FI95484B - Menetelmä näytteessä olevan metallin määrittämiseksi - Google Patents

Description

j 95484

Menetelmä näytteessä olevan metallin määrittämiseksi

Keksintö koskee biotestiä, jossa nestemäisestä, kaasumaise ,i»tai kiinteästä näyttees-5 tä määritetään kvalitatiivisesti ja/tai kvantitatiivisesti metallipitoisuus geenimanipu-loitujen solujen avulla.

Biotesteiksi kutsutaan yleensä menetelmiä, joissa käytetään apuna eläviä soluja tai organismeja. Useissa kehitetyissä biotesteissä käytetään hyväksi bakteeri- tai hiiva-10 soluja. Mikrobien käyttöön raskasmetallijäämien pikatesteinä on kiinnitetty paljon toiveita ja huomiota. Koska mikrobiologiset menetelmät käyttävät hyväkseen bakteereja tai bakteerien itiöitä, on testibakteerin herkkyys raskasmetallille ratkaisevan tärkeä näissä menetelmissä. Tähän asti on ollut tarpeen tehdä kompromisseja sopivien testimikrobien valinnoissa, koska esimerkiksi suuri raskasmetalliherkkyys ja 15 muut testimikrobilta vaadittavat ominaisuudet eivät välttämättä ole olleet saman bakteerikannan ominaisuuksia.

Mikrobien käyttöä raskasmetallijäämien testauksessa rajoittaa ennen kaikkea menetelmien hitaus ja epäherkkyys. Koska menetelmissä tavalla toisella aina kontrol-20 loidaan testimikrobien kasvua, ei testiä voida kuvitellakaan saatavan suoritetuksi alle tunnin. Tämä johtuu siitä, että mikrobien kasvu nopeimmillaankin on hidas tapahtuma. Lisäksi useissa testeissä mikrobit ovat kylmäkuivattuina tai itiöinä, mikä entisestäänkin hidastaa testien suoritusta. Tämänhetkisillä mikrobiologisilla raskasme-tallitesteillä ei voida määrittää yksittäisiä raskasmetalleja tai niiden ryhmiä, vaan ^ 25 kaikki toksiset raskasmetallit, joille ko. mikrobi on herkkä.

Bioluminesenssiin eli valonmuodostumisen mittaukseen perustuvia raskasmetalli-jäämien määritysmenetelmiä on myös kehitetty. Merissä elää planktonisina populaatioina tai symbioosissa kalojen kanssa useita eri bakteerikantoja, jotka tuottavat 30 valoa aineenvaihduntansa sivutuotteena. Valontuotosta vastaa lusiferaasi-niminen • : entsyymi, jonka katalyysin kemiallinen reaktio on seuraavanlainen: FMNH2 + RCHO + 02 -> FMN + RCOOH + H20 + valo, 35 jossa pelkistynyt flaviinimononukleotidi reagoi pitkäketjuisen aldehydin ja hapen kanssa muodostaen vastaavia hapettuneita tuotteita ja valoa aallonpituudella 490 nm. Bakteerilusiferaasin optimilämpötila on yleensä noin 25°C ja se inaktivoituu hyvin nopeasti fysiologisessa lämpötilassa 37°C.

2 95484

Kaupallisestikin saatavilla oleva Photobacterium fischeri -bakteereita hyväksi käyttävä menetelmä (kauppanimi Microtox^M) mittaa ympäristön yleistoksisuutta (Bulich ja Greene, 1979, International Symposium on Analytical Applications of 5 Bioluminescence and Chemiluminescence. State Printing and Publishing, Westlake Village, CA, pp. 193-211). Määrityksessä ko. bakteerisolut ovat kylmäkuivattuja ja niillä voidaan rehydraation jälkeen mitata muun muuassa raskasmetallijäämiä yleensä mikromolaarisella herkkyystasolla seuraamalla yksinkertaisesti valon intensiteetin muutoksia, jotka korreloivat ympäristön toksisuuden kanssa. Tutkittavaa näytettä ja 10 bakteereja inkuboidaan yhdessä ja toksisten aineiden mukanaolo todetaan bakteerien alentuneesta valontuottotasosta verrattuna kontrollinäytteeseen. Menetelmällä on useita heikkouksia, joista ehkä pahin on valon tuoton jatkuva ja nopea lasku, joka kompensoidaan testissä laiteteknisellä ratkaisulla. Tästä on seurauksena erittäin kallis laitteisto. Menetelmä vaatii myös korkean suolapitoisuuden läsnäolon (3 %), 15 minkä on osoitettu vähentävän joidenkin aineiden toksista vaikutusta. Menetelmä on myös epäspesifinen ja se reagoi usealle raskasmetallille ja muulle ympäristömyrkylle samalla tavoin.

Valontuotto-ominaisuuksista vastaavat geenikoneistot voidaan nykyaikaista geenin-20 siirtoteknologiaa hyväksi käyttäen siirtää myös muihin organismeihin ja näin saadaan ennestään pimeä solu tuottamaan valoa kuten alkuperäinen bioluminesoiva bakteerisolu (Belas et ai., Science, 218. 791-793). Näissä menetelmissä käytetään hyväksi valaisevista P. fischeristaja. Vibrio harveyisfa eristettyjä lusiferaasigeenejä, jotka on siirretty Escherichia coli- laboratoriokantoihin. Erikoistapauksena voidaan . - 25 mainita ainoasta maan pinnalla elävästä bioluminesoivasta bakteerista, Xenorhabdus « luminescensistä, eristetyt lusiferaasigeenit (Frackman et ai, 1990, J. Bacteriol., 172. 5767-5773), joiden koodittama proteiini on myös lämmönkestävä. Tällaisia uusia valoa tuottavia soluja voidaan myös käyttää ympäristömyrkkyjen pitoisuuksien mittaamiseen (Karp ja Korpela, Fl-patentti 88309) ja useimmiten nämä menetelmät 30 ovat moninkertaisesti tehokkaampia kuin MicrotoxTM_menete]niä. Myös muut or-v ganismit, pro- tai eukaryoottiset solut voidaan valjastaa toksiinien toteamiseen. Esi merkiksi gram-positiivinen Bacillus subtilis -bakteeri voidaan transformoida valon-tuotto-ominaisuusgeeneillä (Karp, 1989, Biochem. Biophys. Acta, 1007, 84-90) ja käyttää esimerkiksi bakteerisolulle toksisen antibiootin tai raskasmetallin läsnäolon 35 ja pitoisuuden mittaamiseen (Karp ja Korpela, Fl-patentti 88309, US-patenttiha-kemus 768 741). Esimerkkinä eukaryoottisen solun kyvystä tuottaa valoa bakteeri-lusiferaasigeenien avulla voidaan mainita vuonna 1989 julkaistu tutkimus (Boylan et ai, 1989, J. Biol. Chem., 264, 1915-1918).

