SE424090B - Forfarande for bestemning av en antibiotikakoncentration - Google Patents

Forfarande for bestemning av en antibiotikakoncentration

Info

Publication number
SE424090B
SE424090B SE8104898A SE8104898A SE424090B SE 424090 B SE424090 B SE 424090B SE 8104898 A SE8104898 A SE 8104898A SE 8104898 A SE8104898 A SE 8104898A SE 424090 B SE424090 B SE 424090B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
antibiotic
concentration
phage
luminescent
antibiotics
Prior art date
Application number
SE8104898A
Other languages
English (en)
Other versions
SE8104898L (sv
Inventor
S Ulitzur
Original Assignee
Technion Res & Dev Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technion Res & Dev Foundation filed Critical Technion Res & Dev Foundation
Priority to SE8104898A priority Critical patent/SE424090B/sv
Publication of SE8104898L publication Critical patent/SE8104898L/sv
Publication of SE424090B publication Critical patent/SE424090B/sv

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

_Hs1o4s9s-5 2 10 15 20 25 30 35 Antimicrobial Ag. Chemotherapy lá (1979) 43-45). Den andra metoden utnyttjar syraproduktionen från laktos (Ericsson, H.M. och Sherris, J.C., Acta pathol. et Miorobiol. Scan.Sect. B Suppl. gll 1971). Ett kortare test (90-120 minuter) har fram- tagits av Nilsson (Nilsson, L., Antimicrobial Ag. Chemotheraphy lg (1978) 812-816) och av andra (Whitehead, T.P., L.J. Kricka, T.J.N. Carter och C.H.G. Thorpe, Clin.Chem. gå (1979) 1531-1546) och utgår från det faktum att utomcellulärt ATP hos den bakterie- kultur som behandlas med antibiotikumet ökar med en ökande antibiotikumkoncentration. De minsta koncentrationer av antibio- z tikumet som bestämdes med dessa test var 2_pg kloramfenikol per ml med hjälp av Beneckea natriegens testet och llng gentamicin per ml med användning av ATP-testet. Användningen av luminösa (eller luminiscenta) bakterier för bestämning av antibiotika föreslogs ursprungligen av Rake, McKee och Jones (Proc. Soc.
Exper.Biol. & Med., ål (1942) 273-274).
Avsikten med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett förfarande för momentan bestämning av ett antibiotikum i av- sevärt lägre koncentrationer än de som bestämts med de ovan beskrivna metoderna, varvid förfarandet erfordrar en betydligt kortare tid. Uppfinningens kännetecken framgår av de efter beskrivningen följande patentkraven.
Uppfinningen kommer nu att förklaras i detalj med hänvisning till.bifogade ritning på vilken: Fig. l - 3 visar diagram illustrerande användningen av upp- finningen för tre olika antibiotika.
Enligt föreliggande uppfinning mätes kocnentrationen av ett antibiotikum genom utnyttjande.av ett biologiskt kopplat system vid vilket starkt luminiscenta bakterier blandas med en specifik bakteriofag. I frånvaro av antibiotikumet pacificeras de lumini- scenta bakterierna och deras in vivo luminiscens går ner nästan 14.111 noll .
Bakterier är värdorganismer för en speciell grupp av virus som kallas bakteriofager. Bakteriofagadsorptionens kinetik och de intracellulära stegen hos fagutvecklingen är väl beskrivna.
Under optimala villkor adsorberas fagen på värdcellen varefter 10 15 20 25 30 35 3 8104898-5 dess nukleinsyror införes i denna. Under ett första skede (eklipsskedet) styr fagen syntesen av nya enzymerrhos värdcellen.
Dessa nya proteiner (tidiga proteiner) omfattar enzymer som är nödvändiga för syntes av fag-DMA. Senare under eklipsperioden uppträder "sena proteiner" vilka omfattar underenheter hos fagens ändar liksom ett lysozym som bryter ner värdcellens cell- vägg. Det sista skedet innebär att cellen brister och de nybildade infektuösa fagerna frigöres.
