KR100469588B1 - 바이오센서 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 검출가능한 활성을 갖는 리포터 분자를 암호화하는 서열을 포함하고 있는 제 1 핵산 분자; 및 (b) 리포터 분자의 기질을 생산하는 효소를 암호화하는 서열을 포함하고 있는 제 2 핵산 분자를 포함하여 이루어지고, 상기 제 1 서열이 제 1 유도가능한 프로모터의 조절 하에 있으며, 제 2 서열이 제 2 유도가능한 프로모터의 조절 하에 있는 바이오센서용 유전자 구조체와, 이 유전자 구조체를 포함하는 세포 및 세포가 환경 신호에 노출되었을 때 세포 내에서 리포터 분자 활성을 측정하는 수단을 포함하여 이루어지는 환경 신호 측정용 바이오센서에 관한 것이다.
Description
"유전자 반응에 기초한" 바이오센서 측정은, 리포터 유전자를 적절한 프로모터에 부착시켜, 분석 대상에 대한 반응 신호(리포터 유전자에 의하여 암호화되는 효소의 활성으로 이루어짐)를 측정하는 것이 기본이다. 이러한 측정을 위하여 1984년에 박테리아 루시퍼라아제 오페론을 처음 사용하였다.(Baldwin et al., 1984) 이후로, 프로모터의 활성을 조사하기 위하여, 이러한 리포터를 사용하는 방법이 여러번 개시되었다. 현재에도, 많은 문헌이 이러한 내용을 다루는 것으로 보인다. 이러한 문헌에서는 대부분 luxAB 융합체 또는 전체 lux 카세트를 사용한다. 미국 테네시주 대학의 개리 세일러 등(Gary Sayler's group at the University of Tennessee in the USA, King et al., 1990)은 최초로, 목적을 더욱 제한하여, 이러한 구조체를 사용해 오염 물질의 농도를 측정하도록 제안하고, 이를 증명하였다. Burlage 와 Kuo(1994)등은 최근 환경 모니터링과 관련하여 이러한 바이오센서의 사용을 검토하였다.
실제로 알려진 모든 구조체는 활성 측정용 전체 lux 오페론 또는 이의 루시퍼라아제 일부(lux AB, 이런 경우에는 알데히드 기질을 외부에서 첨가하여 활성을 측정)를 사용한다. 전체 lux 오페론을 사용하면, 루시퍼라아제의 합성과 동시에 루시퍼라아제의 기질을 생성시키는 효소(lux CDE에 의하여 암호화되는 지방산 환원 효소)가 생성된다는 단점이 있다. 따라서, 세포가 생성하는 기질의 양이 루시퍼라아제를 포화시키기에는 불충분할 가능성이 있다. 본 발명의 발명자는, 이러한 단점을 해결하고자 바이오센서로 적합한 구조체에 변형을 가하여, 루시퍼라아제가 합성되자마자 최대 광출력을 얻도록 하였다.
본 발명은 환경 신호에 대한 세포의 유전자 반응 측정에 기초하는 환경 신호 검출용 바이오센서의 용도에 관한 것이다.
도 1은lux오페론을 나타낸 도이고,
도 2는 클론 지정된 pLuxAB을 나타낸 도이고,
도 3은 클론 지정된 pLuxCDE를 나타낸 도이고,
도 4는 클론 지정된 pTlux를 나타낸 도이고,
도 5는 톨루엔의 분해를 암호화하는 유전자를 조절하는 두 개의 오페론, Tol 오페론을 나타낸 도이고,
도 6은 pXlacR/S를 나타낸 도이고,
도 7은 구조체 지정된 pXylR의 특징을 나타낸 도이고,
도 8은 구조체 지정된 pTU/M을 나타낸 도이고,
도 9는 pTLU/M의 구성성분의 각 위치를 나타낸 도이고,
도 10은 대표적인 형질전환체 지정된 plu-x을 나타내는 도이고,
도 11은 대표적인 형질전환체 지정된 pLEU를 나타내는 도이다.
도 12는 시간경과에 따른, 크실렌을 첨가한 경우(■)와 크실렌을 첨가하지 않은 경우(□)의 신규한 센서 구조체(Leu-lacR)의 바이오루미네선스; 및 크실렌을 첨가한 경우(●)와 크실렌을 첨가하지 않은 경우(○)의 대조 구조체(Lux-lacR)의 상응하는 데이터를 나타낸다.
도 13은 신규한 센서 구조체(Leu-lacR)로 얻은 검정곡선을 나타낸다. 글리세롤 스톡으로부터 유기체를 접종하고, 최소한으로 흔들면서 30℃에서 밤새 배양하였다.
도 14는 플라스미드 pLEU의 지도를 나타낸다.
<<부록>>
부록 1:
슈도모나스 푸티다(Psuedomonas putida)의 TOL 플라스미드로부터의XylR유전자의 PCR
컴퓨터 분석(PCR프라이머 및 증폭)에 따라, 하기 프라이머를 사용하였다:
XylR 유전자
XylR ORF :
전방 프라이머 (RF) : 30합체
Tm - 52.0℃ G.C - 40%
역방향 프라이머 (RR) : 28합체
Tm - 60.9℃ G.C - 60%
PCR 조건: 프라이머가 46℃, 30주기동안 2.5분의 연장시간에서 30초동안 어닐링된다.
얻어진 생성물 크기: 약 1963 bps
XylR전체 유전자 :
전방 프라이머(XylRN.for) : 29합체
Tm - 62.4℃ G.C. - 62%
역방향 프라이머(XylRn.rev) :29합체
Tm - 60.9℃ G.C. - 48%
PCR 조건: 프라이머가 46℃, 30주기동안 2.5분의 연장 시간에서 30초동안 어닐링된다.
얻어진 생성물 크기: 약 2111 bps
터미네이터
벡터 pkk232-8로부터의 대장균 5s 리보솜 RNA 터미네이터(rrnbT1T2)의 PCR. 컴퓨터 분석(PCR프라이머 및 증폭)에 따라 하기 프라이머를 설계하였다.
전방 터미네이터
전방 프라이머(Frnb.F) : 36합체
Tm - 59.1℃ G.C. - 50%
역방향 프라이머 (Frnb.R) : 27합체
Tm - 62℃ G.C. - 50%
생성물 크기 : 약 390 bps
후방 터미네이터
전방 프라이머 (Rrnb.F) : 26합체
Tm - 59.1℃ G.C. - 50%
역방향 프라이머 (Rrnb.R) : 29합체
Tm -62℃ G.C - 50%
생성물 크기 : 약 380 bps
두 생성물 모두의 PCR 조건: 프라이머가 63℃, 20주기동안 30초의 연장 시간에서 10초동안 어닐링된다.