3 95484

Lusiferaasigeenit voidaan myös asettaa raskasmetalleille respontoituvien geneettisten säätelyelementtien kontrollin alaiseksi, jolloin raskasmetallin läsnäollessa ko. säätelyelementti aktivoi lusiferaasiproteiinin synteesin. Raskasmetallin vaikutukses-5 ta edellä mainitut bakteerit alkavat tuottaa valoa, jonka määrä on suoraan verrannollinen läsnäolevan raskasmetallin määrään. Tämän menetelmän teoreettinen perusta on luonnosta löytyvien raskasmetalleille vastustuskykyisten bakteerien kehittämät geneettiset systeemit, jotka muuttavat tai poistavat tehokkaasti raskasmetalleja niin, että bakteeri pystyy selviytymään suurissa raskasmetallien pitoisuuksissa. Usein 10 tällaiset elementit sijaitsevat bakteerien kromosomin ulkopuolisissa geneettisissä elementeissä eli ns. plasmideissa, joita on löydettävissä muun muuassa Staphylococcus aureus- (Novick ja Roth, 1968, J. Bacteriol., 95, 1335-1342) tai Alcaligenes eutrophus -bakteereista (Mergeay et ai., 1985, J. Bacteriol., 162. 328-334). Näissä systeemeissä useinkin tuntematon repressori eli estäjä muuttaa konformaatiotaan 15 sille spesifisen raskasmetallin läsnäollessa, jolloin metallia muuttavan tai poistavan proteiinin synteesi pääsee käynnistymään. Tällainen säätelyelementti voidaan siirtää geeniteknologisin keinoin kontrolloimaan jonkin vieraan geenin ilmentymistä, kuten esimerkiksi paljon ns. reportterigeeninä käytetyn E. coli -bakteerin /acZ-geenin eteen (Livrelli et ai, 1993, J. Biol. Chem., 268. 2623-2631). Muita paljon käytettyjä 20 reportterigeenejä ovat cat (kloramfenikoliasetyylitransferaasi), β-gluc (β-glukuroni-daasi) ja AFOS (alkalinen fosfataasi). Kyseisiä säätelyelementtejä on myös siirretty ohjaamaan bakteerilusiferaasin tuoton säätelyä bakteerisoluissa. Esimerkiksi eräistä transposoneista on siirretty elohopealle respontoituvat geneettiset säätelyelementit ns. mer-operonista ohjaamaan V. harveyin lusiferaasin synteesiä (Condee ja , 25 Summers, 1992, J. Bacteriol., 174. 8094-8101). Säätelyelementtien hyvänä puolena voidaan mainita niiden tarkkä säätely, mikä aiheuttaa hyvän spesifisyyden ja lähes taustattoman toiminnan. Ko. säätelyelementti on niin sanotusti suljettuna, kun elohopeaa ei ole läsnä. Menetelmä on myös yksinkertainen suorittaa ja se voidaan tehdä jopa kenttäolosuhteissa. Huonona puolena ko. julkaisussa kuvatulla menetelmällä 30 tutkia elohopealle spesifisiä elementtejä voitaisiin mainita lämpöherkän ja tehottoman lusiferaasin käyttö, mikä nähdään myös suhteellisen huonosta detektioherkkyy-destä, joka tässä tutkimuksessa oli Hg2+:lle 10 nM. Lähes kaikki bakteerilusiferaasit ovat suhteellisen lämpöherkkiä ja 37°C:ssa ne inaktivoituvat nopeasti, mistä on seurauksena menetelmän herkkyyden väheneminen. Bakteerilusiferaasit ovat myös te-35 hottomia siinä mielessä, että niiden ns. kvanttitehokkuus on hyvin alhainen. Tällä tarkoitetaan sitä, että kemiallisesta energiasta bakteerilusiferaasin katalysoimassa reaktiossa saadaan näkymään vain 5-10 % laskettuna teoreettisesta maksimista (100%).

I:' 4 95484

Toisena esimerkkinä voidaan mainita arseenin ja kadmiumin toteamismenetelmä, jossa kyseisille metalleille respontoituva operoni asetettiin säätelemään V. harveym lusiferaasigeenejä. Kyseinen plasmidirakennelma pystyi toimimaan sekä E. colissa 5 että S. aureusissa mahdollistaen metallien vaikutuksen seuraamisen valon muodostuksen avulla kahdessa eri organismissa (Corbisier et ai, 1993, FEMS Microbiol.

Lett., 110. 231-238). Menetelmän herkkyys kadmiumille oli 0,5 μΜ ja arseniitti-ionille 0,1 μΜ. Eri raskasmetallit vaikuttavat tässä testissä eri nopeuksilla johtuen tekijöiden vaikutusmekanismien vaihtelevuudesta ja käytettävästä raskasmetalliele-10 mentistä. Tämän menetelmän heikkoudet ovat samat kuin ylhäällä on kuvattu eloho-peamääritykselle. Testeissä käytettävien bakteerien täytyy pystyä mittaamaan jopa pikomolaarisia raskasmetallipitoisuuksia tutkittavasta yhdisteestä riippuen.

Edellä mainituista syistä johtuen kuvattua bioluminesenssiin perustuvia kloonattuja 15 bakteeriperäisen lusiferaasigeenin sisältäviä kantoja hyväksi käyttävää raskasmetallien määritysmenetelmää ei voida helposti soveltaa luonnon vesien mittaamiseen.

Myös seerumi ja virtsa saattavat olla ongelmallisia määrityskohteita.

Huomattavaa on, että raskasmetallien orgaanisille yhdisteille respontoituvia ele-20 menttejä löytyy luonnosta useita ja muutamia niistä on myös eristetty ja emäsjärjes tys määritetty (ks. taulukko I).

Huomattavaa on myös, että useinkaan käytettävät bakteerit eivät myöskään kykene tuottamaan kullekin raskasmetallille spesifistä kuljetuskoneissa, jolloin kyseinen 25 bakteeri ei ole herkkä biosensorisovellutuksiin. Tämä seikka tekee määrityksestä ongelmallisen, mutta se voidaan poistaa siirtämällä kyseisen metallin kuljetuskoneista biosensorina käytettävään soluun geeniteknologisin keinoin.

t 95484 5

Taulukko I: Joitakin raskasmetallirespontoituvia säätelyelementtejä ja niiden kirjallisuusviitteet.

Raskasmetalli lyhenne eristetty mistä emäsjärjestys viite_

Hg”1-1" merR Tn27 + NiBhriain et ai.

Hg4-1" merR Ύη501 + Misra et ai.

Hg4-*· merR pDU1358 + Griffin et ai.

arseniitti arsR E. coli + Wu ja Rosen

Cu++ pcoR E. coli + Rouch kromaatti chrB A. eutrophus - Nies et ai.

kadmium czcR A. eutrophus + Nies hopea - P. stuzeri - Haefeli et ai.

5 Viitteet: • Griffin, H.G., Foster, T.J., Silver, S. ja Misra, T.K. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84, 3112-3116.

• NiBhriain, N., Silver, S. ja Foster, T.J. (1983) J. Bacteriol., 155. 690- 10 703.

• Misra, T.K., Brown, N.L., Fritzinger, D., Pridmore, R., Barnes, W. ja Silver, S. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei USA, 84, 5975-5979.

• Wu, J.H. ja Rosen, B.P. (1991) Mol. Microbiol., 5, 1331-1336.

• Rouch, D.A. (1986) Plasmid-mediated copper resistance, in E. coli.

15 Ph.D. Thesis, The University of Melbourne.

• Nies, A., Nies, D.H. ja Silver, S. (1990) J. Biol. Chem., 265. 5648-5653.

• Haefeli, C., C. Franklin ja K. Hardy (1984) J. Bacteriol. 158. 389-392 • Nies, D. H. (1992) J. Bacteriol. 174, 8102-8110 20 • : Bakteerilusiferaasien ohella tunnetaan useita eukaryoottisia entsyymejä, jotka voivat tuottaa valoa katalyysissä. Tunnetuin näistä on tulikärpäslusiferaasi, joka voi olla peräisin useasta eri lajista, kuten esimerkiksi Photinus pyralisisXzl, Luciola minen-grelicastä, Luciola cruciatasta jne. Tämän lisäksi samanlaista kemiaa käyttäviä lusi-25 feraaseja on eristetty kovakuoriaisista, kuten Pyrophorus plagiophthalamusista, ja kiiltomadosta, Lampyris noctilucasta. (Campbell, Chemiluminescence, 1988, Ellis 95484 6

Horwood Ltd, Chichester). Tulikärpäslusiferaasin kvanttitehokkuus on hyvin suun, yli 80 %. Hyönteislusiferaasin katalysoima reaktio on seuraavanlainen: ATP + D-lusiferiini + O2 —> AMP + oksilusiferiini + H2O + PPi + valo, 5 jossa adenosiinitrifosfaatti reagoi D-lusiferiini-nimisen aineen ja hapen kanssa, jolloin syntyy vastaavia hapettumistuotteita, epäorgaanista pyrofosfaattia ja valoa. Muodostuvan valon aallonpituus on yleensä välillä 540 - 620 nm, kun se bakteeri-lusiferaasin tapauksessa on 470 - 520 nm. Useimmat näitä lusiferaaseja koodittavista 10 geeneistä on kloonattu ja sekvensoitu sekä ilmennetty pro- ja eukaryoottisissa organismeissa (Lampinen et ai, 1992, Mol. Gen. Genet., 232. 498-504; Karp et ai, 1992, Bio/Technology, 10, 565-569; DeWet et ai, 1987, Mol. Cell. Biol., 7, 725-737). Valontuotto, in vivo, voidaan saada aikaan lisäämällä D-lusiferiinia solun ulkopuolelta, ja mikäli halutaan bioluminesenssin olevan lähes verrannollinen solun 15 sisäiseen lusiferaasipitoisuuteen, lasketaan solun ulkoinen pH lähelle pH-arvoa 5,0, jolloin D-lusiferiini protonoituu ja kulkeutuu solukalvon läpi huomattavan helposti. Mainitut seikat tekevät näistä lusiferaaseista hyvin käyttökelpoisen työvälineen erilaisiksi reportterimolekyyleiksi. Voidaan ajatella, että toista aallonpituutta tuottava lusiferaasi toimii solun yleiskunnon indikaattorina ja toista aallonpituutta tuottava 20 lusiferaasi kertoo spesifisesti tietystä tapahtumasta solussa tai sen ulkoisessa tilassa. Tällainen koejärjestely on helposti organisoitavissa laiteteknisin ratkaisuin.