Luminiscenta bakterier är liksom andra prokarioter angripbara av vissa bakteriofager. Den lytiska cykeln hos dessa fager är i princip densamma som den hos den mest kända fagen T4 hos E.coli.
Då starkt luminiscenta bakteriekulturer infekteras av sina specifika bakteriofager kan inga speciella förändringar observeras under "eklipsperioden“ som normalt varar cirka 30-45 minuter.
Nedgången i in vivo luminiscensen uppträder samtidigt som den infektuösa fagen uppträder i mediet. Således representerar nivån av in vivo luminiscensen hos den infekterade cellen produktionen av den bakteriofag som är en följd av nedbrytningen av de luminösa bakterierna. Den fullständiga syntesen av en infektuös fag erfordrar en komplett serie av DNA, RNA och protein- synteser. Antibiotika som blockerar åtminstone någon av dessa synteser blockerar även produktionen av fagen och förhindrar därigenom nedbrytningen av de luminiscenta bakterierna.
Föreliggande uppfinning hänför sig till en metod som utnyttjar detta kopplade biologiska system för bestämning av DNA, RNA och proteinsynteshämmande antibiotika.
Avsikten med uppfinningen är att åstadkomma en metod för snabb bestämning av DNA, RNA och proteinsynteshämmare. Det beskrivna testet erfordrar en tid av endast 60-90 minuter och kan automati- seras i det närmaste fullständigt.
Det nya testet baserar sig på ett biologiskt kopplat system vid vilket starkt lysande bakterier blandas med en specifik bakteriofag. I frånvaro av ett antibiotikum bryts bakterierna ner inom 45-60 minuter och deras in vivo luminiscens reduceras med en faktor 100-2002 Sådana antibiotika som skyddar de lumini- scenta bakterierna från nedbrytning av bakteriofagen är av tre typer: -8104898-5 4 10 15 20 _25 30 '35 (a) Antibiotika som hämmar DNA-syntesen såsom novobiocin eller nalidixicsyra, (b) Antibiotika som hämmar RNA-syntesen såsom rifamycin, (c) Antibiotika som hämmar proteinsyntesen såsom exempelvis kloramfenikol.
Samtliga dessa antibiotika påverkar ej in vivo luminiscensen hos de luminiscenta bakterierna under inkubationstiden vid testet. Om man önskar specifikt detektera verkningssättet hos det aktuella antibiotikumet (om det verkar som DNA-syntes hämmare eller som proteinsynteshämmare) skall det testade antibiotikumet tillföras under den sista tredjedelen av den latenta faginfektions- perioden, Under denna del av den intercellulära fagutvecklingen kommer endast proteinsynteshämmare att mera påtagligt skydda de luminiscenta bakterierna. DNA-synteshämmare är aktiva endast under begynnelseskedet av infektionscykeln, d.v.s. 10-20 minuter efter infektering.
En ytterligare fördel med användning av fagtest för antibiotika är möjligheten att använda faginfekterade frystorkade lumini- scenta bakterier. Därvid nedfryses och torkas de luminiscenta bakterierna kort efter det att de infekterats av fagerna och fagens DNA har trängt in i cellen (en förinkubering av under 10 minuter vid 30°C). Sådana infekterade frystorkade celler kan vid lagring vid 4-6°C återfå sin luminiscens i full utsträckning vid vibrering i lämplig buffert. Emellertid kommer dessa celler att brytas sönder efter cirka 60-90 minuter på grund av den intercellulära fagutvecklingen. Antibiotika som tillföras vid hydreringsskedet hämmar fagutvecklingen och cellnedbrytningen.
Användning av frystorkade system kräver i princip endast två steg för antibiotikabestämning: 1. Alikvoter av de hydrerade faginfekterade luminiscenta bakterierna tillföres såväl provet som en känd standard av det testade antibiotikumet, 2. Proven inkuberas under 90 minuter och nivån hos in vivo luminiscensen bestäms.
