FI88309C - Ny biotest - Google Patents

Description

l 8 8 3 C 9

Uusi biotesti

Biotesteiksi kutsutaan yleensä menetelmiä, joissa käytetään 5 apuna eläviä soluja tai organismeja. Useissa kehitetyissä biotesteissä käytetään hyväksi bakteeri- tai hiivasoluja. Bakteerit ja erityisesti Escherichia coli -bakteeri tunnetaan hyvin tarkasti. Hiivasolut edustavat eukaryootti-soluja, mutta ovat yksisoluisia. Hiivojen kanssa työskenteli) ly on helpompaa kuin korkeampien eukaryoottisolujen kanssa, sillä hiivat jakautuvat nopeasti yksinkertaisissa kasvatus-liuoksissa eivätkä vaadi monimutkaisten kasvutekijöiden läsnäoloa. Hiivojen tuntemus kasvaa nopeasti ja muutamista kannoista tunnetaankin jo kattavat geenikartat. Bakteereis-15 ta ja hiivoista tunnetaan satoja mutanttikantoja, joiden avulla on mahdollista tutkia esimerkiksi spesifisten reaktioiden aktiivisuutta ja tapahtumia. Antibiooteille erityisen herkillä bakteerimutanteilla jo pienetkin antibiootti jäämät saavat aikaan käytettävän bakteerin metaboliassa 20 ja soluseinissä havaittavia muutoksia. Käyttämällä sopivia bakteerimutantteja voidaan antibioottijäämätestit kehittää erityisen herkiksi. Tällaiset bakteerikannat voivat olla villikantojen mutantteja, joiden soluseinämät voivat olla rakenteeltaan poikkeuksellisia niin, että antibiootit pää-25 sevät villikantoihin verrattuna helpommin tunkeutumaan solu-: . seinämän läpi. Samoin genotoksisille tekijöille herkät — bakteerit ja hiivat ovat mutanttikantoja, joiden DNA:n korjausmekanismit eivät toimi yhtä tehokkaasti kuin vil-. . . likantojen. Mutanttikantoja hyväksi käyttämällä voidaan 30 ja on voitu mitata antibiootteja, mutageenisia ja toksisia tekijöitä. Bakteeri- ja hiivakantoihin on suhteellisen yksinkertaista siirtää uusia ominaisuuksia geeninsiirto-tekniikoiden avulla, mikä seikka laajentaa ko. organismien hyväksikäyttömahdollisuuksia biotesteissä. Uusilla ominai-; 35 suuksilla tarkoitetaan tässä yhteydessä viruksen, eukaryoot-ti- tai prokaryoottisten solujen geenien koodittamia proteiineja, joita ei luonnostaan esiinny geeninsiirtotekniikkaa hyväksi käyttävissä kohdeorganismeissa.

2 8 8 3 G 9

Karsinogeenisuuden ja mutageenisuuden välinen yhteys on lähtökohtana mutageenisuustestien käyttämiselle karsinogeenisten yhdisteiden esitestauksessa. Karsinogeenisuuden 5 testaus koe-eläimillä on erittäin kallista ja hidasta.

Mutageenisuustestien käyttöön karsinogeenisuuden pikatesteinä onkin kiinnitetty paljon toiveita ja huomiota. Mikrobien käyttöön perustuvia mutageenisuustestejä kehittämällä eläinkokeita on myös mahdollista vähentää. Kokeellisten 10 testien käytön perustana on deoksiribonukleiinihapon, DNA:n, universaalisuus, jonka mukaan DNA:n rakenne ja toimintaperiaatteet ovat eri organismeissa samanlaiset.

Yleisimmin käytetty mutageenisuustesti on Salmonella typh-15 imurium -bakteereja kohdeorganismina käyttävä Ames-testi (Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Mutat. Res. 31-347). Tällä testillä kyetään havaitsemaan muun muassa useimpien mykotoksiinien, aromaattisten amiinien ja polysyklisten hiilivetyjen genotoksisuus. Ames-testi ei kuitenkaan 20 kykene tunnistamaan karsinogeenisten metallisuolojen tai kloorattujen hiilivetyjen genotoksisuutta. Tässä testissä käytettävissä Salmonella tvphimurium -bakteerikannoissa on pistemutaatioita histidiinin biosynteesiin tarvittavassa geenissä. Kun bakteerit altistetaan mutageenisten yhdis-25 teiden vaikutukselle, tapahtuu revertoituminen 1. takaisin-mutaatio kyseisessä geenissä ja bakteeri alkaa tuottaa histidiiniä itsenäisesti eikä tarvitse enää ulkopuolista histidiinilähdettä. Haittapuolena Ames-testissä on sen hitaus ja huono herkkyys. Tässä testissä kaikki muut geno-30 toksiset muutokset kuin ko. entsyymiin kohdistuvat jäävät toteamatta. Testi on myös suhteellisen kallis testattavaa yhdistettä kohden.

Bioluminesenssiin eli valonmuodostumisen mittaukseen perus-35 tuva genotoksisten tekijöiden määritysmenetelmä on myös kehitetty (Ulitzur S., Weiser, I. and Yannai, S., 1980,

Mut. Res., 74, 113-121). Tässä menetelmässä käytetään hyväksi valaisemattomia Photobacterium leioanathi -kantoja 3 8 8 3 C9 ja Photobacterium fischerin mutanttikantoja. Genotoksisten tekijöiden vaikutuksesta edellä mainitut bakteerit alkavat tuottaa valoa. Tämän menetelmän teoreettinen perusta on vielä arvailujen varassa. Muun muassa jonkin tuntemattoman 5 repressorin 1. estäjän vaikutuksen poistuminen tai sen muodostumisen estymisen sekä bakteerien kromosomaalisen DNA:n fysikaalisessa rakenteessa tapahtuvan muutoksen arvellaan edistävän lusiferaasin tuotannon alkamista bakteerisoluissa. Eri genotoksiset yhdisteet vaikuttavat tässä tes-10 tissä eri nopeuksilla johtuen tekijöiden vaikutusmekanismien vaihtelevuudesta. Tämä testi on Ames-testiä nopeampi, mutta ei läheskään yhtä helppokäyttöinen. Testissä käytettyjen bakteerien tuottamaa valoa täytyy pystyä mittaamaan kineettisestä hyvin pitkiä ja vaihtelevia aikoja (30 min - 10 h) 15 tutkittavasta yhdisteestä riippuen. Käytettävät bakteerit eivät myöskään kykene tuottamaan stabiilia valoa, mikä tekee määrityksestä ongelmallisen. Edellä mainituista syistä johtuen kuvattua bioluminesenssiin perustuvaa Photobacter-ium-kantoja hyväksi käyttävää genotoksisten tekijöiden 20 määritysmenetelmää ei voida helposti automatisoida ja ottaa rutiinikäyttöön, kun määritettäviä näytteitä on paljon.

Mikrobilääkkeinä käytettyjä antibiootteja määritetään muun muassa potilaiden seerumista selvitettäessä hoidossa käytet-' 25 tävän lääkkeen annostusta ja imeytymistehokkuutta. Useiden ·'·'· käytettyjen antibioottien terapeuttinen pitoisuusalue on suhteellisen kapea ja yliannostuksesta potilaalle aiheutuvat riskit voivat olla suuria. Lihasta ja lehmän maidosta on • tärkeää määrittää mikrobilääkejäämät niiden allergikoille 30 aiheuttamien oireiden takia. Juuston valmistuksessa käytettävä maito ei saa sisältää antibiootteja sillä ne estävät ; juustobakteerien toiminnan. Yleisimmät tämänhetkiset mik robilääkkeiden tunnistamiseen käytetyt menetelmät ovat mikrobiologisia. Näissä testeissä mitataan joko antibioo-; 35 teille herkkien mikrobien suoranaista kasvua tai kasvun yhteydessä tapahtuvien aineenvaihduntatuotteiden tuoton estymistä esimerkiksi bakteerien hapontuotantoa erilaisten väri-indikaattorien avulla. Yleisesti käytössä ovat aga- 4 8 8 3 G 9 reillä tehtävät mikrobiologiset testit. Agardiffuusiotestin sylinteri-, kuoppa- ja kiekkomenetelmä ovat esimerkkisovel-lutuksia. Näiden menetelmien välillä olevat erot rajoittuvat ainoastaan näytteen applikaatioon agarille ja bak-5 teerikannan käyttötapaan testeissä.

Koska mikrobiologiset menetelmät käyttävät hyväkseen bakteereja tai bakteerien itiöitä, on testibakteerin herkkyys antibiooteille ratkaisevan tärkeä näissä menetelmissä.

10 Tähän asti on ollut tarpeen tehdä kompromisseja sopivien testimikrobien valinnoissa, koska suuri antibioottiherkkyys ja muut testimikrobilta vaadittavat ominaisuudet eivät välttämättä ole olleet saman bakteerikannan ominaisuuksia.

15 Mikrobien käyttöä antibioottijäämien testauksessa rajoittaa ennen kaikkea menetelmien hitaus ja epäherkkyys. Koska menetelmissä tavalla tai toisella aina kontrolloidaan testimikrobien kasvua, ei testiä voida kuvitellakaan saatavan suoritetuksi alle tunnin. Tämä johtuu siitä, että mikrobien 20 kasvu nopeimmillaankin on hidas tapahtuma. Lisäksi useissa testeissä mikrobit ovat kylmäkuivattuina tai itiöinä, mikä entisestäänkin hidastaa testien suoritusta.

Myös bioluminesenssiin perustuvia antibioottien määritys-25 menetelmiä on kehitetty. Ulitzur (1986, Methods in En- zymology, voi. 133, s. 275-284) on esittänyt kolme erilaista tapaa käyttää bioluminesenssiin perustuvaa menetelmää antibioottien määrityksissä ja ne ovat a) lysis-testi, b) induk-tiotesti ja c) bakteriofagitesti.

30

Ensimmäisessä eli nk. lysis-testissä käytetään hyväksi Vibrio fischeristä eristettyjä lux-geenejä, jotka tuottavat lusiferaasia ja substraatin läsnäollessa muodostuu valoa. Nämä geenit on asetettu plasmidiin, joka on siirretty Bacil-35 lus subtilikseen, joka on erittäin herkkä bakteerien solukalvoihin vaikuttaville antibiooteille kuten esimerkiksi penisilliineille ja kefalosporiineille. Testissä tällaista plasmidin sisältävää B. subtilista kasvatetaan antibioottia 5 88309 sisältävän näytteen kanssa ja bakteerisolukalvojen synteesin inhiboituessa bakteerit hajoavat. Antibioottien vaikutus todetaan kohdebakteerin alentuneessa valontuottotasossa.

5 Induktiotestissä käytetään hyväksi nk. dim-mutantteja Pho-tobacterium phosphoreum -bakteereja, jotka niinensä mukaisesti eivät tuota valoa villikantoihin verrattuna. Tämä kuten muutkin Ulitzurin ryhmän kehittämät bioluminesenssiin perustuvat testit ovat kohdebakteerin kromosomaalisen DNA:n 10 hyväksikäyttöön perustuvia testejä. Induktiotestillä voidaan määrittää proteiinisynteesiin vaikuttavia antibiootteja. Inkuboitaessa bakteereja DNA:hän sitoutuvien yhdisteiden läsnäollessa alkavat nämä alunperin valoa tuottamattomat bakteerit valaista 1. bakteeri alkaa tuottaa lusiferaasi-15 proteiinia. Kun proteiinisynteesiä inhiboivaa antibioottia on mukana reaktiossa, jossa lusiferaasia tuotetaan indusoituneesi Photobacterium phosphoreumin kromosomaalisesta DNA:sta, estävät antibiootit lusiferaasin synteesiä. Antibiootin vaikutus todetaan bakteerien tuottaman valontason 20 laskuna verrattuna bakteereihin, joita ei ollut inkuboitu proteiinisynteesiä estävien antibioottien kanssa. Tällä induktiotestillä ei voida kuitenkaan määrittää DNA:n synteesiä estäviä antibiootteja. Myöskin käytettävän induktion tapahtumat ja selitys ovat arvailujen varassa. Testin 25 suorittamiseen tarvittavat olosuhteet ovat ongelmalliset, koska em. bakteerit tarvitsevat määritysliuoksessa minimi-suolat (muun muassa Ca2·*· - ja Mg^-ionit), joiden tiedetään vähentävän tai täysin estävän aminoglykosidien (streptomysiini, kanamysiini, neomysiini, erytromysiini) toiminnan.