Muita eukaryoottisia lusiferaaseja ovat esimerkiksi aequoriinit, joita tuottaa Aequo-rea victoria -niminen meduusa. Aequoriini tuottaa valoa reagoidessaan Ca2+-ionien ... 25 kanssa ja sen kvanttitehokkuus on myös erittäin korkea. Katkaravun, Vargula hilgendorfiin, lusiferaasi on myös kloonattu ja sekvensoitu, sekä ilmennetty eukary-oottisoluissa (Thompson et ai, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86, 6567-6571). Edellä mainittujen lisäksi eräät kalat ja muut meressä elävät oliot voivat tuottaa suurella kvanttitehokkuudella valoa (lisätietoa saa Campbellin mainiosta kiijasta, 30 Chemiluminescence). Tulikärpäslusiferaasia on käytetty erittäin herkkänä ATP-mää-rän mittarina, joka pystyy mittaamaan jopa 10“14 -molaarisia pitoisuuksia. Sovellu-: ‘ tuksena tästä on herkkä kontaminoivien bakteerimäärien mittaus esim. elintarvikkeista, sillä ATP:n pitoisuus on elävässä solussa lähes vakio.

35 Tarve raskasmetallien, toksiinien ja elintarvikkeiden lisäaineiden määrittämiseksi nopeasti ja yksinkertaisesti on suuri. Tällä hetkellä määritykset täytyy tehdä useimmiten keskitetysti sumissa laboratorioissa, koska laitteistot (esim. atomiabsorptio-spektrofotometri) ovat erittäin kalliita ja vaativat käyttäjiltään erityiskoulutusta.

il iiLik »lii n 1 ai 95484 7

Nopeat, kvalitatiiviset ja myös kvantitatiiviset testit voisivat olla paikan päällä tehtyinä myös merkittävä seula jatkotutkimuksia vaativille näytteille. Tällöin laboratorioiden kuormitus vähentyisi ja ongelmanäytteiden määrittäminen nopeutuisi. Monet näytteet myös kärsivät viiveestä näytteenoton ja analyysin välillä. Raskasmetallien 5 määrityksiä tehdään erilaisista luonnon, teollisuuden prosessi- ja saastuneista vesistä, ruumiin nesteistä, kuten virtsasta, verestä ja seerumista, syljestä sekä hiuksista, elintarvikkeista, esimerkiksi purkitetusta lihasta, kalasta sekä raaka-aineista.

Geeniteknologia on tehnyt mahdolliseksi bakteerien ja hiivojen käytön tuotto-orga-10 nismeina sellaisillekin valkuaisaineille, joita nämä mikrobit eivät normaalisti tuota. Näihin tarkoituksiin on valmistettu erilaisia yhdistelmä-DNA-plasmideja, jotka ovat kromosomin ulkopuolisia ja tätä paljon lyhyempiä rengasmaisia DNA-molekyylejä.

Yhdistelmä-DNA-plasmideja, joissa vieraan, rekombinanttiproteiinin tuotto on ase-15 tettu voimakkaan promoottorin kontrollin alaiseksi, on viime vuosina kehitetty erittäin paljon. Kaikissa tapauksissa pyrkimyksenä on ollut saada aikaan mahdollisimman suuri vieraan proteiinin tuotto uusissa tuottajaorganismeissa kuten E. co//ssa. Näissä tapauksissa haluttua proteiinia voidaan tuottaa jopa 25 % bakteerin koko proteiinimäärästä (Caulcott & Rhodes, 1986, Trends in Biotech., June, 142-146).

20 Tuotettaessa näin suuria määriä vierasta proteiinia on hyvinkin todennäköistä, että tämä tuotto on haitallista bakteerille ja sen aineenvaihdunnalle. Haitallisuuden kannalta onkin kehitetty plasmideja, joissa vieraan proteiinin tuotto on asetettu säädeltävissä olevan promoottorin kontrollin alaiseksi. Tällöin proteiinin tuotto voidaan kytkeä päälle halutussa mikrobin kasvuvaiheessa. Näissä tapauksissa kasvatus suori-... 25 tetaan mikrobia stressaamattomissa olosuhteissa riittävän kauan, jolloin mikrobikas-vusto ehtii saavuttamaan sopivan solutiheyden. Tämän jälkeen kytketään päälle halutun proteiinin tuotto esimerkiksi lisäämällä kasvuliemeen kemiallinen kytkentämo-lekyyli tai suoritetaan kytkentä fysikaalisin keinoin kuten lämpötilan kohottamisella.

30 Plasmidien kopioluku on useinkin hyvin erilainen vaihdellen yhdestä useaan sataan, jopa tuhanteen. Yleisimmin käytetyn plasmidin pBR322 kopioluku on noin 60, kun ' ’ taas sen johdannaisen pUC8:n kopioluku on noin 500. Näin suuren kopioluvun muutoksen kahden sukulaisplasmidin välillä on osoitettu johtuvan yhden emäksen muutoksesta plasmidin ns. ori-alueella (Chambers et ai, 1988, GENE, 68, 139-35 149). Vaikuttamalla plasmidin replikaation aloitukseen asettamalla tämä ori-alue voimakkaan ja säädeltävissä olevan promoottorin kontrollin alaiseksi voidaan keinotekoisesti kasvattaa plasmidin kopiolukua halutulla tavalla sopivasti valittuna ajankohtana. Tällä hetkellä tunnetaan useita plasmideja, joiden kopiolukua voidaan 95484 8 muuttaa mikrobien kasvun kuluessa. Näitä plasmideja käytetään lähinnä teollisissa prosesseissa tuottamaan vieraita rekombinantdproteiineja huomattavia määriä. Näin ollen tähänastinen käyttö ei sulje pois tässä keksinnössä kuvattuja menetelmiä käyttää kopioluvun muutosta erilaisten soluun vaikuttavien tekijöiden, kuten raskasme-5 tallien läsnäolon ja pitoisuuksien mittaamiseksi. Tässä keksinnössä käytetään esimerkkinä erästä runaway-plasmidia, jossa kopioluvun muutos on mahdollinen.

Eniten tutkittuja ja käytettyjä plasmideja vieraiden proteiinien tuottamiseksi ovat ns. pOU-saijan plasmidit, joissa plasmidin replikaation aloituskohtaa säätelevät tekijät 10 on asetettu voimakkaan ja säädeltävän lambda-faagin pR-promoottorin kontrollin alaiseksi (Larsen et ai, 1984, GENE, 28, 45-54). Lambda-pR-promoottoria säätelee repressoriproteiini cl857, joka on tuhottavissa 42°C:n lämpökäsittelyllä. Represso-riproteiinin tuotto voi tapahtua lysogeenisesta faagista, faagista, joka on konjugoitu isäntäorganismin kromosomiin, plasmidista, johon ko. proteiinia koodittava sek-15 venssi on siirretty tai eri inkombatibiliteettiluokkaan kuuluvasta toisesta plasmidista. Inkombatibiliteettiluokilla tarkoitetaan tässä tapauksessa tapausta, jossa toisen plasmidin läsnäolo samassa solussa ei häiritse toisen, erilaisen plasmidin toimintaa ja jakautumista tytärsoluihin solunjakautumisen yhteydessä. Kun säätelyproteiini on tuhottu, pR-promoottori kytkeytyy päälle ja alkaa tuottaa kontrolloimattomasti mata-20 lan kopioluvun Rl-plasmidista peräisin olevia copB- ja repA-proteiineja sekä näiden ja copA-geenejä vastaavia transkriptiotuotteita. Nämä tekijät ja erityisesti voimakas repA-proteiinin ylituottaminen aikaansaavat lisääntyneen ja jopa kontrolloimattoman pOU-pohjaisen plasmidin tuoton E. coli -bakteereissa.

... 25 Esillä olevassa keksinnössä kuvataan menetelmä, jossa lambda-faagin säätely systeemi on korvattu raskasmetallisäätely-yksiköllä, niistä on seurauksena plasmidin kopioluvun riippuvuus läsnäolevan raskasmetallin määrästä, mikä edelleen johtaa raskasmetallin vaikutuksen amplifioitumiseen jopa tuhatkertaisesti ja siten myös markkeriproteiinin amplifioitumiseen ja ultraherkkään raskasmetallimääritykseen.

