGrpEL4는 pUC18[파마시아(Pharmacia), Cat. No. 27-4949-01]로부터 유래되고, 프로모터 서열을 포함하는 에스케리치아 콜라이 스트레스 유전자, grpE를 함유한다. pGrpEL4 플라스미드를 제한효소 EcoRI 및 BbuI로 분해시켜 1.1kb의 단편을 단리하고, 이어서 grpE 프로모터 및 구조 유전자(제1도)에 상응하는 아가로스 겔 전기 영동을 행하였다. 상기 grpE 프로모터는 EcoRI 부위에 의해 5' 말단상에, 또한 PvuII 부위에 의해 3' 말단상에 편리하게 결합된다. 단리된 단편을 제한효소 PvuII를 사용하여 추가로 분해시키고, 상기 구조 유전자(제1도)로부터 상기 프로모터 영역을 분리하였다. EcoRI 링커 단편[스트라진(Stragene), Catalog # 901027]을 포스포릴화시킨후 PvuII 분해의 생성물에 연결시켜 프로모터상의 3' PvuII 부위를 EcoRI 부위로 대체하였다. HaeIII를 사용하여 추가로 분해시켜 일련의 단편들을 얻었으며, 이들 중 하나는 HaeIII에 의해 5' 말단상에 또한 EcoRI 에 의해 3' 말단상에 결합된 grpE 프로모터를 함유한다(제1도).
플라스미드 pUCD615[J. Bacteriol, 169(11) pp. 5101-512, (1987)]는, 카나마이신 및 암피실린 내성을 가지는 유전자 및 lux 발단의 위쪽 다중 클로닝 부위를 가지는 무프로모터 lux 유전자 오페론을 함유하는, 17.6kb의 플라스미드이다(제1도). 상기 pUCD615를 제한효소 EcoRI 및 SmaI 로 우선 분해시켜, 플라스미드를 개방시킨 후, HaeIII로 분해시켜 얻은 상기 DNA 단편과 연결시킨다(제1도).
활성 grpE-lux 융합체를 검색하기 위하여, 연결된 DNA를 사용하여 표준 CaCl2형질전환 방법에 의해 이. 콜라이 균주 XLlBlue[스트라타진(Stratagene)]를 형질전환시키고, 카나마이신 내성을 사용하여 플라스미드의 존재를 검색하였다. 카나마이신(25㎍/mL)을 함유하는, 그리딩된 LB 배지상에서 37℃에서 하룻밤동안 콜로니를 생육시키고 생체발광을 추가로 검색하여, pUCD615의 lux 유전자에 융합된 프로모터 서열을 함유한 형질전환체를 결정하였다. 그리딩된 콜로니를 X-OMATAR 필름[코닥(Kodak), Rochester, NY]에 주위 온도에서 노출시키고 현상한 필름을 육안으로 분석하여 생체발광 검색을 행하였다. 제한효소 분해 후 발광 세포로부터 얻은 플라스미드 DNA를, 제한 단편의 존재 및 크기에 대해 아가로스 겔 전기영동 분석하여 예상한 플라스미드에 의한 형질전환을 추가로 확인하였다. HindIII, BamHI, 및 Sal I 분해물로부터 얻은 제한 단편으로, 플라스미드 pGrpELux.3 및 pGrpELux.5 내지 grpE 프로모터의 존재 및 배향을 확인하였다.
플라스미드 pGrpELux.3 및 pGrpELux.5를 형질전환에 의해 이. 콜라이 숙주 균주 RM443 내로 이동시켜, 각각 이. 콜라이 균주 TV1060 및 TV1061을 얻었다. 이. 콜라이 RFM443은 원래 바흐만(B. Bachmann)의 문헌[E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology(나이드하르트 등 Eds., pp. 1190-1220, Anerican Society of Microbiology, Washington, DC(1987)]에 완전히 기술된 이. 콜라이 W3102로부터 유래되었다.
[실시예 2]
플라스미드 pRY006의 제작 및 RFM443의 형질전환
pRY006을 제작하는데 사용되는 도식의 개요가 제2도에 나타나 있다. 제2도는 상기 제작의 과정을 나타내려는 것이며, DNA 구조물은 실측대로 도시되지 않았다.
dnaK 프로모터를 함유하는 DNA를, 매직 람다(Magic Lambda)제제에 이어 제조자가 제안하는 방법[프로메가 코포레이션(Promega Corp.), Madison, WI]을 사용하여, 람다 파지 9E4[코하라(Kohara, Y.)등; Cell 50, 495-508, 1987]로부터 얻었다. 파지 DNA를 제한효소 BamHI 및 EcoRI로 분해시켰다. 이 처리에 의해, 코우잉(Cowing0 emd (PNAS 82, 2679-2638, 1985)에 의해 기술된, dnaK 프로모터 영역을 포함하는 3.7Kb의 BamHI-EcoRI 제한 단편, 및 DNA 5'에서 이 영역까지의 약 3.0 kb, 및 Dnak 단백질의 아미노 말단을 코딩하는 상기 프로모터 영역의 3' 700bp를 비롯한 몇 개의 DNA 단편이 방출되었다. 분해된 DNA를 제한효소 BamHI 및 EcoRI로 미리 분해시켰던 pUCD615에 연결시켰다(제2도). 얻어진 플라스미드 구조물을 사용하여 이. 콜라이 균주 DH5-[GIBCO-BRL, Gaithersberg, MD, Catalog No. 82635a]를 형질전환시키고, 카나마이신 50㎍/mL를 함유하는 LB 배 지상에서 형질전환된 세균을 37℃에서 하룻밤동안 평판배양하였다. 얻어진 콜로니를 실시예 1에 기술한 바와 같이 X-OMAT AR 필름에 노출시켜 생체발광에 대해 초기에 검색하였다. 형질전환된 세균으로부터 얻은 플라스미드 DNA를 제한효소 분석하여, 원하는 플라스미드 구조물의 존재를 확인하였다. 제한효소 BamHI 및 EcoRI로 분해시켜 3.7Kb의 제한 단편을 얻고, 이어서 아가로스 겔 전기영동시켜 원하는 구조물의 존재를 확인하였다. 상기 플라스미드를 pRY006으로 명명하였다. pRY006을 형질전환에 의해 이. 콜라이 균주 FRM443내로 도입하여 균주 WM1026을 새로 제조하였다.
[실시예 3]
플라스미드 pRY001및 pry002의 제작 및 RFM443의 형질전환
상기 플라스미드를 제작하는데 사용되는 도식의 개요가 제3도에 나타나 있다. 제3도는 상기 제작의 과정을 나타내려는 것이며, DNA 구조물은 실측대로 도시되지 않았다.
dnak 프로모터[코우잉 등의 문헌(PNAS 82, 2679-2683, 1985)에 기술됨]를 함유하는 DNA를, 매직 랍다 제제(프로메가 코포레이션, Madison, WI)에 이어 제조자가 기술한 방법을 사용하여, 람다 파지9E4(코하라 등, Cell 50, 495-508, 1987)로부터 얻었다. 하기의 증폭 프라이머를 사용하여 dnak 프로모터 영역을 PCR 증폭시켰다: 상부 : 5' -GTTATCGGATCCAAAAGCACAAAAAAT-3' (서열 식별 번호 1) 하부 : 5' -AGCAGTGAATTCCATCTAAACGTCTCCA-3'(서열 식별 번호 2)
제조자[진에이엠피(GeneAmp) PCR Reagent Kit, 퍼킨-엘머세터스(Perkin-Elmer Cetus), Norwalk, CT]가 기술한 대로, DNA 증폭을 수행하였다. 시약의 농도는 하기와 같았다 : 1 ×완충액
dATP 200μM
dCTP 200μM
dGTP 200μM
dTTP 200μM
암프리타크(Amplitaq) 폴리머라제(퍼킨-엘머 세터스)2.5 단위 상부 프라이머 100pM
하부 프라이머 100pM
9E4 파지 DNA주형 1ng
dH2O(최종 100μL로 만듬)
하기와 같은 프로그램된 퍼킨-엘머 세터스 진에이엠피 PCR시스템 9600 열순화기를 사용하여 반응을 수행하였다:
용융 : 94℃에서 10초간
어닐링 ; 50℃에서 10초간
신장 : 72℃에서 15초간
사이클 : 30
얻어진 증폭 생성물은 길이가 207개의 염기쌍이고, 또한 진뱅크(GeneBank, 수납번호 10420; 로커스 ECODNAK)에 기탁되어 있는 dnaK 프로모터 영역을 코딩하는 완전한 182 bp 단편과, 짧은 5' 및 3' 플랭킹 서열을 함유한다. PCR-증폭된 DNA를 제한효소 BamHI 및 EcoRI로 분해시키고, 제한효소 BamHI 및 EcoRI로 미리 분해시킨 pUCD615에 연결시켰다(제3도). 얻어진 플라스미드 구조물을 표준 형질전환 방법에 의해 이. 콜라이 균주 DH5-(GIBCO-BRS, Gaithersburg, MD, Cat. No. 82635a)내로 도입하고, 카나마이신(50㎍/mL)을 함유하는 LB 배지상에 세균을 도말하여 37℃에서 하룻밤동안 생육시켰다. 얻어진 콜로니를 실시에 1에 기술한 바와 같이 X-선 필름에 노출시켜 생체발광에 대해 초기에 검색하였다. 2개의 콜로니를 선택하여 형질전환 분석을 하고, 형질전환된 세균으로부터 얻은 플라스미드 DNA를 제한효소 분석하여 원하는 플라스미드 구조물의 존재를 확인하였다. 이어서 아가로스 겔 전기영동을 하면 193bp의 BamHI-EcoRI 제한 단편이 나타나고 이로써 원하는 구조물의 존재를 확인하였다. 상기 플라스미드를 pRY001 및 pRY002로 명명하였다. pRY001 및 pRY002는 상이한 형질절환 콜로니를 나타내지만 제한효소 지도를 기준으로 볼 때 구별할 수 없으며, 본 발명의 목적으로도 동일하게 생각된다. pRY001 및 pRY002는 형질전환에 의해 이. 콜라이 균주 RFM443에 도입되어 각각 균주 WM1021 및 WM1202를 생성시켰다.