30 Myös bakteerin induktio-olosuhteet ovat erittäin tarkat ja lisäksi näytteissä saattaa olla antibiootteja (esim. nali-diksiinihappo) tai muita yhdisteitä, jotka indusoivat bakteerin valontuotannon satunnaisesti. Tässä testissä olemassa olevien indusorien suuri lukumäärä onkin vaikea ongelma.

35 Testeissä käytettävällä bakteerimäärällä on myös mainittu olevan vaikutusta määritykseen. Testissä voidaan käyttää suhteellisen pientä määrää bakteereja, sillä suuremman bakteerimäärän käyttäminen vaatii reaktioseoksen erityistä 6 8 8 3 G 9 hapetusta näissä bakteereissa olevan bioluminesenssi-sys-teemin happiherkkyyden takia. Tämä aiheuttaa ongelmia silloin, kun käytetään mittalaitteita (luminometrit, valo-diodit, valokuvauslevy), jotka eivät ole niin herkkiä kuin 5 nestetuikelaskimet. Myös testin toistettavuus kärsii näiden tekijöiden vuoksi.

DNA-synteesiä, transkriptiota ja translaatiota estävät antibiootit kuuluvat bakteriofagitestin piiriin. Tässä 10 testissä normaalit, valaisevat Photobacterium phosphoreum -bakteerit infektoidaan lyyttisillä bakteriofageilla. Antibiootin läsnäollessa uusia bakteerisolua hajottavia viruksia ei pääse syntetisoitumaan DNA-, RNA- tai proteiinisynteesiin vaadittavien synteesikoneistojen toiminnan estyttyä. 15 Antibiootin läsnäollessa bakteerien tuottaman valon määrässä ei todeta muutosta verrattuna antibiooteilla käsittelemättömiin kontrollisoluihin, joiden valotasot laskevat nopeasti bakteriofagien kyetessä lisääntymään ja hajottamaan bakteerisolun. Bakteriofagitesti on ongelmallinen suorittaa, 20 koska siinä vaaditaan erityinen bakteriofagien lisäys bak-teerisuspensioon ja antibioottinäytteen lisäämisen ajoitus on tarkka. Tässä testissä on myös samoja ongelmia kuin induktiotestissä määritysliuoksen ja testissä käytettävien bakteerimäärien suhteen.

25 Tämän hetkisillä mikrobiologisilla antibioottitesteillä ei voida määrittää yksittäisiä antibiootteja tai antibioot-tiryhmiä vaan kaikki antibiootit, joille testissä käytettävä mikrobi on herkkä. Mittausolosuhteita muuttamalla ja li-30 säämällä tiettyjä antibiootteja hajottavia entsyymejä voidaan eräiden antibioottien vaikutus poistaa.

Tarve raskasmetallien, toksiinien ja elintarvikkeiden lisäaineiden määrittämiseksi nopeasti ja yksinkertaisesti on 35 suuri. Tällä hetkellä määritykset täytyy tehdä useimmiten keskitetysti suurissa laboratorioissa, koska tarvittavat mittalaitteistot ovat erittäin kalliita ja vaativat käyttäjiltään erityiskoulutusta. Nopeat, kvalitatiiviset testit i 1 8 8 3 C 9 voisivat olla paikan päällä tehtyinä myös merkittävä seula jatkotutkimuksia vaativille näytteille. Tällöin laboratorioiden kuormitus vähentyisi ja ongelmanäytteiden määrittäminen nopeutuisi.

5

Toksisten yhdisteiden määrittämiseksi ympäristönäytteistä on kehitetty nk. Microtox-testi, jossa käytetään hyväksi valoa tuottavia Photobacterium phosphoreum -bakteereja. Tutkittavaa näytettä ja bakteereja inkuboidaan yhdessä ja toksisten aineidc 10 mukanaolo todetaan bakteerien alentuneesta valontuottotasosta verrattuna kontrollinäytteeseen. Myös useita eläinsolutestejä on kehitetty mittaamaan toksisia tekijöitä, mutta näiden laajamittaiselle käytölle on useita esteitä, kuten esimerkiksi niidr hitaus ja monimutkainen käyttö sekä valmistus.

15

Toksisia ja mutageenisia aineita on tarpeellista pystyä määrittämään erilaisista vesistä, tällaisia ovat esimerkiksi jätevesi talousvesi, raakavesi, pohjavesi, virkistyskäyttöön tarkoitetui vedet, teollisuuden prosessivesi, elintarvikkeiden valmistus-20 prosesseissa käytetty vesi ja lääketeollisuudessa käytettävä raakavesi. Myös maanäytteistä ja ilmanäytteistä on yhä lisääntyvä tarve saada määritetyksi toksisia ja mutageenisia tekijöitä. Elintarviketeollisuudessa käytettävien raaka-aineiden, ravintoaineiden ja nautintoaineiden laadun kontrollointiin 25 kiinnitetään suurta huomiota.

Keksintö perustuu aiemmin tunnettuihin ja hyväksyttyihin periaatteisiin geenien ilmentymiseen eli ekspressioon vaikuttavistc säätelytekijöistä ja niiden käyttöön yhdistelmä-DNA-tekniikalli 30 tuotetuissa eliöissä kuten esimerkiksi bakteereissa ja hiivoissa.

Keksinnön oleelliset tunnuspiirteet on esitetty oheisissa : : ' patenttivaatimuksissa.

35

Geeniteknologia on tehnyt mahdolliseksi bakteerien ja hiivojen käytön tuotto-organismeina sellaisillekin valkuaisaineille, joita nämä mikrobit eivät normaalisti tuota. Näihin tarkoituksiin on valmistettu erilaisia yhdistelmä- 8 8 8 3 C 9 DNA-plasmideja, jotka ovat kromosomin ulkopuolisia ja tätä paljon lyhyempiä rengasmaisia DNA-molekyylejä. Yhdistelmä-DNA-plasmidit voivat sisältää useita eri geenejä ja ne pystyvät lisääntymään itsenäisesti. Yhdistelmä-DNA-plas-5 miditekniikka on yleisimmin käytetty tapa siirrettäessä vieraita geenejä bakteerisoluihin. Haluttu geeni voidaan liittää erityisillä restriktioentsyymeillä plasmidiin. Plasmidin siirtäminen bakteerisoluun suoritetaan yleensä transformaatiolla, jossa bakteerisolun seinämä on tehty 10 plasmidia läpäiseväksi. Eukaryoottisoluissa käytetään yhdistelmä-DNA-vektoreita, jotka sisältävät prokaryoottista, virusperäistä ja eukaryoottisolun DNA:ta sopivasti yhdistettynä samassa vektorissa. Eukaryoottisoluihin saadaan yhdis-telmä-DNA-vektoreja siirrettyä esimerkiksi elektroporaatiol-15 la ja Ca-saostustekniikalla.

Yhdistelmä-DNA-plasmideja, joissa vieraan, rekombinantti-proteiinin tuotto on asetettu voimakkaan promoottorin kontrollin alaiseksi, on viime vuosina kehitetty erittäin pal-20 jon. Kaikissa tapauksissa pyrkimyksenä on ollut saada aikaan mahdollisimman suuri vieraan proteiinin tuotto uusissa tuottajaorganismeissa kuten E. colissa. Näissä tapauksissa haluttua proteiinia voidaan tuottaa jopa 25 % bakteerin koko proteiinimäärästä (Caulcott & Rhodes, 1986, 25 Trends in Biotech., June, 142-146). Tuotettaessa näin suuria määriä vierasta proteiinia on hyvinkin todennäköistä, että tämä tuotto on haitallista bakteerille ja sen aineenvaihdunnalle. Haitallisuuden kannalta onkin kehitetty plasmideja, joissa vieraan proteiinin tuotto on asetettu 30 säädeltävissä olevan promoottorin kontrollin alaiseksi.

Tällöin proteiinin tuotto voidaan kytkeä päälle halutussa mikrobin kasvuvaiheessa. Näissä tapauksissa kasvatus suoritetaan mikrobia stressaamattomissa olosuhteissa riittävän kauan, jolloin mikrobikasvusto ehtii saavuttaa sopivan 35 solutiheyden. Tämän jälkeen kytketään päälle halutun proteiinin tuotto esimerkiksi lisäämällä kasvuliemeen kemiallinen kytkentämolekyyli tai suoritetaan kytkentä fysikaalisin keinoin, kuten lämpötilan kohottamisella. Kuvassa 6 9 8830^ on esitetty plasmidi pCSS108 (Korpela & Karp, Biotechnol. Lett., 10(6), 1988, 383-388), jota käyttäen bakteerilusi-feraasin tuotto saadaan aikaan lisäämällä IPTG-niminen kemikaali, joka kytkee ko. proteiinin tuoton päälle kloonatussa 5 E. colissa.

Käytetyissä plasmideissa kussakin on tietty resistenssi-tekijä, jonka avulla voidaan valita vain plasmidin sisältämä solukanta hyvinkin suuresta solupopulaatiosta. Resistens-10 sitekijä auttaa solua selviytymään olosuhteissa, jotka ovat muille soluille myrkylliset. Myrkyllinen tekijä lisätään kasvuympäristöön muiden kuin halutun solun kasvun ehkäisemiseksi. Resistenssitekijä voi olla tietty geeni, jonka koodaama proteiini hajottaa tai inaktivoi muuten kasvuympä-15 ristössä olevan myrkyllisen tekijän, kuten esimerkiksi antibiootin. Eri antibiooteille tuovan resistenssin geenejä tunnetaan useita, yleisimmin on käytetty β-laktamaasia koodittavaa geeniä. Tämän geenin toiminnan tuloksena solu hajottaa kasvuympäristössään olevan penisilliinin, tai sen 20 johdannaisen, β-laktaamirenkaan, jolloin ko. antibiootti menettää toimintakykynsä. Muita yleisesti käytettyjä geenejä ovat kloramfenikoliasetyylitransferaasia, kanamysiini-asetyylitransferaasia ja tetrahydrofolaattireduktaasia koodittavat geenit. Riippuen solutyypistä voidaan käyttää 25 myös geenejä, jotka tuovat solulle kyvyn kasvaa esimerkiksi tetrasykliinin, erytromysiinin, spektinomysiinin, strep-tomysiinin, sulfonamidien, neomysiinin, tiostreptonin, vio-mysiinin ja kolisiinien läsnäollessa. Tunnetaan myös resistenssiteki jöitä, jotka muuttavat tai poistavat kasvuympä-30 ristössä olevan raskasmetallin. Valintapaine plasmidillisten solujen eduksi voidaan myös luoda siirtämällä plasmidiin geeni, jonka tuote korvaa solun kromosomista puuttuvan ominaisuuden. Tällaisia geenejä ovat esimerkiksi aminohappojen biosynteesiteihin osallistuvat tekijät. Näissä ta-: 35 pauksissa solun kasvuympäristöstä puuttuu tietty elintärkeä aminohappo ja solu ei muutoin pysty toimimaan ellei plas-midissa sijaitsevan geenin tuote syntetisoi ko. aminohappoa tai sen biosynteesin välivaihetta. Myös muut solulle elin- 10 8 8 5 C 9 tärkeät toiminnot aiheuttavat plasmidilliselle solulle edun verrattaessa plasmidittomiin soluihin. Plasmidissa voi olla esimerkiksi tietty geeni, jonka tuote osallistuu solukalvon tai solun perimän rakennusaineiden tuottoon.

