DE69225221T3 - Fusionierte gene sowie deren verwendung zur bestimmung von metall- und xenobiotikagehalten - Google Patents

Fusionierte gene sowie deren verwendung zur bestimmung von metall- und xenobiotikagehalten

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf fusionierte Gene, Vektoren, die sie enthalten, einen Prozeß, um sie herzustellen, und auf ihre Verwendung zum Nachweis von Metallen oder xenobiotischen Verbindungen.
  • Giftige Abfälle sind für eine Reihe von Industrien ein wichtiges Verunreinigungsproblem.
  • Unter den darin enthaltenen Substanzen können Schwermetalle und xenobiotische Verbindungen genannt werden, die eine sehr starke Verunreinigung hervorrufen, und die die Gesundheit gefährden können. Die Verunreinigungsquellen sind verschiedenartig. Infolge der Anwendung strenger Vorschriften besteht außerdem ein Bedarf an Methoden zum Nachweis von Metallen und xenobiotischen Verbindungen in der Umwelt, um die Abfälle, welche Metalle, wie zum Beispiel Schwermetalle, und xenobiotische Verbindungen enthalten, in Grenzen zu halten.
  • Die meisten Methoden, die routinemäßig verwendet werden, um Metallkonzentrationen zu messen, sind physikalische Methoden, die auf den wesentlichen physikalischen (gewöhnlich elektronischen) Unterschieden zwischen dem Metall und dem Trägermedium beruhen.
  • Unter diesen Methoden werden die induktiv gekoppelten Plasmasysteme, die Röntgenstrahlenfluoreszenz oder die Atomabsorption am häufigsten verwendet.
  • Der Hauptvorteil dieser Methoden ist die sehr niedrige Nachweisgrenze (ungefähr 0,1 ppm), sowie ein Multielementaspekt der Analyse. Die Hauptnachteile sind der hohe Preis der Ausrüstung, deren Verwendung hochqualifiziertes Personal erfordert, die lange Zeit, die erforderlich ist, um die zu analysierenden Proben herzustellen, und die Empfindlichkeit dieser Methoden gegen viele Störungen, die auf die Art der Proben zurückzuführen sind.
  • Viele Organismen können hohe Konzentrationen von Schwermetallen, wie Kadmium und Blei, vertragen. Der zugrundeliegende Mechanismus ist verschieden. Eine spezifische, genetisch codierte Resistenz gegen Schwermetalle kann sich bei Populationen von Organismen entwickeln, die über lange Zeitperioden Schwermetallen ausgesetzt sind ("Genetic adaptation to heavy metals in aquatic organisms: a review" P. L. Klerks, J. S. Weis (1987), Environmental pollution 45: 173-205). Bei Bodenuntersuchungen an mit Schwermetallen stark verunreinigten Stellen werden häufig Stämme von Mikroorganismen gefunden, die Schwermetalle besser vertragen können. Einige solcher Stämme wurden bei einer stark verunreinigten Stelle in Belgien isoliert, und die Genetik ihrer Reaktionen auf Schwermetalle wurde analysiert ("Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemilithotroph with plasmid-bound resistance to heavy metals" M. Mergeay, D. Nies, H. G. Schlegel, J. Gerits, P. Charles, F. von Gijsegem (1985), J. Bacteriol. 162: 328- 334; "Cloning of plasmid genes encoding resistance to cadmium, zinc, and cobalt in Alcaligenes eutrophus CH34" D. Nies, M. Mergeay, B. Friedrich, H. G. Schlegel (1987), J. Bacteriol. 119: 4865-4868).
  • Die meisten Mikroorganismen können eine große Vielfalt von Verbindungen zersetzen, um metabolische Energie zu erzeugen, und um metabolische Zwischenverbindungen, und insbesondere Kohlenstoff, für sich verfügbar zu machen. Einige Organismen sind auf die Zersetzung von exotischen Materialien spezialisiert, wozu sie ungewöhnliche Enzymsysteme verwenden. Dies sind häufig Bodenbakterien, die sich an Stellen entwickelt haben, wo infolge der industriellen Tätigkeit eine beträchtliche Menge eines solchen Materials in den Boden eingedrungen ist. Die Fähigkeit, hochkonjugierte aromatische Kohlenwasserstoffe und ihre Halogenidderivate zu zersetzen, ist ein gutes Beispiel, da diese Materialien in der Natur selten gefunden werden, und spezielle Enzyme erfordern, um ihre Zersetzung, gewöhnlich durch Sauerstoffanreicherung, einzuleiten.
  • Alcaligenes eutrophus weist als bakterieller Organismus spezifische induzierbare Gene auf, die Resistenz gegen Schwermetalle bewirken, oder an dem Stoffwechsel von xenobiotischen Verbindungen, wie PCBs, beteiligt sind.
  • Die Bakterien der Gruppe Alcaligenes eutrophus (gramnegativ) haben außer der Eigenschaft, daß die fakultativ chemilithotroph sind, die Eigenschaft, daß sie ein oder mehrere Megaplasmide aufweisen, die ihnen eine mehrfache Resistenz gegen Schwermetalle verleihen. Diese Bakterien wurden in der Umgebung von Buntmetallfabriken und in der Umgebung von Bergwerken in Belgien und in Zaire gefunden (Diels et al., 1988(a), Isolation and characterization of resistant bacteria to heavy metals from mining areas of Zaire. Aren. Int. Physiol. Biochim. 96(2) B83; Diels et al., 1988(b), Detection of hetereotrophic bacteria with plasmid-bound resistances to heavy metals from Belgian industrial sites. Arch. Int. Physiol. Biochim. 96(2) B84).
