KR100464068B1

KR100464068B1 - 페놀계 화합물 검출용 바이오센서 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100464068B1
Application number: KR10-2002-0027161A
Authority: KR
Inventors: 신혜자; 박후휘; 박선미; 임운기
Original assignee: 학교법인 동서학원
Priority date: 2002-05-16
Filing date: 2002-05-16
Publication date: 2005-01-03
Also published as: KR20030089115A

Abstract

본 발명의 페놀계 화합물 검출용 바이오센서는, 검출 보고 역할을 갖는 반딧불 루시페라제 유전자를 암호화하는 서열을 포함하는 제1핵산분자; 및 페놀계 화합물 분해효소 조절유전자capR(본 발명에 의한 고유 명칭), 상기 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 유전자Pr및 분해효소 합성을 조절하는 프로모터 유전자Po로 구성되는 제2핵산분자를 포함하는 플라스미드를 갖는 세포; 및 상기 세포가 페놀계 화합물에 노출되었을 때 페놀계 화합물과 반응하는 조절단백질CapR에 의해 프로모터 유전자Po아래의 루시페라제가 합성되어 그 활성을 형광발현으로 측정하는 것(kit)을 특징으로 한다. 상술한 구성에 의하면, 시간 및 장소에 구애받지 않고 전처리과정 없이 단시간에 현장시료를 나노수준으로 저렴하게 페놀계 화합물을 분석할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.

Description

페놀계 화합물 검출용 바이오센서 및 그 제조방법{biosensor for detecting phenolic compounds and the manufacturing method thereof}

본 발명은 페놀계 화합물 검출용 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 유전자 재조합기술을 이용한 페놀계 화합물 검출용 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것이다.

낙동강의 페놀 유출 사고로 유해물질에 대한 경각심이 커져 가고 있고, 특히 공업적으로 널리 활용되고 있는 페놀과 같은 방향족 유기용매들은 환경에 유출되면 먹이사슬을 통해 인체에 유입되어 발암성물질이 되거나 환경호르몬으로 작용하고 있어 생물체에 미치는 영향이 심각하므로 선진국에서는 최우선적으로 제거해야 할 환경 독성물질로 분류되고 있다.

이러한 페놀 같은 방향족 화합물을 측정하기 위해 기기 화학적 방법이 활용되고 있으나 막대한 장비로 비용이 많이 드는 점과 복잡한 처리에 의해 시간이 오래 걸리며 전문가가 아니면 활용이 용이하지 않는 점으로 경제적 기술적 효과가 크게 부각되지 않고 있는 실정이다. 또한 이들 중장비 기기는 현장에서 활용할 수 없는 불편함도 있다. 그리고, 이러한 방향족 화합물은 분석의 전처리과정에서 대부분 휘발되는 문제점도 있었다.

그러므로 이러한 방향족 화합물을 보다 신속 간단하고 낮은 비용으로 정확하게 검출하는 기술의 개발은, 전세계적 스톡홀름 환경협약을 지켜야 하는 국가사회적 측면에서 그리고 기존 검출방법이 가지는 고비용과 현장적용 등의 문제점을 해결해야 하는 경제적 및 환경 기술적 차원에서 매우 중요하다. 또한, 상기 화합물들의 사전 유출을 방지하고 모니터링하기 위해서는 분석방법의 간단, 신속성이 더욱 요구되며, 상술한 바와 같이 전처리 과정에서 휘발되는 문제점을 해결하기 위해 전처리를 하지 않거나 최소화하는 분석방법을 필요로 한다.

한편, 슈도모나스(Pseudomonas)를 비롯하여 많은 미생물이 환경에 존재하는 난분해성 방향족 화합물과 같은 독성물질에 적응하며 이들을 생분해하여 탄소원으로 사용하는 능력을 가진다는 것이 보고되어 있다(Harayama and Timmis, 1992: Kustu et al., 1991). 이러한 미생물의 특성은 그 유전자와 관련 단백질에 기인되며 미생물은 생존을 위해 이들 독성물질을 분해하는 효소들을 가지도록 진화하고 있다. 이들 미생물은 분해해야 할 화합물이 존재할 때에만 분해효소를 생합성하기 위해 관련 유전자의 발현을 조절하고 있다.