5

Eri plasmidien kopioluku solussa on useinkin hyvin erilainen vaihdellen yhdestä useaan sataan, jopa tuhanteen. Yleisimmin käytetyn plasmidin pBR322 kopioluku on noin 60, kun taas sen johdannaisen pUC8:n kopioluku on noin 500. Näin suuren 10 kopioluvun muutoksen kahden sukulaisplasmidin välillä on osoitettu johtuvan yhden emäksen muutoksesta plasmidin ns. ori-alueella (Chambers et ai., 1988, GENE, 68, 139-149). Vaikuttamalla plasmidin replikaation aloitukseen asettamalla tämä ori-alue voimakkaan ja säädeltävissä olevan promoot-15 torin kontrollin alaiseksi, voidaan keinotekoisesti kasvattaa plasmidin kopiolukua halutulla tavalla sopivasti valittuna ajankohtana. Tällä hetkellä tunnetaan useita plas-mideja, joiden kopiolukua voidaan muuttaa mikrobien kasvun kuluessa. Näitä plasmideja käytetään lähinnä teollisissa 20 prosesseissa tuottamaan vieraita rekombinanttiproteiineja huomattavia määriä. Näin ollen tähänastinen käyttö ei sulje pois tässä keksinnössä kuvattuja menetelmiä käyttää kopio-luvun muutosta erilaisten soluun vaikuttavien tekijöiden mittaamiseksi. Tässä keksinnössä käytetään esimerkkeinä 25 kolmea ns. runaway-plasmidia, joissa kopioluvun muutos on mahdollinen. Eniten tutkittuja ja käytettyjä plasmideja vieraiden proteiinien tuottamiseksi ovat ns. pOU-sarjan plasmidit, joissa plasmidin replikaation aloituskohtaa säätelevät tekijät on asetettu voimakkaan ja säädeltävän 30 lambda-faagin p^-promoottorin kontrollin alaiseksi (Larsen et ai., 1984, GENE, 28, 45-54). Lambda-p^-promoottoria säätelee repressoriproteiini cl857, joka on tuhottavissa +42°C:n lämpökäsittelyllä. Repressoriproteiinin tuotto voi tapahtua lysogeenisesta faagista, faagista, joka on kon-35 jugoitu isäntäorganismin kromosomiin, plasmidista, johon ko. proteiinia koodittava sekvenssi on siirretty tai eri inkombatibiliteettiluokkaan kuuluvasta toisesta plasmidista. Eri inkombatibiliteettiluokkien plasmideilla tarkoitetaan il 8 8 3 G 9 tässä tapauksessa plasmideja, jotka kykenevät monistumaan ja jakautumaan itsenäisesti toisen plasmidin läsnäolosta huolimatta samassa solussa. Kun repressoriproteiini on tuhottu, pn-promoottori kytkeytyy päälle ja alkaa tuottaa 5 kontrolloimattomasti matalan kopioluvun Rl-plasmidista peräisin olevia copB- ja repA-proteiineja sekä näiden ja copA-geenejä vastaavia transkriptiotuotteita. Nämä tekijät ja erityisesti voimakas repA-proteiinin ylituottaminen aikaansaavat lisääntyneen ja jopa kontrolloimattoman pOU-10 pohjaisen plasmidin tuoton E. coli -bakteereissa.

Hiivat kuten bakteeritkin ovat yksisoluisia, mutta hiivat eroavat bakteereista siinä, että ne ovat eukaryoottisoluja. Verrattuna korkeampiin eukaryoottisoluihin hiivat ovat 15 geneettisiltä ominaisuuksiltaan paljon paremmin tunnettuja. Saccharomvces cerevisiaen ja Schizosaccharomvces bombein geneettinen kartta tunnetaan jo yksityiskohdittain (Petes, 1980, Molecular Genetics of Yeast, Ann. Rev. Biochem., 49, 845-876). Myös hiivojen kloonausmenetelmät tunnetaan hyvin 20 ja ne ovat erittäin tehokkaita. Hiivasolut ovatkin erittäin yleisesti käytettyjä kloonausisäntiä.

Hiivoilla on erotettu neljä erilaista yhdistelmä-DNA-vek-torityyppiä: integroituvat plasmidit (YI*,), episomaaliset 25 plasmidit (YEp), replikoituvat plasmidit (YR*») ja keinotekoiset kromosomit. Hiivan integroituvat plasmidit voivat sisältää bakteeriperäistä DNA:ta ja hiivan geeni(e)n osan-/osia. Tämä plasmidityyppi sitoutuu tarkasti tiettyyn kohtaan hiivasolun kromosomaalisessa DNA:ssa. Replikoituvat 30 hiivan plasmidit sisältävät DNA:ta bakteereista, hiivan geenin osan ja erityisen alueen hiivan kromosomaalisesta DNA:sta, joka sisältää ko. plasmidin replikoitumisen aloituskohdan. Tämä replikoitumista ohjaava alue sallii plasmidin jakautumisen kromosomin ulkopuolisena DNA-molekyylinä 35 hiivasolussa. Hiivan episomaaliset plasmidit sisältävät bakteeriperäisen DNA-jakson, hiivasolun geenin ja kokonaisen tai osan hiivan nk. 2 mikronin plasmidia (Hollenberg, 1982, Current Topics in Microbiology and Immunology, 96, 119-144).

12 8 8 3 ϋ 9

Keinotekoiset kromosomit ovat lineaarisia DNA-vektoreita. Nämä vektorit eivät sovellu hyvin proteiinien ekspressiovek-toreiksi.

5 Hiivalle on kuvailtu plasmidirakennelma, jonka kopiolukua voidaan säädellä. Hiivan sentromeerit ovat alueita, jotka vaaditaan hiivan kromosomin jakautumisessa mitoosin ja meioosin aikana. Sentromeeri-DNA (CEN3) on eristetty ja se on siirretty glukoosilla repressoituvan alkoholidehydro-10 genaasipromoottorin (ADH2) säätelyn alaiseksi. Näin saadun plasmidin CEN3 toimintaa voidaan säädellä käytetyn hiili-lähteen avulla hiivassa. Käytettäessä glukoosia hiililäh-teenä ADH2-promoottori on repressortunut ja tällöin CEN3 toimii normaalisti tasapainottaen mitoosissa käytetyn plas-15 midirakenteen (YR*,). Jos hiililähde vaihdetaan kasvulie-messä YR^-plasmidia alkaa kerääntyä soluun, jolloin kopio-luku saattaa nousta jopa sataan (Chlebowicz-Slediewska, E.

& Sledziewska, A., 1985, GENE, 39, 25-31).

20 Hiivoissa käytettävinä ekspressiovektoreina ovat seuraavat säädeltävät promoottorit osoittautuneet erittäin käyttökelpoisiksi: alkoholi-isoentsyymi I:n (ADHI) geenin promoottori, fosfoglyserolikinaasin (PGK) promoottori, repressoituvan happaman fosfataasin (PH05) promoottori ja alfa-fak-25 torin promoottori. ADHI on hiivan sytoplasminen entsyymi, joka tuottaa etanolia asetaldehydistä ja tarvitsee tähän synteesiin myös NADHsta. Kun hiivasoluja kasvatetaan glukoosin läsnäollessa niin ADHI:tä on vähintään 1 % hiivasolun kokonaisproteiinimäärästä. PGKsn promoottorin toimintaa 30 taas voidaan säädellä hiivan hiililähteen (esim. glukoosin) avulla, joka aktivoi promoottorin alaisen entsyymin ekspressiota. PH05:n ekspressio voidaan estää epäorgaanisen fosfaatin avulla; tämän promoottorin toiminta aktivoidaan poistamalla epäorgaaninen fosfaatti hiivasolujen kasvatus-35 liuoksesta. PH05:n säätely tapahtuu erityisen säätelykom-pleksin avulla, joka muodostuu PH02, PH04, PHO80 ja PH085 geenituotteista (Bosfiana, K.A., 1980, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, 77, 6541-6545). Myös eräitä mutantteja (PH04:ssä 13 8 8 309 ja PHO80:ssä) tunnetaan, jotka ovat aktivoitavissa yksinkertaisella lämpötilan muutoksella. Nämä mutanttihiivasolut kasvavat +35°C:ssa, mutta eivät tuota hapan fosfataasi -entsyymiä edes fosfaatin puuttuessa kasvatusliuoksesta.

5 Kun lämpötilaa lasketaan +23°C:een, hapan fosfataasia tuotetaan hiivasoluissa runsaasti kasvatusliuokseen fosfataasin läsnäollessa tai ilman sitä. Tällaisella lämpötilan muutoksella säädeltäviä mutanttikantoja on käytetty tuottamaan esim. interferonia, kun interferonia koodaava DNA-jakso on 10 hiivan replikoituvassa plasmidissa säädeltävän repressoi-tuvan hapan fosfataasi PH05:n alaisuudessa (Kramer, R.A., DeChiara, T.M., Schaber, M.D. ja Hilliker, S., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. OSA, 81, 367-370). Lämpötilan muutoksella saatiin tarkasti säädeltyä interferonin ekspressiota hiiva-15 solussa.

Korkeampien eukaryoottisolujen käyttäminen yhdistelmä-DNA-vektorien isäntäsoluina haluttaessa tuottaa proteiineja on nopeasti kehittyvä alue. Yleinen periaate kehitettäessä 20 ekspressiosysteemejä on se, että niillä voitaisiin tuottaa haluttuja eukaryoottiproteiineja suuressa mittakaavassa. Optimaalisella ekspressiosysteemillä olisi mahdollista tuottaa proteiineja useissa eri solutyypeissä. Täysin säädeltävissä oleva proteiinien ekspressiosysteemi olisi 25 ihanteellinen ratkaisu. Yleisimpien säädeltävien promoottorien käyttö on rajoittunut suhteellisen harvoihin isäntä-soluihin. Usein myös promoottorien säädeltävyys on puutteellista tai ekspressiovektorit on rakennettu tuumoreita aiheuttavien virusten DNA:sta, jolloin niiden käytöllä on 30 olemassa riskitekijänsä.

Eukaryoottisoluissa geenien ekspressiota on mahdollista säädellä muun muassa seuraavilla tavoilla: Simian virus 40 (SV40) T-antigeenin, metallotioneiini-geenien, heat-shock -35 geenien, glukokortikoidisten hormonien, DNA:n metylaation ja anti-sense RNA:n avulla. SV40:n tuottama antigeeni säätelee omaa transkriptiotaan. T-antigeenia tuotetaan runsaasti välittömästi viruksen infektoitua kohdesolunsa ja 14 88309 myöhemmin T-antigeeni sitoutuu omaan promoottorialueeseensa ja estää transkription. Käytettäessä SV40-vektoreita kloonauksiin tämä T-antigeenin välittämä säätelyfunktio voidaan estää käyttämällä sopivaa lämpöherkkää T-antigeeni 5 -mutanttia. Tällaiset lämpöherkät T-antigeeni -mutantit tuottavat normaalisti T-antigeeniä korkeissa inkubointi-lämpötiloissa, kun taas huoneenlämpötilassa T-antigeenin tuotto on estynyt (Rio, D.C., Clark, S.G. & Tjian, R., 1985, Science, 227, 23-28).

10

Metallotioneiinit ovat proteiineja, jotka sitovat itseensä raskasmetalleja. Monet eukaryoottisolut alkavat tuottaa näitä proteiineja raskasmetallien läsnäollessa. Metallo-tioneiinien tuotannossa on todettu 50-kertainen kasvu, kun 15 kadmiumia lisättiin solujen kasvatusliuokseen 4xl0‘6 -mo- laariseksi pitoisuudeksi (Hamer, D.H. & Walling, M.J., 1982, J. Mol. Appi. Genet., 1, 273-288). Edellä mainittua kadmiumin indusoimaa proteiinien tuotantoa on mahdollista vielä nostaa käyttämällä kasvuliuoksia, jotka sisältävät 20 mahdollisimman vähän raskasmetalleja.

Useat niin kutsuttujen heat-shock -geenien promoottorit ovat osoittautuneet olevan toimivia ja tarkasti säädeltävissä useissa eri solutyypeissä. Näiden geenien promoottorien 25 sääteleminen tapahtuu yksinkertaisesti lämpötilaa muuttamal la. Heat-shock -geenit esiintyvät erittäin yleisesti euka-ryoottisoluissa. Nämä geenit aktivoituvat tuottamaan proteiineja korkeassa lämpötilassa kun taas normaalissa kasvatus-lämpötilassa proteiinien tuotto on vähäistä tai sitä ei ta-30 pah-du lainkaan. Parhaiten tutkittu heat-shock -systeemi on banaanikärpäsen eli Drosophila melanogasterin, jossa lämpötilan kohottaminen +25°C:sta +37°C:een aiheuttaa nopean normaalien proteiinien biosynteesin pysähtymisen ja heat-shock -proteiinien tuottamisen. Yleisin ja tunnetuin heat-35 shock -proteiini on hsp70. Näiden proteiinien ekspression säätelymekanismia ei vielä tunneta tarkasti. Näitä promoottoreja käyttämällä (Drosophilian hsp70-promoottori) on voitu kasvattaa hGH:n (humaani kasvuhormoni) tuottoa 15 8 8 3 G 9 jopa 1200-kertaiseksi aktivoimattomiin soluihin verrattuna (Dreano, M., Myers, A., Cheng-Meyer, C., Rungger, D., Voellmy, R. ja Bromley, P., 1986, GENE, 49 1-8).