제노르하브더스 루미네선스(
Xenorhabdus luminescens) Lux CDABE
유전자
X. 루미네선스(X. luminescens)로부터의lux오페론(CDABE) 유전자(리보솜 결합 부위 포함)의 PCR. 하기 유전자(들)를 단일 단위로서 증폭하였다.
-lux CD
- lux AB
- lux E
- 전체 오페론lux CDABE
컴퓨터 분석(PCR프라이머 및 증폭)에 따라 하기 프라이머를 사용하였다.
Lux CD :
전방 프라이머 (luxCD.F) : 26합체
Tm - 62.2℃ G.C. - 53%
역방향 프라이머 (luxCD.R) : 32합체
Tm - 57.4℃ G.C. - 27%
PCR 조건: 프라이머가 52℃, 25주기동안 2.5분의 연장 시간에서 30초동안 어닐링된다.
얻어진 생성물의 크기 : 약 2483 bps
Lux AB :
전방 프라이머 (lux.F) : 32합체
Tm - 54.4℃ G.C. - 36%
역방향 프라이머 (lux.R) : 18합체
Tm - 61.5℃ G.C. - 53%
PCR 조건: 프라이머가 50℃, 25주기동안 2.0분의 연장 시간에서 30초동안 어닐링된다.
얻어진 생성물의 크기 : 약 2114 bps
Lux E :
전방 프라이머 (luxE.F) : 32합체
Tm - 53.4℃ G.C. - 41%
역방향 프라이머 (luxE.R): 30합체
Tm - 58.3℃ G.C. - 41%
PCR 조건: 프라이머가 45℃, 25주기동안 2.0분의 연장 시간에서 30초동안 어닐링된다.
얻어진 생성물의 크기 : 약 1205 bps
Lux
오페론 :
전방 프라이머 (luxCD.F) : 25합체
Tm - 62.2℃ G.C. - 53%
역방향 프라이머 (luxE.R) : 30합체
Tm - 58.3℃ G.C. - 41%
PCR 조건: Boerhinger expandTM롱 템플리트 PCR 키트를 사용하였다. 필수적으로 처음 10 주기는 다음과 같았다:
- 94℃에서 10초간 변성
- 52℃에서 30초간 어닐링
- 68℃에서 5분간 연장
그리고 나서, 이후의 15주기는 다음과 같았다:
- 94℃에서 10초간 변성
- 52℃에서 30초간 어닐링
- 68℃에서 5분간 연장하되, 각 연장 단계에서 20초씩 증가
얻어진 생성물의 크기 : 약 5831 bps
상부 톨루에이트 이화작용 경로 프로모터 영역 슈도모나스 푸티다(Psuedomonas putida)의 TOL 플라스미드로부터의 상부 톨루에이트 이화작용 경로 프로모터(리보솜 결합 부위를 포함)의 PCR. 컴퓨터 분석(PCR프라이머 및 증폭)에 따라, 하기 프라이머를 사용하였다:
전방 프로모터 (UF) : 19합체
Tm - 62.6℃ G.C. - 53%
역방향 프로모터 (UR) : 28합체
Tm - 61.5℃ G.C. - 53%
PCR 조건: 프라이머가 58℃, 25주기동안 30초의 연장 시간에서 10초동안 어닐링된다.
얻어진 생성물의 크기 : 약 246 bps
부록 2:
센서 요소로 사용할 수 있는 프로모터의 예
| 프로모터 | 신호 | 참고문헌 |
| mer | 중금속(특히 수은) | Selinofova, O.; Burlage,R. and Barkay, T., Appl. Env. Microbiol., 59,3083-3090,1993 |
| Psal | 나프탈렌, 살리실레이트 | Heitzer, A.; webb,O.F.;Thonnard, J.E. & Sayler, G.S.. Appl. Env. Microbiol.,58,1839-1846,1992 |
| fliC | 알루미늄 | Guzzo, J.;Guzzo, A,& Dubow, M.S.Toxicol.Lett.64/65,687-693,1992 |
| arsB | 비소 | Corbisier, P.;Ji, G.;Nuyts, G.;Mergeay, M.& Silver, S. FEMS Microbiol. Lett., 110,231-238,1993 |
| cardA | 카드뮴 | Corbisier, P.;Ji, G.;Nuyts, G.;Mergeay, M.& Silver, S. FEMS Microbiol. Lett., 110,231-238,1993 |
| Pm and Ps | 방향족 탄화수소 | Abril, M.A., Michan, C., Timmis, K.N., and Ramos, J,L, J.Bacteriol. 171,6782-6790,1989 |
| tcb | 클로로벤젠 | van der Meer, J.R., devos, W. M.,Harayama.,S & Zehnder, A.Microbiol. Rev., 56,677-694,1992 |
| clc | 클로로벤조에이트 | van der Meer, J.R., devos, W. M.,Harayama.,S & Zehnder, A.Microbiol. Rev., 56,677-694,1992 |
| bphdeVos, W. | 폴리클로리네이티드 비페닐 | van der Meer, J.R., M.,Harayama.,S & Zehnder, A.Microbiol. Rev., 56,677-694,1992 |
| cat | 카테콜 | van der Meer, J.R., devos, W. M.,Harayama.,S & Zehnder, A.Microbiol. Rev., 56,677-694,1992 |
| dmpR | 페놀류 | Sze,C.C.; Moore, T.& Shingler,V,Appl. Env. Microbiol.,178,3727-3735,1996 |
| lac | 락토오즈 | Engebrecht J.; Simon, M.&Silverman, M, Science, 227,1345-1347,1985. |
| ara | 아라비노오즈 | Engebrecht J.; Simon, M.&Silverman, M, Science, 227,1345-1347,1985. |
| rha | 람노오즈 | Ramos, J.L.; Rojo, F. & Timmis,K.N.Nucleic Acids Res.18,2149-2152,1990. |
| mel | 멜리비오즈 | Ramos, J.L.; Rojo, F. & Timmis,K.N.Nucleic Acids Res.18,2149-2152,1990. |
| xyl | 크실로오즈 | Ramos, J.L.; Rojo, F. & Timmis,K.N.Nucleic Acids Res.18,2149-2152,1990. |
| sor | 소르보오즈 | Ramos, J.L.; Rojo, F. & Timmis,K.N.Nucleic Acids Res.18,2149-2152,1990. |
| hut | 히스티딘 | Fisher, S,H.; Rohrer, K.&Ferson, A.E.J.Bact.,178,3779-3784,1996 |
| nifA | 질소 동화 | Shingler, V. Mol.Miocrobiol.19,409-416,1996 |
| ntrC | 질소 동화 | Shingler, V. Mol.Miocrobiol.19,409-416,1996 |