발현조절은 프로모터(promoter)라는 특이조절유전자와액티베이터(activator)라는 단백질의 상호작용에 의해 가능하다. 액티베이터 단백질은 분해화합물인 난분해성 방향족 화합물과 결합되어야만 구조적 변이가 유도되어 분해 효소의 생합성을 위한 전사를 시작한다.

이 결합에 의해 전사 액티베이터, 호스트팩터(host factor)와 RNA 중합효소(polymerase)로 이루어진 DNA 프로모터복합체(promoter complex)가 형성되어 다운스트림에 있는 분해효소 유전자를 발현시킨다(Marques and Ramos, 1993; Perez-Martin et al., 1994). XylR과 XylS를 비롯한 몇몇 액티베이터 단백질들이 발견되어 보고되고 있고 분해 유전자의 구조가 규명되고 있다. 이러한 발견과 규명에 힘입어 유기오염 독성물질들을 탐지하는 바이오센서의 개발이 가능하게 되었다.

분해관련 프로모터를 반딧불 루시페라제(firefly luciferase)나β-갈락토시다제 등의 리포터유전자와 재조합하여 관련 분해화합물에 의해 이들 재조합유전자의 프로모터가 활성화될 때 리포터 단백질이 발현되고 이를 생화학적으로 인지할 수 있는 바이오센서의 개발이 시도되고 있다(Willardson et al., 1998; Hollis et al., 1999; Reid et al., 1998; Blouin et al., 1996; Heitzer et al., 1994).

또한 스트레스유전자를 리포터유전자와 재조합하여(Belkin et al., 1996) 산소에 관한 스트레스를 측정한 연구와 열충격(heat shock) 유전자를 리포터유전자에 재조합하여(Van Dyk et al., 1994) 여러 환경스트레스에 의해 유도되는 열충격유전자의 발현으로 환경독성을 측정한 연구 및 SOS 럭스테스트(lux test)를 이용하여 환경의 제노톡신(genotoxin)을 측정한 연구(Ptitsyn et al., 1997)가 보고되고 있다. 그외 여러 화합물이나 금속을 측정하는 다양한 바이오센서에 관한 연구도 진행되고 있다(Sticher et al., 1997; Peitzsch et al., 1997; Schramm et al., 1996).

윌라드슨(Willardson) 연구그룹에서는 벤젠, 톨루엔 및 유사화합물을 검출하는 바이오센서를 보고하였다. 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) mt-2 유래 TOL 플라스미드로부터 전사가능한 액티베이터xylR과 프로모터Pu를 리포터유전자luc와 재조합하여E.coli세포에 형질전환한 후 벤젠, 톨루엔 등에 의해 형광을 유도하여 화합물의 탐색을 연구하였다. 이 바이오센서를 이용하여 물과 토양에서 BTEX(benzene, toluene, and xylene)의 오염을 측정하였다. 정확한 농도의존 형광이 관찰되었고 3-자이렌은 39.0±3.8μM, 3-메틸벤질알콜은 2,690±160μM의 K_1/2값을 나타냈다. 그러나, 높은 염과 pH에서 형광발현이 저해되는 문제가 보고된다(Willardson et al., 1998). 또한, 검출가능한 한계농도가 높은 문제점도 있다.

국내에서는 살충제(pesticides)와 결합하는 수용체(receptor)를 이용한 면역검정(immunoassay)법으로 살충제를 검출한 연구와 포도당산화효소(glucose oxidase)를 막에 고정하여 포도당을 분석한 연구가 보고되고 있으며 생물공학적으로 재조합한 여러 독성물질들에 의한 세포의 스트레스 반응연구가 보고되고 있다. 또한 제품개발에서는 생물전자이용법으로 용존산소를 측정한 BOD 미터(Meter)가 개발되고 있으며 발광미생물을 이용하여 용존산소를 측정하는 장치가 연구되었다.

그러나, 환경오염물에서 페놀계 화합물의 정성분석과 정량분석을 저렴하고 신속정확하게 행할 수 있는 페놀계 화합물 검출용 바이오센서는 개발되고 있지 않다.