5 Esillä olevassa keksinnössä käytetään hyväksi yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettuja eukaryootti- ja bakteerisoluja, jotka ovat sopivasti valittuja kantoja tai linjoja ja sisältävät tarkoituksenmukaiset yhdistelmä-DNA-vektorikon-struktiot. Kytkemällä päälle DNA:n, RNA:n ja proteiinien 10 synteesi hallitusti voidaan kaikki tekijät, jotka vaikuttavat edellä mainittuihin synteesikoneistöihin suoraan tai epäsuorasti, mitata. Mittausperustana voidaan käyttää valittua yhdistelmä-DNA-vektorin geenituotetta, markkeri-proteiinia, sen aktiivisuutta tai yleisen aineenvaihdunnan 15 tilan mittaamista. Aktivoimalla yhdistelmä-DNA-vektorin replikaatio hallitusti voidaan näin muodostunutta DNA:ta mitata suoraan esimerkiksi radioaktiivisia leimoja tai virtaussytometriaa hyväksikäyttämällä.

20 Tutkittavien yhdisteiden määrittämiseksi voidaan valmistaa sopivat yhdistelmä-DNA-vektorit riippuen siitä, mihin määritettävän yhdisteen vaikutus kohdistuu. Esimerkiksi DNA-synteesin (nukleotidien) ja DNA:n replikaation estävien yhdisteiden sekä DNA:han sitoutuvien yhdisteiden kuten 25 useiden syöpälääkkeiden määrittäminen on mahdollista ns.

runaway replication -tyyppisillä plasmideilla E. coli -bakteereilla. Kyseisessä plasmidissa on plasmidin jakautumis-alue kontrolloitu lämpöherkällä, indusoitavalla lambdan PrE-promoottorilla. Näin DNA-synteesi ja replikaatio voidaan 30 aloittaa haluttuna ajankohtana ja mitattavien yhdisteiden vaikutus nivoutuu kiinteästi tähän solunjakautumisesta riippumattomaan DNA:n hallittuun ja voimakkaaseen biosynteesiin. Jos DNA:n synteesi tai replikaatio on estynyt, ilmenee tämä plasmidin kopioluvun pysymisenä samana tai 35 jopa vähentymisenä. Kontrollisoluissa, joiden DNA-synteesi ei ole estynyt, plasmidien kopioluku kasvaa. Plasmidien kopioluvussa tapahtuvat muutokset voidaan määrittää suoraan DNA:ta mittaamalla sekä määrittämällä plasmidin geenituot- 16 8 8 3 ί teiden määrää tai aktiivisuutta. Tällaisella plasmidilla on mahdollisuus määrittää vaikutuksiltaan hyvinkin erilaisten yhdisteiden vaikutusta, koska kyseiseen plasmidiin voidaan liittää myös sopivan markkeriproteiinin tuotosta vastaava 5 geenipala voimakkaan ja säädeltävissä olevan promoottorin alaisuuteen, jonka markkerin ilmentymistä testissä mitataan. Tällöin kaikki DNA:hän, RNA:han, proteiineihin, näiden biosynteesiteihin tavalla tai toisella vaikuttavat yhdisteet voidaan määrittää. Haluttaessa kehittää mahdollisimman 10 kattava testi soluseinämiin, nukleiinihappoihin, proteiineihin ja metaboliaan vaikuttavien tekijöiden määrittämiseksi on tällainen runaway replication -plasmidi ihanteellinen. Tällöin solun annetaan jakautua ja tämän jälkeen aktivoidaan solussa olevan yhdistelmä-DNA-plasmidin replikaatiota sääte-15 levä promoottori ja markkeriproteiinin ilmentymisestä vastaava promoottori samanaikaisesti tai tietyn ajan kuluttua. Ominaisuuksiltaan samanlainen yhdistelmä-DNA-vektori on valmistettavissa myös eukaryoottisoluille.

20 Toisenlainen lähestymistapa on käyttää plasmideja, joiden replikoituminen on sidoksissa solujakautumiseen. Yhdis-telmä-DNA-plasmideja, jotka ovat solussa erittäin monena kopiona ja jotka sisältävät markkeriproteiinin voimakkaan ja säädeltävän promoottorin alaisuudessa, voidaan käyttää 25 solukalvoihin, nukleiinihappoihin, proteiineihin ja aineenvaihduntaan vaikuttavien tekijöiden määrittämiseksi. Sekä DNA:hän ja solukalvoihin vaikuttavat tekijät voidaan määrittää tällaisella testisysteemillä käytettäessä aktiivisesti jakautuvia soluja. Tällöin erittäin monena kopiona oleva 30 yhdistelmä-DNA-plasmidi syntetisoituu tytärsoluille ja systeemi on näin ollen erittäin herkkä DNA:han vaikuttaville tekijöille. Aktiivisesti jakautuvat solut ovat herkkiä myös solukalvoihin vaikuttaville tekijöille. Soluissa olevan yhdistelmä-DNA-plasmidin markkeriproteiinin ilmentymistä 35 säätelevä promoottori aktivoidaan, jolloin alkaa voimakas proteiinisynteesi ja systeemi on herkkä myös proteiinisynteesiin vaikuttaville tekijöille.

i 17 883C9

Mutageenisten aineiden vaikutusta solun perimään eli DNA:hän voidaan havainnoida keksinnössä kuvatulla periaatteella seuraamalla vajavaisen geenin (ja siten geeniä vastaavan proteiinituotteen) revertoitumista aktiiviseksi proteiinik-5 si. Menetelmällä voidaan seurata ko. tekijöiden vaikutusta käyttämällä joko aktiivisesti jakautuvia soluja tai jos on tarve voidaan myös hyödyntää nopeaa testiä käyttämällä keksinnössä kuvattua runaway replication -pohjaista systeemiä .

10

Erityisenä sovellutuksena, käytettäessä lusiferaasigeenejä plasmidissa, on solun energiametaboliaan vaikuttavien yhdisteiden määrittäminen. Tämä on mahdollista, koska lusife-raasientsyymin katalysoima reaktio vaatii solun aineenvaih-15 dunnan energiarikkaita yhdisteitä. Tekijät, jotka voivat vaikuttaa solun energiametaboliaan millä tahansa biosyn-teesitasolla (replikaatio, transkriptio, translaatio) tai aineenvaihdunnassa, voidaan määrittää bioluminesenssin eli valonmuodostuksen avulla.

20

Toisaalta solun energiametaboliaan vaikuttavien tekijöiden vaikutus voidaan määrittää kuvaamallamme testiperiaatteella, koska DNA:n ja RNA:n synteesit vaativat runsaasti energiaa ja ovat näin ollen mitattavissa. Erityistapauksena voidaan 25 pitää bakteerilusiferaasi-proteiinia, joka käyttää solun keskeisiä aineenvaihduntatuotteita, NAD(P) ja FMNHa, hyväkseen. Tällöin saadaan myös solun aineenvaihdunta kytkettyä plasmidiin siirretyn proteiinituotteen määrän tai aktiivisuuden määrittämiseen.

30

Keksinnön luonne tekee mahdolliseksi hyvin erilaiset mittaustavat, esimerkiksi spektrofotometriset, luminometriset, ja silmämääräiset määritykset. Spektrofotometriset määritykset voivat tulla kyseeseen silloin, kun plasmidissa on 35 geeni, jonka tuotteen aktiivisuus voidaan mitata väriä · muuttavan substraatin avulla, esimerkkinä voivat toimia beetta-galaktosidaasi, alkalinen fosfataasi, amylaasit tai peroksidaasi-entsyymit. Luminometrinen määritys suorite- 18 8 8 3 C 9 taan esimerkiksi bakteerilusiferaasigeenin sisältämän plas-midin avulla. Lusiferaasin mittauksessa on hyvänä puolena valon mittauksen herkkyys verrattuna esimerkiksi spektro-fotometrisiin määrityksiin. Yksinkertaisen väri-indikaat-5 torin käyttäminen taas on perusteltua tapauksissa, joissa herkkyys ei ole tärkein kriteeri, vaan menetelmän yksinkertaisuus ja nopeus. Mitattaessa solun aineenvaihdunnassa tapahtuvia muutoksia voidaan käyttää esimerkiksi tetrazol-iumsuoloja, jotka muodostavat pelkistyessään vaikeasti 10 liukenevan formazan-punavärin. Myös immunologiset määritysmenetelmät (vasta-aineet) liitettynä herkkiin mittaussys-teemeihin (RIA, FIA) ovat mahdollisia. Samoin radioaktiivisten leimojen ja virtaussytometrian käyttäminen testin lopputuloksen toteamisessa on mahdollista.

15

Yhdistelmä-DNA-vektorin kopioluvun muutokseen perustuva menetelmä:

Solu rakentaa perimäaineksensa eli DNA:n deoksiribonukleo-20 tiditrifosfaateista. Solussa voi esiintyä myös kromosomin ulkopuolista eli episomaalista DNA:ta, joka sijaitsee plas-mideissa. Plasmidien monistuminen ei ole riippuvainen solun jakautumisesta, vaan kullakin plasmidilla on oma menetelmä monistua ja jakautua tytärsoluihin solunjakautumisen yh-25 teydessä. Plasmidi käyttää kuitenkin solun DNA:n monistus-eli replikaatiokoneistoa omaan replikaatioonsa.

Kuvassa 1 on esitetty kaaviokuva kopioluvun muuttamiseen perustuvasta menetelmästä, jossa solun sisältämä erityis-30 plasmidi (esim. runaway replication -plasmidi (pCSS123)) saadaan hallitusti sopivana ajankohtana monistumaan voimakkaasti. Alkutilanteessa solu sisältää kuvattua plasmidia harvoina kopioina. Tutkittavan tekijän annetaan vaikuttaa riittävän pitkän ajan soluihin, jotka sisältävät ko. eri-35 tyisplasmidin. Tämän jälkeen plasmidin monistuminen kytketään päälle ja plasmidi monistuu niin voimakkaasti kuin se on mahdollista tutkittavan tekijän läsnäollessa. Plasmidin monistuminen saadaan aikaan lisäämällä kasvuliemeen esimer- is 883C9 kiksi kemiallinen kytkentämolekyyli tai suorittamalla kytkentä fysikaalisin keinoin kuten kohottamalla lämpötila +42°C:een. Samanaikaisesti tai sen jälkeen, kun plasmidin monistuminen on kytketty päälle, voidaan aktivoida myös 5 halutun geenin ilmentyminen samasta erityisplasmidista.

Tällöin plasmidin monistumisen aste voidaan suoraan määrittää mittaamalla tuotetun markkeriproteiinin määrää tai sen aktiivisuutta, joka on riippuvainen plasmidin kopioluvusta solussa. Kuvassa 1 tämä on esitetty plasmidista tuotetun 10 proteiinin entsyymiaktiivisuuden määrittämisenä soluista. Tämä mahdollistaa myös RNA:n synteesiin, translaatioon, vaikuttavien tekijöiden tutkimisen kuvatulla plasmidin monistumiseen perustuvalla menetelmällä. Plasmidin monistumiseen perustuvaa menetelmää voidaan näin ollen käyttää 15 hyväksi määritettäessä tai tutkittaessa muun muassa seuraa-viin kohteisiin vaikuttavia tekijöitä: DNA:n synteesi, replikoituminen, RNA:n synteesi, transkriptio, translaatio, soluseinämät sekä spesifiset metaboliatiet että entsyymiaktiivisuudet.

20

Kuvassa 2 on esitetty ylimalkaisesti plasmidin kopioluvun muutokseen perustuvan menetelmän mahdollisuuksia määrittää solun eri synteesikoneistoihin ja reaktioihin vaikuttavia tekijöitä. DNA:n, RNA:n ja proteiinin biosynteesit ovat 25 monivaiheisia ja ne vaativat usean eri tekijän keskinäistä vuorovaikutusta. Kullakin vaiheella on sekä luontaisia että keinotekoisia vaikuttajayhdisteitä, jotka joko aktivoivat tai estävät toiminnan. Nalidiksiinihappo esimerkiksi vaikuttaa DNA:n replikaatioon, estäen DNA-polymeraasin 30 toiminnan.