[실시예 4]
4% 에탄올의 농도에서의 생체발광의 스트레스 유도
카나마이신(25㎍/mL)을 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 56클렛에 도달할 때(%66 적색 필터가 끼워된 클렛-서머슨 색도계상에서 측정함)까지 균주 TV1060을 생육시킨 후, 주위 온도에서 동일한 배지내에 1:11로 희석시키고, 밀도가 20클렛 단위에 이를 때까지 3시간동안 주위 온도에서 생육시켰다. 세포 100μL를 미소적정판의 웰에 넣고, 40% 에탄올 10μL(실험용, 최종 에탄올 농도 4%) 또는 증류수 10μL(대조용)를 첨가하였다. 상기 판을 즉시 광도계[루미노스칸(Luminoskan), 핀란드]에 놓고, 생체발광량을 RLU 대 시간으로서 측정하였다. 제4도에서 볼 수 있는 바와 같이, 4% 에탄올로 스트레스받은 형질전환된 TV1060배양물로부터의 발광량은, 스트레스를 가한 지 1000초 후 극적으로 증가하여 130 RLU의 최대량에 도달하였다. 대조용 배양물에 증류수를 첨가하면 기준 발광량에 아무런 변화가 없었다(제4 도).
[실시예 5]
다양한 에탄올 농도에서의 생체발광의 스트레스 유도
카나마이신(25㎍/mL)을 함유하는 LB 배지에서 균주 TV1060을 하룻밤동안 생육시킨 후, 동일한 배지내에 1:11로 희석시키고 20클렛에 도달할 때가지 실온에서 생육시켰다. 2%, 4%, 8%, 또는 16%중 한 농도의 에탄올 100μL(실험용, 최종 농도는 각각 1%, 2%, 4%, 및 8%로 됨) 또는 동일한 배지 100μL(대조용)를 함유하는 미소적정판의 웰에 세포 100μL를 넣었다. 상기 판을 즉시 광도계, 모델 ML3000(다이나테크 래버러토리즈, Chantilly, VA)에 놓고, 생체발광량을 RLU대 시간으로서 측정하였다. 제5도에서 볼 수 있는 바와 같이, 에탄올로 스트레스받은 형질전환된 TV1060 배양물로부터의 발광량은, 에탄올 농도의 증가에 상응하여 발광량이 증가함을 나타내었다. 실시에 4에서와 마찬가지로, 스트레스를 가한 지 1000초 후에 발광량의 증가가 관찰되었다. 대조용 배양물은 기준 발광량에 아무런 변화가 없었다(제5도). 8% 에탄올로 스트레스를 가한 지 3000초 후에 최대 발광량이 얻어졌으며, 이는 대조용의 발광량에 비하여 263배가 증가된 것이다. 낮은 농도의 에탄올 스트레스는 그에 따라 발광량이 적어서, 4%, 2%, 및 1% 에탄올 농도의 경우에는 대조용에 비하여 발광량이 각각 96배, 13.5배 및 3.9 배가 증가되었다.
[실시예 6]
균주 WM1021 및 WM1026에서의 생체발광의 스트레스 유도
카나마이신(50㎍/mL)을 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 균주 WM1021 및 WM1026을 대략 18시간동안 생육시켰다. 그 다음, 배양 물을 새 배지내에 1:50으로 희석시키고, 주위 온도에서 대략 3시간동안 생육시켰다. 세포의 밀도가 20클렛 단위에 도달하면, 다양한 농도의 에탄올 20μL를 함유하는 미소적정판의 웨에 세포 현탁액 80μL를 넣고, 이 판을 즉시 다이나테크 모델 ML3000 광도계에 넣었다. 에탄올은 최종 농도 16%, 8%, 4%, 2%, 및 1%로 존재하며, 탈이온수 대조용을 포함하였다. 상기 광도계를 미리 프로그램하여 2분 간격으로 발광량을 측정하였다. 제6a도 및 제6b도는 균주 WM1021 및 WM1026이 각각 다양한 농도의 에탄올에 대해 반응하여 생성시킨 발광량 데이타를 나타낸다. 제6a도에 나타난 바와 같이, 치사량 미만의 1%, 2% 및 4% 에탄올 농도를 수용한 배양균에서는 스트레스 받은 지 1000초 후 급격하게 발광량이 증가한다. 더 높은, 치사량의 에탄올 농도 8% 및 16%에서는, 발광량이 기준 수치 미만으로 떨어지는 것이 나타나며, 이는 세포의 사멸을 나타낸다. 제6b도는 숙주세포 WM1026을 사용한 유사한 결과를 나타낸다. 따라서, 치사량 미만의 에탄올에 반응하여 광이 증가하는 반면에, 보다 높은 치사량의 농도에서는 발광량이 줄어든다. 이 실시에는 치사량 미만 및 치사량에서 손상인자의 존재를 검출하는 본 발명의 능력을 증명한다.
[실시예 7]
pGrpE.Lux5로 형질전환된 tolC+및 tolC-균주에서 펜타클로로페놀에 의한 생체발광의 스트레스 유도의 비교
유기 화합물에 대하여 증진된 투과성을 가지는 이. 콜라이 검출 생물체를 제공하기 위하여 tolC-변이주 DE112를 RFM443으로부터 제작하였다. 상기 이. 콜라이 균주 DE112는 tolC 부위에서 변이가 일어난 것을 제외하고는 균주 RFM443과 동종이다. 이는 공여체인 균주 CS1562(tolC: miniTn10)및 수용체인 균주 RFM443에서 생육된 용균물을 사용하여 파지 P1 매개된 형질도입에 의해 제작되었다. CS1562(tolC:miniTn10)는 오스틴(Austin) 등의 문헌[J.Bacteriol. 172, 5312(1990)]에 완전히 기술되어 있고, 상기 형질도입 과정은 밀러(Miller, J. H)의 문헌[Experiments in Molecular Genetics, (1972), Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 201-205]에 기술되어 있다. RFM443은 원래 W3102로부터 유래되었고, 이는 바흐만의 문헌[E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology, 니드하르트 등 Eds., pp. 1190-1220, American Society of Microbiology, Washington, DC, (1987)]에 완전히 기술되어 있다. 얻어진 테트라사이클린 내성 재조합체를 소수성 화합물 크리스탈 바이올렛에 대한 과민방응에 대해 검색하였다.
DE112 및 RFM443은 tolC 부위만 제외하고 동종이다. 두 균주를 실시예 1에 기술한 플라스미드 pGrpELux.5로 형질전환시키고, 각각 TV1076(tolC: :miniTn10) 및 TV1061(tolC+)로 명명하였다.
50㎍/mL의 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 25℃에서두 균주를 하룻밤동안 생육시켰다. 카나마이신(50㎍/mL)을 함유하는 새 LB 배지내에 그 배양물을 1:50으로 희석시키고 25℃에서 4시간동안 흔즐면서 배양하였다. 클렛-서머슨 색도계상에서 세포 밀도를 측정하였다. 두 균주가 25 내지 29클렛 단위에 도달하면, 이들 세포를 시험에 사용하였다.
각 배양물로부터 얻은 세포(50μL)를, 미소적정판의 웨내의 카나마이신(50㎍/mL)및 다양한 농도의 펜타클로로페놀(PCP)을 함유한 LB 배지에 각 웨랑 최종 용적이 100μL가 되도록 첨가하였다.