30

Hiivoilla on erotettu neljä erilaista rekombinantti-DNA-vektorityyppiä: integroituvat • · ’ ‘ plasmidit (Ylp), episomaaliset plasmidit (YEp), replikoituvat plasmidit (YRp) ja keinotekoiset kromosomit. Hiivan integroituvat plasmidit sisältävät bakteeriperäistä DNA:ta ja hiivan geenin osan. Tämä plasmidityyppi sitoutuu tarkasti tiettyyn koh-35 taan hiivasolun kromosomaalisessa DNA:ssa. Replikoituvat hiivan plasmidit sisältävät DNA:ta bakteereista, hiivan geenin osan ja erityisen alueen hiivan kromosomaa-lisesta DNAista, joka sisältää ko. plasmidin replikoitumisen aloituskohdan. Tämä replikoitumista ohjaava alue sallii plasmidin jakautumisen k'omosomin ulkopuoli- 95484 9 sena DNA-molekyylinä hiivasolussa. Hiivan episomaaliset plasmidit sisältävät bakteeriperäisen DNA-jakson, hiivasolun geenin ja kokonaisen tai osan hiivan nk. 2 mikronin plasmidia (Hollenberg, 1982, Current Topics in Microbiology and Immunology, 96, 119-144).

5

Korkeampien eukaryoottisolujen käyttäminen yhdistelmä-DNA-vektorien isäntä-soluina haluttaessa tuottaa proteiineja on nopeasti kehittyvä alue. Yleinen periaate kehitettäessä ekspressiosysteemejä on se, että niillä voitaisiin tuottaa haluttuja euka-ryoottiproteiineja suuressa mittakaavassa. Optimaalisella ekspressiosysteemillä olisi 10 mahdollista tuottaa proteiineja useissa eri solutyypeissä. Täysin säädeltävissä oleva proteiinien ekspressiosysteemi olisi ihanteellinen useisiin eri tapauksiin.

Eukaryoottisoluissa geenien ekspressiota on mahdollista säädellä muun muassa seu-raavilla tavoilla: Simian virus 40 (SV40) T-antigeenin, metaliotioneiini-geenien, 15 heat-shock-geenien, glukokortikoidisten hormonien, DNA:n nietylaation ja anti-sense RNA:n avulla. SV40:n tuottama antigeeni säätelee omaa transkriptiotaan. T-antigeenia tuotetaan runsaasti välittömästi viruksen infektoitua kohdesolunsa ja myöhemmin T-antigeeni sitoutuu omaan promoottorialueeseensa ja estää transkription. Käytettäessä SV40-vektoreita kloonauksiin tämä T-antigeenin välittämä sääte-20 lyfunktio voidaan estää käyttämällä sopivaa lämpöherkkää T-antigeenimutanttia. Tällaiset lämpöherkät T-antigeenimutantit tuottavat normaalisti T-antigeenia korkeissa inkubointilämpötiloissa, kun taas huoneenlämpötilassa T-antigeenin tuotto on estynyt (Rio, D.C., Clark,S.G. & Tjian, R., 1985, Science 227. 23-28).

... 25 Metallotioneiinit ja sideoforit ovat proteiineja, jotka sitovat itseensä raskasmetalleja.

Monet eukaryoottisolut alkavat tuottaa näitä proteiineja raskasmetallien läsnäollessa. Bakteerit tuottavat sideoforeja metalli-ionien sitomiseen solun ulkopuolella. Metallotioneiinien tuotannossa on todettu 50-kertainen kasvu, kun kadmiumia lisättiin solujen kasvatusliuokseen 4x10*6 -molaariseksi pitoisuudeksi (Hamer, D.H. & 30 Walling, MJ., 1982, J. Mol. Appi. Genet., I, 273-288). Edellä mainittua kadmiumin indusoimaa proteiinien tuotantoa on mahdollista vielä lisätä käyttämällä ' * kasvatusliuoksia, joissa on mahdollisimman vähän raskasmetalleja.

Esillä olevassa keksinnössä käytetään hyväksi yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmis-35 tettuja bakteerisoluja, jotka ovat sopivasti valittuja kantoja ja sisältävät tarkoituksen mukaiset yhdistelmä-DNA-vektorikonstruktiot. Keksinnössä käytetään hyönteisistä peräisin olevia lusiferaaseja koodittavia geenejä, joita ohjaavat raskasmetalleille respontoituvat geneettiset elementit. Näitä elementtejä voidaan eristää joko pro- tai 95484 10 eukaryooteista. Hyönteislusiferaasit ovat kestäviä fysiologisissa lämpötiloissa (37°C) ja niiden kvanttitehokkuus on 88 %, jotka tekijät pääasiallisesti vaikuttavat testin toimivuuteen. Tämän lisäksi geneettiset elementit, jotka ohjaavat markkeri-proteiinin synteesiä, sisältävät vain ja ainoastaan minimaalisen määrän geneettistä 5 informaatiota, joka tarvitaan tarkasti säätelemään markkeriproteiinin ilmentymistä.

Tutkittavien yhdisteiden määrittämiseksi voidaan valmistaa erilaiset yhdistelmä-DNA-vektori-konstruktiot riippuen siitä, mikä on määritettävä raskasmetalliyhdiste. Esimerkiksi elohopealle respontoituva elementti voidaan asettaa säätelemään plas-10 midin kopioluvun määrääjä samanaikaisesti plasmidissa olevan hyönteislusiferaasi-geenin toimintaa. Näin menetellen saadaan aikaan valtava monistusefekti, kun elohopeaa on läsnä, ja elohopean määrä voidaan korreloida lusiferaasin aktiivisuusmit-tauksella. Tämänkaltaisessa mittauksessa tulos saadaan parissa tunnissa.

15 Erityisenä pikasovellutuksena lusiferaasigeeni voi sijaita raskasmetallirespontoitu- van elementin kontrollin alaisena plasmidissa, jonka kopioluku on vakioinen. Tällöin määritys nopeutuu ja se saattaa antaa tietoa ympäröivästä raskasmetallikonta-minaatiosta jopa kymmenessä minuutissa. Tällöin menetelmän herkkyys on luonnollisesti rajallinen, mutta se on kuitenkin riittävä esimerkiksi luonnonvesien ras-20 kasmetallikontaminaatioiden mittaamiseksi.

Keksinnön luonne tekee mahdolliseksi hyvin erilaiset mittaustavat. Lusiferaasin mittauksessa on hyvänä puolena valon mittauksen herkkyys verrattuna esimerkiksi spektrofotometrisiin määrityksiin. Yksinkertaisen mustan laatikon, jossa tapahtuu 25 röntgenfilmin valottaminen, käyttö on perusteltua tapauksissa, joissa herkkyys ei ole tärkein kriteeri, vaan menetelmän yksinkertaisuus ja nopeus. Kannettava suhteellisen herkkä luminometri varustettuna valomonistinputkella tai valodiodilla, josta voidaan erikoistapauksena mainita vyöryvalomonistin, on perusteltu niissä tapauksissa, joissa määritys pitää tehdä kenttäolosuhteissa. Mikrotiitterilevyjä lukevaa lu-30 minometria tarvitaan silloin kun näytteiden määrä on erittäin suuri.

Erikoistapauksena voidaan pitää ns. Doctor's Office -laitetta, jota voitaisiin käyttää esimerkiksi hammaslääkärin vastaanotolla mitattaessa amalgaamipaikoista liukenevan elohopean määrää. Menetelmän tärkeimpänä etuna voidaan mainita ei-jakautu-vien solujen käyttö, josta on seurauksena erittäin nopea, jopa εΐιο yhden tunnin 35 määritys.

Keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti viittaamalla kuviin.