Huomionarvoinen seikka on se, että menetelmässä lähdetään liikkeelle muutamista säädeltävissä olevista DNA-molekyy-leistä, jotka voidaan saada monistumaan haluttuna ajankoh-35 tana ilman, että se olisi mitenkään riippuvainen itse solun jakautumisesta. Tämä mahdollistaa jakautumattomienkin solujen käyttämisen erilaisten tekijöiden testaukseen, jolloin määritykseen kuluvaa aikaa ei rajoita solujen hidas 20 8 8 3 G 9 jakautuminen. Tämän menetelmän keksinnöllisyys perustuu plasmidin DNA:n, perimäaineksen, hallittuun monistumiseen ja tämän mahdollistamaan erittäin laajojen yhdisteryhmien ja tekijöiden tutkimiseen.

5

Keksinnössä käytetään hyväksi säädeltävissä olevia promoottoreita ja näiden promoottorien säätelemiä toimintoja, kuten esimerkiksi yhdistelmä-DNA-vektorin kopioluvun kasvattamista ja/tai valittujen markkeriproteiinien tuottamista soluissa 10 halutulla hetkellä. Promoottorit sisältävät alueen, johon RNA-polymeraasi-entsyymi voi sitoutua, sekä erityisen sää-telyproteiinin tai muun molekyylin kiinnittymiseen tarkoitetun alueen. Promoottoreilla tarkoitetaankin yksinkertaisesti DNA:ssa olevaa yksikköä, joka kontrolloi sen vieressä 15 tai lähistöllä sijaitsevan geenin ekspressiota. Kytkeytyviä promoottoreita E. coli -bakteerilla ovat esimerkiksi lac-. trp-, hybridipromoottori tae ja lambda-faagin pL- ja pR-pro-moottorit. Nämä promoottorit eroavat toisistaan muun muassa voimakkuudessa ja kytkentätavassa. lac- ja trp-promoottorit 20 voidaan kytkeä päälle kemiallisilla yhdisteillä, kun taas px.-promoottorin kytkeminen päälle voidaan suorittaa yksinkertaisesti lämpötilaa kohottamalla.

Toksisten aineiden määritys menetelmällä, jossa käytetään 25 hyväksi hallitusti aktivoitua valkuaisaineen biosynteesiä vhdistelmä-DNA-plasmidissa olevalla säädeltävällä promoottorilla ;

Solun toinen perimäaines DNA:n ohella on RNA, erityisesti 30 ns. lähetti-RNA (mRNA). Lähetti-RNA:ta syntetisoidaan solussa, ribonukleotiditrifosfaateista, joita on solussa varastoituneena. Lähetti-RNA:ta syntetisoidaan DNA-mole-kyylin kunkin geenin mukaiseksi erityisessä transkriptio-koneistossa, johon osallistuu tästä toiminnasta vastaavia 35 molekyylejä. Valkuaisainetta eli proteiinia valmistetaan lähetti-RNA-molekyylien toimiessa malleina yleisesti tunnettujen hypoteesien mukaisesti. RNA:n synteesi on mahdollista kytkeä päälle hyvin nopeasti, kuten myös RNA:n koodittaman 2i 883C9 proteiinin synteesi. Keksinnössä käytetään hyväksi erityisiä yhdistelmä-DNA-plasmideja, jotka on valmistettu niin, että ne voidaan saada tuottamaan haluttaessa erittäin paljon sopivasti valikoituja proteiineja. Tässä tapauksessa eri-5 tyisplasmidi on rakennettu niin, että plasmidin kopiolukua ei voida säädellä, vaan se on käytetylle plasmidille ominainen käytettävässä mikrobissa. Pyrkimyksenä on käyttää tässä tapauksessa sellaisia plasmideja, joiden kopioluku on mikrobissa erittäin suuri, jolloin proteiinin tuotto on 10 erittäin suurta. Kun tällaisiin erityisplasmideja sisältäviin soluihin vaikutetaan RNA:n tai proteiinien tuottoa inhiboivilla tekijöillä, kuten esimerkiksi antibiooteilla, ennen erityisplasmidin proteiinituotannon indusoimista, voidaan indusoinnin jälkeisestä muuttuneesta proteiinin 15 tuotosta arvioida antibiootin määrää, vaikutusmekanismia tai ylipäätään antibiootin mukanaoloa systeemissä. Keksinnön ideaa sovelletaan tässä tapauksessa altistamalla mikrobi tekijöille, jotka vaikuttavat sellaisiin biosynteesiteihin, jotka käynnistetään spesifisesti ja tarkasti säädellystä 20 vaikuttavien tekijöiden läsnäollessa. Tällöin, kun käytetään keksinnössä kuvatun kaltaisia yhdistelmä-DNA-plasmi-deja, saadaan sopivasti valitun proteiinin tuotto vaikuttavista tekijöistä riippuvaiseksi.

25 Merkille pantavaa on samaten se, että tällaisella yhdis-telmä-DNA-plasmidin sisältämällä mikrobilla voidaan myös määrittää DNAshan ja solukalvoihin vaikuttavia tekijöitä. Tämä on mahdollista siten, että mikrobin jakautuessa se joutuu syntetisoimaan näitä erittäin monena kopiona olevia 30 erityisplasmideja ja tällöin erityisplasmidit ovat alttiina DNAthan vaikuttaville tekijöille. Aktiivisesti jakautuvat solut ovat erityisen alttiita myös soluseinämiin ja niiden biosynteesiin vaikuttaville tekijöille.

35 Kuvassa 3 on esitetty edellä kuvatun keksinnön soveltaminen käytännössä, jolloin erityisplasmidi on hyvin monena kopiona mikrobissa. Mikrobi saatetaan kuvan tapauksessa alttiiksi biosynteesejä inhiboivalle tekijälle ja riittävän pitkän 22 883C9 vaikutusajan jälkeen erityisplasmidit hallitusti aktivoidaan tuottamaan proteiinia, joka tässä tapauksessa on entsyymi. Kuvassa esitetyt nuolen paksuudet ovat verrannollisia lähet-ti-RNA:n ja valkuaisainesynteesin tehokkuudelle ja siten 5 vaikuttavien tekijöiden efektiivisyydelle. Tapauksessa, jossa inhiboivaa tekijää on ollut mukana, entsyymin tuotto on jäänyt alhaiseksi. Vertaamalla tulosta tapaukseen, jossa vaikuttavaa tekijää on ollut tunnettuja määriä ja/tai ei lainkaan mukana, voidaan määritys suorittaa joko kvantita-10 tiivisesti tai kvalitatiivisesti. Kuvassa 4 on esitetty yksinkertaistetusti ne kohdat biosynteesiteistä, joihin vaikuttavia tekijöitä voidaan määrittää edellä kuvatun kaltaista yhdistelmä-DNA-plasmidia käyttäen, kun ei käytetä aktiivisesti jakautuvia soluja. Jos käytetään aktiivisesti 15 jakautuvia soluja määrityksessä, on mahdollista tutkia myös DNA:hän vaikuttavia tekijöitä kuten kuvassa 2 on esitetty. Erona kuvassa 1 esitettyyn menetelmään on siis se, että tässä tapauksessa ei käytetä vain muutamina kopioina olevaa yhdistelmä-DNA-plasmidia, jonka kopiolukua voidaan halut-20 taessa kasvattaa runsaasti aktiivisesti jakautumattomassa solussa.

On siis olemassa erilaisia promoottoreja, jotka voidaan kytkeä päälle sopivasti käsittelemällä. Promoottoreiden 25 voimakkuuksissa on huomattavia eroja, ja kaikki tässä keksinnössä mainitut promoottorit ovat suhteellisen voimakkaita. Kuitenkin voidaan sanoa, että pz.-promoottori on huomattavasti voimakkaampi kuin lac- ja trp-promoottorit. Lambda-faagin p^-promoottori on myös huomattavasti edellisiä 30 promoottoreita nopeampi eli kytkennän vaikutus näkyy selvästi nopeammin verrattuna mainittuihin kahteen muuhun. Osaksi mainittu nopeus voidaan selittää kytkentämolekyylin hitaalla kulkeutumisella solukalvon lävitse lac- ja trp-promoottorien tapauksessa ja edelleen kulkeutumisella solun 35 sisällä vaikutuskohtaansa (esimerkkinä voidaan mainita lac-promoottorin kytkentämolekyyli IPTG). Myös käytetyn plas-midin kopioluku selittää osaltaan kytkennän suhteellisia eroja. Plasmidin pCSS112 (ks. kuva 7) kopioluku E. coli'ssa 23 8 8 3ϋ9 on noin 60, kun taas plasmidin pCSS108 (ks. kuva 8) kopio-luku on noin kymmenkertainen. Kummassakin plasmidissa lusiferaasin tuottoa säätelee suhteellisen voimakas, repres-soituva promoottori, edellisessä tapauksessa lambda-faagin 5 ρι,-promoottori ja jälkimmäisessä tapauksessa E. coli'n laktoosioperonin lac-promoottori. Kumpaakin promoottoria säätelevät tietyt repressoriproteiinit, joita tuotetaan rajoitettuja määriä. Koska edellisessä tapauksessa käytetyn plasmidin kopioluku on huomattavasti pienempi kuin jälkim-10 mäisessä tapauksessa, on lusiferaasiproteiinin tuotto edellisessä tapauksessa paremmin kytketty pois päältä eli de-repressortunut. Näin ollen jäkimmäisessä tapauksessa lac-promoottori "vuotaa" repressoriproteiinin suhteellisen määrän vähäisyydestä johtuen, jolloin määritettävän aineen 15 tai aktiivisuuden perustaso on jo valmiiksi korkealla.

Toksisten tekijöiden vaikutus saadaan havainnollistettua tehokkaammin käytettäessä voimakasta ja nopeasti kytkeytyvää promoottoria, joka ohjaa tiettyä geeniä tai toimintaa yhdis-telmä-DNA-vektorissa.

20

Mutaaeenisten aineiden määritys vhdistelmä-DNA-vektorin hallittuun kopioluvun muutokseen tai vakioiseen kopiolukuun perustuvalla menetelmällä: 25 Mutageenisia aineita on perinteisesti määritety ns.Ames'in testeillä, joissa käytetään hyväksi Salmonellan mutanttikan-toja. Mutanttikannoissa on histidiini-aminohapon biosyn-teesitie puutteellinen siten, että biosynteesitietä koodit-tavassa kromosomaalisissa DNA-jaksoissa esiintyy yksittäisiä 30 pistemutaatioita tai ns. lukukehysmutaatioita. Kasvatettaessa näitä kantoja minimimaljoilla, joilta puuttuu his-tidiini, ei periaatteessa voi tapahtua kasvua. Jos kuitenkin kantoja käsitellään mutagenisoivilla aineilla, jotka korjaavat kyseiset muutokset kromosomaalisessa DNA:ssa 35 takaisin villityypin sekvenssiksi tai muutoin toimivaksi * - proteiiniksi, siten että solulle palautuu kyky syntetisoida histidiiniä, saadaankin aikaan kasvavia bakteeripesäkkeitä, joiden määrä on verrannollinen käytetyn mutageenisen aineen 24 8 8 3 G 9 määrään. Menetelmässä on käytetty erilaisia Salmonella-kantoja, joilla pystytään arvioimaan usean eri vaikutusmekanismin omaavia mutageenisia aineita, eli menetelmä on hyvinkin spesifinen. Menetelmän haittapuolena on pitkä 5 kasvatusaika minimimaljoilla (2 vrk) ja suuritöisyys. Menetelmää ei voida automatisoida.

Mutageenisten aineiden havainnointi ja määrittäminen voidaan suorittaa kehittämäliamme yhdistelmä-DNA-vektorin kopioluvun 10 muutokseen perustuvalla tai nk. vakioisen kopioluvun menetelmällä. Edellisessä tapauksessa määritys tehdään aktivoimalla kohdeplasmidi monistumaan mutageenisen tekijän vaikutettua, jolloin mahdollinen vaikutus moninkertaistuu ja lopputulos voidaan määrittää nopeasti ja herkästi. Tässä 15 tapauksessa ei aktiivinen solunjakautuminen ole välttämätöntä, koska keksimässämme menetelmässä käytetään isäntä-solun jakautumisesta riippumattomia, säädeltävästi monistuvia plasmideja. Tässä systeemissä on myös edullista, että valkuaisaineen tuotto on erittäin vahvan promoottorin sää-20 telyn alaisena. Jälkimmäisessä tapauksessa, jossa käytetään vakioisen kopioluvun omaavia soluja, tarvitaan useimmissa tapauksissa mutageenisten aineiden määrittämiseksi aktiivisesti jakautuvia soluja. Määrityksessä lopputuloksen esim. mutageenisen aineen aikaansaama aktiivisen entsyymin 25 muodostuminen aktivoidaan erityisillä säädettävillä promoottoreilla erityisissä yhdistelmä-DNA-plasmideissa. Tällainen keino nopeuttaa määritystä myös merkittävästi ja lisää määrityksen herkkyyttä.