| laf | 대장균의 측면 편모의 발현, 표면의 반응에서 유도됨 | Engebrecht J.; Simon, M.&Silverman, M, Science, 227,1345-1347,1985. |
| proU | 오스모랄리티 | Zhang, X.;Fletcher,S.A.&Csonka, L.N.J.Bact.178,3377-3379,1996 |
| csiA | 기아 | Kjelleberg, S.; Albertson, N.Flaerdh, K.;Holmquist,L.;Jouper-Jaan,A;Marouga,R.;Oestling,J.;Svenbald.B.&Weichart,D.Antonie vanLeeuwenhoek,63,3/4,333-342,1993 |
| sigB,ctc,gsiB,gspA,katE,gspB,gtaB,csbA | Bacillus subtilis의 스트레스 반응 | Hecker, M.;Schumann, W.&Volker,U.Mol.Microbiol., 19,417-428,1996 |
| danak | 열 쇼크 | Van Dyk, T.K.;Majarian,W.R.;Konstantinov.K.B.;Young,R.M.;Dhurjati,P.S.& LaRossa,R.A.Appl.Env.Microbiol.,60,1414-1420,1994. |
| grpE | 열 쇼크 | Van Dyk, T.K.;Majarian,W.R.;Konstantinov.K.B.;Young,R.M.;Dhurjati,P.S.& LaRossa,R.A.Appl.Env.Microbiol.,60,1414-1420,1994. |
| algB | 알기네이트 생합성 | Shingler,V.Mol,Miocrobiol.19,409-416,1996 |
| cspA | 냉 쇼크 | Nakashima,K.;Kanamaru,L.;Mizuno,T.& Horikoshi,K.J.Bact.178,2994-2997,1996. |
| hrpS | 독성 결정인자 | Shingler,V.Mol,Miocrobiol.19,409-416,1996 |
본 발명의 제 1 실시 형태는,
(a) 검출가능한 활성을 갖는 리포터 분자를 암호화하는 서열을 포함하고 있는 제 1 핵산 분자; 및
(b) 리포터 분자의 기질을 생산하는 효소를 암호화하는 서열을 포함하고 있는 제 2 핵산 분자를 포함하여 이루어지고, 상기 제 1 서열이 제 1 유도가능한 프로모터의 조절 하에 있으며, 제 2 서열이 제 2 유도가능한 프로모터의 조절 하에 있는 바이오센서용 유전자 구조체이다.
바람직한 실시 형태에서, 제 1 핵산 분자는 박테리아 루시퍼라아제 Lux AB 또는 기능적인 이의 등가물을 암호화하고, 제 2 핵산 분자는 Lux CDE 효소 지방산 환원 효소 또는 기능적인 이의 등가물을 암호화한다. 이러한 유전자는 모든 바이오루미네선스 미생물의 lux 오페론에서 얻을 수 있으며, 이 중 대부분은 비브리오 (Vibrio), 제노르하브더스(Xenorhabdus), 포토하브더스(Photorhabdus) 및 포토박테리움(Photobacterium) 속에 속한다(Meighen, 1994). 이러한 계에서 검출가능한 활성은 광발생이다.
본 발명은 모든 유도가능한 프로모터를 사용할 수 있는 것으로 이해해야 한다. 적당한 몇가지 프로모터를 예로 들어 부록 2에 기재한다. 그러나, 이에 한정되는 것이 아니며, 가능한 다수의 프로모터를 나타내기 위한 것이다. 제 1 프로모터는 대부분, 바이오센서가 반응하기에 적합한 환경 신호에 따라 선택한다. 특히, 바이오센서가 크실렌을 검출하기 위하여 사용되는 경우, 제 1 프로모터로서 Pu 프로모터가 특히 적당하다.
본 발명의 제 1 실시형태의 바람직한 다른 실시 형태로는, 도 14의 크실렌 검출에 적합한 유전자 구조체가 있다.
본 발명의 유전자 구조체의 분명한 장점은, 세포 안에 있는 경우, 리포터 분자의 발현과는 독립적으로 효소 발현을 유도할 수 있다는 것이다. 이를 통하여, 효소에 의하여 생산되는 기질을 세포에 부하할 수 있다. 이 기질은, 생산되는 경우, 리포터 분자에 의하여 즉시 사용될 수 있어, 검출 신호에 신속한 반응이 가능하다. 리포터 분자가 환경 신호에 반응하게 되면, 최대한 반응하여 검출가능한 활성을 나타낼 수 있다. 시험중인 환경 신호에 노출됨으로써 제 1 프로모터가 유도될 수 있는 것이 바람직하다. 신호에 의하여 직접적으로 유도되거나, 구조체를 함유하는 세포 내의 하나 이상의 개별 경로를 활성화시킴으로써 간접적으로 유도될 수 있다.
유전자 구조체는 프로모터를 통하여 리포터 분자를 활성화시키기 위해 필요한 부속 요소 또는 그 요소들을 암호화하는 핵산 분자들을 더욱 포함할 수 있다. 예를 들면, 제 1 프로모터를 활성화하기 위하여 "2차 메시지" 분자를 발현시키는 핵산 분자 또는 조절 유전자가 포함된다.
조절 유전자에 의한 간접적인 활성화 경로에 의존하여 존재하는 프로모터의 주요 인자(effector)의 특성은, 조절 단백질의 신호 결합 부위를 변이시킴으로써 변형시킬 수 있다(Ramos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8467-8471, 1986). 문헌(deLorenzo, V.,; Herrero, M.; Jakubzik, U. & Timmis, K. N. J. Bact., 172, 6568-6572, 1990 또는 Sohaskey, C.D.; Im, H. & Schauer, A.T., J.Bact., 1674, 367-376, 1992)에 기재된 바와 같은 트랜스포즌을 기초로 하는, 프로모터가 없는 프로모터-탐침 벡터를 사용하면 새로운 프로모터를 확인할 수 있다.
본 발명의 제 2 실시형태는, 본 발명의 제 1 실시형태의 유전자 구조체를 포함하는 세포, 및 세포가 환경 신호에 노출되었을 때 세포 내에서 리포터 분자의 활성을 측정하는 수단을 포함하여 이루어지는 환경 신호 측정용 바이오센서이다.
세포는 박테리아, 효모, 진균류와, 다른 식물 세포 및 동물을 포함하는 모든 세포가 가능하다. 상기 세포중 박테리아 세포가 바람직하다. 환경 신호는 오염 물질, 독소, 온도, 방사선, 생물제제 및 화학제제가 가능하다.
박테리아 루시퍼라아제 계를 사용하는 경우, 센서의 기본적인 유전자 단위는 지방산 환원 효소의 제조를 암호화하는 제 2 핵산 분자(단위 2), 제 1 프로모터 및 루시퍼라아제 유전자를 함유하는 리포터 요소를 암호화하는 제 1 핵산 분자(단위 1), 경우에 따라서는, 조절 유전자와 같은 센서 요소를 활성화하는 부속 요소를 공급하는 제 3 단위(단위 3)이다. 시판중인 센서에는, 모든 요소가 숙주 유기체의 염색체에 삽입되는 것이 이상적이다. 이와 달리, 모든 단위를 플라스미드에 위치시키거나, 염색체에 삽입된 요소 및 플라스미드-유래 구조체(plasmid-borne construct)를 조합한 조합체를 사용할 수 있다. 예를 들면, 세 개의 단위를 사용하는 경우, 단위 1을 플라스미드 상에 위치시키고, 단위 2 및 단위 3을 염색체에 삽입할 수 있다.