95484 11

Kuvassa 1 on esitetty kaaviokuva raskasmetallin herkäksi osoittamiseksi biologisesta tai ei-biologisesta materiaalista menetelmällä, joka perustuu plasmidin kopioluvun kasvattamiseen raskasmetallin läsnäollessa, kun raskasmetallirespontoituva elementti ohjaa plasmidin kopiolukua. Selvyyden vuoksi kuvasta on jätetty huomattavan 5 suuri osa tekijöitä kuvaamatta, jotka tekijät vaikuttavat solun ja rekombinanttiplas-midin toimintaan ja jotka tekijät ovat yleisesti tunnettuja tosiseikkoja. Kuvassa oleva solu on esitetty kaksikalvoisena mikrobisoluna. Yhtä hyvin se voisi olla yksikalvoi-nen mikrobisolu tai eukaryoottisolu. Lähtötilanteessa kuvassa mustana pallona esitetty raskasmetallirespontoituva elementti ohjaa plasmidin kopioluvusta vastaavien 10 yksiköiden synteesiä (nimitetty kuvassa COPiksi). Samassa plasmidissa sijaitsevaa lusiferaasigeeniä (LUC) ohjaa sama jokin toinen säätely-yksikkö, joka on kuvattu mustalla neliöllä. Raskasmetallin läsnäollessa, jolle kyseinen säätelyelementti on herkkä, säätelyproteiinissa tapahtuu konformaation muutos (kuvattu mustan pallon osittaisen avautumisena), käynnistyy välittömästi plasmidin kopioluvun hillitön 15 kasvu, jota on seuraavassa kuvassa esitetty pienten pallojen määrän lisääntymisenä. Kun lusiferaasin synteesi käynnistetään (indusoidaan esimerkiksi indusoituvasta säätely-yksiköstä, kuvattu mustan neliön osittaisena avautumisena) eli promoottorista alkaa solu ensin tuottaa lähetti-RNA:ta (kuvattu aaltoviivoina seuraavasssa kuvassa) ja sen jälkeen spesifistä globulaarista lusiferaasientsyymiä (kuvattu lankarullina). 20 Lisättäessä lusiferiiniä lusiferaasiproteiini synnyttää valoa ja saa solun tällöin bio-luminesoimaan, joka ilmiö voidaan mitata ja jonka määrä korreloi suoraan käytetyn raskasmetallin määrään. Selvyyden vuoksi kuvaan on piirretty eri vaiheet, käytännössä kuitenkin määritys voidaan niin haluttaessa tehdä kaikki eri vaiheet samanaikaisesti.

25

Kuvassa 2 on esitetty kaaviokuva raskasmetallin herkäksi osoittamiseksi biologisesta tai ei-biologisesta materiaalista menetelmällä, joka perustuu suoraan entsyymin induktioon raskasmetallille respontoituvasta elementistä. Selvyyden vuoksi kuvasta on jätetty kuvaamatta huomattavan suuri osa tekijöitä, jotka vaikuttavat solun ja rekom-30 binanttiplasmidin toimintaan ja ovat yleisesti tunnettuja tosiseikkoja. Kuvassa oleva solu on esitetty kaksikalvoisena mikrobisoluna. Yhtä hyvin se voisi olla yksikalvoi-nen mikrobisolu tai eukaryoottisolu. Lähtötilanteessa solussa oleva raskasmetallirespontoituva elementti (kuvattuna mustalla pallolla), joka on asetettu ohjaamaan lusiferaasin (LUC) synteesiä rekombinanttivektorissa (kuvattu paksuna nuolena), on 35 hyvin tarkkaan kytketty pois päältä eikä siitä tuoteta lähetti-RNA:ta. Seuraavassa vaiheessa, kun solun ulkoiseen liuokseen lisätään raskasmetallia (raskasmetalli kulkeutuu solun sisään ryhmäspesifisten ioninkuljetuskanavien kautta), jolle kyseinen säätelyelementti on herkkä, säätelyproteiinissa tapahtuu konumiaation muutos (ku- 95484 12 vattu mustan pallon osittaisena avautumisena), transkriptio käynnistyy välittömästi (kuvattu aaltoviivalla), kuten myös vastaava lusiferaasiproteiinin synteesi (kuvattu lankarullilla, jotka edustavat globulaarisia lusiferaasiproteiineja). Lisättäessä lusi-feriiniä lusiferaasiproteiini synnyttää valoa ja saa solun tällöin bioluminesoimaan, 5 j oka ilmiö voidaan niitata ja jonka määrä korreloi suoraan käytetyn raskasmetallin määrään. Selvyyden vuoksi kuvaan on piirretty eri vaiheet, käytännössä kuitenkin määritys voidaan niin haluttaessa tehdä kaikki eri vaiheet samanaikaisesti.

Kuvassa 3 on esitetty plasmidin pMVl rakentaminen ja rakenne.

10

Kuvassa 4 on esitetty kantaan E. coli MC1061/pMVl perustuva elohopean määritys mitattuna valonmuodostuksen avulla: bakteerien bioluminesenssi elohopeakloridin pitoisuuden funktiona. Määrityksessä on kontrollina yleistoksisuutta mittaava kanta E. coli MC 106 l/pCSS810/pGB3.

15

Kuvassa 5 on esitetty kantaan E. coli MC1061/pMVl perustuva elohopean määritys mitattuna valonmuodostuksen avulla: bakteerien bioluminesenssi eräiden muiden metalli-ionien pitoisuuden funktiona.

20 Kuvassa 6 esitetään elohopean määritys menetelmällä, jossa käytetään pMV 1-plas-midilla kloonattuja E. coli -soluja, jotka on sidottu kiinteään alginaattikantajaan.

Kuvassa 7 on esitetty plasmidin pMV2 rakenne ja rakentaminen.

25 Kuvassa 8 on esitetty elohopean määritys käyttämällä E. coli -kantaa, johon on kloonattu plasmidi pMV2, jossa lusiferaasin synteesiä ohjaa elohopealle respontoi-tuva elementti ja plasmidin kopioluku on hyvin alhainen.

Kuvassa 9 on esitetty plasmidin pMV3 rakenne ja rakentaminen.

30

Kuvassa 10 on esitetty kantaan E. coli MC1061/pMV3 perustuva elohopean määri- » « tys mitattuna valonmuodostuksen avulla.

Huomionarvoinen seikka on se, että menetelmässä lähdetään liikkeelle muutamista 35 lusiferaasimolekyyleistä, joita voidaan tuottaa lisää haluttuna ajankohtana ilman, että se olisi mitenkään riippuvainen itse solunjakautumisesta. Tämä mahdollistaa jakautumattomienkin solujen käyttämisen raskasmetallijäämien testaukseen, jolloin määritykseen kuluvaa aikaa ei rajoita solujen hidas jakautuminen. Tämä mahdollis- 95484 13 taa täten myös muualla kuin laboratoriossa tehtävät raskasmetallimääritykset. Tällöin määritys voidaan suorittaa esimerkiksi koulun terveydenhoitajan vastaanotolla, mikäli lasten veren lyijypitoisuus halutaan selvittää. Yhtä hyvin määritys voidaan tehdä teollisuuden jätevesisaostusaltaan äärellä käyttäen kannettavaa luminometria 5 ja kertakäyttöputkiin pakattua määritysreagenssia. Tämän menetelmän keksinnöllisyys perustuu äärimmäiseen joustavuuteen, menetelmiä voidaan soveltaa mitä erilaisimpiin mittauspaikkoihin tai näytemateriaaleihin - yhteinen nimittävä tekijä on herkkä, nopea ja halpa detektio.

10 Merkillepantavaa on samaten se, että tällaisella menetelmällä voidaan myös seurata jatkuvasti päästöjä esimerkiksi kaivosteollisuuden prosessivesistä niin, että aiheutetusta kohonneesta tasosta menee automaattisesti ilmoitus prosessin valvomoon. Tämä on mahdollista siten, että kiinteään kantajaan sidotut solut on asetettu patruunaan, jonka läpi on järjestetty prosessiveden ja lusiferaasireaktion substraatin ajoit-15 täinen virtaus. Kun vertailupatruunaan on sidottu konstitutiivisen lusiferaasiekspres-sion omaavia soluja, jotka ilmoittavat solujen tilasta ja siten siitä, milloin patruuna pitää vaihtaa (mikä voidaan myös automatisoida) saadaan kehitetyksi luotettava menetelmä teollisuusprosessin automaattiseksi seuraamiseksi. Sitominen kiinteään kantajaan voidaan suorittaa useilla eri tavoilla esimerkiksi ilmentämällä saman solun 20 pinnalla selluloosaan sitoutuvaa peptidiä CBDcex, joka on peräisin Cellulomonas filmin sellulaasientsyymiä koodittavasta geenistä (Francisco et ai., 1993, Bio/Tech-nology, H., 491-495; Gilkes et ai., 1988, J. Biol. Chem., 263. 10401-10407). Myös muiden organismien sellulaasientsyymit sisältävät tarkoitukseen sopivia halpaan kiinteään kantajaan sitoutuvia alayksiköitä, joita koodittavia geenejä voidaan ilmen-25 tää solun pintaproteiiniin fuusioituna.