30 Esimerkkinä tässä keksinnössä lusiferaasia koodittaviin geeneihin on yhdistelmä-DNA-teknisin keinoin aikaansaatu pistemutaatioita siten, että tuotettava proteiini ei ole funktionaalinen eikä näin ollen tuota valoa. Käsiteltäessä näitä uusia mikrobikantoja mutageenisilla aineilla voidaan 35 valontuottokyky palauttaa, jolloin saadaan selvä korrelaatio mutageenisen aineen määrälle ja valontuotolle. Edelleen, mutaatiot lusiferaasigeeneissä voidaan valita siten, että menetelmällä havaitaan eri mutageenisten aineiden luokat.

25 8 8 3 C 9

Keksinnössä käytetyt solukannat. plasmidit ia niiden rakentaminen sekä menetelmät; 5 E. coli JM103 (Alac-pro, thi, strA, supE, endA, sbsB!5.

hsdR4 (F'traD34, proAB, lacI^Z ΔΜ15) (Messing et ai., Nucl. Acids Res., 9., 1981, 309-321), MC1061 (cl+) (Casadaban & Cohen, J. Mol. Biol, 138, 1980, 179-207) ja K-12 (M72 SmR-lacZamAbio-uvrB troEA2 (Nam7Nam53cl857ÄHl) (Remaut et ai., 10 1981, Gene, .15., 81-93) käytettiin geeninsiirtoisäntinä ja toksisuuskokeissa. Solut kasvatettiin asianmukaisilla minimimaljoilla ja maljoja säilytettiin korkeintaan 1 kuukausi +4°C:ssa, minkä jälkeen vedettiin uudet maljat. Kantoja säilytettiin myös -70°C:ssa 15 % glyserolissa, josta 15 tarpeen vaatiessa aloitettiin kasvatus minimimaljän kautta. Plasmidien eristystä varten soluja kasvatettiin ensin 5 ml:n tilavuudessa (2xTY-mediumia, kuvattu jäljempänä) 10 tuntia 30°C:ssa ravistellen, ja alkukasvatus siirrettiin isompaan tilavuuteen samaa mediumia 10 tunniksi.

20

Kuvissa 5a ja 5b on esitetty yhdistelmä-DNA-plasmidin pCSS123 (tallennettu DSM-numerolla 5119) rakentaminen ja valmistus. Plasmidi pWH102 pilkottiin restriktioentsyymeillä Sali ja PvuII. Katkaistu plasmidi pWH102 ajettiin agaroosi-25 geeli-elektroforeesilla. Tämän jälkeen erotettiin 2300 emäsparin mittainen pala matalassa lämpötilassa sulavalta geeliltä leikkaamalla se ultraviolettivalossa. Saatu pala sulatettiin 65°C:ssa ja se liitettiin ligaasientsyymin avulla samoilla restriktioentsyymeillä katkaistuun plas-30 midiin pEMBL19 (-) (Dente et ai.. 1983, Nucleic Acids Res., 11, 1645-1655). Saatu rakennelma siirrettiin myöhemmin kuvatulla tavalla E. coli JM103 -bakteerikantaan. Tehtiin yhdistelmä-DNA-plasmidien eristys pienessä mittakaavassa, kuten on kuvattu (Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning: 35 A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor), ja todettiin restriktioentsyymikatkaisuin . · oikea plasmidirakennelma. Plasmidieristys suuremmassa mittakaavassa tehtiin saman kirjan ohjeiden mukaisesti.

26 8 8 3 C 9

Saatu plasmidirakennelma pCSSlll (kuva 5a) katkaistiin restriktioentsyymillä PvuII ja 2400 emäsparin mittainen DNA-pala erotettiin, kuten edellä on kuvattu. Tämä pala liitettiin edellä kuvatulla tavalla restriktio-entsyymillä 5 BamHI-katkaistuun plasmidiin pOU61 (Larsen et ai.. 1984,

Gene, 2S./ 45-54) sen jälkeen, kun DNA-palan päät oli tasattu DNA-polymeraasientsyymin avulla asianmukaisessa puskuriseok-sessa. Ligaatioseos siirrettiin myöhemmin kuvatulla tavalla E♦ coli JM101 -bakteerikantaan ja oikean plasmidirakennelman 10 sisältävät bakteeripesäkkeet valittiin transformaatiomal-joilta pimeähuoneessa pipetoimalla maljan kanteen 5 μΐ 10 % dekanaalia, joka höyrystyessään aiheutti lusiferaasi-geenit sisältävien pesäkkeiden valoa tuottavan ominaisuuden.

15 Käytetyt symbolit ja lyhenteet: amp^ = β-laktamaasigeeni, ori = plasmidirakennelman monistumisen aloituskohta, lux A ja B = lusiferaasiproteiinia koodittavat geenit, IacP = E. coli'n laktoosioperonin promoottori, Fl(IG) = faagin F1 intergeeninen alue, MCS = monelle restriktioentsyymille 20 soveltuva DNA:n katkaisualue, joka on peräisin yhdistelmä-DNA-plasmidista pUC18 (Yanisch-Perron et ai., 1985, Gene, 33., 103-109), kb = tuhat emäsparia, repA. copA ja copB = geenit, joiden proteiinituotteet vastaavat plasmidin kopio-luvusta ja jakautumisesta tytärsoluihin, CI857 = lambda-25 faagin lämpöherkkä repressori, pR = lambda-faagin oikeanpuoleinen promoottori. Restriktioentsyymien lyhenteet: R = EcoRI, H = Hindlll, B = BamHI, S = Sali, P = PvuII, Sa = Sacl, K = Kpnl, Sm = Smal, X = Xbal, Ps = PstI, Sp = SphI. B/P = liittämiskohta BamHI, tasatut päät, PvuII.

30

Kuvassa 6 on esitetty plasmidi pCSS108 (Korpela & Karp, Biotechnol. Lett., 10(6), 1988, 383-388), jota käyttäen bakteerilusiferaasin tuotto saadaan aikaan lisäämällä IPTG-niminen kemikaali, joka kytkee ko. proteiinin tuoton päälle 35 sitoutumalla lac-repressoriproteiiniin.

Kuva 6. Yhdistelmä-DNA-plasmidin pCSS108 rakenne.

27 883C9

Vibrio harvevi -bakteerin lusiferaasigeeni siirrettiin plasmidirakennelmasta pWH102 (Gupta et ai. . 1985, Arch. Microbiol., 143. 325-329) katkaisemalla ko. plasmidi re-striktioentsyymillä BamHI. Saadut kaksi DNA-palaa käsitel-5 tiin entsyymillä alkalinen fosfataasi (CIP) pääte-fosfaat-tiryhmien poistamiseksi, jotta palat eivät pääse uudelleen liittymään toisiinsa. Palat erotettiin toisistaan ajamalla matalassa lämpötilassa sulava agaroosigeelielektroforeesi-laitteistossa. 5000 emäsparin mittainen pala leikattiin 10 irti (suurempi pala), ja geeli sulatettiin kuumentamalla 65°C:ssa 15 minuuttia. Sulassa tilassa oleva DNA laimennettiin puskurilla ja osa tästä lisättiin restriktioentsyymillä BamHI katkaistun yhdistelmä-DNA-plasmidin pEMBL 18 (+) (Dente et ai. . 1983, Nucleic Acids Res., .11., 1645-1655) 15 joukkoon. Ligaasientsyymillä liitettiin saadut DNA-palat toisiinsa ympyränmuotoiseksi rakennelmaksi ja ne siirrettiin myöhemmin kuvatulla tavalla E. coli JM103 -bakteerikantaan. Valoa tuottavat pesäkkeet havainnoitiin pimeähuoneessa silmävaraisesti levittämällä 5 μΐ 10 % n-dekanaalia kas-20 vumaljan kanteen. Käytetyt symbolit: kuten kuvassa 5.

Plasmidin pCSS112 (tallennettu DSM-numerolla 5120) rakenne ja valmistus on esitetty kuvassa 7. Kyseisessä plasmidissa lusiferaasigeenit on asetettu lambda-faagin p^-promoottorin 25 toiminnan alaiseksi. Sopivassa isännässä, kuten K-12AHIAtrp (cl857), ko. promoottorin toimintaa säätelee lämpökäsittelyllä tuhoutuva lambda-faagin repressoriproteiini CI857. Plasmidi pWH102 katkaistiin restriktioentsyymeillä Sali ja BamHI. Plasmidi pPLcATUO (Stanssens et ai. . 1985 Gene, 30 ^6., 211-233, osaksi julkaisematon) katkaistiin restriktio entsyymeillä Sali ja Bglll. Saadut DNA-palat erotettiin geelielektroforeesilla siten, että katkaistusta plasmidista pWH102 eristettiin noin 4000 emäsparin mittainen DNA-pala ja plasmidista pPLcATUO eristettiin noin 2900 emäsparin 35 mittainen pala. Saadut DNA-palat liitettiin toisiinsa

ligaasientsyymin avulla ja siirrettiin E. coli MC1061 (cl+) -bakteerikantaan. Haluttu plasmidirakennelma etsittiin kuten edellä on kuvattu ja siirrettiin E. coli K-12ÄtrpAHI

28 3 8 3C9 (c1857 ) -bakteerikantaan. Käytetyt symbolit ja lyhenteet: kuten kuvassa 5, lisäksi pl = faagin lambda vasemmanpuoleinen promoottori, Pv = Pvul.

5 Yhdistelmä-DNA-plasmidien siirto E. coli -kantoihin:

Yhdistelmä-DNA-plasmidit siirrettiin ns. CaCl2~käsiteltyihin soluihin siten, että yli yön kasvatetuista bakteereista siirrettiin 5 ml:n kasvusto 2xTY:ssä (NaCl 8 g, hiivaeks-10 trakti 8 g, tryptoni 16 g, H2O ad 1 1, pH 7,4) 100 ml:aan samaa kasvatusliuosta. Bakteereja kasvatettiin noin 2 tuntia, kunnes absorbanssi mitattuna 600 nm:ssä oli 0,8. Solut jäähdytettiin jäähauteella ja sentrifugoitiin 4000xg:ssä 5 min. Solupelletti suspendoitiin 50 ml:aan 50 mM CaC^sa 15 jäähauteella, minkä jälkeen sentrifugoitiin alas 3000xg, 5 min 0°:ssa. Solut suspendoitiin 4 ml:aan 50 mM CaCl2sa/ johon oli lisätty glyserolia 15 %:ksi. Nämä ns. kompetentit solut jaettiin 1 ml:n eriin ja jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja säilytettiin -70°:ssa myöhempää käyttöä 20 varten.

E. coli-kantoien transformointi yhdistelmä DNA-plasmideilla: 250 /kfl kompetentteja soluja lisättiin jäähauteella kylmen-25 nettyihin putkiin, joissa oli puhdasta plasmidi-DNA:ta tai ns. ligaatioseosta 1-10 1 ja 26 1 lOxTMC (100 mM Tris- HC1, pH 7,4, 100 mM MgCl2, 100 mM CaCl2). Putkia sekoitettiin varovaisesti ja pidettiin jäähauteella 10 min.

Tämän jälkeen soluja ravisteltiin +42°C:ssa 2 min. Tämän 30 jälkeen lisättiin 1 ml 2xTY-kasvatusliuosta ja ravisteltiin 1 tunti +30°C:ssa. Ligaatioseoksilla transformoidut solut sentrifugoitiin alas 3 min 8000xg:ssä ja suspendoitiin noin 100 /4l:aan sentrifugoitua supernatanttia ja levitettiin antibioottiselektio-maljoille. Transformoidut solut levi-35 tettiin antibioottimaljoille.