박테리아 루시퍼라아제 계를 사용하는 기능성 바이오센서 단위는, 시험 시료를 본 발명의 제 1 실시형태에 따른 유전자 구조체를 함유하는 바이오센서 세포와 접촉시키는 장치 및 세포의 광출력을 측정할 수 있는 기구로 구성되어 있다. 원칙적으로 모든 광 측정 기구를 사용할 수 있으며, 가장 적당한 시스템은 광전자증배기(photomultipliers), 전하결합장치(charge coupled devices), 발광측정기(luminometers), 광측정기(photometers), 광섬유케이블 또는 액체 섬광 카운터(liquid scintillation counters)이다. 이들 시스템은 휴대 가능하거나 실험실 용으로 가능하며, 단일 분석에 사용하거나, 다중 분석을 위한 고도의 작업 처리 장치로 사용할 수 있다. 본 발명에 적당한 시판중인 90가지 이상의 시스템이 문헌(Stanley in J.Bioluminesc. Chemiluminescence, 7, 77-108, 1992)에 공개되었고, 이후에 정기적으로 갱신되고 있다.
분석물은 표면에 흡착되거나, 액체 매질중에 용해되거나, 기상으로 존재하는 경우에 바이오센서를 사용하여 측정할 수 있다. 측정 조건은, 유전자 구조체를 포함하는 바이오센서 세포가 확실히 기능을 할 수 있도록 충분한 수분을 이용할 수 있으면 된다. 시료를 분석 전에 적당한 완충 조성물로 희석하여, 이 용액 내에서 배양하는 것이 바람직하다. 이와 달리, 분석 대상은 막과 같은 선택적으로 투과가능한 베리어나 용매와 같은 수단을 사용하여 분석 전에 시료로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, 가스 시료를 액체를 통과시키거나, 적당한 고체 흡착제를 통과시켜 분석물을 분석전에 농축할 수도 있다.
유기체에서 유전자 반응을 유도하는 환경 신호나, 유기 또는 무기 화학제제를 검출하기 위하여 바이오센서를 사용할 수 있다. 미생물계가 주로 사용되지만, 포유류, 식물 또는 진균류 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 생리학적 측정에 적당한 프로모터 뒤에 루시퍼라아제 유전자를 삽입하여, 결핍(starvation), 독성 또는 포자 형성과 같은 생리학적 반응을 검출하기 위하여, 바이오센서를 사용할 수 있다. 입자에 부착되거나, 수성 시료에 용해되거나, 기상에 분산되어 있는 오염 물질을 검출하기 위하여 바이오센서를 사용할 수 있다. 그러나, 일반적으로는 액상에서 측정해야 한다.
본 발명의 제 3 실시형태는, 본 발명의 제 2 실시형태에 따른 바이오센서를, 바이오센서 안에서 세포의 리포터 분자 발현을 유도하는 신호에 노출시키되, 상기 세포는 노출 전이나 노출 동안 세포 안에서 기질이 형성되도록 효소를 생산하도록 유도되는 단계, 상기 리포터 분자가 미리 형성된 기질과 반응함으로써 검출가능한 반응을 하도록 하는 단계, 및 이 반응을 검출하는 단계를 포함하여 이루어지는 환경 신호의 검출 방법이다.
본 발명을 더욱 명확히 이해하기 위하여, 도면을 참조하여 바람직한 실시형태를 기재한다.
본 발명에 사용된 모든 구성성분은 일반인이 쉽게 사용가능한 것이다(본 작업을 위하여 특별히 생성시킨 다른 구조체는 제외함).
<재료 및 방법>
배양 조건
대장균의 재조합종을 37℃에서 루리아 브로스(LB)-트립톤 10g/L, NaCl 10g/L 및 효모 추출물 5g/L 중에 호기적으로 통상적으로 배양하였다. 코베 아가(Kobe argar) 15g/L를 가하여 배지를 고체화하였다. 필터 멸균된 항생제를 필요량 가하였다. 암피실린 100mg/ml를 벡터 pSP72, pUC18, pTrc 99A 및 pPL-L에 기초한 구조체를 유지하는데 사용하고, 테트라사이클린 10mg/ml를 pRK404에 기초한 구조체를 위해 사용하였다. 다른 탄소 공급원으로는 글루코오즈(1% w/v) 및 락토오즈(1% w/v)를 사용하였다.
일반적인 재조합 DNA 방법
제한효소 및 다른 DNA 변형 효소는 공급자에 의해 특정된 조건하에서 사용하였다. DNA를 조작 및 클로닝하기 위해 Sambrook 등(1989)에 의한 표준 방법을 사용하였다. 플라스미드를 함유하는 클론을 신속히 스크리닝하기 위해서, Morelle (1989)에 의한 방법에 따라 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다.