Förfarandet enligt uppfinningen kommer nu att beskrivas i detalj med hjälp av ett exempel: 10 15 20 25 30 35 8104898-5 5 Exempel (l) Luminiscenta bakterier av stammen Beneckea Harveyi (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (ll) får växa vid 30°C i ett flytande komplex ASWRP(l) medium till en slutlig eelitärher ev s - 108 en luminiscens av l-2 ' 1012 kvanta per sekund och ml. celler per ml och Den luminiscenta kulturen infekteras med bakteriofagen "hv-3" i förhållande 10 PFU per luminiscent bakterie.
Blandningen inkuberas under 10-15 minuter vid 30°C så att fagen adsorberas och dess DNA tränger in i cellen.
Den infekterade kulturen nedkyles snabbt i is och de infekterade cellerna centrifugeras vid Oo. _Cellkulorna nedsänkes-i en blandning bestående av 5% havsvatten innehållande 0,15 N natriumglutamat och 0,25 N sykros vid pH 7,0. Den slutliga cellkoncentrationen är ej kritisk men ett lämpligt värde är 109 celler per mi. 0,5 ml av den sålunda behandlade kulturen fylles på lämp- liga flaskor och kulturerna frystorkas under standardbe- tingelser.
De frystorkade kulturerna kan förvaras vid 4-9°C under åtminstone 4 månader utan att deras aktivitet går förlorad.
Före rester riilföree s mi kallt Aswnr (1) medium till den frystorkade kulturen.
Den testade antibiotikalösningen placeras i l ml ASWRP medium eller tillföres NaCl så att en slutlig Nacl kon- centration av 3 % erhålles. Lösningens pH-värde bör ligga mellan 6 och 8,5 (lämpligen 7,2). 0,1 ml av den hydrerade faginfekterade kulturen tillföres testlösningen och ett antal kända antibiotikakoncentrationer liksom även ett prov utan antibiotikum.
Blandningen inkuberas under lätt skakning vid 30-37°C under 60-90 minuter eller till dess att luminiscensen icke ytterligare sjunker i provet utan antibiotikum.
Luminiscensen hos samtliga prov bestämmes vid samma tid- punkt (inom 5 minuter) och koncentrationen hos det aktuella provet bestämmes med hjälp av en kalibreringskurva som er- hålles från standardproverna. . 10 15 20 D 25 8104898-5 6 I figurerna l - 3 visas kurvor för tre olika antibiotika vars koncentrationer bestämts enligt den ovan beskrivna metoden. Fig. l visar därvid de kurvor som erhålles för antibiotikumet nalidixicsyra som hämmar DNA-syntesen. Fig. 2 visar motsvarande kurvor för rifamycin som hämmar RNA-syntesen och Fig. 3 visar de kurvor som erhålles för kloramfenicol som hämmar proteinsyntesen. På abskissan angives därvid tiden i sekunder, på ordinatan antalet ljuspulser per sekund och ml lösning samt till höger i figuren de använda mängderna ifug/ml.
Den ovan beskrivna metoden kan även användas då mer än ett anti- biotikum finnes i provet, varvid man kan använda ett antal olika antibiotika resistenta mutanter av luminiscenta bakterier för att bestämma verkningssättet hos detaktuella antibiotikumet.
De väsentliga fördelarna vid det nya bioluminiscenstestet är följande; ' (1) Testerna är mycket snabba och känsliga. (2) Testerna är specifika och bestämmer specifikt aktiviteten hos det testade antibiotikumet i dess naturliga tillstånd. (3) Testerna är ekonomiska, enkla och kan utföras automatiskt. (4) Den minsta volymen som erfordras för dessa test är 0,1 ml eller eventuellt mindre. Därför erfordras endast l-5 pl av provet. (5) Det är möjligt att utnyttja en bakteriestam som är resistent mot vissa antibiotika för att specifikt bestämma verkan av andra antibiotika i antibiotikablandningar.