' ·

Keksinnössä käytetään hyväksi raskasmetalleilla säädeltävissä olevia promoottoreita ja näiden promoottorien säätelemiä toimintoja. Promoottorit sisältävät alueen, johon RNA-polymeraasi-entsyymi voi sitoutua sekä erityisen säätelyproteiinin tai muun 30 molekyylin kiinnittymiseen tarkoitetun alueen. Promoottoreilla tarkoitetaankin yksinkertaisesti DNA:ssa olevaa yksikköä, joka kontrolloi sen vieressä tai lähistöllä sijaitsevan geenin ekspressiota. Kytkeytyviä promoottoreita E. coli -bakteerilla ovat esimerkiksi lac-, trp-, hybridipromoottori tae ja lambda-faagin pl- ja pR-promoot-torit. Nämä promoottorit eroavat toisistaan muun muassa voimakkuudeltaan ja 35 kytkentätavaltaan. Lac- ja trp -promoottorit voidaan kytkeä päälle kemiallisilla yhdisteillä, kun taas pL-promoottorin kytkeminen päälle voidaan suorittaa yksinkertaisesti lämpötilaa kohottamalla. Tässä keksinnössä promoottorit kytketään päälle spesifisesti raskasmetalleilla.

M 95484 14

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Seuraavassa keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin esimerkkien avulla.

5

Esimerkki 1.

Keksinnössä käytetyt solukannat, plasmidit ja niiden rakentaminen sekä menetelmät 10 E. coli MC 1061 (Casadaban ja Cohen, J. Mol. Biol, 138, 1980, 179-207) käytettiin geeninsiirtoisäntinä ja toksisuuskokeissa. Solut kasvatettiin asianmukaisilla minimi-maljoilla ja maljoja säilytettiin korkeintaan 1 viikko +4°C:ssa, minkä jälkeen bakteerit siirrostettiin uusille maljoille. Kantoja säilytettiin myös -70°C:ssa 15 % glyserolissa, josta tarpeen vaatiessa aloitettiin kasvatus minimimaljalla. Plasmidien eris-15 tystä varten soluja kasvatettiin ensin 5 ml:n tilavuudessa (2xTY-mediumia, kuvattu alla) 10 tuntia 30°C:ssa ravistellen, ja alkukasvatus siirrettiin isompaan tilavuuteen samaa mediumia 10 tunniksi.

E. coli -kantojen käsittely yhdistelmä-DNA-plasmidien siirtoa varten: 20

Yhdistelmä-DNA-plasmidit siirrettiin ns. CaCl2-käsiteltyihin soluihin siten, että yli yön kasvatettuja soluja nuorennettiin siirtämällä 5 ml:n kasvusto 2xTY:ssä (NaCl 8 g, hiivaekstrakti 8 g ja tryptoni 16 g, H2O ad 11, pH 7,4) 100 ml:aan samaa lientä. Kasvatettiin noin 2 tuntia, kunnes absorbanssi niitattuna 600 nm:ssä oli 0,8. Solut 25 jäähdytettiin jäähauteella ja sentrifugoitiin alas 4000xg, 5 min. Solupelletti suspen- toitiin 50 ml:aan 50 mM CaCl2:a jäähauteella, minkä jälkeen sentrifugoitiin alas 3000g, 5 min 0°C:ssa. Solut suspendoitiin 4 ml:aan 50 mM CaCl2:a, johon oli lisätty glyserolia 15 %:ksi. Tässä tapauksessa nämä ns. kompetentit solut jaettiin 1 ml:n eriin ja jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja säilytettiin -70°C:ssa myö-30 hempää käyttöä varten.

♦ 1 E. co/i-kantojen transformointi yhdistelmä DNA-plasmideilla: 250 μΐ joko tuoreita tai pakastettuja kompetentteja soluja lisättiin valmiiksi jäähau-35 teella kylmennettyihin putkiin, joissa oli puhdasta plasmidi-DNA:ta tai ns. ligaatio-seosta 1-10 μΐ ja 26 μΐ lOxTMC (lOOmM Tris-Cl, pH 7,4, 100 mM MgCl2). Sekoitettiin hellävaroen ja pidettiin jäähauteella 10 min (pakastetut solut) tai 60 min (tuoreet solut). Joissakin tapauksissa tämän jälkeen soluja pidettiin 42°C:ssa 2 min 95484 15 ravistellen. Tämän jälkeen lisättiin 1 ml 2xTY-lientä ja ravisteltiin 1 tunti 30°C:ssa. Ligaatioseoksilla transformoidut solut sentrifugoitiin alas 3 min 4000xg ja suspen-doitiin noin 100 pl:aan sentrifugoitua supematanttia ja levitettiin antibioottiselektio-maljoille. Puhdasta plasmidi-DNA:ta sisältävistä transformoiduista soluista levitet-5 tiin suoraan sopiva määrä antibioottimaljoille.

Kaksinauhaisen DNA:n emäsjärjestyksen määrittäminen:

Noin 4 pg kaksinauhaista standardimenetelmillä puhdistettua DNA:ta (esimerkiksi 10 CsCl-gradientti) lisätään 2 pilaan 2 M NaOH:ta. Annetaan seistä 5 min huoneen lämpötilassa ja lisätään 3 pl 3 M Na-asetaattia, pH 4,5 ja 2 pi H2O. DNA saoste-taan lisäämällä 75 pl absoluuttista etanolia ja seosta seisotetaan 30 min -70°C:ssa. Saostunut DNA sentrifugoidaan pohjaan 5 min 12000 rpm Eppendorf-mikrosentri-fugissa ja pestään kertaalleen 70-%:isella etanolilla. Sentrifugoinnin jälkeen suorite-15 taan sakan kuivaus 5 min vakuumieksikkaattorissa ja kuivauksen jälkeen sakan liuotus 4 pl:aan vettä. Samanaikaisesti lisätään 5 pmol spesifistä aluketta ja 1 pl 10xKlenow-puskuria (koostumus kuvailtu Amersham, Ltd.n sekvensointiopaskir-jassa). Liuotuksesta alkaen toimenpiteet suoritetaan 37°C:ssa. Annetaan seistä 15 min, minkä jälkeen lisätään 1 yksikkö Klenow-entsyymiä, 4 pl ^^S-leimattua deok-20 si-ATP:a ( 500 pCi/ml) ja sekoitetaan sentrifugoimalla. Edellistä seosta otetaan 3,5 pl kuhunkin dideoksinukleotidireaktioputkeen (deoksi- ja dideoksinukleotidien suhteet on kuvattu opaskirjassa) ja annetaan seistä 15 min. Kuhunkin neljään putkeen lisätään 1,5 pl Chase-liuosta, jossa kunkin deoksinukleotidin pitoisuus on 10 mM. Annetaan seistä 15 min, minkä jälkeen reaktiot ajetaan polyakryyliamidigeelille, . 25 kuten opaskirjassa on kuvattu. Geeliä ajetaan tarpeen mukaan, minkä jälkeen geeli kiinnitetään, kuivatetaan ja valotetaan röntgenfilmillä yleisten periaatteiden mukaisesti.

Esimerkki 2: Plasmidin pMVl rakentaminen ja rakenne (kuva 3).

30

Keksinnössä kuvattu plasmidi pMVl rakennettiin käyttäen hyväksi aiemmin kuvat-* tujarekombinantti-DNA-plasmidejaja yleisesti tunnettuja molekyylibiologisia tekniikoita. Plasmidi pCSS810 pilkottiin restriktioentsyymeillä Xhol ja BarriHl yli yön 37°C:ssa. Pilkottu plasmidi käsiteltiin päätefosfaattiryhmien poistamiseksi li-35 säämällä naudan intestinaalista alkalista fosfataasia 0,1 yksikköä ja pidettiin 37°C:ssa 30 min. Plasmidi erotettiin pilkkoutumattomista tuotteista ajamalla 0,8 % matalassa lämpötilassa sulava agaroosigeeli. Tämän jälkeen erotettiin 7300 emäspa-rin mittainen pala geeliltä leikkaamalla se ultraviolettivalossa. Saatu geelipala sula- 95484 16 tettiin 65°C:ssa ja siitä eristettin pilkottu plasmidi, joka liitettiin ligaasientsyymin avulla samoilla restriktioentsyymeillä katkaistuun PCR-tuotieeseen. Kyseinen poly-meraasiketjureaktiotuote saatiin kun E. coli -kannasta (NCTC 50278). Eristetystä plasmidista eristettiin PCR-reaktiolla (polymeraasiketjureaktio) merR-geeni sekä 5 mer-operonin säätelyalue. Reaktiossa käytettiin seuraavanlaisia alukkeita: 5'-CTT AAGGATCCCCTC AT AGTT AATTTCT CCT CTTTT GAATTTGG ATTGG ATA-3' ja 5'-CATATCTCGAGCTAAGGCATAGCTGACCT-3' sekä Taq-polyme-raasia. Reaktion jälkeen 550 emäsparin kokoinen reaktiotuote eristettin agaroosi-geeliltä, pilkottiin BamHI- ja Xhol-entsyymeillä sekä erotettin pilkkoutumattomista 10 tuotteista kuten pCSS810 edellä. Nämä DNA-palaset yhdistettiin toisiinsa ligaasientsyymin avulla. Huomattavaa tässä on, että merR-geeni ja /wer-operonin säätely-alue eristettiin kokonaisuudessaan ottamatta säätelyn kannalta tarpeettomia osia mukaan, mikä seikka on tärkeä tämän keksinnön toimivuuden kannalta aiheuttaen erittäin herkän elohopean detektion.

