CN111944880A - 一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的引物和探针组及试剂盒 - Google Patents
一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的引物和探针组及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的引物和探针组及试剂盒；引物组包括用于检测copA基因的上游引物，如SEQ ID NO.1所示；下游引物，如SEQ ID NO.2所示；探针，如SEQ ID NO.3所示。用于检测czcD基因的上游引物，如SEQ ID NO.4所示；下游引物，如SEQ ID NO.5所示；探针，如SEQ ID NO.6所示；探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；试剂盒包括：PCR反应液、混合酶液、阳性标准品、弱阳性质控品和强阳性质控品；该试剂盒通过特异性的引物和探针、在PCR反应阴性对照、弱阳性质控品、强阳性质控品的监控下，与阳性标准品进行同步测定，测得的结果具有灵敏度高、准确度高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的引物和探针组及试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
当前，环境重金属污染越来越受到人们的关注。相对于有机污染而言，土壤重金属污染持续时间长，无法通过土壤自然过程降解，对环境的危害更持久，从而影响土壤微生物的构成。
铜和镉是我国土壤重金属污染中比较典型的两种重金属元素，有时会产生联合污染。重金属污染会对土壤细菌产生选择压力，进而影响土壤细菌的构成和数量。copA是编码多重抗铜氧化酶的基因，广泛存在于耐铜细菌中，可作为耐铜细菌的遗传标记物。czcD是编码阳离子外排蛋白，从而缓解土壤重金属镉对细菌的毒性。因而，可以通过测定重金属耐受基因的数量，来分析重金属对土壤细菌的影响。
土壤本身也是重金属耐受基因的一个重要库，但是，传统的定量检测方法，主要是基于微生物培养测序，缺乏相对有力的手段来确定耐受基因的数量。随着实时荧光PCR检测技术的发展，特别是探针法的进步，能及时确定土壤中耐受基因的数量，对于控制环境重金属污染，分析细菌重金属耐受性具有积极意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的引物和探针组，该引物和探针组可配合对copA和czcD基因特异性的核酸片段体现出良好的扩增效率。
本发明的第二个目的在于提供一种试剂盒，该试剂盒通过特异性的引物和探针、在PCR 阴性对照、弱阳性质控品、强阳性质控品的监控下，与阳性标准品同步检测，测得的结果具有灵敏度高、准确度高的特点。
实现本发明的第一个目的通过采取如下技术方案达到：
一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的引物和探针组，包括，
上游引物copA-F：5’ATYGAGCTKCATYTGACCGG 3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物copA-R：5’ATYTTCMAGKTCRCTCCACATGCC 3’，如SEQ ID NO.2所示；
探针copA-P：5’TGSATBGGRTGSGYCATCATVSTGTC 3’，如SEQ ID NO.3所示；探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记BHQ1基团。
上游引物czcD-F：5’CGACGCCGCGCACATG 3’，如SEQ ID NO.4所示；
下游引物czcD-R：5’TANCCSSCGACGCCGA 3’，如SEQ ID NO.5所示；
探针czcD-P：5’CCGCGCCGARRTSCTCG 3’，如SEQ ID NO.6所示；探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有BHQ1基团。
进一步地，引物和探针根据copA基因片段保守区进行设计，该靶片段的序列如SEQID NO.7所示；引物和探针根据czcD基因片段保守区进行设计，该靶片段的序列如SEQ ID NO.8所示。
实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种用于copA和czcD基因荧光定量PCR检测的试剂盒，包括PCR反应液、混合酶液、阳性标准品、弱阳性质控品和强阳性质控品；PCR反应液包括引物和探针；
引物为：上游引物copA-F：5’ATYGAGCTKCATYTGACCGG 3’，如SEQ ID NO.1所示；下游引物copA-R：5’ATYTTCMAGKTCRCTCCACATGCC 3’，如SEQ ID NO.2所示；上游引物czcD-F：5’CGACGCCGCGCACATG 3’，如SEQ ID NO.3所示；下游引物czcD- R：5’TANCCSSCGACGCCGA3’，如SEQ ID NO.4所示；
探针为：探针copA-P：5’TGSATBGGRTGSGYCATCATVSTGTC 3’，如SEQ ID NO. 3所示；探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记BHQ1基团；探针czcD-P：5’CCGCG CCGARRTSCTCG3’，如SEQ ID NO.6所示；探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有BHQ1基团；