| 구성체 | 벡터 | 주해/설명 |
| pxylac-R | pRK404 | lacZ 프로모터에 융합된 XylR ORF |
| pXylR | pRK404 | pRK404의 PstI/BamHI 부위로 클론된 Pr을 함유하는 XylR 유전자 |
| pTer | pSP72 | rrnbT1T2April 96 터미네이터 양자를 함유 |
| pTu | pSP72 | pTer의 EcoRI/SmaI 부위로 클론된 Pu |
| pluxAB | pUC18 | lacZ 프로모터에 융합된 luxAB 유전자 |
| pTLU | pSP72 | pTu 중의 Pu 프로모터에 융합된 luxAB 유전자 |
| pluxCDE | pTrc 99A | trc 프로모터에 융합된 luxCDE 유전자 |
| pluxCDABE | pTrc 99 | trc 프로모터에 융합된 luxCDABE 유전자 |
| pTluxCDABE | pSP72 | pTer로 클론된 luxCDABE 유전자 |
| pLu-x | pSP72 | pTu 중의 Pu 프로모터로 융합된 luxCDABE 유전자 |
| pLEU | pTrc 99A | pluxCDE의 BamHI/PstI 부위로 클론된Pu-luxAB 검출 카세트 |
| 구성체 | 벡터 | 구성일자 |
| pxylac-R | pRK404 | 1994년 8월 사용가능 |
| pXylR | pRK404 | 1996년 4월 21일 구성됨(Karen Jury's labbook, 6면)1996년 4월 26일 확인됨(Karen Jury's labbook, 8면) |
| pTer | pSP72 | 1994년 8월 사용가능 |
| pTu | pSP72 | 1994년 8월 사용가능 |
| pluxAB | pUC18 | 1995년 7월 3일 구성됨(Tony Vancov labbook 1, 28121면)1995년 7월 6일 확인됨(Tony Vancov labbook 1, 28125면) |
| pTLU | pSP72 | 1995년 7월 25일 구성됨(Tony Vancov labbook 1, 28141면)1995년 8월 1일 확인됨(Tony Vancov labbook 1, 28146면) |
| pluxCDE | pTrc 99A | 1995년 7월 25일 구성됨(Tony Vancov labbook 1, 28141면)1995년 8월 9일 확인됨(Tony Vancov labbook 1, 28153면)1995년 8월 10일 알데히드 프로듀서 확인됨(Tony Vancov labbook 1, 28154면) |
| pluxCDABE | pTrc 99 | 1995년 11월 13일 구성됨(Tony Vancov labbook 2, 9122면)1995년 11월 17일 확인됨(Tony Vancov labbook 2, 9124면) |
| pTluxCDABE | pSP72 | 1996년 5월 16일 구성됨(Tony Vancov labbook 3, 33417면)1996년 5월 17일 확인됨(Karen Jury's labbook, 15면) |
| pLu-x | pSP72 | 1996년 4월 21일 구성됨1996년 4월 21일 확인됨(Karen Jury's labbook, 5면) |
| pLEU | pTrc 99A | 1995년 12월 8일 구성됨(Tony Vancov labbook 2, 9142면)1995년 12월 13일 확인됨(Tony Vancov labbook 2, 9143면)1995년 12월 14일 확인됨(플레이트 에세이, Tony Vancov labbook 2, 9144면) |
| 코드 | 대장균 종 | 구성체* | 수득일 |
| Tlu-lacR | NM522 | pTLU + pxylac-R | 1995년 8월 7일 구성됨(Tony Vancov labbook 1, 29151면)1995년 8월 10일 확인됨(Tony Vancov labbook 2, 28154면) |
| Leu-lacR | NM522 | pLEU + pxylac-R | 1996년 4월 16일 구성됨(Tony Vancov labbook 3, 33404면)1996년 4월 20일 확인됨(Tony Vancov labbook 3, 33408면) |
| Leu-R | NM522 | pLEU + pXylR | 1996년 5월 10일 구성됨(Karen Jury's labbook, clone (i)e)1996년 5월 11일 확인됨(luminometer readings and gels,Karen Jury's labbook, 13면) |
| Lux-LacR | NM522 | pLu-x + pxylac-R | 1996년 5월 17일 구성됨(Tony Vancov labbook 3, 33418면)1986년 5월 18일 확인됨(Karen Jury's labbook, 14-16면) |
| Lux-R | NM522 | pLu-x + pXylR | 1996년 5월 10일 구성됨(Karen Jury's labbook, clone (ii)g)1996년 5월 11일 확인됨(luminometer readings and gels,Karen Jury's labbook, 13면) |
| *XylR 조절유전자(pXylR 또는 pxylac-R)를 운반하는 구조체는 pRK 404 플라스미드 상에 위치하나,센서의 실제 광 발생 요소는 플라스미드 pSP72(pLu-x) 또는 pTrc 99A(pLEU)에 삽입됨에 유의 |
바이오루미네선스 어세이- 배양물의 준비
달리 언급되지 않는한, 대장균 클론을 신선한 아가 플레이트로부터 적절한 항생제가 함유된 40ml의 LB 배지가 들어있는 플라스크에 접종하고, 호기적으로(흔들면서) 37℃에서 약 2-3시간 배양하였다. OD600약 0.8-1.2에서 배양물을 수확하고, 2회 세척하고, 100mM 인산염 완충용액 pH 7.5, 1/10 묽힌 LB 브로스 및 0.1%글루코오즈(w/v)를 함유하는 완충액 중에 재현탁하였다. 문헌에 명시된 몇가지 경우에, IPTG 및 m-크실렌(1mM)과 같은 유도인자(inducers) 및/또는 주효인자(effectors)를 첨가하였다. 배양물의 광학 밀도를 1.6으로 조절하고, 하기와 같이 어세이하였다:
세포 현탁액 10ml를 100ml 밀봉 병(스코트 병)에 넣고, 실험 내내 자석 교반기에 놓고, 실온에서 교반하였다. 20분 또는 30분 간격으로 샘플링하였다. 배양물을 100ml 분취하여 옮기고, 생물량을 측정하기 위하여 600nm에서 배양물의 광학 밀도를 측정하였다. 미세역가 플레이트를 사용하는 MicroBeta 섬광 카운터로 광 생성(바이오루미네선스, Lumi Counts Per Second, LCPS)을 측정하였다. 20㎕의 20% 글루코오즈를 미세역가 플레이트의 각 웰에 가하였다(글루코오즈는 전자주게로 작용). 각 샘플에서, 0.5% 테트라데실 알데히드를 첨가한 경우와 그렇지 않은 경우의 루미네선스 활성을 기록하였다. LCPS를 OD600으로 나누어 특이 활성을 결정하였다.
알데히드 지시 플레이트
파라로사닐린 및 중아황산염의 혼합물은 쉬프 시약으로 종종 언급되며, 알데히드의 검출에 광범위하게 사용된다(Lillie 1977). 이러한 성분은 알데히드를 생성하는 클론 발현 효소를 동정하는 데 사용할 수 있는 고체 배지 중에 병합된다. 파라로사닐린 8ml(95% 에탄올 2.5mg/ml)와 중아황산 나트륨 100mg을 예냉된 Luria 아가에 가하여 지시 플레이트를 준비하였다. 백그라운드 색의 증가를 촉진하는 알데히드를 포함하는 증기 및 광, 두가지 모두로부터 격리하여 플레이트를 실온에서 저장하였다.
결과
루시퍼라아제 성분의 클로닝
a) 배경 설명
X. 루미네선스(X. luminescens) 유래의 lux AB 유전자 생성물은 다른 박테리아(30℃ 이하-Szittner and Meighen, 1990)에서 유래한 것보다 열적으로 더욱 안정하다(45℃ 이하). 따라서, 본 발명의 구조체에는 이러한 종의 lux 유전자를 사용하였다. 이 유기체의 lux 구조 유전자 순서는 luxCDABE이며, 측면에 luxCD 및 luxE 유전자가 위치한 루시퍼라아제 유전자이다(도 1 참조).
b) lux AB 유전자 클로닝
시판중인 프로모터 검출 lux 계를 사용하지 않고 이러한 계를 만든다. luxA 유전자의 리보좀 결합 부위(RBS)의 상류에 바로 위치한 특정 클로닝 부위(EcoRV, ClaI 및 EcoRI), 측면에 위치한 전사 터미네이터(rrnbT1T2), 및 다른 벡터에 클로닝이 용이하도록 하는 최소한 두 개의 특정 효소 부위(BamHI 및 XhoI 또는 SalI 또는 PstI)를 갖도록, 프로모터가 없는 luxAB 유전자 카세트를 설계한다. EcoRV, ClaI 및 EcoRI 부위의 올바른 위치에 삽입된 프로모터 서열은 luxAB 유전자를 발현시킬 수 있다.