에탄올중 PCP 모용액 100mg/mL를 사용하여 카나마이신(50㎍/mL)을 함유하는 LB 배지중 PCP의 75㎍/mL 용액을 제조하였다. 상기 용액(50μL)을 미소적정판의 웰 내에 넣고 이로부너 순차적으로 2배씩 희석해 나갔다. 동일 용적의 세포가 첨가될 때, 최고 에탄올 농도는 0.037%였고, 이는 상기 세포로부터 상당한 반응을 유도하지 않는 것으로 알려진 농도이다.
25℃에서, 다이나테크 ML3000 미소적정판 광도계에서 주기적인 간격으로 광량을 계측하고, 그 데이타는 PCP의 농도를 유도비의 함수로서 플로팅하여 제7도의 그래프에 나타낸다. 상기 유도비는 PCP 존재하의 발광량(RLU)을 PCP 부재하의 발광량(RLU)D으로 나눈 것으로 정의된다.
제7도는 PCP 사용량 대 첨가한지 60분 후의 유도비를 나타낸다. 낮은 사용량에서는, tolC+균주, TV1061로부터 발광이 유도되지 않았다(비=1). 그러나, 상기 낮은 사용량에서 상기 tolC-균주, TV1076은 발광량을 상당히 증가시켰다. 또한, 많은 사용량의 경우는, 상기 tolC+균주에서 유도가 관찰되며, tolC-균에서 상기 PCP의 독성 효과(발광량의 손실)가 관찰된다. 따라서, 상기 tolC-균주는 상기 tolC+균주에서 검출될 수 있는 농도보다 더 낮은 농도의 상기 화합물을 검출하기 유용하다. 마찬가지로, 기타 소수성 화합물도 또한 grpE: :lux 융합체를 함유하는 플라스미드와 상기 숙주 균주의 조합에 의해 보다 쉽게 검출될 것이다.
[실시예 8]
pGrpE.Lux.5로 형질전환된 tolC+및 tolC-균주에서의 유기 및 무기 오염물질에 의한 생체발광의 스트레스 유도
TV1061 및 TV1076를 상기 기술한 대로 조작하였다. 카나마이신 (50㎍/mL)을 함유하는 LB배지에서 25℃에서 두 균주를 하룻밤동안 생육시켰다. 카나마이신(50㎍/mL)을 함유하는 LB 배지내에 상기 배양물을 40 내지 100배로 희석시키고 25℃에서 흔들면서 배양하였다. 세포 밀도를 클렛-서머슨 색도계상에서 결정하였다. 두 균주의 밀도가 15 내지 30클렛 단위가 되면, 시험에 세포를 사용하였다.
각 배양물로부터 얻은 세포(50μL)를, 미소적정판의 웰 내의 카나마이신(50㎍/mL) 및 다양한 농도의 벤젠, 에탄올, 메탄올, 2-니트로페놀, 4-니트로페놀, PCP, 페놀, 톨루엔, 및 크실렌 함유하는 LB 배지에 각 웰당 최종 용적이 100μL가 되도록 첨가하였다. 대조용 웰은 시험 화합물의 용해시키는데 사용되는 적절한 용적의 용매를 함유하였다.
벤젠, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 메틸렌클로라이드, 디메틸 설폭사이드, 트리톤 X-100, 페놀, 톨루엔, 및 크실렌은 카나마이신(50㎍/mL)을 함유하는 LB 배지내에 직접 첨가되었다. 메탄올중 2-니트로페놀(130,g/mL) 및 4-니트로페놀(112mg/mL)의 소용액을, 카나마이신(50㎍/mL)을 함유하는 LB 배지내에 희석시켜 시험 농도로 만들었다. 메탄올의 최종 농도는 상기 세포로부터 상당한 반응을 유도하지 않는 농도였다. 에탄올중 PCP(100㎎/mL)의 모용액을, 카나마이신(50㎍/mL)을 함유하는 LB 배지내에 희석시켜 시험 농도로 만들었다. 에탄올의 최종 농도는 상기 세포로부터 상당한 반응을 유도하지 않는 농도였다. 물중 황상구리(250mM), 질산납(100mM), 염화수은(100mM), 염화나트륨(20%), 아세트산나트륨(2M), 프로피온산나트륨(2M), 과산화수소(30%), 퓨로마이신(10㎎/mL), 메틸 비올로겐(200㎎/mL), 및 아크릴아미드(1M)의 모용액을, 카나마이신(50㎍/mL)을 함유하는 LB 배지내에 희석시켜 시험 농도로 만들었다. 물중 염화 카드뮴(100mM)의 모용액을, 카나마이신을 함유하지 않는 LB 배지내에 희석시켜 시험 농도로 만들었다.
2시간동안 주기적인 간격으로 발광량을 측정하고, 그 데이타를 표 II에 나타내었다. 발광량은 모두 25℃, 다이나테크 ML3000 미소 적정판 광도계에서 측정하였다.
표 II의 데이타는 시험 화합물에 노출된 지 1시간 후에 읽은 값을 나타내고, 최대 발광량을 나타내는 시험 화합물의 농도로서 표현된다. 데이타는 또한 기준 발광량 대한 유도된 발광량의 증가 배수를 나타낸다.
[ 표 II]
표 II의 데이타로부터, 광범위한 화학 화합물 및 환경 조건이 플라스미드 pGrpELux.5를 함유하는 이.콜라이 균주로부터 발광을 유도함을 알 수 있다. 그러므로, tolC-변이를 함유하는 검출 생물체가 임의의 환경 손상인자에 대한 바람직한 숙주라고 결론지을 수 있다.
[실시예 9]
pRY002로 형질전환된 및 tolC-균주에서의 유기 및 무기 오염물질에 의한 생체발광의 스트레스 유도
DE112(tolC: :miniTn10)를 실시예 7에 기술한 대로 조작하였고, RFM443의 공급원은 이미 기술하였다. 두 균주를 실시예 3에 기술한 표준 방법에 의해 플라스미드 pRY002로 형질전환시키고, 각각 WM1302(tolC: : miniTn10)및 WM1202(tolC+)로 명명하였다.
카나마이신 50㎍/mL를 함유하는 LB 배지에서 25℃에서 두균주를 하룻밤동안 생육시켰다. 카나마이신(50㎍/mL)을 함유하는 새 LB 배지내에 상기 배양물을 1:100으로 희석시키고 25℃에서 4시간동안 흔들면서 배양하였다. 세포 밀도를 클렛-서머슨 색도게상에서 결정하였다. 두 균주의 밀도가 28클렛 단위로 되면, 시험에 세포를 사용하였다.
각 배양물로부터 얻은 세포(50μL)를, 미소적정판 웰 내의 카나마이신(50㎍/mL)및 다양한 농도의 PCP, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 페놀, 에탄올, 메탄올, 2-니트로페놀, 아트라진 및 황상구리를 함유하는 LB 배지에 각 웰당 최종 용적이 100μL가 되도록 첨가하였다. 대조용 웰은 시험 화합물을 용해시키는데 사용되는 적절한 용적의 용매를 함유하였다.
본질적으로 실시예 8에 기술한 바와 같이 시험용 화합물을 제조하였다. 황산구리는 배양 배지에 직접 첨가하고 아트라진은 세포 배양물에 첨가하기 전에 우선 메탄올에 용해시켰다. 아트라진을 제외하고, 모든 용매는 상기 시스템에 스트레스 반응이 나타나는 데 필요한 양 미만으로 첨가하였다. 상기 아트라진 샘플에 존재하는 메탄올의 양은 작지만 검출가능한 반응을 유도하고; 표 III의 데이타는 메탄올만을 동량으로 사용하여 얻은 반응보다 높게 검출된 총 반응이다.
2시간동안 주기적인 간격으로 발광량을 측정하고, 그 데이타를 표 III에 나타낸다. 모든 발광량은 25℃, 다이나테크 ML3000 미소적 정판 광도게에서 측정하였다.
표 III의 데이타는 시험 화합물에 노출된 지 1시간 후에 읽은 값을 나타내고, 최대 발광량을 나타내는 시험 화합물의 농도로서 표현된다. 데이타는 또한 기준 발광량에 대한 유도된 발광량의 증가 배수를 나타낸다.
[표 III]
표 III의 데이타로부터 몇 부류의 화학 화합물이 플라스미드 pRY002를 함유하는 이. 콜라이 균주로부터 생체발광을 유도함을 알 수 있다. 두 tolC-및 tolC+숙주는 소수성이 덜한 화합물에 대하여 비슷한 감수성을 나타내었다. 상기 tolC-변이를 함유하는 검출 생물체가 임의의 환경 손상인자에 대한 바람직한 숙주라고 결론지을 수 있다.