阳性标准品、弱阳性质控品和强阳性质控品均包括含有copA和czcD基因片段的载体质粒；该靶片段的序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步地，PCR反应液包括浓度为0.3-0.5mM含dUTP的dNTPs、2-6mM的Mg2SO4、2％ -8％的海藻糖、1％-4％DMSO、0.2％-1％甜菜碱、0.5％-2％的BSA、0.1-1nM纳米金、0.2-0.8μM的引物和0.2-0.5μM的探针；所述纳米金的直径为2nm-10nm。
进一步地，混合酶液包括3-6U的HotStart Taq酶和0.2-0.4U的UNG酶。
进一步地，阳性标准品包括：
阳性标准品A：含有浓度为1.0×104copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒；
阳性标准品B：含有浓度为1.0×105copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒；
阳性标准品C：含有浓度为1.0×106copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒；
阳性标准品D：含有浓度为1.0×107copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒。
进一步地，试剂盒进行PCR反应的程序为：45℃，5min；94℃，2min；90℃，5sec，60℃(-1℃/循环)，20sec，72℃，30sec，10个循环；90℃，8sec，55℃，20sec，72℃，1min，4 0个循环；数据的采集定在72℃，1min。
进一步地，载体质粒为pGH载体。
本发明的待检样本包括但不限于土壤样本。
本发明的设计原理如下：
荧光PCR是一种在核酸扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。本发明利用针对靶核酸序列的特异性引物和探针，通过双重实时荧光 PCR，实现对copA基因和czcD基因靶核酸序列片断的扩增与定量检测。采用TaqMan探针法检测copA基因和czcD基因，所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和BHQ1 基团的寡核苷酸。在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号可以被检测。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，随着PCR反应向指数期、线性期和平台期的扩增，荧光信号逐渐积累，当荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数(即Ct值)时，扩增信号值超过背景荧光值而被检测到，Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct值越小。因此，Ct值的大小可以反应出模板最初的含量的多少。根据阳性标准品制备的标准曲线，在样本Ct值已知的情况下，可计算出样本中靶核酸的浓度。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明的引物和探针组可配合对copA和czcD基因特异性的核酸片段体现出良好的扩增效率；
2、本发明针对copA和czcD采用TaqMan探针法，实现2种重金属耐受基因的双重检测；
3、本发明的试剂盒与荧光PCR检测技术相配合，通过特异性的引物和探针、在PCR阴性对照、弱阳性质控品、强阳性质控品的监控下，与阳性标准品进行同步测定，操作简便，无需电泳，防止产物被污染，测得的结果具有超高的灵敏度和高准确度。
附图说明
图1为本发明实施例中的扩增曲线图。
图2为本发明实施例中的copA阳性标准品扩增曲线图。
图3为本发明实施例中的copA基因标准曲线图。
图4为本发明实施例中的czcD基因阳性标准品扩增曲线图。
图5为本发明实施例中的czcD基因标准曲线图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例：
一、预配置试剂和设备的准备：
(1)PCR反应液体系：取PCR检测缓冲液，在冰上或4℃融化；再取出混合酶液；将所有组分轻微摇晃混匀并低速简短离心；每30μL的PCR反应液体系含PCR检测缓冲液29. 5μL和混合酶液0.5μL。
PCR反应液含浓度为0.3mM的dNTP(dNTP中含有dUTP)、4.0mM的Mg2SO4、5％的海藻糖、3％DMSO、0.5％甜菜碱、1％的BSA、0.5nM纳米金(直径5nm)、0.6μM的上游引物copA F、0.6μM的下游引物copA R、0.3μM的上游引物czcD F、0.4μM的下游引物cz cD R、0.3μM的探针czcD P；
其中：
上游引物copA-F：5’ATYGAGCTKCATYTGACCGG 3’；
下游引物copA-R：5’ATYTTCMAGKTCRCTCCACATGCC 3’；
上游引物czcD-F：5’CGACGCCGCGCACATG 3’；
下游引物czcD-R：5’TANCCSSCGACGCCGA 3’；
探针copA-P：5’TGSATBGGRTGSGYCATCATVSTGTC 3’
探针czcD-P：5’CCGCGCCGARRTSCTCG 3’；