15

Saatu rakennelma siirrettiin edellä kuvatulla tavalla E. coli MC 1061 -bakteerikantaan. Yhdistelmä-DNA-plasmidien eristys tehtiin pienessä mittakaavassa, kuten on kuvattu (Maniatis et ai, 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor), ja todettiin restriktioentsyymikat-20 kaisuin oikea plasmidirakennelma. Plasmidin eristys suuremmassa mittakaavassa tehtiin saman kirjan ohjeiden mukaisesti. Näin rakennettu plasmidi pMVl sisältää sekä grampositiivisesta että gramnegatiivisesta bakteerista peräisin olevat DNA-rep-likoitumisen aloituskohdat. Se on siten ns. sukkulaplasmidi, joka voidaan siirtää myös muihin gramnegatiivisiin bakteereihin tai grampositiivisiin bakteereihin esi-25 merkiksi B. subtilikseen aiemmin kuvatulla menetelmällä (Contente ja Dubnau, 1979, Mol. Gen. Genet., 167. 251-258). Käyttäen tämänkaltaista plasmidirakennel-maa voidaan raskasmetallimääritys tehdä siinä organismissa, jossa detektio on herkin mahdollinen, so. metallin kuljetusmekanismit ovat aktiiviset. Yhdistelmä-DNA-plasmidi pMVl on talletettu 10.11.1993 talletuslaitokseen DSM talletusnumerolla 30 8708.

·* Esimerkki 3: Kantaan E. coli MC1061/pMVl perustuva elohopean määritys mitat tuna valonmuodostuksen avulla 35 Yli yön kasvaneet plasmidilla pMV1 kloonatut E. coli MC 1061 solut, joiden OD^oo = 1,5-2,0, pestiin kahdesti M9-minimikasvuliuoksella (Maniatis et ai, (1982)

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), johon oli lisätty 10 g/1 happohydrolysoitua kaseiinia. Solut 95484 17 laimennettiin 1:200 em. kasvuliuoksella. Näiden solujen kanssa sekoitettin eri määriä elohopeayhdisteitä, muita ioniyhdisteitä, lämpökäsiteltyä (30 min 56°C) verta tai vesinäytteitä ympäristöstä. Näytteiden, jotka olivat luminometriputkissa tai 96-kuop-palevyllä annettiin seistä 60 minuuttia + 30°C:ssa, minkä jälkeen näytteisiin lisättiin 5 100 μΐ 1 mM D-lusiferiiniä ja näytteiden luminesenssi mitattiin välittömästi. Tunte mattomien näytteiden valontuottoa verrattiin tunnettujen elohopeapitoisuuksien aiheuttamiin luminesenssimääriin. Määrityksessä käytettiin ns. sisäisenä standardina samoja E. coli-soluja, jotka oli kloonattu plasmidilla pCSS810 (Lampinen et ai, 1992, Mol. Gen. Genet. 232. 498-504), joiden solujen tuottaman valon määrä il-10 moittaa epäspesifisen toksisuuden osuuden ympäröivässä nesteessä. Kuvassa 4 on esitetty bakteerien bioluminesensssi elohopeakloridin pitoisuuden funktiona. Kuvassa 5 on esitetty bakteerien bioluminesensssi eräiden muiden metalli-ionien pitoisuuden funktiona. Kuvasta voidaan havaita, että suuretkaan muiden ionien pitoisuudet eivät aiheuta valonmuodostusta käytettäessä kuvattua elohopeaspesifistä biosenso-15 ria. Vastaavanlainen määritys voidaan tehdä myös käyttäen grampositiivista bakteeria, esim. B. subtilis, johon plasmidi pMVl on siirretty.

Esimerkki 4: Elohopean määritys menetelmällä, jossa käytetään pMVl-plasmidilla kloonattuja E. co//-soluja, jotka on sidottu kiinteään alginaattikantajaan 20

Solujen sitominen alginaattiin suoritettiin seuraavalla tavalla: E. coli MC 1061 / pMVl -solut kasvatettiin kuten esimerkissä 2. Solut pestiin kahdesti M9-kasvuliuoksella, johon oli lisätty 10 g/1 happohydrolysoitua kaseiinia, sekä suspendoitiin samaan liuokseen. 200 μΐ tätä liuosta sekoitettiin 2 ml:aan 2-%:ista 25 alginaattiliuosta, sekoitettin ja seos imettiin 5 ml:n injektioruiskuun. Seos puristettiin neulan läpi 0,5 M CaCl2-liuokseen, jota sekoitettiin magneettisekoittajalla. Sekoitusta jatkettiin 30 minuuttia, minkä jälkeen helmet pestiin vedellä useita kertoja ja suspendoitiin em. M9-liuokseen.

30 Kuvassa 6 on esitetty elohopean vaikutus E. coli MC 1061/pMV 1-soluihin, jotka on sidottu alginaattihelmiin. Luminometriputkiin lisättiin kuhunkin yksi alginaattihelmi ja M9-mediumia 200 μΐ sekä eri määriä HgCl2. Annettiin seistä 30°C:ssa yksi tunti, minkä jälkeen mitattiin immobilisoitujen solujen tuottaman valon määrä lisäämällä luminometriputkiin 100 μΐ 1,0 mM D-lusiferiiniä 0,1 M Na-sitraattipuskurissa, pH 35 5,0. Määritykseen käytettiin Bio-Orbit 1251 luminometria 30 minuuttia substraatin lisäyksen jälkeen.

95484 18

Esimerkki 5: Plasmidin pMV2 rakenne ja rakentaminen

Plasmidi pMV1 pilkottiin restriktioentsyymeillä XhoI ja Hindin, jotka irrottavat tu-likärpäslusiferaasia koodittavan geenin ja merR- ja mer-operonialueet kokonaisuu-5 dessaan. Fragmentin kohesiiviset päät tasattiin lisäämällä deoksinukleotidit I mM:ksi ja 1 yksikkö Klenow-entsyymiä. Reaktiota pidettiin 30 min 37°C:ssa, minkä jälkeen noin 2200 emäsparin mittainen DNA-fragmentti erotettiin LGT-aga-roosigeelillä ja lasi-maitokäsittelyllä, kuten edellä on kuvattu. Plasmidi pOU61 (Larsen et ai., 1984, Gene 28, s. 45-54) pilkottiin restriktioentsyymillä BamHI, päät 10 tasattiin Klenow-entsyymikäsittelyllä kuten edellä. Pilkottu vektori DNA käsiteltiin 0,1 yksiköllä alkalista fosfataasia päätefosfaattiryhmien poistamiseksi 20 min 37°C:ssa ja eristettiin 10 kiloemäsparin mittainen DNA-fragmentti LGT-agaroosi-geeliltä, kuten edellä. Saadut DNA-palat liitettiin toisiinsa T4-DNA-ligaasientsyy-min avulla ja transformoitiin E. coli MC 1061 -soluihin esimerkissä 1 kuvatulla ta-15 valla. Tehtiin plasmidiminipreparaatit, joista todettiin oikea rakenne restriktioent-syymidigestioin. Kuvassa 7 on esitetty saadun plasmidin pMV2 rakenne. Kuvassa 8 on esitetty elohopean määritys käyttämällä E. coli -kantaa, johon on kloonattu plasmidi pMV2, jossa lusiferaasin synteesiä ohjaa elohopealle respontoituva elementti ja plasmidin kopioluku on hyvin alhainen eli 1-2/solu. Kuvasta havaitaan, 20 että elohopean määritys on lähes samaa herkkyysluokkaa kuin aikaisemmissa tapauksissa, ja dynaaminen mittausalue on olennaisesti kasvanut lähes viiteen dekadiin asti.