[실시예 10]
lux 오페론에 융합된 lon, recA, uvrA, katG, micF, uspA, xthA, his, phoA, glnA 프로모터의 제작
추가의 플라스미드를 제작하는 도식은 상이한 프라이머 및 주형을 PCR 반응에 사용하고, 40 사이클을 사용한 것을 제외하고는 제3도에 나타내고 또한 실시에 3에 기술된, pRY001 및 pRY002의 제작법과 동일하다. 사용된 상기 프라이머 및 주형을 하기 표 IV에 나열한다.
[표 IV]
a 프로모터 서열은 진뱅크에서 얻을 수 있다.
b 상부 프라이머의 밑줄친 영역은 BamHI 제한 효소 절단 부위이다. 3'에서 제한 부위까지는 원하는 프로모터의 위쪽 영역에 상보적인 서열이다(일반적으로 18개 뉴클레오티드).
c 하부 프라이머의 밑줄친 영역은 EcoRI 제한 효소 절단 부위이다. 3' 에서 제한 부위까지는 원하는 프로모터의 아래쪽 영역에 상보적인 서열이다(일반적으로 18개 뉴클레오티드).
d PCR 반응용 주형은 염색체 DNA 제제[C, 지스킨스(Zyskind)및 번스타인(Bernstein)의 문헌(Recombinant DNA Laboratory Manual, Academic Press, New York, 1992)에 따라 제조됨] 또는 이. 콜라이K12에서 생육된, 지정 번호[보우퍼드(Bouffard)등의 문헌(CABIOS8: 563-567(1992)) 참조]로 나타내어지는 이. 콜라이 염색체[코하라등, Cell 50; 459-508(1987)]을 담당하는, 특수화한형질도입 파지의 중첩 세트 중 하나로부터 얻은, 물에 재현탁한 플라크였다. 플라크로부터의 증폭은 버그(Berg)의 방법[크리쉬난(Krishnan), 블래케슬리(Blakesley) 및 버그(1992)의 문헌(Nucleic Acids Research 19:1153) 참조]으로 수행하고, 염색체 제제로부터의 증폭은 버그의 방법으로 수행하되, 주형으로서 1μL의 염색체 DNA 제제를 사용하는 것이 달랐다.
e 상기 PCR 생성물의 계산된 크기. 아가로스 겔 전기영동 분석으로 생성물의 크기를 확인하였다.
표 IV 에 나열된 모든 프로모터 서열은 공개되어 있으며 진뱅크로부터 얻을 수 있다. 상부 프라이머의 밑줄친 영역은 BamHI 제한효소 절단 부위이다. 3'에서 제한 부위까지는 원하는 프로모터의 위쪽 영역에 상보적인 서열이다(일반적으로 18개의 뉴클레오티드). 하부 프라이머의 밑줄친 영역은 EcoRI 제한효소 절단 부위이다. 3'에서 제한 부위까지는 원하는 프로모터의 아래쪽 영역에 상보적인 서열이다(일반적으로 18개의 뉴클레오티드). PCR 반응용 주쇄는 염색체 DNA 제제[C, 지스킨드 및 번스타인의 문헌(Recombinant DNA Laboratory Manual, Academic Press, New York, 1992)에 따라 제조됨] 또는 이. 콜라이 K12에서 생육된, 지정 번호[보우퍼드 등, CABIOS 8: 563-567(1992)]로 나타내어지는 이. 콜라이 염색체[코하라 등, Cell 50; 495-508(1987)]을 담당하는, 특수화한 λ형질도입 피지의 중첩 세트 중 하나로부터 얻은, 물에 재현탁한 플라크였다. 플라크로부터의 증폭은 버그(Berg0의 방법[Nucleic Acids Research 19, 1153(1991)]으로 수행하였다. 염색체 제제로부터의 증폭은 버그의 방법으로 수행하되, 주형으로서 1μL의 염색체 DNA 제제를 사용한 것이 달랐다.
얻어진 각 플라스미드를 3가지의 이. 콜라이 숙주 균주(RFM443, DE112, 및 ,W3110)에 도입하였다. 플라스미드 및 형질전환된 숙주 세포를 하기 표 V에 나열하였다.
[표 V]
프로모터의 공지된 감수성에 적절한 다양한 환경 손상인자를 사용하여 형질전환된 검출 숙주에서 프로모터-리포터 융합체를 시험하였다. 프로모터 및 이들의 상응하는 유도 손상인자를 표 VI에 요약하였다.
[표 VI]
b. 다중 조절 반응을 초래함.
c 증가된 생체발광 반응을 개시하게 하는 화학적 유도.
d 긍정적인 조절 회로의 파괴에 의해 생체발광회 발헌을 방지하는 유전자 제작.
e 에탄올은 열 쇼크 반응의 강력한 유도체이다[나이드하르트 및 반보겔렌(VanBogelen), E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology(나이드하르트 등 Eds., pp. 1334-1345 American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)].
f 미트파이신 C는 SOS 반응의 공지된 유도체이다[워커(Walker), E. coli and Salmonella typhimurum; Callular and Molecular Biology(나이드하르트 등 Eds., pp. 1346-1357, American Society of Microbiology, Washington, DC 91987)].
g 카트뮴은 유전자 손상을 유도한다고 보고되었다[나이드하르트 및 반보겔렌, E. coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology(나이드하르트 등 Eds., pp. 1334-1345, American Society of Microbioldgy, Washington, DC (1987)].
h 상기 화합물은 초산화물을 생성시키는 산화환원 순환을 촉진한다.
초산화물은 변이제거되어 과산화수소가 된다. 초산화물은 과산화수소에 노출되어 유도된 40개의 단백질 외에 40개 단백질의 합성을 유도한다[뎀플(Demple), Ann. Rev. Genet. 25 : 315-337(1991)].
I 과산화수소는 oxyR 레귤론(regulon) 및 이. 콜라이 및 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)에 유도된 약 40개의 폴리펩티드증 몇 개의 다른 단백질을 유도한다[크리스트맨(Christman) 등, Call 41: 753-762(1985) : 스토즈(Storz)등, Science 248:189-194(1990); 뎁플, Ann. Rev. Genet, 25 : 315-337(1991)].
j 반 다이크(T. Van Dyk), 미공개.
k 이 화합물은 tRNA 의 아미노아실화를 방지함으로써 엄격한 반응을 유도하였다[카쉘(Cashel) 및 러드(Rudd), E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology(나이드하르트 등 Eds., pp. 1410-1438, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987); 윙클러(Winkler), E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology(나이드하르트 등 Eds., pp. 395-411, American Society of Microblology. Washington, DC (1987))].
I 이화대사산물 활성화 반응은 양호한 탄소원의 부재에 의해 개시된다
[나이드하르트, 잉그라함(Ingraham) 및 사엑터(Schaecter), Physiology of the Bacterial Cell: A Molecular Approach, Sinauer Associates, Sunderlnad, MA (1990), pp, 351-388: 마가사닉(Magasanik) 및 나이드하르트, E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology(나이드하르트 등 Eds., pp. 1318-1325, Amercan Society of Microbillogy, Washington, DC (1987)]/
m 제한된 인산 농도의 사용은 인산염 고갈 레귤론을 유도한다[워너(Wanner), E. coli and Salmonella typhimurium; Celluar and Molecular Biology(나이드하르트 등 Eds., pp, 1326-1333, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))]
n 유일한 N원으로서의 글루타민의 사용은 N고갈 레귤론의 발현을 유도한다(리쩌(Rietzer) 및 마가사닉, E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology(나이드하르트 등 Eds., pp. 1302-1320 American society of Microbiology, Washington, DC (1987))].
[실시예 11]
에탄올 또는 황산구리에 대한 lon 형질전환된 숙주 세포의 반응
카나마이신(50μg/mL)을 함유하는 LB 배지에서 26℃에서 이콜라이 균주 pLonE6/RFM443을 하룻밤동안 배양시킨 후 카나마이신(50μg/mL)을 함유하는 새로운 LB 배지 중으로 회석시키고 26℃에서 초기대수증식까지 생육시켰다. 카나마이신(50μg/mL) 및 다양한 농도의 에탄올(배지에 직접 첨가됨) 또는 황산구리(물증 250mM모용액으로부터 희석됨)를 함유하는 LB 배지 50μL에 세포 50μL를 첨가하였다. 다이나테크 ML3000 광동계에서 26℃에서 광 발생량을 배양시간의 함수로서 정량하였다. 에탄올의 최종 농도가 4%일 때 에탄올에 의해 유도된 최대 반응이 관찰되었으며; 에탄올을 첨가한지 60분 후에 처리되지 않은 대조용보다 에탄올 존재하에서 발광량이 134배 더 컸다. 최종 농도가 5mM일 때 최대 황산구리 유도가 발생되었으며; 60분 후에 유도비가 408배였다.