본 발명은 상기 문제점들을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 전처리과정 없이 단시간에 현장시료를 나노수준으로 저렴하게 분석할 수 있는 페놀계 화합물 검출용 바이오센서 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 의한 클로닝된 벡터맵을 나타내는 도면

도 2a 및 도 2b는 본 발명에 의한 페놀계 화합물 검출용 바이오센서의 바이오 발광 반응을 나타내는 그래프.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 의한 제1양태의 페놀계 화합물 검출용 바이오센서는 검출 보고 역할을 갖는 리포터 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 제1핵산분자와, 페놀계 화합물 분해효소 조절유전자capR, 상기 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 유전자Pr및 페놀계 화합물 분해효소 합성을 조절하는 프로모터 유전자Po을 갖는 제2핵산분자를 포함하여 구성되는 유전자 구조체; 및 상기 유전자 구조체를 갖는 세포를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 구성의 페놀계 화합물 검출용 바이오센서에 의하면, 페놀계 화합물 존재시 리포터유전자 발현정도에 따라 누구나 페놀계 화합물 분석을 신속, 정확하게 저비용으로 행할 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 페놀계 화합물 검출용 바이오센서는 제1핵산분자인 반딧불 루시페라제 유전자,luc이 제2핵산분자와 페놀계 화합물에 의해 암호화하여 합성됨으로 형광을 발현하는 것을 특징으로 한다.

상기한 구성에 의하면, 환경오염물에서 페놀의 농도를 0.05ppm까지 정량분석할 수 있는 이점이 있으며, 이는 다른 방법(스트레스 유전자를 이용한)으로 제조된 바이오센서보다 100배 정도 높은 감도에 해당한다.

본 발명의 다른 구체적인 실시예에 의하면, 상기 세포가 페놀계 화합물에 노출되었을 때 세포내 루시페라제의 활성을 측정하는 수단을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기한 구성에 의하면, 전처리과정 없이 단시간에 현장시료를 나노수준으로 저렴하게 분석할 수 있는 이점이 있다.

상기 세포는 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 대장균이 바람직하다.

상기 루시페라제의 활성을 측정하는 수단은 모든 광측정기구를 사용할 수 있으며, 운반용 루미노미터(luminometer)가 현장에서 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 상기 세포는 동결건조기(lyophilizer)를 이용하여 분말화한 형태로서, 필요한 때 어디서나 시료용액과 혼합하여 난분해성 방향족 화합물의 유무를 시험관안에서 확인가능한 키트로 개발할 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 제2양태에 의하면, 페놀계 화합물 검출용 바이오센서의 제조방법은, 페놀계 화합물 분해효소 조절유전자capR(본 발명에 의한 고유의 명칭임), 상기 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 유전자Pr, 및 분해효소 합성을 조절하는 프로모터 유전자Po을 포함하는 삽입유전자를 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 삽입유전자들을 제한효소 Kpn I로 자르는 단계; 반딧불 루시페라제 유전자를 포함하는발현벡터를 상기 제한효소로 자르는 단계; 및 상기 삽입유전자와 발현벡터를 클로닝하여 컴피턴트셀에 형질전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 구성에 의하면, 전처리과정 없이 단시간에 현장시료를 나노수준으로 저렴하게 분석할 수 있는 페놀계 화합물 검출용 바이오센서를 단순한 공정에 의해 용이하게 제조할 수 있는 이점이 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 페놀계 화합물 검출용 바이오센서 및 그 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.

먼저 페놀과 특이적으로 반응하는 유전자를 규명하고 얻기 위하여 페놀분해미생물 중 가장 탁월한 분해능을 가진 미생물의 유전자를 분리한 다음 중합효소 연쇄반응을 이용하여 분해 관련 유전자 부위를 증폭시켜 클로닝하였다.

이때 사용된 프라이머는 기존에 알려진 페놀분해 관련 유전자의 염기서열 중 진화적으로 매우 보존성이 높은 부위의 서열로 정하여 제작하였다. 제작된 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 실행함으로써 페놀분해 관련 조절유전자capR(본 발명에 의한 고유의 명칭)과 이의 발현을 조절하는 프로모터 유전자Pr과 페놀분해효소 합성을 조절하는 프로모터 유전자Po를 함께 증폭시킨다.