Esimerkki 6: Plasmidin pMV3 rakenne ja rakentaminen ... 25

Plasmidi pMV2 pilkottiin restriktioentsyymillä Hindlll, kohesiiviset päät tasattiin Klenow-käsittelyllä, kuten edellä ja entsyymi inaktivoitiin 20 min 65°C:ssa. Tämän jälkeen katkaistu pMV2 katkaistiin osittaisella Bglll-digestiolla ja eristettiin noin II kb:n mittainen lineaarinen vektori-DNA agaroosigeeliltä, kuten on edellä kuvat-30 tu. Näin saatuun vektoriin liitettiin merR- ja mer-operonialueet pMVl-plasmidista, joka oli pilkottu XhoI:11a, päät tasattu Klenow-entsyymillä, ja kuumentamisen jälkeen pilkottu BamHI-entsyymillä. Liitäminen tapahtui T4-DNA-ligaasientsyymin avulla, kuten edellä ja seos transformoitiin E. coli MC 1061-soluihin. Oikean plas-midirakenteen omaavat plasmidit identifioitiin restriktioentsyymidigestioin. Kuvassa 35 9 on esitetty plasmidin rakentaminen. Yhdistelmä-DNA-plasmidi pMV3 on talletet tu 10.1.1994 talletuslaitokseen DSM talletusnumerolla 8893.

95484 19

Esimerkki 7: Kantaan E. coli MC1061/pMV3 perustuva elohopean määritys mitattuna valonmuodostuksen avulla

Yli yön kasvaneet plasmidilla pMV3 kloonatut E. coli MC1061-solut, joiden 5 OÖ600 = 1,5-2,0, pestiin kahdesti M9-minimikasvuliuoksella (Maniatis et ai, (1982)

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), johon oli lisätty 10 g/1 happohydrolysoitua kaseiinia. Solut laimennettiin 1:200 em. kasvuliuoksella. Näiden solujen kanssa sekoitettiin eri määriä elohopeayhdisteitä. Näytteiden, jotka olivat luminometriputkissa tai 96-10 kuoppalevyllä, annettiin seistä 60 minuuttia + 30°C:ssa, minkä jälkeen näytteisiin lisättiin 100 μΐ 1 mM D-lusiferiiniä ja näytteiden luminesenssi mitattiin välittömästi. Kuvassa 10 on esitetty bakteerien bioluminesensssi elohopeakloridin pitoisuuden funktiona.

Claims (20)

1. 95484
2. 1. Menetelmä näytteessä olevan raskasmetallin määrittämiseksi, tunnettu siitä, että 5 ai) soluun siirretään hyönteislusiferaasigeenin sisältävä yhdistelmä-DNA-plasmi-di, jonka kopioluku on raskasmetallilla säädeltävissä olevan promoottorin alaisuudessa, tai a2) soluun siirretään hyönteislusiferaasigeenin sisältävä yhdistelmä-DNA-plasmi-10 di, jonka kopioluku on vakio välillä 1 ja 2000/solu ja plasmidi sisältää markkeripro-teiinina viruksen, prokaryoottisolun tai eukaryoottisolun valkuaisainetta tai sen biologisen aktiivisuuden kannalta olennaista osaa koodaavan DNA-jakson, jonka ilmentyminen on raskasmetallilla säädeltävissä olevan promoottorin alaisuudessa ja on kontrolloitu negatiivisella ja/tai positiivisella palautteella, 15 b) kohdan ai) tai a2) mukaisen yhdistelmä-DNA-plasmidin sisältämä solu saatetaan kosketukseen raskasmetallin sisältävän näytteen kanssa, esimerkiksi inkuboi-malla näitä yhdessä, jolloin raskasmetallin kulkeutuminen soluun on joko passiivista tai sille on solussa oma koneisto, c) raskasmetallin annetaan vaikuttaa yhdistelmä-DNA-plasmidin sisältämään soluun sopivan ajan, minkä jälkeen yhdistelmä-DNA-plasmidin tai sen koodittaman valkuaisaineen määrä määritetään joko fysikaalisin tai kemiallisin keinoin, 25 d) yhdistelmä-DNA-plasmidin tai sen koodittaman valkuaisaineen määrää verrataan kemiallisin tai fysikaalisin menetelmin vertailukokeeseen, jossa raskasmetallia ei ollut läsnä ja/tai sitä oli tunnettu määrä reaktiossa, jolloin raskasmetallin läsnäolo ja/tai määrä saadaan määritettyä.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa ai) : yhdistelmä-DNA-plasmidi sisältää DNA-jakson, joka koodaa yhtä tai useampaa valikoitua viruksen, prokaryoottisolun tai eukaryoottisolun valkuaisainetta tai sen biologisen aktiivisuuden kannalta olennaista osaa.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valkuaisainet ta koodaava DNA-jakso on säädeltävissä olevan promoottorin alaisuudessa, joka on •: kontrolloitu positiivisella tai negatiivisella palautteella ja on säädeltävissä käytettä- 95484 vässä mikrobisolussa sekä aktivoidaan samanaikaisesti tai haluttuna hetkenä sen jälkeen, kun plasmidin kopiolukua säätelevä promoottori aktivoidaan.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheen ai) 5 mukaisten plasmidien kopiolukua säätelee elohopealle tai sen orgaaniselle yhdisteelle respontoituva elementti.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solu on Escherichia coli ja bakteerin sisältämän yhdistelmä-DNA-plasmidin valkuaisaineen 10 synteesiä säätelee sama tai eri raskasmetallille respontoituva elementti.
7. 6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa ai) yhdistelmä-DNA-plasmidi on pMV3, joka on talletettu talletuslaitokseen DSM talletusnumerolla 8893. 15
8. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheessa a2) yhdistelmä-DNA-plasmidi on pMVl, joka on talletettu talletuslaitokseen DSM talletusnumerolla 8708.
9. 8. Patenttivaatimuksen 1 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tä verrataan vertailukokeeseen, jossa toissijaisen säätely-yksikön kontrolli aiheuttaa soluille vakioisen markkerivalkuaisaineen tuottotason.
10. 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että solu on gram-25 negatiivinen tai grampositiivinen bakteeri kuuluen ryhmään Enterobacteriaceae tai iyhmään Bacillus.
11. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solu on Escherichia coli. 30 . 11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solu on Ba- « ‘ ' cillus subtilis.
12. 12. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 35 että valkuaisaineen tuottoa ohjaavan promoottorin säätelytekijöitä tuotetaan soluun ulkopuolelta, syntetisoidaan solun sisällä olevan toisen plasmidin tai solun genomi-sen DNA.n ohjaamana, ne tulevat määritettävän näytteen mukana. 95484
13. 13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tutkittava näyte on nestemäisessä, kaasumaisessa tai kiinteässä muodossa ja näyte on biologista tai ei-biologista alkuperää.
14. 14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä- DNA-plasmidin sisältävät solut ovat kylmäkuivattuja ja ne rehydroidaan ennen määritystä sopivalla puskurilla, määritettävällä liuoksella tai kasvatusliuoksella tai ne ovat immobilisoituja kiinteään kantajaan.
15. 15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että metalli on ras kasmetalli tai sen orgaaninen yhdiste ja että käytettävä solu on määritettävälle raskasmetallille herkkä.
16. 16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lusiferiiniä 15 lisätään reaktioon mitattaessa ekspressoituneen lusiferaasientsyymin määrää bakteerissa.
17. 17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-plasmidin määrää verrataan käyttämällä hyväksi samassa solussa olevaa toista 20 plasmidia, jossa on toisen säätely-yksikön kontrollin alaisena erilaisen aallonpituus-maksimin tuottavaa lusiferaasia koodittava geeni.
18. 18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys tehdään maidosta, elintarvikkeista tai niiden pakkausmateriaaleista, seerumista, virt- 25, sasta, syljestä, sedimenteistä, savukaasuista, teollisuuden prosessivesistä, jätevesistä tai luonnon vesistä.
19. 19. Plasmidi pMV1, joka on talletettu talletuslaitokseen DSM talletusnumerolla 8708. 30
20. 20. Plasmidi pMV3, joka on talletettu talletuslaitokseen DSM talletusnumerolla • ‘ 8893. il ' IH F liiti I I I Bl 4 23 95484