[실시예 12]
미토마이신 C, 에티디움 브로마이드 또는 염화카드뮴에 대한 recA 형질전환된 숙주 세포의 반응
카나마이신(50μg/mL)을 함유하는 LB 배지에서 26℃에서 플라스미드 pRecALux3을 함유하는 이, 콜라이 균주를 하룻밤동안 생육시키고 카나마이신(50μg/mL)를 함유하는 새로운 LB 배지 중으로 희석시킨 후 26℃에서 초기 대수증식기까지 생육시켰다. 카나마이신(50μg/mL) 및 다양한 농도의 미토마이신 C(물중 20mg/ml의 모용액으로부터 희석시킴)를 함유하는 LB 배지 50μL에 생포 50μL를 첨가하였다. 26℃에서 다이나테크 ML3000 광도계에서 광 발생량을 정량하였다. 0.5μg/mL 미토마이신 C를 첨가한지 100분 후, 유도비는 다음과 같았다;
균주 DPD2791 (pRecALux3/W3110) 4.74
균주 DPD2794 (pRecALux3/RFM443) 20.00
균주 DPD2797 (pRecALux3/DE112) 15.70
이. 콜라이 균주 DPD2794는 에티디움 브로마이드의 존재에 대해 반응을 나타내었다. 카나마이신(25μg/mL)을 함유하는 LB 배지에서 26℃에서 하룻밤 동안 세포를 생육시킨 후 새로운 LB 배지 중으로 희석시키고 26℃에서 초기 대수증식기까지 생육시켰다. 다양한 농도의 에티디움 브로마이드(물중 10mg/mL 모용액으로부터 희석시킴)를 함유하는 LB 배지 50μL를 첨가하였다. 26℃에서 다이나테크 ML3000 광도계에서 광 발생량을 정량하였다. 0.25mg/mL의 에티디움 브로마이드를 첨가한지 180분 후, 유도비는 1.9배였다.
이, 콜라이 균주 DPD2794도 디스크 확산 시험에 의해 염화카드뮴의 존재에 대해 반응하는 것으로 밝혀졌다. 카나마이신(50μg/mL)을 함유하는 LB 한천배지 상에 세포를 도말시키고, 100mM 염화카드뮴 용액 20μL로 습윤된 여과 다스크를 한천배지 상에 올려놓았다. 37℃에서 하룻밤 동안 배양시킨 후, 한천배지를 상온까지 냉각시켰다. 듀퐁 리 플렉션(DuPont Reflection)필름을 배지에 10분간 노출시켰다. 생육 억제대역(직경 18mm)주위에서 발광이 향상된 대역(직경 35mm)이 관찰되었다.
[실시예 13]
메틸 비올로겐, 관산화수소 또는 메나디온에 대한 KatG 형질 전환된 숙주 세포의 반응
플라스미드 pKatGLux2 및 pKatGLux6을 함유하는 이. 콜라이 균주를 LB 배지에서 37℃에서 하룻밤동안 생육시키고 새로운 LB 배지중으로 희석시킨 후 37℃에서 초기 대수증식기까지 생육시켰다. 다양한 농도의 메틸 비올로겐(MV)(물중 200mg/mL 모용액으로부터 희석됨) 또는 과산화수소(H2O2)(물중 0.3% 용액으로부터 희석됨) 및 LB 배지 60μL에 세포 40μL를 첨가하였다. 26℃에서 다이나테크 ML3000 광도계에서 광 발생량을 정량하였다. 데이터는 하기 표 VII에 기재되어 있다.
[표 VII]
[표 VIII]
이. 콜라이 균주 DPD2511도 메나디온의 존재에 대해 증가된 생체발광으로 반응하는 것으로 밝혀졌다. 카나마이신(25μg/mL)을 함유하는 LB 배지에서 26℃에서 하룻밤동안 세포를 생육시키고 LB 배지를 희석시킨 다음 26℃에서 대수증식기까지 생육시켰다. LB 배지 80μL중 다양한 농도의 메나디온(물중 200mg/mL 용액으로부터 희석됨)을 함유하는 미소적정판의 웰에 세포 20μL를 첨가하였다. 26℃에서 다이나테크 ML3000 광도계에서 광 발생량을 정량하였다. 80분이 경과되었을 때, 2.3mM 메나디온으로 처리한 세포의 생체발광은 처리하지 않은 대조용보다 1200배 더 컸다.
[실시예 14]
메틸 비올레겐 또는 과산화수소에 대한 MicF 형질 전환된 숙주세포의 반응
플라스미드 pMicFLux1 및 pMicFLux2를 함유하는 이. 콜라이 균주를 LB배지에서 37℃에서 하룻밤동안 배양하고 새로운 LB 배지 중으로 희석시킨 다음 37℃에서 초기 대수증식기까지 생육시켰다. LB 배지 60μL 및 다양한 농도의 메틸 비올로겐(물중 200mg/mL 모용액으로부터 희석시킴) 또는 과산화수소(물중 0.3% 용액으로부터 희석시킴)에 세포 40μL를 첨가하였다. 26℃에서 다이나테크 ML3000에서 광 발생량을 정량하였다. 데이터는 하기 표 IX 및 X에 기재되어 있다.
[표 IX]
[표 X]
[실시예 15]
에탄올 또는 황산구리에 대한 UspA 형질전환된 숙주 세포의 반응
플라스미드 pUspALux.2를 함유하는 이.콜라이 균주 DE134를 카나마이신(25μg/mL)을 함유하는 LB 배지에서 26℃에서 하룻밤동안 세포를 생육시킨 후, 카나마이신(50μg/mL)을 함유하는 새로운 LB 배지 중으로 희석시키고 26℃에서 초기 대수증식기까지 생육시켰다. 카나마이신(50μg/mL) 및 다양한 농도의 에탄올(배지에 바로 첨가됨) 또는 황산 구리(물중 250mM 모용액으로부터 희석됨)를 함유하는 LB 배지 50μL에 세포 50μL를 첨가하였다. 26℃에서 다이나 테크 ML3000에서 광 발생량을 정량하였다. 에탄올에 의해 유도된 최대 반응은 에탄올의 최종 농도가 4%일 때 관찰되었으며; 에탄올을 첨가한지 60분 후 유도비는 148배였다. 최종 농도가 5mM일 때 최대 황산구리 유도가 발생되었으며; 60분 후 유도비는 6.9배였다.
[실시예 16]
프로피온산염, 아세트염 또는 관산화수소에 대한 xthA 형질 전환된 숙주세포의 반응
lux 오페론에 융합된 xthA 프로모터를 갖는 플라스미드를 함유하는 이.콜라이 균주를, 카나마이신(25μg/mL)을 함유하는 LB 배지에서 26℃에서 하룻밤동안 생육시키고, 카나마이신(25μg/mL)을 함유하는 새로운 LB 배지 중으로 희석시킨 후 26℃에서 초기 대수증식기까지 생육시켰다. 카나마이신(25μg/mL) 및 다양한 농도의 아세트산염(물중 2M 모용액으로부터 희석시킴), 프로피온산염(물중 2M 모용액으로부터 희석시킴) 또는 과산화수소(물중 30% 모용액으로부터 희석시킴)를 함유하는 LB 배지 50μL에 세포 50μL를 첨가하였다. 26℃에서 다이나테크 ML3000광도계에서 광 발생량을 정량하였다. 균주 DPD2778에 0.025% 과산화수소를 첨가한지 9시간 후, 생체발광은 첨가하지 않은 대조용보다 70배 더 컸으며; 100mM 아세트산염을 첨가한지 1시간 후, 유도비는 54였고; 100mM 프로피온산염을 첨가한지 3일 후, 반응비는 207이었다. 균지 DPD2781의 경우, 0.05% 과산화수소를 첨가한지 18시간 후에 생체 발광은 첨가하지 않은 대조용에 비해 660배 더 컸고; 100mM 아세트산염을 첨가한지 1일 후, 유도비는 61이었으며; 100mM 프로피온산염을 첨가한지 3일 후, 유도비는 291이었다.