이를 전기영동으로 확인한 후 제한효소 Kpn I으로 양쪽끝을 자른 다음 이 단편을 정제한 후, 도 1에 나타난 바와 같이 동일한 제한효소로 잘라진 발현벡터인 pGL3-베이직벡터(Promega회사)에 클로닝한다. 그런 다음 삽입유전자를 포함하는 발현벡터를 대장균(DH5α)에 형질전환하였다. 정확한 클로닝의 여부는 염기서열을 통해 확인하였으며 다른 분해 미생물과 98% 유사염기서열을 가지고 있다. 조절 유전자capR은 기존 알려진 페놀 분해관련 유전자와 13개 이상의 다른 아미노산을 가지므로 고유의 서열로 본 발명에서capR이라 명한다. 상기 CapR 단백질의 아미노산 서열(563개)은 다음과 같다.

MPIKYKPEIQ HSDFKDLTNL IHFQSTEGKI WLGEQRMLLL QVSAMASFRR

EMVNTLGIER AKGFFLRQGY QSGLKDAELA RKLRPNASEY DMFLAGPQLH

SLKGLVKVRP TEVDIDKECG RFYAEMEWID SFEVEICQTD LGQMQDPVCW

TLLGYACAYS SAFMGREIIF KEVSCRGCGG DKCRVIGKPA EEWDDVASFK

QYFKNDPIIE ELYELQSQLV SLRTNLDKQE GQYYGIGQTP AYQTVRNMMD

KAAQGKVSVL LLGETGVGKE VIARSVHLRS KRAAEPFVAV NCAAIPPDLI

ESELFGVEKG AFTGATQSRM GRFERADKGT IFLDEVIELS PRAQASLLRV

LQEGELERVG DNRTRKIDVR VIAATHEDLA EAVKAGRFRA DLYYRLNVFP

VAIPALRERR EDIPLLVEHF LQRFHQEYGK RTLGLSDKAL EACLHYSWPG

NIRELENVIE RGIILTDPNE SISVQALFPR APEEPQTASE RVSSDGVLIQ

PGNGQGSWIS QLLSSGLSLD EIEESLMREA MQQANQNVSG AARLLGLSRP

ALAYRLKKIG IEG

도 2a 및 도 2b는 본 발명에 의한 페놀계 화합물 검출용 바이오센서로 측정된 페놀농도 및 배양시간에 따른 형광값(bioluminescence)를 나타내는 그래프로서, 도 2a는 형광값을 log값으로 나타낸 그래프이다. 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 페놀 0.05ppm(500nM)에서 3ppm정도까지 농도에 의존하여 형광값이 증가하고 페놀 주입 후 시간별 측정에서도 시간에 따라 형광값이 증가하였다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명한다.

실시예 1. 게놈 DNA의 분리

유전자 은행으로부터 페놀류를 분해하는 것으로 알려진 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) KCTC1452를 분양받아 트립틱 소이 브로스(typtic soy broth) 3ml에 접종하여 200rpm, 25℃에서 18-20시간 진탕배양한 후 6000rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 모았다.

모아진 세포에 0.567ml의 10mM Tris-HCl/1mM EDTA(pH 8.0)을 넣어 부유시킨 후 10% SDS 30㎕와 20mg/ml 프로테이나제K 3㎕를 넣어 조심스럽게 섞은 후 37℃에서 1시간 동안 방치하였다.

여기에 80㎕의 5M NaCl을 넣어 조심스럽게 잘 섞고, 100㎕의 10% CTAB/0.7%NaCl 용액을 넣어 섞은 다음 65℃에서 10분간 가열하였다.

이 용액에 동량의 클로로포름/이소아밀알콜을 첨가하여 인버팅(inverting)에 의해 잘 섞어 원심분리하여 상층액을 취하여 새 튜브에 옮기고, pH 5.2의 3M 초산나트륨을 10분의 1양만큼 넣은 후 0.6배의 이소프로판올을 넣어 잘 섞었다.

게놈 DNA가 염에 의해 침전이 되면서 하얀 실모양의 DNA가 보이면 멸균된 파스퇴르 파이펫의 끝부분을 잘 봉한 후 건져내고, 이를 마르지 않도록 바로 70% 에탄올 1ml에 담그기를 반복하여 염을 제거하고, 지나치게 건조되지 않도록 살짝 말린 후 10mM 트리스-HCl/1mM EDTA(pH 8.0) 100㎕에 넣어 풀리도록 10분 이상 방치하였다.