EcoRV 부위의 상류에 있는 rrnbT1T2 터미네이터는, 다른 프로모터로부터 lux 유전자로 계속하여 전사되는 것을 억제하기 위한 것이며, lux 유전자 말단의 rrnbT1T2 터미네이터는 숙주-벡터계의 불안정화 억제를 돕기 위한 것이다.
pSP72의 다른 부위의 rrnbT1T2 터미네이터의 클로닝이 용이하도록, 두 세트의 PCR 프라이머를 설계하였다. 우선, 후방의 터미네이터를 벡터 pKK232-8(Brosius, 1984)로부터 증폭하여, pSP72의 BamHI/XbaI 부위에 클론함으로써 pT2를 얻었다. Bg/II 및 BamHI는 양립가능한 결합 말단을 생성하지만, 다시 결합된 말단은 어느 한 효소에 의하여 다시 분리될 수 없다. 따라서, pSP72의 원래의 BamHI 및 Bg/II 제한 부위 및 rrnbT1T2 PCR 생성물은 각각 pT2에 존재하지 않는다. 전방 전사 터미네이터는 유사하게 증폭되어 pT2의 Bg/II/EcoRV 부위에 클론되었다. 양성 클론(지정된 pTER)을 분리하여 특징을 조사하고, 다른 연구를 위해 보존하였다.
X. 루미네선스 유래의 LuxAB 유전자를 증폭하여 EcoRI/SmaI 부위 pUC18에 클론하여 벡터의 lacZ 프로모터 및 luxAB 유전자 사이에 전사 융합시켰다. 이와 같은 구조체를 갖는 콜로니의 바이오루미네선스는, 외인성 알데히드를 첨가하면 어둠 속에서 육안으로 쉽게 관찰되었다. 무작위적으로 선택한 10개의 콜로니에서 분리한 구조체는 서로 동일하고 순수한 특징을 보였다. 한가지 클론, 지정된 pluxAB가 포함되어 있었다(도 2 참조).
c) 알데히드 합성 유전자 클로닝
17개의 염기쌍에 의하여 구별되는 trp(-35) 영역 및 lac UV5(-10) 영역을 함유하는 trc 프로모터의 전사 조절 하에 luxCDE 유전자를 위치시켰다(Amann et al., 1988). luxCD 프라이머에 의하여 생성되는 PCR 단편을 제한효소 Eco RI/Kpn I로 절단하여 제한효소 Kpn I/Bam HI로 절단한 luxE PCR 생성물에 연결하였다. 특정 제한 효소 부위를 각 프라이머의 5' 말단에 결합하여 위치시켰다. 프라이머의 뉴클레오티드 서열 및 증폭 조건을 부록에 기재한다. 얻어지는 연결 혼합물을 상방으로 luxCD 역방향으로 LuxE 프라이머와 25회 추가 증폭하였다. luxCDE(약 3.7Kb)를 포함하는 최종 산물을 발현 벡터 pTrc 99A의 EcoRI/BamHI 부위에 클론하여, NM522로 형질전환하였다. 형질전환체를 알데히드 지시 플레이트 상에 부착함으로써 양성 알데히드 생성 클론을 분리하였다. 무작위로 선택한 클론의 연속 PCR 및 RE 분석을 통하여 구조체를 확실히 알 수 있었다. 클론 지정된 pLuxCDE(도 3)은 다른 연구를 위해 보관하였다.
플라스미드 pTrc 99A는, IPTG로 유도가능한 강한 trc 프로모터를 함유한다. 또한, 상기 벡터는 프로모터를 조절하는 lacIq억제제 및 lacZ 리보좀 결합 부위를 함유한다. 그러나, trc 프로모터는 매우 강한 프로모터로, 비유도 상태에서도 낮은 수준이지만 전사를 하는 것으로 보였다(Amann et al., 1988).
d) 대조구 구조체-루시퍼라아제 오페론
단일 단위로서 전체 lux 오페론을 암호화하는 구조체를 대조구로 하였다. 전체 lux 오페론(CDABE 유전자)은, 키트(Boerhinger's expandTMLong Template PCR kit)로, 상방으로 luxCD 및 역방향으로 luxE 프라이머를 사용하여, X. 루미네선스로부터 증폭하였다. 제한효소 EcoRI 및 BamHI로 절단 후, PCR 단편을 pTrc 99A의 EcoRI/BamHI 부위에 클론하여, trc 프로모터 및 lux 오페론 사이에 전사 융합시켰다. 얻어진 재조합체 클론을 가시 검사(visual examination)하면, 외인성 알데히드가 있는 경우, 또는 없는 경우에 바이오루미네선스가 나타나지 않았다. 그러나, 외인성 알데히드가 없는 경우, 섬광 카운터를 사용하여 루미네선스를 검출하였다. 이러한 형질전환체를 RE 및 PCR 분석하여 특징 조사한 결과, 전체 lux 오페론이 클론되었음을 확인할 수 있었다. 대표적인 형질전환체, 지정된 pluxCDABE를 다른 연구를 위하여 보관하였다.
내부 프로모터가 lux 오페론 전사를 활성화할 가능성을 배제하기 위하여, PCR 단편을 pTER의 EcoRI/SmaI 부위에 클론하였다. 얻어진 재조합 클론(지정된 pTlux)을 육안 및 섬광 카운터를 사용하여 조사하면, 외인성 알데히드가 존재하거나 없는 경우, 바이오루미네선스가 나타나지 않았다. pTlux는 두 개의 전사 터미네이터가 측면에 위치하는 luxCDABE 유전자를 함유한다(도 4에 개략적으로 설명되어 있다.).
BTEX 센서 구성
a) 배경 설명
슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 Tol 플라스미드는, 톨루엔, m-크실렌 및 p-크실렌을 완전히 분해하기 위하여 필요한 효소를 암호화한다(Wang & Dunn, 1974; Worsey & Williams, 1975). 톨루엔 분해를 암호화하는 유전자는 두 오페론으로 구성된다(도 5 참조). "상부" 경로로 인하여 톨루엔 및 크실렌이 방향족성 카르복시산으로 산화된다(Franklin et al., 1983). 이화 작용 효소 유전자에 추가로, Tol 플라스미드는 상부 경로 주효인자(톨루엔 등)와 함께 경로 오페론 프로모터로부터 발현을 일으키는 XylR 조절 단백질을 암호화한다(Pu, Abril et al., 1989).
b) 조절 유전자 클로닝
xylR 유전자를 전형적인 Tol 플라스미드로부터 증폭하고(PCR을 통하여), 숙주가 광범위한 벡터 pRK404의 PstI/BamHI 부위에 개별적으로 클론하였다(Ditta et al., 1985). 얻어진 구조체는 유도가능한 lacZ 프로모터의 전사 조절 하에 있으며, 도 6과 같았다.
xylR 유전자는 내부 PstI 부위를 함유하므로, NsiI 제한 부위를 전방 PCR 프라이머를 통하여 xylR 유전자 생성물의 5' 말단에 도입하였다. 이 프라이머는 NsiI 인식 부위를 함유한다. NsiI로 분리하면 PstI와 양립가능한 결합 말단을 생성하여, 연결이 용이해진다. 얻어진 구조체, 지정된 pxylac-R은 xylR 유전자의 개방 해독 프레임(the open reading frame, ORF)을 함유한다.