Kaksinauhaisen DNA:n emäsjärjestyksen määrittäminen: 29 883C9

Noin 4 μg kaksinauhaista standardimenetelmillä puhdistettua DNA:ta (esimerkiksi CsCl-gradientti) lisätään 2 μ1:33η 2 M NaOHrta. Annetaan seistä 5 min huoneenlämpötilassa ja lisä-5 tään 3 μΐ 3 M Na-asetaattia, pH 4,5 ja 2 μΐ H20. DNA saos-tetaan lisäämällä 75 μΐ absoluuttista etanolia ja seosta seisotetaan 30 min -70°C:ssa. Saostunut DNA sentrifugoidaan pohjaan Eppendorf-mikrosentrifugissa (12000 rpm, 5 min) ja sakka pestään kertaalleen 70-%:lla etanolilla. Sentrifu-10 goinnin jälkeen sakkaa kuivataan 5 min vakuumieksikkaatto-rissa ja kuivauksen jälkeen sakka liuotetaan 4 μl:aan vettä. Samanaikaisesti lisätään 5 pmol spesifistä aluketta ja l μΐ ΙΟχΚΙenow-puskuria (koostumus kuvailtu kaupallisessa sekven-tointiopaskirjassa, Amersham, Ltd.). Liuotuksesta alkaen 15 toimenpiteet suoritetaan 37°C:ssa. Putkia seisotetaan 15 min, minkä jälkeen lisätään 1 yksikkö Klenow-entsyymiä, 4 μΐ 35S-leimattua deoksi-ATP:a (<500 μΟΐ/ηιΙ) ja sekoitetaan sent-rifugoimalla. Edellistä seosta otetaan 3,5 μΐ kuhunkin di-deoksinukleotidireaktioputkeen (deoksi- ja dideoksinukleoti-20 dien suhteet on kuvattu opaskirjassa) ja annetaan seistä 15 min. Kuhunkin neljään putkeen lisätään 1,5 μΐ Chase-liuos-ta, joissa kunkin deoksinukleotidin loppupitoisuus on 1,0 mM. Putkia seisotetaan 15 min, minkä jälkeen liuokset siirretään polyakryyliamidigeelille. Geeliä ajetaan riittäväs-25 ti, jonka jälkeen geeli kiinnitetään, kuivatetaan ja valotetaan röntgenfilmillä yleisten periaatteiden mukaisesti.

Esimerkki 1:

Plasmidin kopioluvun muutos käsiteltäessä soluja nalidiksii-30 nihapolla:

Keksinnössä kuvattu plasmidi pCSS123 on ns. runaway replication -plasmidi, jossa kopioluvun muutos saadaan aikaan lämpötilaa muuttamalla. Kuvassa 8 tämä on havainnollistettu 35 tutkimalla lämpökäsiteltyjen E. coli-soluien. jotka sisältävät kyseisen plasmidin, DNA:n määrää ja laatua. Kuvassa on tutkittu tunnetun DNA:n replikaation estävän aine aineen, 30 8 8 3 C 9 nalidiksiinihapon, vaikutusta solujen DNAshan ja erityisesti tässä hakemuksessa käytetyn plasmidi pCSS123:n määrään.

E. coli pCSS123/JM103 -soluja kasvatettiin 20 ml:ssa 2xTY-5 kasvatusliuosta +30°C:ssa neljässä eri erlenmeyer-pullossa, kunnes absorbanssi mitattuna 600 nm:ssä oli 0f3. Pulloihin lisättiin nalidiksiinihappoa, jonka tiedetään estävän solun DNA:n replikaation, loppupitoisuuteen 0, 1, 10 ja 100 μς/ιηΐ. Jokaisesta pullosta otettiin välittömästi 2x1,5 ml:n näyt-10 teet 15 ml:n putkiin, joita pidettiin +30°C:ssa 20 min.

Putket siirrettiin +42°C:een 1 tunniksi; pullot jätettiin +30°C:een. Tämän jälkeen putkia ja pulloja pidettiin vielä yksi tunti +30°C:ssa ravistelussa, minkä jälkeen eristettiin totaali-DNA 1,5 ml:sta kasvustoa. Solut sentrifugoitiin 15 alas ja suspendoitiin sakat 500 μ1:ηηη 50 mM TRIS-HC1, pH 8,0, 50 mM EDTA. Soluja pidettiin jäähauteella 30 min, jonka jälkeen lisättiin lysotsyymiä 50 μΐ (10 mg/ml) ja pidettiin jäissä 45 min. Tämän jälkeen lisättiin 100 μΐ STEP-liuosta (0,5 % SDS, 50 mM TRIS-HC1 pH 7,5 ja 0,4 M 20 EDTA) ja pidettiin 60 min +50°C:ssa. Lisättiin 600 μΐ fenolia, ravisteltiin 5 min kevyesti ja sentrifugoitiin 10 min 12000xg. Supernatantti otettiin talteen ja sille suoritettiin DNAsn saostus lisäämällä 2 tilavuutta 99,5 % etanolia ja kaliumasetaattia, pH 6,0, 0,3 Miksi. Pidettiin -70°C:ssa 25 30 min ja sentrifugoitiin 10 min 12000xg. Sakka pestiin 1x500 μ1:11β 70 % etanolia, sentrifugoitiin kuten edellä ja sakka kuivattiin vakuumieksikkaattorissa 5 min. Kuivunut sakka liuotettiin 50 μΐ 50 mM TRIS-HC1, pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 μς/πιΐ RNAaasi A-liuosta ja pidettiin 20 min +65°C:ssa 30 sekä analysoitiin. Kuvassa on esitetty agaroosigeelielek-troforeesiajo soluista eristetyistä DNA:ista. Kuvasta havaitaan, että lämpökäsittelemättömien näytteiden DNA-määrät ja laatu pysyvät suhteellisen muuttumattomina. Edelleen käsiteltäessä soluja suurimmalla nalidiksiinihappopitoisuu-35 della (100 μg/ml) DNA:n määrä ja laatu ovat kuten käsittelemättömien kontrollinäytteiden määrä ja laatu. Lämpökäsitellyt solut, joita ei oltu käsitelty nalidiksiinihapol-la, antoivat geelielektroforeesissa huomattavan plasmidi- 31 8 8 3 C 9 DNAsn määrän lisäyksen (kuvattu nuolella). Plasmidi-DNAsn määrä väheni käsiteltäessä soluja pienillä pitoisuuksilla (1 ja 10 μς/πιΐ) nalidiksiinihappoa.

5 Esimerkki 2 s

Plasmidin kooioluvun muutokseen perustuva toksisten aineiden määritys mitattuna valonmuodostuksen avulla: Yön yli kasvaneita pCSS123/JM103-soluja laimennettiin 10 1:1 000. Tämän jälkeen otettiin 0,5 ml laimennettuja soluja 2xTY:ssä ja lisättiin eri määriä antibiootteja tai muita toksisia aineita liuokseen ja inkuboitiin 20 min +30°C:ssa. Putket siirrettiin +42°C:een 60 minsksi lämpökäsittelyä varten. Tämän jälkeen kaikki putket temperoitiin 15 +30°C:een 5 minsn aikana vesihauteella ja samalla lisättiin IPTG (isopropyyli-P-D-tiogalaktopyranosidi) 1 mM:ksi ja n-dekanaali 0,01 %:ksi. Putket siirrettiin automaattiseen valoa keräävään mittauslaitteistoon eli luminometriin (LKB-Wallac 1251, Turku), jonka mittauskaruselli oli temperoitu 20 +30°C:een. Mittaus suoritettiin automode-ohjelmalla siten, että jokaista putkea mitattiin kerran kahdessa minuutissa valontuoton suhteen. Tulokset kerättiin luminometriä ohjaavan mikrotietokoneen muistiin myöhempää analyysia varten. Kuvassa 9 on esitetty nalidiksiinihapon toteaminen määritys-25 liuoksesta käyttämällä E. coli-solula. joihin on kloonattu plasmidi pCSSl23. Kuvasta havaitaan, että jo kahden μς:η pitoisuus nalidiksiinihappoa määritysolosuhteissa voidaan havaita käytetyllä menetelmällä erittäin nopeasti.

30 32 8 8 3 C 9

Esimerkki 3:

Antibiootin määritys menetelmällä, jossa käytetään hyväksi yhdistelmä-DNA-plasmidia missä replikaation aloitus ei ole säädeltävissä ϊ 5

Esimerkissä on verrattu antibiootin vaikutusta käytettäessä plasmideja, joissa bakteerilusiferaasigeenin ekspressiota ohjaa lac-(hidas) tai ρχ,-promoottori (nopea). E. coli -klooneja pCSS112/K-12AHlAtrp(cI857) kasvatettiin yli yön 10 2xTY-kasvatusliuoksessa, jossa oli 100 μg/ml ampisilliiniä. Tämän jälkeen tehtiin sopiva laimennus HBSS-puskuriin tai maitoon ja lisättiin tätä 500 μΐ 3 ml:n luminometriputkiin. Putkia temperoitiin +30°C:ssa ja lisättiin eri määriä erilaisia toksisia aineita putkiin. Putkia seisotettiin 20 15 min 30°C:ssa. Tämän jälkeen nostettiin lämpötila +42°C:een 10 minuutiksi, jonka jälkeen putket siirrettiin +30°C:een temperoituun luminometriin mitattaviksi. Vertailuna käytettiin kloonia pCSS108/JM103, jolle tehtiin samanlaiset käsittelyt sillä erotuksella, että solut pidettiin koko ajan 20 +30°C:ssa ja mRNA- ja proteiinisynteesit käynnistettiin lusiferaasigeenien edessä olevasta lac-promoottorista IPTG-kemikaalilla (loppupitoisuus 1 mM). Kuvasta 10 havaitaan, että käytettäessä plasmidirakennelmaa, jossa pi,-proomottori ohjaa määritettävän proteiinin tuottoa, saadaan toksisen 25 aineen vaikutus esille huomattavasti pienemmissä pitoisuuksissa kuin käytettäessä hidasta ja heikompaa lac-promoot-toria. Kloramfenikolin tapauksessa valontuoton kinetiikka on esitetty kuvassa 11 käytettäessä plasmidia pCSS112 E. coli -kannassa K12AHIAtrp(cl857Ϊ. Kuvasta havaitaan, että 30 erot mitatussa aktiivisuudessa (valontuotossa) ovat näkyvissä mittauksen alusta saakka jopa 0,1 μg:n pitoisuuksilla määrityskyvetissä.

Esimerkki 4: 35 Toksisten aineiden määritys menetelmällä, jossa käytetään hyväksi E. colissa vakioisena määränä olevaa vhdistelmä-DNA-plasmidia ia säädeltävää lambda-faaqin Pi.-promoottoria bakteerilusiferaasin biosynteesin aktivoinnissa; 33 88309

Seuraavassa on esimerkkejä muihin solujen biosynteesikoneis-toihin ja aineenvaihduntaan vaikuttavien tekijöiden määrityksestä kuvaamallamme menetelmällä. Testit on suoritettu 5 samalla tavoin kuin aiemmissa esimerkeissä on kuvattu eli tarkoituksena on ollut kehittää mahdollisimman nopeasti suoritettava testi, joka kuitenkin olisi riittävän herkkä. Testeissä käytettiin plasmidia pCSSl12 edellä mainitussa bakteerikannassa.

10

Seuraavat kuvat esittävät kunkin testatun aineen vaikutusta mitattuna valonmuodostuksen avulla. Kuten aiemmissakin määrityksissä inhiboivien tekijöiden vaikutus näkyy alentuneena bioluminesenssin tuottona verrattuna tapaukseen, 15 jossa inhiboivaa tekijää ei ole ollut mukana. Kuvassa 12 on esitetty transkription eli lähetti-RNA:n muodostuksen estävän antibiootin, rifampisiinin, määritys kehittämällämme menetelmällä. Jo yksi mikrogramma rifampisiinia voidaan todeta tällä erittäin nopeasti suoritettavalla testillä.

20 Oksitetrasykliinin, joka sitoutuu 30S ribosomaaliseen alayksikköön, vaikutus kehittämäämme mittaussysteemiin erittäin nopealla määritystavalla on esitetty kuvassa 13. Kuten rifampisiini oli myös tämän antibiootin vaikutus voimakas ja selvästi todettavissa. Kuvassa 14 on esitetty yleisen 25 aineenvaihdunnan estäjän, eulfiitin, jota käytetään elintarviketeollisuudessa, vaikutus testisysteemissämme. Tämä tulos osoittaa selvästi kehittämämme testisysteemin mahdollistavan myös solun yleiseen aineenvaihduntaan vaikuttavien tekijöiden määrittämisen erittäin nopeasti.