게놈 DNA가 파스퇴르 파이펫에서 녹아나오면 4℃에 하룻밤 정도 두어서 게놈DNA가 버퍼내에 균일하게 퍼지도록 하여 이를 0.7% 아가로오즈겔에 걸어 게놈 DNA임을 확인하였다.

실시예 2. 페놀 분해 조절관련 유전자의 검색

문헌조사를 통해 페놀분해에 관여하는 주요 조절단백질(Regulatory protein)인DmpR이 페놀의 분해메카니즘에서 페놀 인지 및 분해에 중요한 유전자임을 확인하고, 이에 해당하는 유전자 클러스터(cluster)인dmp오페론 부분을 검색하였다. 이 검색에는 NIH내의 NCBI검색사이트를 이용하였다. 검색을 통해dmpR및 이것의 프로모터 부분인Pr, 그리고 DmpR 조절단백질에 의해 조절받는dmp오페론의 프로모터인Po부분의 염기서열을 조사하였다.

실시예 3. 프라이머 제작

유전자뱅크에서 검색된 유사단백질의 DNA 염기서열을 바탕으로 아래와 같이 관련 유전자의 시작과 끝에 해당하는 프라이머를 제노텍에 주문 제작하였다.

Forward; 5'-CGGGGTACCAAGCTTATCCTAGCCTTCGATGCCGAT-3'(서열번호 2)

Reverse; 5'-CGGGGTACCAAGCTTTAACGAGTGAGCTGATGGAAA-3'(서열번호 3)

실시예 4. PCR(Polymerase Chain Reaction)에 의한 증폭

확인된 균주의 게놈 DNA로부터 상기 프라이머를 사용하여 전체 반응양을 50㎕되도록 하였다. 주형 DNA로 사용될 게놈 DNA의 농도는 100ng으로 하고 제작된 프라이머는 최종농도 1.0μM이 되도록 하였다. dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)의 농도는 각각 2.5mM이 되도록 하였다. Taq 중합효소는 1.25units이 되도록 하여 PCR 반응을 진행시켰다.

먼저 95℃에서 10분 동안 전-변성(pre-denaturation)한 후, 95℃ 1분, 50℃ 1분, 72℃ 2분으로 30싸이클을 수행하고 72℃에서 10분 동안 반응을 시켜 DmpR 관련 유전자를 증폭시키고, 이를 0.7% 아가로즈겔에 DNA 마커와 함께 0.5X TAE 버퍼에 전기영동하여 PCR산물을 확인하였다.

실시예 5. 클로닝 및 리게이션(Cloning and Ligation)

확인된 PCR 산물 1㎍에 대해 제한효소인 KpnI(Takara사) 1U을 37℃에서 2시간 처리하였다. PCR산물을 1.2% 아가로오즈겔에 전기영동한 후 5㎍/ml의 EtBr용액에 10분간 착색(staining)하고 증류수에 15분간 탈색(destaining)하여 UV일루미네이터(UV illuminators)에서 약 2.2kb인 DNA절편을 DNA분자마커를 사용하여 확인하고 이를 포함한 부위를 조심스럽게 자른다.

자른 아가로오즈겔의 무게를 재어서 3배의 부피로 NaI용액을 넣은 후 65℃에서 5분간 겔을 녹인 후에 그 속에 녹아있는 DNA가 바인딩될 수 있도록 5㎕의 글래스밀크(glassmilk)를 넣고 실온에서 5분간 둔 후 원심분리하여 펠릿만을 얻어 세척용액을 넣고 원심분리하는 과정을 3번 반복하였다.

그런 다음, 글래스밀크-DNA를 실온에서 말린 후 20㎕의 TE버퍼를 넣고 삽입DNA를 추출하였다. 그리고, 루시페라제 유전자를 가진 pGL3 베이직벡터(Basic vector, Promega사)도 동일하게 Kpn I으로 잘랐다.