전체 xylR 유전자(프로모터 -Pr을 포함)도 클론하였다. 이러한 구조체의 구성 원리를 통하여, 이종구조(heterologous) 유전자를 함유하는 종은 원형 유전자를 갖는 종보다 BTX 화합물에 대하여 더욱 빠르게 반응한다는 것이 증명되었다. 전체 xylR 유전자(2.1kb)를 Tol 플라스미드로부터 증폭하여(PCR을 통하여), pRK404의 PstI/BamHI 부위에 클론하였다. lacZ 프로모터로부터 전사 간섭을 배제하기 위하여, xylR 유전자를 반대 방향에 클론하였다. 이를 돕기 위하여, 전방 및 역방향 PCR 프라이머의 제한 부위를 교환하였다. 따라서, 전방 프라이머는 5' 말단에 BamHI 인식 부위를 함유하고, 유사하게 역방향 프라이머는 NsiI 부위를 함유한다. 도 7에서 얻어진 구조체 pXylR의 특징을 설명한다.
c) 이화 작용 프로모터를 lux 검출계에 융합
상기 목적을 위한 다음 단계는 Tol 플라스미드의 상부 경로 프로모터를 pTER에 클론하는 것이었다. 프로모터를 Tol 플라스미드로부터 증폭하여, pTER의 EcoRV/EcoRI 부위에 개별적으로 연결하고, 대장균 HB101로 형질전환하였다. PCR 및 제한 엔도뉴클레아제 분석 후, 두 클론을 분리하여 다음 연구를 위해 보관하였다. Pu 프로모터를 갖는 구조체는 지정된 pTU이다(도 8 참조).
X. 루미네선스 유래의 luxAB 유전자가 대장균 내에서 기능적으로 전사된 후, 유전자를 계속하여 pTU에 클론하였다. luxAB PCR 단편을 블런트 말단을 형성한 후 제한효소 Eco RI로 절단하여, pTU의 Eco RV/Eco RI 부위에 개별적으로 연결하여 pTLU를 얻었다. 얻어진 재조합체 클론을 가시적으로 조사하면, 외인성 알데히드의 존재하에 바이로루미네선스를 나타내지 않았다. 그러나, 섬광 카운터를 사용하여 루미네선스를 검출하였다. 세포의 루프 풀(loop full of cells)을 아가 플레이트에서 떼어내어, 100ml의 Luria 브로스 및 1% 테트라데실 알데히드를 함유하는 에펜도르프 튜브에서 다시 현탁하였다. 배양액을 폴리스티렌 미세-역가 플레이트에 옮기고, 섬광 카운터를 사용하여 광생산을 스캔하였다. RE 및 PCR 분석을 통하여 이와 같은 형질전환체의 특징을 조사한 결과, 구조체는 확실히 증명되었다.
도 9는 구조체 성분의 각 위치를 도시한 것이다.
d) Pu 프로모터 구조체의 전사
pTLU의 잠재적인 유용성을 확인하기 위하여, 공지된 주효인자 m-크실렌에 반응하는 이러한 클론의 루시퍼라아제 활성을 검사하였다. 이 클론 및 이의 특이 조절자(pxylacR)를 함유하는 대장균종도 조사하였다(도 4). pTLU를 함유하는 대장균 NM522에서, 상대적으로 낮은 수준의 루미네선스가 검출되었다. 이러한 결과는 종래 결과(Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1990)와 일치하며, Pu가 이의 조절자 없이 전사를 개시할 수 있다는 것을 나타낸다.
예상한 대로, 존재하는 당 및/또는 IPTG 타입에 따라, Pu 프로모터의 XylR-의존성 발현이 40 내지 470배 증가하였다. 글루코오스로 배양된 것 이외의 모든 유기체에서, 주효인자 분자(m-크실렌)가 없는 경우, 광출력이 5 내지 10배 감소하였다. 글루코오스(7.5x105LCPS) 존재 하에 배양된 세포에서, 가장 높은 크실렌-유도 루시퍼라아제 활성이 나타났다. 글루코오스는 lacZ 프로모터(XylR은 lacZ 프로모터로부터 전사된다.)로부터의 전사를 억제하는 것으로 알려져 있으므로, 이러한 결과를 해석할 때 약간의 주의가 필요하다.
| 구성체 | 보충 | LCPM |
| pLuxAB | +IPTG | 6.2 x 106 |
| pLuxAB | -IPTG | 8.9 x 105 |
| pxylacR | +IPTG, +크실렌 | -a |
| pxylacR | +IPTG, -크실렌 | -a |
| pTLU | +IPTG, +크실렌 | 1.6 x 103 |
| pTLU | +IPTG, -크실렌 | 2.3 x 103 |
| pxylacR-pTLU | +크실렌 | 6.6 x 104 |
| pxylacR-pTLU | -크실렌 | 1.8 x 104 |
| pxylacR-pTLU | +IPTG, +크실렌 | 4.3 x 105 |
| pxylacR-pTLU | +IPTG, -크실렌 | 8.6 x 104 |
| pxylacR-pTLU | +글루코오즈, +크실렌 | 7.5 x 105 |
| pxylacR-pTLU | +글루코오즈, -크실렌 | 4.2 x 105 |
| pxylacR-pTLU | +락토오즈, +크실렌 | 3.4 x 105 |
| pxylacR-pTLU | +락토오즈, -크실렌 | 4.8 x 104 |
| -a: 검출되지 않음 |
재조합 종을 밤새 배양하고, 각각 100 및 10mg/ml 농도의 암피실린 및 테트라사이클린을 함유하는 LB 브로스로 100배 희석하였다. 탄소원, 글루코오즈 및 락토오즈를 1% 농도로 공급하였다. 조절 유전자 XylR의 발현을 유도하기 위하여, 1mM 농도의 IPTG를 가하였다. 주효인자 m-크실렌(1nM)의 존재하에 10% 테트라데실알데히드 2ml를 가하고, 5시간 후에, 루미네선스 활성(초당 발광수; Luminescence Counts Per Second)를 결정하였다. 배양물을 30℃에서 배양하였다.