探针copA-P的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有BHQ1基团；探针czcD-P的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记有BHQ1基团；
UNG酶+dNTPs中的dUTP，组合的系统能够防止实验室的假阳性结果，提高该试剂盒的可靠性。PCR反应中最常见、最重要的污染物是PCR产物，PCR试剂盒以dUTP部分取代dTTP，所以PCR产物都是含有dU的DNA链。在PCR开始前增加45℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下D NA链断裂，，消除由于污染PCR产物产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性和准确性。同时在变性阶段，UNG酶被灭活，不会再降解新扩增的产物U-DNA，从而保证荧光定量PCR 的正常进行。
(2)弱阳性质控品：为含有copA和czcD基因片段的重组质粒；
(3)强阳性质控品：为含有copA和czcD基因片段的重组质粒；
(4)阳性标准品：
阳性标准品A：含有浓度为1.0×104copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒；
阳性标准品B：含有浓度为1.0×105copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒；
阳性标准品C：含有浓度为1.0×106copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒；
阳性标准品D：含有浓度为1.0×107copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒。
靶片段的序列如SEQ ID NO.9所示。
需要使用的设备有：
荧光PCR检测仪：ABI荧光定量PCR仪，厂家：美国应用生物系统公司。
二、样本处理
称取0.5g土样，用FastDNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，USA)试剂盒抽提土壤 DNA。主要步骤如下：
1)往土壤加入978μL磷酸钠缓冲液和122μLMT buffer，重悬土样，裂解土壤微生物细胞；
2)14000×g离心10min后，取上清液，加入250μLPPS，振荡、混匀后，14000×g离心；
3)取上清液与Binding Matrix溶液混匀，使磁珠和DNA充分结合，用5.5M异硫氰酸胍溶液清洗磁珠，以去除腐殖酸等杂质；
4)将磁珠加入SPINTM Filter中，用SEWS-M溶液清洗磁珠；最后用无DNase和热源的水洗脱DNA。
用NanoDrop 2000(Thermo，USA)测定提取后的DNA溶液浓度和纯度，并稀释到5ng·μL-1。存于离心管中，于4℃暂存，核酸溶液长期储存温度为-18℃。
三、质控品处理
弱阳性质控品、强阳性质控品与阳性标准品不需要经过处理，直接取10μL加入PCR反应液体系中。
四、分装反应孔
试剂盒中设有至少1个样本反应孔、1个PCR阴性对照反应孔、1个弱阳性反应孔和1个强阳性反应孔；每个反应孔分装30μLPCR反应液，再加入10μL的核酸提取液，其中P CR阴性对照反应孔加入10μL无菌无核酸酶水。
五、反应
将试剂盒放入荧光PCR检测仪中进行PCR扩增，反应程序为45℃，5min；94℃，2min；90℃，5sec，60℃(-1℃/循环)，20sec，72℃，30sec，10个循环；90℃，8sec，55℃，20se c，72℃，1min，40个循环；数据的采集定在72℃，1min。
六、检测结果分析
运行完毕，得到图像如图1-图5所示，图1中1为copA强阳性质控品A，2为copA弱阳性质控品B，3为copA阳性样本，4为czcD强阳性质控品A，5为czcD弱阳性质控品B， 6为czcD阳性样本，7为PCR阴性对照，8为阈值线。分析图像后调节Baseline的Start值、 End值和Threshold值：Start值位于3-15之间，End值位于5-20之间，调整PCR阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线。图2中1为阳性标准品A的FAM荧光扩增曲线，2为阳性标准品B的FAM荧光扩增曲线，3为阳性标准品C的FAM荧光扩增曲线，4为阳性标准品D的FAM荧光扩增曲线。图4中1为阳性标准品A的VIC荧光扩增曲线，2为阳性标准品B的VIC荧光扩增曲线，3为阳性标准品C的VIC荧光扩增曲线，4为阳性标准品D的V IC荧光扩增曲线。将4个阳性标准品A、B、C、D的浓度输入相应孔，再进行结果分析：
1)PCR阴性对照目的基因扩增曲线Ct值应为UNDET；
2)弱阳性质控品的FAM和VIC荧光的Ct应在23.00-27.00之间；
3)强阳性质控品的FAM和VIC荧光的Ct应在12.00-16.00之间；
4)根据4个阳性标准品绘制的标准曲线如图3和图5所示，FAM和VIC荧光的相关系数(R)均应≥0.98；
5)以上4个条件需在同一次试验中同时满足，否则认为检测结果不能正确地反映样本实际情况，需重新进行检测。满足以上条件后方可进行以下结果判断：
(1)仪器显示UNDET表示待检样品为阴性；
(2)结果显示样本copA基因或czcD基因拷贝数在1×103-1×108copies/mL时，定量结果有效，可直接报告相应的定量数值；
(3)结果显示典型扩增曲线copA基因或czcD基因拷贝数低于1×103copies/mL时，检测结果有效，定量数值仅供参考；
(4)待检样本copA基因或czcD基因的拷贝数大于等于1000copies/mL时，能100％检出；