이렇게 얻어진 삽입유전자와 루시페라제유전자를 가진 pGL3 베이직벡터를 삽입DNA : 벡터DNA의 5:1 비율로 첨가하고 1U의 T4 DNA 리가제(TAKARA사)를 이용하여 16℃에서 16시간 리게이션반응을 하여 이를 DH5α컴피턴트셀(competent cell)에CaCl2에 의한 형질전환방법으로 형질전환시켜 이를 50㎍/ml 암피실린이 함유된 LB플레이트에 플레이트한 후 37℃ 배양기에서 16시간 배양하였다.

플레이트에서 잘 분리된 콜로니를 멸균된 이쑤시개를 사용해 50㎍/ml 암피실린이 함유된 LB 배지에 접종배양하여 16시간 진탕배양한 후 플라스미드 DNA를 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep kit,QIAGEN사)를 이용하여 분리하였다.

먼저, 세포를 1.5ml E-튜브에 모은 다음에 P1 버퍼 250㎕를 넣어 펠릿을 부유시키고, P2 버퍼를 250㎕ 넣어 5번 부드럽게 흔들어주며 세포를 용해시킨 후, N3 버퍼를 350㎕ 넣고 부드럽게 5번 흔들어주어 용해된 것을 중성화시켰다.

10분 동안 상온에서 원심분리하여 상층액을 조심스럽게 따라 내어 2ml 퀴아프렙 스핀 칼럼(QIAprep spin column)에 옮긴 다음에 PB 버퍼를 500㎕ 넣어 1분 동안 원심분리하였다. PE버퍼 750㎕를 넣어 스핀컬럼을 1분간 원심분리하여 씻어준 후에 걸러진 것을 버리고 1분간 한번 더 원심분리하여 남은 버퍼용액을 제거하고, 퀴아프렙 스핀 컬럼을 1.5ml E-튜브에 옮긴 후에 EB 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 8.5) 50㎕을 넣어 1분간 둔 후에 1분간 원심분리하여서 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA는 0.7% 아가로오즈겔에 전기영동을 하여 Kpn I를 사용하여 클로닝된 것을 확인하였다.

실시예 6. 시퀀싱 및 호모로그의 비교

클론된 유전자의 서열은 생거의 디데옥시 종결법에 근거한 DNA 시퀀싱키트(ABI 377, PE Applied Biosystems)을 사용하여 자동시퀀싱을 수행하였다.

먼저 클로닝된 유전자 500ng와 프라이머 1.6pmole과, 빅다이(Bigdye)를 이용하여 전체 반응액을 10㎕로 하여서 PCR반응을 진행시킨다. 시퀀싱에 사용된 프라이머는 pGL3 베이직벡터의 멀티플 클로닝사이트(multiple cloning site)에 삽입된 유전자의 서열을 파악하기 위해서 다음과 같은 프라이머를 이용하였다.

의미가닥 : 5'-CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC-3'(서열번호 4)

역의미가닥 : 5'-CTT TAT GTT TTT GGC GTC TTC CA-3'(서열번호 5)

95℃에서 10분동안 전-변성(pre-denaturation)한 후, 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분으로 25사이클 반응시킨 후에, 72℃에서 10분 반응시켰다. 얻어진 PCR산물은 1.5ml E-튜브에 옮겨서 에탄올에 침전하여 증폭된 DNA만을 정제하였다.

pH4.6의 3M 초산나트륨을 1㎕을 넣고 25㎕의 100% 에탄올을 첨가하여 25분 얼음에 둔 후 15000rpm에서 4℃로 15분 동안 원심분리한 다음 상층액을 따라낸 후 70% 에탄올을 첨가하여 다시 10분간 원심분리하여 상층액은 버리고 펠릿만을 남긴다.

그런 후 충분히 말린 후 로딩다이(loading dye)를 넣어 95℃에서 2분 동안 변성시킨 후 2㎕만 따라내서 로딩을 수행하였다. 자동서열기에 의한 시퀀싱을 진행하고 서열만을 텍스트파일로 받는다. 이를 NCBI의 블라스트 데이터베이스(BLAST database)와 비교검색하여, 그 결과 일부 서열이dmpR유전자와 DmpR에 의해 작동되는Po프로모터와 약 98% 유사성을 보임을 확인하였다. 그러므로 본 발명에 의한 조절 유전자를capR로 명명하고 그 서열은 서열목록에서 서열번호 1로 나타낸다.