e)BTEX 센서 조절 구조체
lux 오페론[조절 구조체]을 Pu 프로모터의 조절하에 둔다. 상기한 바와 같이, Boerhinger's expandTM롱 템플리트 PCR 키트를 사용하여 X. 루미네선스(X. luminescens)로부터 lux 오페론(CDABE 유전자) 전체를 증폭시켰다. 5'말단을 제한효소 EcoRI로 절단하고, 3' 말단을 블런트 말단으로 형성시킨 PCR 단편을 pTu의 EcoRI/SmaI 부위에 연결시켰다. NM522로 형질전환한 후, 외인성 알데히드의 부재하에 섬광 카운터로 포지티브 바이오루미네이팅 클론을 동정하였다. 제한 엔도누클리아제 및 PCR 분석을 사용하여, 이들의 진정성(authenticity)를 결정하였다. 대표적인 형질전환체, 지정된 pLu-x를 다음 작업을 위해 유지시켰다(도 10 참조). 백그라운드 루미네선스 활성을 결정하고자 하였다. pLu-x를 Luria 브로스에서 배양하고, 상기 '방법 및 재료' 부분에서 설명된 프로토콜에 따라 어세이하였다. 외인성 m-크실렌이 있거나, 없는 경우에 루미네선스는 검출되지 않았다.
f) 완전한 BTEX 센서의 구성
Pu-luxAB 카세트를 아가로오즈 겔 전기영동법으로 pTLU로부터 분리하고, 제한효소BamHI/PstI로 절단하고, pluxCDE의 유사한 제한부위에 클론하였다. RE 및 PCR 분석으로, Pu-luxAB 카세트가lux CDE유전자에 융합되는 이러한 형질전환체의 특성을 확인하였다. 대표적인 형질전환체, 지정된 pLEU를 다음 작업을 위해 유지시켰다. pLEU의 Pu-luxAB 카세트의 상대적인 위치를 도 11에 나타내었다. 백그라운드 루미네선스 활성을 결정하기 위해서, Luria 브로스에서 pLEU를 배양하고, '재료 및방법' 부분에서 설명한 프로토콜에 따라 어세이하였다. 반복된 어세이는 m-크실렌의 존재하에도 루미네선스를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 조절단백질 XylR의 부재하에는 Pu가 유도되지 않았음을 분명하게 나타낸다.
시험종 Leu-lacR은 pLEU과 pxylac-R를 모두 NM522로 형질전환하고, 암피실린과 테트라사이클린에 내성을 갖도록 선택하여 생성하였다. 유사하게, 각 구조체(도 1 및 2 참조)를 NM522로 형질전환하여 Leu-R, Lux-lacR 및 Lux-R을 생성하였다.이러한 종들의 어세이 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.
본 발명의 신규한 센서의 기능을 도 12 및 도 13에 나타내었다. 신규한 센서의 반응은 명백히 본래의 lux 유전자 카세트에 기초한 참조 구조체를 사용하여 얻은 것보다 탁월하였다. 신규한 센서에 있어서, 광 신호의 유도가 더욱 빠르고, 더욱 강하였다. 도 13은 이러한 센서를 사용하여 크실렌의 경우 ppm 이하의 수준에서도 선형 검정곡선을 얻을 수 있음을 분명히 나타낸다. 그러므로, 신규한 센서 구조체에서 달성한 바와 같이, lux 유전자를 분할함으로써 센서 반응이 상당히 향상된다.
본 기술분야의 당업자에게는, 구체적인 실시예에 나타낸 바와 같이, 광범위하게 설명된 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는한 다양한 변형 및/또는 변화가 가능하다는 것이 명백할 것이다. 그러므로, 본 실시예는 설명하고자 하는 것이지, 제한하고자 하는 것은 아니다.
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Claims (15)
- (a) 박테리아 루시퍼라아제 Lux AB 이며 검출가능한 활성을 갖는 리포터 분자를 암호화하는 서열로 이루어진 제 1 핵산 분자; 및(b) Lux CDE 효소 지방산 환원 효소이며 리포터 분자의 기질을 생산하는 효소를 암호화하는 서열로 이루어진 제 2 핵산 분자를 포함하여 이루어지고, 상기 제 1 서열이 제 1 유도가능한 프로모터의 조절 하에 있으며, 제 2 서열이 제 2 유도가능한 프로모터의 조절 하에 있는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 유전자 구조체.
- 제 1항에 있어서, Lux를 암호화하는 핵산 분자가 비브리오(Vibrio), 제노르하브더스(Xenorhabdus), 포토하브더스(Photorhabdus) 및 포토박테리움(Photobacterium) 속에 속하는 바이오루미네선스 미생물의 lux 오페론 중에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 구조체.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1 프로모터가 Pu 프로모터인 것을 특징으로 하는, 크실렌 검출용 구조체.
- 제 3항에 있어서, 도 14로 도시된 바와 같은 구조체.
- 제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 프로모터가 환경 신호에 노출됨으로써, 신호에 의하여 직접적으로 유도되거나, 구조체를 함유하는 세포 내의 하나 이상의 개별 경로를 활성화시킴으로써 간접적으로 유도될 수 있도록 하는 구조체.
- 제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 프로모터를 활성화하기 위하여 "2차 메시지" 분자를 발현시키는 핵산 분자 또는 조절 유전자를 더욱 포함하는 구조체.
- 제 1항 내지 4항 중의 어느 한 항에 따른 유전자 구조체를 포함하는 세포, 및 세포가 환경 신호에 노출되었을 때 세포 내 리포터 분자의 활성을 측정하는 수단을 포함하여 이루어지는 환경 신호 측정용 바이오센서.
- 제 7항에 있어서, 상기 세포는 박테리아, 효모, 진균류 및 다른 식물 세포 및 동물로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
- 제 8항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
- 제 9항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
- 제 7항에 있어서, 상기 환경 신호는 오염 물질, 독소, 온도, 방사선, 생물제제 및 화학제제로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
- 제 7항에 있어서, 세포 내에서 리포터 분자의 활성을 측정하는 수단이 세포의 광출력을 측정할 수 있는 기구인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
- 제 12항에 있어서, 세포의 광출력을 측정할 수 있는 기구는 광전자증배기(photomultipliers), 전하결합장치(charge coupled devices), 발광측정기(luminometers), 광측정기(photometers), 광섬유케이블 및 액체 섬광 카운터로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
- (a) 제 7항에 따른 바이오센서를, 바이오센서 안에서 세포의 리포터 분자 발현을 유도하는 신호에 노출시키되, 상기 세포는 노출 전이나 노출 동안 세포 안에서 기질이 형성되도록 효소를 생산하도록 유도되는 단계,(b) 상기 리포터 분자가 미리 형성된 기질과 반응함으로써 검출가능한 반응을 하도록 하는 단계, 및(c) 이 반응을 검출하는 단계를 포함하여 이루어지는 환경 신호 측정 방법.
- 삭제
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