Claims (1)

1. 8154898-5 PATENTKRAV Förfarande för bestämning av en antibiotikakoncentration, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att antibiotikumet saman- föres med en förutbestämd kvantitet av en luminiscent bakterie samt en bakteriofag som bryter ned de luminiscenta bakterierna, varvid bakteriofagaktiviteten hämmas av antibiotikumet, så att ljusemissionen efter en viss förutbestämd inkubationstid blir beroende av antibiotikumets koncentration och ökar med denna.
SE8104898A 1981-08-18 1981-08-18 Forfarande for bestemning av en antibiotikakoncentration SE424090B (sv)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8104898A SE424090B (sv) 1981-08-18 1981-08-18 Forfarande for bestemning av en antibiotikakoncentration

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8104898A SE424090B (sv) 1981-08-18 1981-08-18 Forfarande for bestemning av en antibiotikakoncentration

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE8104898L SE8104898L (sv) 1982-02-26
SE424090B true SE424090B (sv) 1982-06-28

Family

ID=20344381

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8104898A SE424090B (sv) 1981-08-18 1981-08-18 Forfarande for bestemning av en antibiotikakoncentration

Country Status (1)

Country Link
SE (1) SE424090B (sv)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990012887A1 (en) * 1989-04-20 1990-11-01 Bio-Orbit Oy Determination of factors affecting gene regulation and/or gene replication

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990012887A1 (en) * 1989-04-20 1990-11-01 Bio-Orbit Oy Determination of factors affecting gene regulation and/or gene replication
US6475719B1 (en) 1989-04-20 2002-11-05 Bio-Orbit Oy Determination of factors affecting gene regulation and/or gene replication

Also Published As

Publication number Publication date
SE8104898L (sv) 1982-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1049798B1 (en) Antibiotic sensitivity testing
Clewell Nature of Col E1 plasmid replication in Escherichia coli in the presence of chloramphenicol
Tissières et al. Amino acid incorporation into proteins by Escherichia coli ribosomes
Romaniuk et al. RNA binding site of R17 coat protein
Groat et al. Starvation proteins in Escherichia coli: kinetics of synthesis and role in starvation survival
Lane et al. The rep mutation III. Altered structure of the replicating Escherichia coli chromosome
Capecchi et al. Suppression in vitro: Identification of a Serine-sRNA as a" Nonsense" Suppressor
Newcomb et al. Assembly of the herpes simplex virus capsid: identification of soluble scaffold-portal complexes and their role in formation of portal-containing capsids
EP0610937B1 (en) Process for detecting luciferase
Chrispeels et al. Modification of valyl tRNA synthetase by bacteriophage in Escherichia coli
Alber et al. A genetic screen for mutations that increase the thermal stability of phage T4 lysozyme.
US5134063A (en) Methods for detection, identification and specification of listerias
Miller Multilevel regulation of bacteriophage λ lysogeny by the E. coli himA gene
Fraenkel-Conrat et al. Bacteriophages that contain lipid
Gale et al. The Assimilation of Amino-acids by Bacteria: 4. The Action of Triphenylmethane Dyes on Glutamic Acid Assimilation
SE424090B (sv) Forfarande for bestemning av en antibiotikakoncentration
Iverson et al. Nucleic acid content and ultraviolet susceptibility of Tetrahymena pyriformis
Craine et al. Identification of a biochemically unique DNA-membrane interaction involving the Escherichia coli origin of replication
Neidhardt et al. Phage‐Induced modification of valyl‐tRNA synthetase
Faanes et al. Roles of arginine and canavanine in the synthesis and repression of ornithine transcarbamylase by Escherichia coli
Den Blaauwen et al. Regulation of cyclic AMP synthesis by enzyme IIIGlc of the phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system in crp strains of Salmonella typhimurium
Krüger et al. Host-dependent modification of bacteriophage T7 and SAMase-negative T3 derivatives affecting their adsorption ability
Fukuma et al. Effect of bacteriophage ghost infection on protein synthesis in Escherichia coli
Kaulenas Transfer of amino acids from aminoacyl-tRNA into protein by isolated ribosomes of the house cricket
Adler et al. Properties of Escherichia coli mutants with alterations in Mg2+-adenosine triphosphatase