[실시예 17]
유전자 발현에 대한 his 형질전환된 숙주세포의 반응
lux오페론에 융합된 his 프로모터를 갖는 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 균주는, 유전자 발현이 적절한 제어인자의 존재에 의존함을 보여주는 유전자 실험에서 엄격한 반응 시스템에 의해 제어되는 것으로 밝혀졌다. CaCl2 매개된 형질전환에 의해 플라스미드 DNA를 상이한 동종 균주, 즉 정상적으로 제어되는 균주(균주 CF1648), relA 제어 유전자에서 변이된 균주(균주 CF1693), 또는 relA 및 spoT 제어 유전자에서 변이된 균주(균주 1651)중으로 위치시켰다. 이들 균주는 카쉘[크시아오(Xiao)등 (1991)Residual Guanosine 3'5'-bispyrophosphate synthetic activity of relA null mutants can be eliminate by spoT null mutations. J. Biol. Chem., 266: 5980-5990]로부터 수득하였다. 암피실린(150μg/mL)을 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 하룻밤동안 균주를 생육시키고 동일한 배지에서 희석시킨 후 초기 대수증식기까지 37℃에서 생육시켰다. 26℃에서 다이나테크 ML3000 광도계에서 발광을 정량하였다. 세가지 플라스미드는 각각 relA 변이주에서 감소된 발광량을 나타내었으며, relA, spoT 이중변이중에서는 급격히 감소된 발광량을 나타내었다. 데이터는 하기 표 XII에 기재되어 있다.
[표 XII]
세린 하이드록사메이트에 노출시킴으로써도 이들 융합체를 유도할 수 있다. 이 화합물은 세릴-tRNA 신테타제에 의한 tRNAser아미노아실화의 특이적인 저해제이다[파이저(Pizer) 및 토사(Tosa)(1971) J. Bacteriol. 106:972-982]. 우라실(25μg/mL) 카나마이신 설페이트(10μg/mL) 및 글루코오스(0.4%)가 보충된 최소 E 배지[데이비스(Davis)등, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1980]에서 29℃에서 흔들면서 세포를 하룻밤동안 생육시켰다. 카나마이신 설페이트를 함유하지 않도록 개질된 동일한 배지 중에서 세포를 20배 희석시키고 19 내지 34클렛 단위로 될 때까지 전술한 바와 같이 생육시켰다. 물중 D,L-세린 하이드록시사메이트의 2mg/mL 용액을, 카나마이신 설페이트를 함유하지 않도록 개질된 동일한 배지에서 희석시켰다(일련의 2배 희석액). 미소정적판에서 이들 희석액(50μL)을 활발하게 생육시킨 배양물 50μL와 혼합하였다. 26℃에서 다이나테크 ML3000광도계에서 광발생량을 정량하였다. 배양한지 1180분 후, 하기 유도비가 관측되었다:
[표 XIII]
이 데이터는, 엄격한 반응 메카니즘을 알게 되면 다양한 아미노산 생합성 저해제를 검출할 수 있는 생체센서를 개발하는데 이용할 수 있음을 암시한다. 다수의 제조제가 아미노산 생합성의 저해제이기 때문에, 이 생체센서는 몇 가지 제초제[예컨대, 아세토락테이트 신타제-관련 제초제(설포닐우레아, 이미다졸리논 및 트리아졸리피리미딘 부류 포함), 포스피노트리신 및 글라이포세이트]의 유용한 검출기일 수 있다.
[실시예 18]
인산염 제한에 대한 phoA 형질전환된 숙주세포의 반응
lux 오페론에 융합된 phoA 프로모터를 갖는 플라스미드를 함유하는 이.콜라이 균주 DPD1522 내지 DPD1533은 인산염 제한에 대한 반응하는 것으로 나타났다. 트리신을 함유하지 않고 탄소원으로서의 글루코오스(0.4%), 비타민 B1(0.00002% )표준 농도의 인산염(2.0mM)또는 제한된 농도의 인산염(0.1mM)을 함유하는 MOPS 배지[보흐너(Bochner)등(1982) Complete analysis of cellular nucleotides by two-dimensional thin layer chromatography, J. Biol. Chem. 257:9759-9769]상에 이들 균주를 단일 콜로니로 접종하였다. 37℃에서 하룻밤동안 배양한 후, 배지를 상온으로 냉각시키고 다양한 시간동안 듀퐁 리플렉션즈 필름에 노출시켰다. 표준 농도의 인산염을 함유하는 배지에서 생육된 균주는 필름이 상당히 노출되는데 3시간이 필요하였다. 대조적으로, 제한된 인산염을 함유하는 배지에서 생육되는 균주는 필름이 상당히 노출되는데 단 1분만 필요하여, 제한된 인산염원에 의해 발광이 유도되었음을 나타내었다.
이 결과는 광도계를 사용하여 수행한 실험에 의해 확인되었다. 글루코오스(0.4%), 우라실(25μg/mL) 및 카나마이신 설페이트(10μg/mL)로 보충된 2mM 인산칼륨을 함유하는 상기 최소배지에서 29℃에서 흔들면서 하룻밤동안 배양물을 생육시켰다. 카나마이신 설페이트 및 인산칼륨을 함유하지 않도록 개질된, 동일한 용적의 동일한 배지에 재현탁하기 전에 원심분리하여 세포를 수획하였다. 카나마이신 설페이트를 함유하지 않고 인산칼륨의 최종 농도가 0 내지 2000μM로 되도록 개질된 동일한 배지 50μL에 세포 50μL를 첨가하였다. 26℃에서 다이나테크 ML3000광도계에서 발광량(재현탁된 세포를 첨가한지 300분을 넘는 경우 시간의 함수로서)을 정량하였다. 2종의 균주[DPD1522(pPhoALux3/W3110) 및 DPD1523(pPhoALux4/W3110)]에서의 전형적인 결과는 하기에 기재되어 있다:
[표 XIV]
[실시예 19]
유일한 탄소원으로서의 글루타민에 대한 glnA 형질전환된 숙주세포의 반응
0.1%(NH4)2SO4를 함유하는 최소 인산염 배지[벤더(Bender)등, (1977) Biochemical parameters of glutamine synthetase from Klebsiella aerogenes, J. Bacteriol, 129:1001-1009]에서 이. 콜라이 균주 DPD2831을 하룻밤동안 생육시켰다. 이들 배양물을 원심분리에 의해 수획하고 동일한 배지(대조용) 또는 (NH4)2SO4를 함유하지 않지만 유일한 질소원으로서 0.004% 글루타민을 함유하는 배지에 재현탁시켰다. 26℃에서 다이나테크 ML3000광도계에서 발광량을 정량하였다. 재현탁시킨지 62분 후에 불량한 질소원(글루타민)을 갖는 배지의 세포는 대조용 배양물보다 62배 더 큰 생체발광을 가졌다.
[실시예 20]
플라스미드 및 숙주 세포를 함유하는 lac의 제작
비브리오 피셔리의 플라스미드-유래 lux 유전자가 이.콜라이 lac 프로모터의 조절하에 있도록 이. 콜라이 균주를 제작하였다. pUC19[야니쉬-페론(Yanisch-Perron)등(1985)Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors, gene 33 :103-119]의 232개 염기쌍 Pvu II 내지 EcoRI 단편을 SmaI 및 EcoRI 분해된 pUCD615[로고스키 등, (1987) Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmis pTiC58, J. Bacteriol, 169:5101-5112]중으로 연결시켜 pLacLux를 생성시켰다. 이 플라스미드는 원래 F'lacIq를 함유하는 이. 콜라이 균주 XL1-Blue[블록크(Bullock)등, (1987), XL1-Blue: A high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with bata- galactosidase selection, Biotechniques, 4:376-379]에서 단리되어 lux 유전자가 IPTG에 의해 유도될 수 있도록 하였다. 또한 CaCl2매개된 형질 전환에 의해 플라스미드를 이.콜라이 균주 W3110, REM443, 및 DE112중으로 도입하였다(표 V, 실시예 10 참조).
[실시예 21]
탄소원 수준에 대한 lac 형질전환된 숙주 세포의 반응
글루코오스는 이. 콜라이에게 바람직한 탄소원이다. 각각 플라스미드 pLacLux를 함유하는 이. 콜라이 균주 TV1058 및 TV1068을, 카나마이신(25μg/mL)을 함유하고 0.4% 글루코오스를 함유하지 않거나 함유하는 LB 배지에서 26℃에서 하룻밤동안 생육시켰다. 하룻밤동안 생육시킨 배양물을 하룻밤동안 생육시킬 때와 동일한 배지에서 희석시키고 초기 대수증식기까지 생육시켰다. #66 적색 필터가 끼워진 클렛-서머슨(Klett-Summeson) 색도계로 배양물의 혼탁도를 측정하였다. 세포 배양물 50μL에 존재하는 발광을 26℃에서 다이나테크 ML3000 광도계에서 정량하였다. 데이터는 하기 표 XIV에 기재되어 있다.
[표 XV]
따라서, 플라스미드 pLacLux를 함유하는 세포는 LB 배지에 존재하는 최적량 미만의 탄소원에서 생육시키는 경우 발광량을 증가시킨다.