30

Esimerkki 5:

Toksisen aineen määritys menetelmällä, lossa käytetään hyväksi lambda-faaain Ρτ.-promoottoria beta-aalaktosidaasin biosvnteesikoneiston aktivointiin: 35

Edellisissä esimerkeissä käytettiin mittausperusteena bakteerin tuottamaa valoa, joka aiheutui lusiferaasia koodit-tavista geeneistä. Valkuaisaineena voidaan käyttää mitä 34 88309 tahansa proteiinia tai peptidiä, jolle on olemassa määritysmenetelmä. Tässä esimerkissä lusiferaasia koodittava geeni vaihdettiin beta-galaktosidaasi-geeniin. Käytetty plasmidi pPLcAT14 on kuvattu aikaisemmin (Stanssens, P., 5 Remaut, E. & Fiers, W., 1985, GENE, 36, 211-223).

E. coli -klooneja pPlcAT14/AK12*HItrp kasvatettiin yön yli 2xTY-kasvuliuoksessa, jossa oli 100 pg/ml ampisilliiniä. Tämän jälkeen bakteereista tehtiin sopiva laimennos HBSS-10 puskuriin ja lisättiin tehtyä laimennosta 80 μΐ lasiputkiin. Kloramfenikolia lisättiin 20 yl:ssa eri määriä edellä mainittuihin putkiin ja inkuboitiin huoneenlämmössä seisottaen 15 min. Inkuboinnin jälkeen suoritettiin pL-promoot-torin aktivointi siirtämällä putket +42°C:een 30 minrksi.

15 Tämän seurauksena solun biosynteesikoneisto aktivoituu tuottamaan pPLcAT14-plasmidin beta-galaktosidaasi-geenin koodittamaa vastaavaa entsyymiä. Induktion jälkeen putkiin lisätään tolueenia 10 %:ksi, jonka tarkoituksena oli tehdä bakteerien soluseinämä ONPG-kemikaalia läpäiseväksi. Beta-20 galaktosidaasi-entsyymi muodostaa ONPG-kemikaalin kanssa reagoidessaan aallonpituudella 420 nm mitattavan keltaisen värin. Tämän jälkeen putket sentrifugoitiin ja mitattiin liuoksen absorbanssi 420 nm:ssä. Kuvassa 15 on esitetty kloramfenikolin vaikutus menetelmässämme, kun määritettävänä 25 proteiinina oli beta-galaktosidaasi ja sen substraatin tuottama värillinen lopputuote.

Taulukko 1

Yleisesti käytettyjä antibiootteja ja niiden vaikutuskohdat: 30

Soluseinät_Proteiinisynteesi Nukleiinihapposynteesi

Penisilliinit Kloramfenikoli Nalidiksiinihappo

Kefalosporiinit Tetrasykliinit Nobobiosiini

Basitrasiini Aminoglykosidit Rifamysiinit 35 Vankomysiini Makrolidit Phleomysiini

Polymyksiinit Erytromysiini Mithramysiini

Gramisidiinit Linkomysiini Aktinomysiini

Valinomysiini Puromysiini Kinolonit

Claims (21)

35 8 8 3 C 9

1. Menetelmä yksisoluiseen organismiin, kuten esimerkiksi mikrobi- tai hiivasoluun, vaikuttavan tekijän määrittämiseksi, joka tekijä vaikuttaa suoraan tai epäsuorasti solun

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- : 35 tä, että yhdistelmä-DNA-plasmidi sisältää DNA-jakson, joka koodaa yhtä tai useampaa valikoitua viruksen, prokaryootti-solun tai eukaryoottisolun valkuaisainetta tai sen biologisen aktiivisuuden kannalta olennaista osaa ja plasmidissa 36 8 8 3 G 9 voi olla yksi tai useampia DNA-jaksoja, jotka tekevät solun vastustuskykyiseksi antibiootteja, raskasmetalleja ja/tai toksiineja vastaan.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että valkuaisainetta koodaava DNA-jakso on säädeltävissä olevan promoottorin alaisuudessa, joka on kontrolloitu positiivisella tai negatiivisella palautteella ja on säädeltävissä käytettävässä mikrobisolussa sekä aktivoidaan samanai-10 kaisesti tai haluttuna hetkenä sen jälkeen, kun plasmidin replikaation aloituskohtaa säätelevä promoottori aktivoidaan .

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu sii-15 tä, että määritettävä tekijä on yhdistelmä-DNA-plasmidin DNA:n biosynteesiin tai replikaatioon, RNA:n biosynteesiin, transkriptioon, translaatioon, solukalvoihin, metaboliaan tai entsyymiaktiivisuuteen vaikuttava tekijä kuten esimerkiksi aflatoksiinit, raskasmetallit, etidiumbromidi, nali-20 diksiinihappo, trimetopriimi, fluorokinolonit, aminoglyko-sidit, penisilliinit, kefalosporiinit, rifampisiini, klor-amfenikoli, tetrasykliinit, sulfonamidit ja käytettävä solu on määritettäville antibiooteille herkkä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että solu on Escherichia coli ja bakteerin sisältämän yhdistelmä-DNA-plasmidin replikaatiosta vastaavaa monistus-koneistoa voidaan tarkasti säädellä voimakkaan promoottorin avulla, kuten esimerkiksi lambda Pj,- ja lac-promoottorit. 30

5 DNA:hän, RNA:han ja/tai proteiineihin tai näiden synteesi-koneistoihin, tunnettu siitä, että a) soluun siirretään yhdistelmä-DNA-plasmidi, jonka repli-kaatiosta vastaavan monietuskoneiston aloituskohta tai -koh- 10 dat ovat säädeltävissä olevan promoottorin alaisuudessa, jota voidaan kontrolloida joko positiivisella tai negatiivisella palautteella; b) yhdistelmä-DNA-plasmidin sisältämä solu saatetaan kos-15 ketukseen vaikuttavan tekijän kanssa, esimerkiksi inkuboi- malla näitä yhdessä; c) vaikuttavan tekijän annetaan vaikuttaa yhdistelmä-DNA-plasmidin sisältämään soluun sopivan ajan, minkä jälkeen 20 yhdistelmä-DNA-plasmidin replikaatiosta vastaavan monistus-koneiston aloituskohtaa säätelevä promoottori aktivoidaan, jolloin plasmidin kopioluku alkaa kasvaa solussa, mikäli vaikuttava tekijä ei ole vaikuttanut plasmidin replikoitu-mista estävästi; ' 25 d) yhdistelmä-DNA-plasmidin kopioluvun muutos solussa määritetään suoraan tai epäsuorasti; e) kopiolukua verrataan vertailukokeeseen, jossa vaikutta-30 vaa tekijää ei ollut läsnä ja/tai sitä oli tunnettu määrä reaktiossa, jolloin vaikuttavan tekijän läsnäolo ja/tai määrä saadaan määritettyä.

6. Menetelmä soluun vaikuttavan tekijän määrittämiseksi, joka tekijä vaikuttaa suoraan tai epäsuorasti solun DNA:hän, RNArhan ja/tai proteiineihin tai näiden synteesikoneistoi-hin, tunnettu siitä, että 35 a) soluun siirretään yhdistelmä-DNA-plasmidi, joka on solussa useana kopiona ja plasmidi sisältää markkeriproteiinina viruksen, prokaryoottisolun tai eukaryoottisolun valkuais- i 37 8 8 3 G 9 ainetta tai sen biologisen aktiivisuuden kannalta olennaista osaa koodaavan DNA-jakson, jonka ilmentyminen on säädeltävissä olevan promoottorin alaisuudessa ja on kontrolloitu joko negatiivisella tai positiivisella palautteella; 5 b) yhdistelmä-DNA-plasmidin sisältämä solu saatetaan kosketukseen vaikuttavan tekijän kanssa, esimerkiksi inkuboimalla näitä yhdessä; 10 c) vaikuttavan tekijän annetaan vaikuttaa yhdistelmä-DNA-plasmidin sisältämään soluun sopivan ajan, jonka jälkeen yhdistelmä-DNA-plasmidin markkeriproteiinin ilmentymistä kontrolloiva säädeltävä promoottori aktivoidaan, jolloin markkeriproteiinin määrä solussa alkaa kasvaa, mikäli vai-15 kuttava tekijä ei ole vaikuttanut suoraan tai välillisesti proteiinisynteesiin; d) yhdistelmä-DNA-plasmidin sisältämän markkeriproteiinin muutos mitataan; 20 e) markkeriproteiinin määrää verrataan vertailukokeeseen, jossa vaikuttavaa tekijää ei ollut läsnä ja/tai sitä oli tunnettu määrä reaktiossa, jolloin vaikuttavan tekijän läsnäolo ja/tai määrä saadaan määritettyä. - ; 2 5

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solu on gramnegatiivinen tai grampositiivinen bakteeri kuuluen ryhmään Enterobacteriaceae, edullisesti Escherichia coli tai ryhmään Bacillus, edullisesti Bacillus 30 subtilis.

8. Patenttivaatimusten 1-3, 6 tai 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että promoottorin säätelytekijöitä tuotetaan joko isäntäsolun kromosomaalisesta DNA:sta, solussa olevasta - 35 toisesta eri inkombatibiliteettiluokkaan kuuluvasta plasmi-dista, samasta plasmidista, lyyttisestä tai lysogeenisestä faagista tai viruksesta tai säätelytekijöitä lisätään solu- 38 8 8 309 jen ulkopuolelta kuten esimerkiksi kemiallisia yhdisteitä lisäämällä, lämpötilaa muuttamalla tai säteilyttämällä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu sii-5 tä, että yhdistelmä-DNA-plasmidissa voi olla yksi tai useampia DNA-jaksoja, jotka tekevät solun vastustuskykyiseksi antibiootteja, raskasmetalleja ja toksiineja vastaan.

10. Patenttivaatimuksen 1 tai 6 mukainen menetelmä, tunnet-10 tu siitä, että tutkittava näyte on nestemäisessä tai kiinteässä muodossa tai näyte sisältää radioaktiivista säteilyä tai ultraviolettisäteilyä.

11. Patenttivaatimuksen 1 tai 6 mukainen menetelmä, tunnet-15 tu siitä, että solut ovat kylmäkuivattuja ja ne rehydroidaan ennen määritystä sopivalla puskurilla tai kasvatusliuoksel-la.

12. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu sii-20 tä, että vaikuttava tekijä on yhdistelmä-DNA-plasmidin DNA:n biosynteesiin, RNA:n biosynteesiin, transkriptioon, translaatioon, solukalvoihin tai metaboliaan vaikuttava tekijä kuten mutageenit, antibiootit, raskasmetallit tai toksiinit.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solu on Bacillus subtilis.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-plasmidissa oleva markkeri- 30 proteiini on säädeltävissä olevan vahvan promoottorin, kuten o105:n, alaisuudessa sekä markkeriproteiini on alfa-amylaasi, alkalinen fosfataasi tai lusiferääsi.

15. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu 35 siitä, että solu on Escherichia coli. 39 883C9

16. Patenttivaatimuksen 5 tai 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-plasmidi sisältää DNA-jakson, joka koodaa viruksen, prokaryoottisolun tai euka-ryoottisolun valkuaisainetta tai sen biologisen aktiivisuu- 5 den kannalta olennaista osaa siitä ja proteiinin ilmentymistä voidaan kontrolloida säädeltävän promoottorin, kuten esimerkiksi lac tai lambda Pl, avulla.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu 10 siitä, että valkuaisaine on lusiferääsi, beta-galaktosi- daasi, alkalinen fosfataasi, peroksidaasi tai T4-lysotsyymi.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-plasmidi koodaa Vibrio harvevin 15 lusiferaasia tai muuta bakteerilusiferaasia.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-plasmidi on plasmidi pCSS112.

20. Jonkin patenttivaatimuksen 17-19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aldehydiä lisätään reaktioon mitattaessa ekspressoituneen lusiferaasientsyymin määrää bakteerissa.

21. Patenttivaatimuksen 4 tai 12 mukainen menetelmä, tun-: 25 nettu siitä, että määritys tehdään maidosta, seerumista tai vesistä. 40 8 8 3G9