또한 아미노산의 서열도 약 97%의 상동성을 보이나, 기존에 보고된 바 없는 새로운 단백질이며, 페놀외에도 카테콜(Catechol), 2-클로르페놀(2-Chlorphenol), 2-메틸페놀(2-Methylphenol), 2,5-디메틸페놀(2,5-dimethylphenol)도 검출가능하였다.

실시예 7. 형광발현에 의한 페놀검출

상술한 대로 만들어진 미생물 유래 바이오센서의 페놀검출능력을 페놀주입시 나타나는 형광발현으로 확인하였다. 페놀이 바이오센서 세포(OD600 값 = 0.4 정도)에 주입되었을 때 페놀과 특이하게 반응하는 조절단백질인 CapR이 생성되어 반응한 후 이 복합체가 형광발현 유전자인 루시페라제 유전자 바로 앞에 있는Po프로모터에 결합하여 형광발현효소들을 생합성하며 주입된 기질을 분해하여 형광을 낼 때 이를 루미노미터로 측정하여 확인하였다.

각각의 다른 농도의 페놀과 배양시간에 따른 형광의 발현(도 2a 및 2b 참조)에서 페놀검출용 바이오센서가 500nM의 나노수준의 페놀을 측정할 수 있음을 보여주었고 조건에 따라 감도는 더욱 증가할 수 있음을 기초실험으로 나타내었다.

상술한 구성의 본 발명의 페놀계 화합물 검출용 바이오센서에 의하면, 전처리과정 없이 단시간에 현장시료를 나노수준으로 저비용으로 분석할 수 있는 효과를 도모할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 바이오센서는 환경분야 이외에, 의학,식품 등의 다양한 분야에서 페놀계 화합물을 측정하기 위해 활용될 수 있다.

한편, 본 발명의 페놀계 화합물 검출용 바이오센서의 제조방법에 따르면, 상기 특징의 페놀계 화합물 검출용 바이오센서를 단순한 공정에 의해 제조할 수 있는 효과도 도모할 수 있다.