[실시예 22]
fabA 형질전환된 숙주세포의 제작 및 지방산 고갈에 대한 이 숙주세포의 반응
fabA 유전자는 지방산, 따라서 이. 콜라이 막의 이중결합의 배치를 담당하는 효소를 코딩하고 있다. 이러한 이중결합은 생육의 절대적인 조건이다. fabA 의 합성은 2가지 프로모터 인자에 관련되어 있다:
낮은 수준의 구조적 상부 프로모터 및 유도성 하부 프로모터. fabA를 둘러싸는 서열에서 두 프로모터의 위치가 결정되었다. 표 IV에 기재된 PCR 프라미어는 구조적 상부 프로모터 없이 유도성 하부 프로모터를 클로닝하도록 고안되어 있다. 하부 프로모터의 전사는 일정 RNA 수준에서 10배 이상으로 조작될 수 있다.[헨리(Henry) 등, J, Mol. Biol. 222:843-849(1991)]. fabA-lac 융합체에서 연구된 이중 fabA 프로모터의 조절은 β-갈락토시다제비활성의 수준에서 13배로 조작되었다[헨리등, Cell, 70: 671-679(1992)]. fabA 발현의 조절은 fadR 유전자 생성물에 의해 매개된다[넌(Nunn)등, J, Bacteriol, 154:554-560(1983)]. FadR 단백질은 제어된 하부 fabA 프로모터의 -40 영역에 결합함으로써 fabA 전사를 자극한다. 막 합성능이 과다한 경우에는, 장쇄 아실-CoA 분자가 축적된다. 이들 분자는 FadR 단백질에 결합되어 제어된 fabA 프로모터로부터 이것을 분리시킨다[헨리 등, Cell, 70: 671-679(1992)]. 따라서, fabA-lux 융합체는 막 합성 상태의 감시자로서 작용할 것으로 기대된다. 지방산 고갈 조건하에서, 장쇄 아실-CoA 축적물은 적을 것이고, fabA-lux의 발현은 높아야 하며; 과량의 지방산은 장쇄 아실-CoA를 다량 축적하게 하여 융합체로부터 lux 발현 수준을 낮추어야 한다.
이 융합체는 지방산 합성 저해 뿐만 아니라 CoA 이용효율도 감시하여야 하며, 이소류신-발린 합성 효소 아세토락테이트 신타제의 저해를 포함하는 다수의 인자에 의해 제한될 수 있다.[라로싸 등, Biosynthesis of Branched Chain Amino Acids, pp. 108-121, 바락(Barak) 편집, Chipman and Schloss, VCH Publishers, Net York. 1990]. fabA: lux 융합체를 함유하는 강력한 검출 생물체에서 지방산 고갈의 스트레스를 만들어내는 방법은 생육 배지에 3-데세노일-N-아세틸시스테아민을 혼입 시킴으로써 지방산 탈포화를 저해하거나[ 넌 등, (1983), J. Bacteriol, 154:554-560], 또는 설포메튜론 메틸 같은 제초제[반 다이크 등, Mol Gen Genet(1987) 207:435-440] 또는 아미노산 발린[라로싸 등, (1987)J. Bacteriol, 169:1372-1378]의 작용에 의해 세포내 CoA를 프로피오닐-CoA로써 소거하는 것을 포함한다.
fabALux의 제작 및 REM443의 형질 전환
fabA: lux 유전자 융합체를 함유하는 형질전환 플라스미드는 필수적으로 pRY001 및 pRY002의 제조에 대해 실시예 3에서 설명한 바와 같은 방법 및 물질을 사용하여 제작한다. 표 IV에 나열된 프라이머를 사용하여 fabA 프로모터를 PCR 증폭시킨다. fabA 유전자의 서열은 공지되어 있으며, 핵산 서열의 진뱅크 데이터베이스로부터 용이하게 입수할 수 있다. fabA: :lux 융합체를 함유하는 플라스미드를 pfabALux로 일컫는다.
실시예 3에서 WM1021 및 WM1202의 제작에 대해 기재한 물질 및 방법을 사용하여 pFabALux로 이.콜라이 숙주 RFM443을 형질전환 시킨다.
pFabALux로 형질전환된 이. 콜라이 숙주 RFM443을 , 카나마이신(10μg/mL)을 함유하는 최도 E 배지에서 29℃에서 하룻밤동안 생육시킨다. 하룻밤 생육시킨 배양물을 이 배양물과 동일한 배치 중에서 희석시키고 초기 대수증식기까지 생육시킨다. . #66 적색 필터가 끼워진 클렛-서머슨 색도계를 사용하여 배양물 혼탁도를 측정한다. 설포메튜론 메틸 50μg/mL의 존재 또는 부재하에 세포 배양물 50μL에 존재하는 발광을 26℃에서 다이나테크 ML3000광도계에서 정량한다. 설포네튜론 메틸의 존재하에서의 배양물은 설포메튜론 메틸 부재하에서의 대조용과 비교할 때 10 내지 25배의 발광량 증가를 나타낸다.
따라서, 플라스미드 pFabALux를 함유하는 세포는 지방산 합성 저해 조건 하에서 생육될 때 생체발광량을 증가시킬 것으로 예측된다.
[실시예 23]
물리적 공격에 대한 반응
recA: :lux, uvrA: lux, grpE: :lux, danK: :lux, katG: :lux, micF: :lux 및 uspA: :lux 융합체를 자외선 조사에 노출시켰다. grpE: :lux를 제외한 모두가 생체발광량을 증가시킴으로써 이 물리적 공격에 반응하였다. 26℃에서 카아마이신 설페이트(25μg/mL)로 보충된 LB 배지에서 흔들면서 하룻밤 동안 균주를 생육시켰다. LB 배지 중으로 20배 희석시킨 후, 20 내지 40클렛 단위의 밀도에 도달할 때까지 배양물을 26℃에서 계속 흔들었다. 스트라타링커(Stratalinker) 1800 장치(스타라타진)로 254nm에서 조사하기 전에 배양물(50μl) 및 새로운 LB 배치(50μl)를 미소적정판의 웰에 첨가하였다. 이어, 26℃에서 다이나테크 ML3000 광도계에서 조사 후 시간의 함수로서 발광량을 정량하였다. 배양한지 240분 후 반응비를 계산하였다. 이들을 하기 표 XVI에 기재한다:
[표 XVI]
시험된 구조물 중 하나를 제외한 모두가 화학적 스트레스 뿐만 아니라 물리적 스트레스에도 반응함이 명백하다.
[서열 목록]
(1) 일반정보:
(i) 출원인 :
(A) 성명: 이. 아이. 듀퐁 드 네모아 앤드 캄파니
(B) 거리 : 마켓트 스트리트 1007
(C) 도시 : 윌밍톤
(D) 주 : 델라웨어
(E) 국가 : 미합중국
(F) 우편번호 : (ZIP): 19898
(G) 전화번호 : 302-892-4929
(H) 팩스번호 : 302-892-7949
(ii) 발명의 명칭 : 환경 손상인자의 고감도 검출법
(iii) 서열 수 : 24
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 형태 : 3.5인 디스켓, 1.0MB
(B) 컴퓨터 : 매킨토시
(C) 작동 시스템 : 매킨토시 시스템 6.0
(D) 소프트웨어 : 패턴트인 릴리스(PatentIn Release)#1.0, 버전 #1.25(EPO)
(v) 본 출원 데이터 :
(A) 출원 번호 : CR-9279-B
(vi) 선출원 데이터 :
(A) 출원번호 : US 08/063,173호
(B) 출원일 : 1993년 5월 14일
(2) 서열 특징 :
(A) 길이 : 27 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 1 : GTTAGCGGAT CCAAAAGCAC AAAAAAT
(2) 서열 식별 번호 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 28염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 ; DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 2 : AGCGTGAAT TCCATCTAAA CGTCTCCA
(2) 서열 식별 번호 3에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 3 : ACTTAAGGAT CCAAGCGATG GCGCGTAAA
(2) 서열 식별 번호 4에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 4 : AGCAGCGAAT TCATCGCCGC TTCCAGACAA
(2) 서열 식별 번호 5에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 5 : ACTTAAGGAT CCAGAGAAGC CTGTCGGCAC
(2) 서열 식별 번호 6에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 28 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 6 : AGCTTTGAAT TCCGCTTCTG TTTGTTTT
(2) 서열 식별 번호 7에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 7 : ACTTTTGGAT CCGTGTAAAC GCGCGATTG
(2) 서열 식별 번호 8에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 8 : AGCAGCGAAT TCTTCCCGGA TTAAACGCTT
(2) 서열 식별 번호 9에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 9 : ACTTAAGGAT CCCGAAATGA GGGCGGGAAA
(2) 서열 식별 번호 10에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 10 : AGCAGCGAAT TCGAACGTTG CTGACCACGA
(2) 서열 식별 번호 11에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 11 : ACTTAAGGAT CCCCCCAAAA ATGCAGAATA
(2) 서열 식별 번호 12에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 31 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 12 : AGCAGCGAAT TCGGGCATCC GGTTGAAATA G
(2) 서열 식별 번호 13에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 13 : ACTTAAGGAT CCGCCATTAC GTTGFCTGAA
(2) 서열 식별 번호 14에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 14 : AGCAGCGAAT TCCCACCCGT TTCGGTCATT
(2) 서열 식별 번호 15에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 29 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 15 : ACTTAAGGAT CCCTCCCGAT ACGCTGCCA
(2) 서열 식별 번호 16에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 32 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 16 : AGCAGCGAAT TCGGCGATGA GAATGTGTTT AT
(2) 서열 식별 번호 17에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 17 : ACTTAAGGAT CCAATTACTG CGCCATTCTG
(2) 서열 식별 번호 18에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 18 : ACATCGGAAT TCTCATAGTC GCTGCCATTT
(2) 서열 식별 번호 19에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 19 : ACTTAAGGAT CCCTAATTGT ACGCATGTCA
(2) 서열 식별 번호 20에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 20 : AGCAGCGAAT TCAAAGTCTC TGTGAATGTT
(2) 서열 식별 번호 21에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 21 : ACTTAAGGAT CCAGATTATC GTCACTGCAA
(2) 서열 식별 번호 22에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 22 : AGCAGCGAAT TCGGCCAATC AGCAAAATAA
(2) 서열 식별 번호 23에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 23 : ACTTTCGGAT CCTTGGTGCA ACATTCACAT
(2) 서열 식별 번호 24에 대한 정보 :
(i) 서열 특징 :
(A) 길이 : 30 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 스트랜드 : 단일
(D) 모양 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA(게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열 식별 번호 : 24 : AGCAGCGAAT TCTCAGCGGA CATCGTCAGT

Claims (18)

  1. (a) 스트레스 유도성 프로모터 서열의 조절하에 발현가능한 lux 유전자 복합체를 함유하도록 유전자 조작된 세균(bacteria)을 환경 손상인자에 노출시키고; (b) 상기 세균의 발광량 변화를 측정하는 것을 포함하는 환경 스트레스를 검출하는 방법.