(5)待检样本copA基因或czcD基因的拷贝数小于1000copies/mL时，不能100％检出。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于铜耐受基因copA荧光PCR检测的引物组，其特征在于：引物组包括，
上游引物copA-F：5’ATYGAGCTKCATYTGACCGG 3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物copA-R：5’ATYTTCMAGKTCRCTCCACATGCC 3’，如SEQ ID NO.2所示；
探针copA-P：5’TGSATBGGRTGSGYCATCATVSTGTC 3’，如SEQ ID NO.3所示；探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记BHQ1基团。
2.一种用于镉耐受基因czcD荧光PCR检测的引物和探针组，其特征在于：包括，
上游引物czcD-F：5’CGACGCCGCGCACATG 3’，如SEQ ID NO.4所示；
下游引物czcD-R：5’TANCCSSCGACGCCGA 3’，如SEQ ID NO.5所示；
探针czcD-P：5’CCGCGCCGARRTSCTCG 3’，如SEQ ID NO.6所示；探针的5’端标记有VIC荧光基团，3’端标记BHQ1基团。
3.根据权利要求1所述的用于copA基因荧光PCR检测的引物组，其特征在于：所述引物根据copA基因序列进行设计，该靶片段的序列如SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求2所述的用于czcD基因荧光PCR检测的引物和探针组，其特征在于：所述引物和探针根据czcD基因序列进行设计，该靶片段的序列如SEQ ID NO.8所示。
5.一种用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液、混合酶液、阳性标准品、弱阳性质控品和强阳性质控品；所述PCR反应液包括引物和探针；
所述引物为：上游引物copA-F：5’ATYGAGCTKCATYTGACCGG 3’，如SEQ ID NO.1所示；下游引物copA-R：5’ATYTTCMAGKTCRCTCCACATGCC 3’，如SEQ ID NO.2所示；上游引物czcD-F：5’CGACGCCGCGCACATG 3’，如SEQ ID NO.4所示；下游引物czcD-R：5’TANCCSSCGACGCCGA 3’，如SEQ ID NO.5所示；
所述探针为：探针copA-P：5’TGSATBGGRTGSGYCATCATVSTGTC 3’，如SEQ ID NO.3所示；探针czcD-P：5’CCGCGCCGARRTSCTCG 3’，如SEQ ID NO.6所示；探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有BHQ1基团，且探针copA-P和探针czcD-P分别采用不同荧光发光基团进行标记；
所述阳性标准品、弱阳性质控品和强阳性质控品均包括含有copA和czcD基因片段的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应液包括浓度为0.3-0.5mM含dUTP的dNTPs、2-6mM的Mg2SO4、2％-8％的海藻糖、1％-4％DMSO、0.2％-1％甜菜碱、0.5％-2％的BSA、0.1-1nM纳米金(直径2nm-10nm)、0.2-0.8μM的引物和0.2-0.5μM的探针。
7.根据权利要求5所述的用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述混合酶液包括3-6U的HotStart Taq酶和0.2-0.4U的UNG酶。
8.根据权利要求5所述的用于于copA和czcD基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述阳性标准品包括：
阳性标准品A：含有浓度为1.0×104copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒；
阳性标准品B：含有浓度为1.0×105copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒；
阳性标准品C：含有浓度为1.0×106copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒；
阳性标准品D：含有浓度为1.0×107copy/mL的copA和czcD基因靶片段的重组质粒。
9.根据权利要求5所述的用于copA和czcD基因荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒进行PCR的反应体系为：45℃，5min；94℃，2min；90℃，5sec，60℃(-1℃/循环)，20sec，72℃，30sec，10个循环；90℃，8sec，55℃，20sec，72℃，1min，40个循环；数据的采集定在72℃，1min。
10.根据权利要求5所述的用于copA和czcD基因双重荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述载体为pGH。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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