<110> SHIN, HAE JA <120> biosensor for detecting phenolic compounds and the manufacturing method thereof <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2146 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 1 ctagccttcg atgccgattt tcttcagccg ataggccagt gccggtcggc ttaggccgag 60 caagcgcgcg gcaccggaga cgttttggtt ggcctgttgc atggcttcgc gcatcaggct 120 ttcctcgatc tcgtcgaggc tcaggccgct gctcaacaac tggctgatcc aactgccctg 180 gccattgcct ggctgaatca gcacgccgtc cgacgacacc cgctcgctgg cggtctgcgg 240 ctcttccggc gcccgtggga acagcgcctg cacgctgatg ctttcgttcg gatcggtgag 300 gatgatgccg cgctcgatga cgttctccag ctcacggata ttgcccggcc aactgtaatg 360 caggcaggcc tccagggctt tgtctgaaag gccgagggtt ctcttgccgt actcctggtg 420 gaagcgctga aggaagtgct caaccagcag tggaatgtcc tcgcggcgtt cgcgcaacgc 480 cgggatcgcc accgggaaaa cgttcagccg gtagtacagg tcggcgcgaa aacgcccggc 540 cttgaccgct tcggccaggt cctcgtgggt ggctgcgata acccttacgt cgatcttgcg 600 cgtgcggttg tcgccaactc gctccagctc gccttcttgc agcacgcgca gcagactggc 660 ctgagcgcgc gggctgagtt cgatcacctc gtcaaggaag atggtgccct tgtcggcccg 720 ctcgaagcgg cccatgcgtg actgggtggc gccggtgaag gcgccttttt ccacgccgaa 780 caattcggac tcgatcaggt ccggcgggat cgccgcacag ttcaccgcga caaagggctc 840 ggcggcgcgt ttgctgcgca ggtgcacgct acgcgcgatg acctccttgc cgaccccggt 900 ctcgccaagc agcagcaccg agactttgcc ctgtgcggcc ttgtccatca tattgcgcac 960 ggtctggtag gccggggtct gaccgatgcc gtagtactgg ccttcctgtt tgtcgaggtt 1020 ggtacgcagc gacaccagtt gcgattgcaa ctcgtagagt tcctcgatga tggggtcgtt 1080 cttgaaatac tgtttgaagc tggcaacgtc gtcccactct tcggccggct tgccaatgac 1140 ccggcacttg tcgccgccgc agccgcggca gcttacttcc ttgaagatga tttcccggcc 1200 catgaacgcc gaggaatagg cgcaggcgta gccgagcaga gtccagcaca ccgggtcttg 1260 catctgcccc aggtcggtct ggcagatttc cacctcgaag gagtcgatcc actccatctc 1320 ggcatagaag cgcccgcatt ccttgtcgat atcgacctcg gtggggcgga ccttgaccag 1380 acccttgagc gaatgcagct gcgggccggc gaggaacatg tcgtactcgc tggcattcgg 1440 tctaagcttc ctggccagtt cggcatcctt caggccggac tggtaaccct ggcgcaggaa 1500 gaagcccttg gcgcgttcga tgcccagggt attgaccatt tcccggcgaa agctggccat 1560 tgctgaaacc tgcagcaaca gcatgcgttg ttcgccaagc cagatcttgc cttccgtgct 1620 ctggaagtgg atcaggttgg tcaggtcctt gaaatcggag tgctggattt caggcttgta 1680 cttgatcggc atgtaagcga ggcccctatt tatttttaga tggggaaatc agggtcgccg 1740 ctatagcgca aggcaggcgg cgattccaga tggggtcatg gggaaaatcg gcagtttttt 1800 cacctgcgcc agctccccat agccgacctc agtatctggc aaaagtcaac caaatgatca 1860 atcgacggca gtgactttag tgctagagat cagccttcag ctgcgccatg agcatttgct 1920 caagcggcct tgggcaattg atcaaatgct taaaaagcct gcgcaagcgc ggcttaattt 1980 cgctcgctcc gatcattcta aaaattagaa acacattgaa aaacaatacc ttgaggtcgg 2040 ttttcagacc ttggcacagc tgttgcactt tgtcctgcgc aatccgccaa cctggagatg 2100 gccgtgacca atacccccac accgactttc gatcagccac tcgtta 2146 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 2 cggggtacca agcttatcct agccttcgat gccgat 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 3 cccaagcttg gtaccaaact gcagcaacag catgcg 36 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 4 ctagcaaaat aggctgtccc 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 5 ctttatgttt ttggcgtctt cca 23

Claims

서열번호 1에 기재된 페놀계 화합물 분해효소 조절유전자capR, 상기 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 유전자Pr및 페놀계 화합물 분해효소 합성을 조절하는 프로모터 유전자Po로구성되는 폴리뉴클레오티드; 및 검출 보고 역할을 갖는 리포터분자와 상기 폴리뉴클레오티드를 갖는 세포를 포함하는 페놀계 화합물 검출용 바이오센서.
제1항에 있어서, 리포터분자가 반딧불 루시페라제(firefly luciferase)인 것을 특징으로 하는 페놀계 화합물 검출용 바이오센서.
제2항에 있어서, 상기 세포가 페놀에 노출되었을 때 루시페라제의 활성을 측정하는 수단을 포함하여 이루어지는 페놀계 화합물 검출용 바이오센서.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는Pseudomonas putidaKCTC1452에서 유래한 것임을 특징으로 하는 바이오센서.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포는 동결건조된 분말형태인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
서열번호 1에 기재된 페놀계 화합물 분해효소 조절유전자capR, 상기 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 유전자Pr및 페놀계 화합물 분해효소 합성을 조절하는 프로모터 유전자Po을 포함하는 삽입유전자를 증폭시키는 단계;

상기 증폭된 삽입유전자들을 제한효소 Kpn I로 자르는 단계;

반딧불 루시페라제 유전자를 갖는 발현벡터를 상기 제한효소로 자르는 단계;

상기 삽입유전자와 발현벡터를 클로닝하여 컴피턴트셀에 형질전환시키는 단계를 포함하는 페놀계 화합물 검출용 바이오센서의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 컴피던트셀이 대장균 DH5α인 것을 특징으로 하는 페놀계 화합물 검출용 바이오센서의 제조방법.