  2. (a) 스트레스 유도성 프로모터 서열의 조절하에 발현가능한 lux 유전자 복합체를 함유하도록 유전자 조작된 세균을 치사량에 가까운 환경 손상인자에 노출시키고; (b) 상기 세균의 발광량 증가를 측정하는 것을 포함하는 환경 스트레스를 검출하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 발광량 증가를 환경 스트레스의 수준과 상관시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  4. (a) 스트레스 유도성 프로모터 서열의 조절하에 발현가능한 이종 lux 유전자 복합체를 함유하도록 유전자 조작된 세균을 환경 손상인자에 노출시키고; (b) 상기 세균의 발광량 증가를 측정하는 것을 포함하는 세균 집단의 스트레스를 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 환경 손상인자가 아트라진, 벤젠. 황산구리, 2,4-디클로로페녹시 아세트산, 에탄올, 메탄올, 2-니트로페놀, 4- 니트로페놀, 펜타클로로페놀, 페놀, 톨루엔, 디메틸설폭사이드, 질산납, 염화카드뮴, 염화나트륨, 메나디온, 에티디움 브로마이드, 세린 하이드록사메이트, 아세트산염, 프로피온산염, 관산화수소, 퓨로마이신, 염화수은, 2,4-디클로로아날린, 프로판올, 부탄올, 이소프로한올, 메틸렌 클로라이드, 트리톤X100, 아크릴아미드, 메틸 비올로겐, 미토마이신 C, 크실렌 및 자외선 조사로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 대수 증식기에 있는 세균을 환경 손상인자에 노출시키는 방법.
  7. (a) 스트레스 유도성 프로머터 서열; 및 (b) 상기 스트레스 유도성 프로모터 서열의 조절하에 발현 가능한 lux 유전자 복합체를 포함하는, 치사량에 가까운 환경 손상인자에 노출될 때 생물발광량을 증가시킬 수 있는 형질 전환된 생물발광 세균.
  8. 제7항에 있어서, lux 유전자 복합체가 미생물과 이종인 형질전환된 생물발광 세균.
  9. 제7항에 있어서, 소수성 환경 손상인자에 대한 상기 미생물의 세포 외막 투과성을 변화시키는 tolC 변이를 함유하는 세균.
  10. (i) grpE 스트레스 유도성 프로모터 서열의 조절하에 발현가능한 이종 lux 유전자 복합체 및 tolC 변이를 포함하는, ATCC 번호 69314의 TV1076 ; (ii) dnaK 스트레스 유도성 프로모터 서열의 조절하에 발현가능한 이종 lux 유전자 복합체 및 tolC 변이를 포함하는, ATCC 번호 69316의 WM1302; (iii) grpE 스트레스 유도성 프로모터 서열의 조절하에 발현가능한 이종 lux 유전자 복합체를 포함하는, ATCC 번호 69142의 TV1060 ; (iv) grpE 스트레스 유도성 프로모터 서열의 조절하에 발현가능한 이종 lux 유전자 복합체를 포함하는, ATCC 번호 69315의 TV1061 ; (v) dnaK 스트레스 유도성 프로모터 서열의 조절하에 발현가능한 이종 lux 유전자 복합체를 포함하는, ATCC 번호 69141의 WM1021 ; (vi) dnaK 스트레스 유도성 프로모터 서열의 조절하에 발현가능한 이종 lux 유전자 복합체를 포함하는, ATCC 번호 69143의 WM1026 ; 및 (vii) dnaK 스트레스 유도성 프로모터 서열의 조절하에 발현가능한 이종 lux 유전자 복합
    체를 포함하는, ATCC 번호 69313의 WM 1202 로 이루어진 군으로부터 선택된 이. 콜라이(E. coli).
  11. (a) 스트레스 유도성 프로모터 서열; 및 (b) 상기 프로모터 서열의 조절하에 발현가능한 세균 lux 유전자 복합체를 포함하는 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서, 스트레스 유도성 프로모터 서열이 groE, dnaK. grpE, phoA, glnA, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP, uspA, katG, uvrA, frdA, micF, fabA, lac, his, sodA, sodB, soi-28, recA, xthA 및 narG로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산분자.
  13. 제11항에 있어서, 발현가능한 lux 유전자 복합체가 luxA 및 luxB를 포함하는 핵산 분자.
  14. 제2항에 있어서, 환경 손상 인자가 (i) rpoH 또는 그의 유전자 생성물의 작용을 변화시키는 단백질 손상, (ii) oxyR 또는 그의 유전자 생성물의 작용을 변화시키는 산화손상, (iii) SoxRS 또는 이들 각각의 유전자 생성물의 작용을 변화시키는 산화 손상, (iv) fadR 또는 그의 유전자 생성물의 작용을 변화시키는 막 손상, (v) relA 및 spoT 또는 이들 각각의 유전자 생성물의 작용을 변화시키는 아미노산 고갈, (vi) cya및 crp 또는 이들 각각의 유전자 생성물의 작용을 변화시키는 탄소 고갈, (vii) phoB, phoM, phoR 및 phoU 또는 이들 각각의 유전자 생성물의 작용을 변화시키는 인산염 고갈, (viii) glnB, glnD, glnG 및 glnL 또는 이들 각각의 유전자 생성물의 작용을 변화시키는 질소 고갈, (ix) 조절 인자의 작용을 변화시키는 포괄적인 스트레스 반응; (x) rpoS 또는 그의 유전자 생성물의 작용을 변화시키는 정지기 반응 ; 또는 (xi) lexA 또는 recA 또는 이들 각각의 유전자 생성물의 작용을 변화시키는 DNA 손상을 자극하는 방법.
  15. 제2항에 있어서,발광량 증가를 환경 스트레스의 수준과 상관시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제2항에 있어서, 상기 환경 손상인자가 아트라진, 벤젠. 황산구리, 2,4-디클로로페녹시 아세트산, 에탄올, 메탄올, 2-니트로페놀, 4- 니트로페놀, 펜타클로로페놀, 페놀, 톨루엔, 디메틸설폭사이드, 질산납, 염화카드뮴, 염화나트륨, 메나디온, 에티디움 브로마이드, 세린 하이드록사메이트, 아세트산염, 프로피온산염, 관산화수소, 퓨로마이신, 염화수은, 2,4-디클로로아날린, 프로판올, 부탄올, 이소프로한올, 메틸렌 클로라이드, 트리톤X100, 아크릴아미드, 메틸 비올로겐, 미토마이신 C, 크실렌 및 자외선 조사로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 대수 증식기에 있는 세균을 환경 손상인자에 노출시키는 방법.
  18. 제2항에 있어서, 대수 증식기에 있는 세균을 환경 손상인자에 노출시키는 방법
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