  • Alcaligenes eutrophus CH34 (ATCC 43123) weist zwei Megaplasmide auf: pMOL28 (165 kb) und pMOL30 (240 kb). Es wurde gefunden, daß pMOL30 an der Expression der Schwermetallresistenz gegen Kadmium, Zink, Kobalt, Kupfer, Blei, Quecksilber, Thallium und Mangan beteiligt ist. Weiterhin wurde gefunden, daß pMOL28 an der Expression der Schwermetallresistenz gegen Kobalt, Chrom, Thallium und Quecksilber beteiligt ist (Mergeay et al., 1985, Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemilithotroph with plasmid-bound resistance to heavy metals. J. Bacteriol. 169, 328-334; Nies et al., 1987, Cloning plasmid genes coding resistance to cadmium, zinc and cobalt in Alcaligenes eutrophus CH34. J. Bacteriol. 169, 4865-4868; Diels et al. 1989(a), Large plasmid governing multiple resistance to heavy metals: a genetic approach. Toxicol. Environ. Chem. 23, 79-89).
  • Diese Megaplasmide sind durch homologe Kreuzungen übertragbar (Mergeay et al., 1985, Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemilithotroph with plasmid-bound resistance to heavy metals. J. Bacteriol. 169, 328-334, Table 1).
  • Die Restriktionskarte der natürlichen Plasmide von Alcaligenes eutrophus, der Ort der verschiedenen Resistenzen gegen Schwermetalle, sowie die Resistenzmechanismen für einige Metalle (Quecksilber, Kadmium, Zink, Nickel, Kobalt, Chrom) werden allmählich verstanden.
  • pMOL30 enthält zum Beispiel ein EcoRI-Fragment von 9,1 kb, das czc genannt wird, das durch Klonieren nachgewiesen wurde, und das gleichzeitig Resistenz gegen Kadmium-, Zink- und Kobaltionen verleiht (Nies et al., Cloning plasmid genes coding resistance to cadmium, zinc and cobalt in Alcaligenes eutrophus CH 34. J. Bacteriol. 169, 4865-4868).
  • In dem Fall von Kadmium, Kobalt, Nickel und Zink wird die Resistenz durch ein Ausströmsystem bestimmt (Ausstoßung der metallischen Kationen nach ihrem Eindringen in die Zelle). Daneben scheint im Anschluß an eine Alkalisierung des Kulturmediums durch die Bakterien eine Ansammlung des Metalls in dem Bereich der Bakterienhüllen zu erfolgen (Diels et al., 1989(b), Accumulation of Cd and zinc ions by Alcaligenes eutrophus strains. Biohydrometallury 89. Jackson Haie USA). Dieses Phänomen der Ansammlung tritt in der stationären Phase auf und hängt von den Bedingungen des Stoffwechsels ab.
  • Gen- und Proteinfusionen waren behilflich bei der Untersuchung der Genregulation, der Proteinverarbeitung, dem Export und anderen Aspekten der Genfunktion.
  • Alle Reportergensysteme, die gegenwärtig verwendet werden, umfassen Gene, die ein enzymatisch wirksames Protein codieren. Die Empfindlichkeit dieser Systeme variiert entsprechend den Eigenschaften des Reporterenzyms, der Art und der Qualität der verfügbaren Untersuchungen, und der Anwesenheit oder Abwesenheit von störenden Aktivitäten bei dem Zelltyp. Das Lactose (lac)- Operon von Escherichia coli wurde bei diesen Untersuchungen am häufigsten verwendet, weil eine große Menge Information bezüglich verschiedener Aspekte dieses genetischen Systems verfügbar ist (Berman M. L. 1983, "Vectors for constructing hybrid genes" Biotechniques 1: 178-183; Koenen et al. 1982, "Immunoenzymatic detection of expresses gene fragments coled in the lacZ gene of E. coli. J. Bacteriol. 1: 509-512; Silhavy et al., 1985, Uses of lac fusions for the study of biological problems. Microbiol. Rev. 49, 398-418; Silhavy et al., 1984, "Experiments with gene fusions" Gold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, NY).
  • Mehrere Plasmidvektoren wurden entworfen zum Zwecke der Klonierung und der anschließenden Beurteilung des lac- Gens mit Promotorwirksamkeit (Casadaban et al., 1980, "In vitro gene fusions that join an enzymatically active beta- galactosidase segment to amino-terminal fragments of exogenous proteins: Escherichia coli plasmid vectors for the detection and cloning of translational initiation Signals" J. Bacteriol. 143: 971-980; Shapira et al., 1983, "New versatile plasmid vectors for expression of hybrid proteins coded by a cloned gene fused to lacZ gene sequences encoding enzymatically active carboxyterminal portion of beta-galactosidase" Gene 25: 71-82; Minton N. P., 1984, "Improved plasmid vectors for the Isolation of translational lac gene fusions" Gene 11: 269-273), oder für die Untersuchung der Proteinfunktion. Sie verwenden Gentranskriptions- und Gentranslations-Initiierungssignale und führen zu enzymatisch wirksamen β-Galaktosidase- Proteinen, die Aminoendgruppen-Aminosäuresequenzen von dem exogenen Gen enthalten (Müller-Hill et al., 1976, "Repressor-galactosidase chimaeras in Markam R. and Horne R. W. (eds) Structure-function relationship of proteins" North-Holland, New York, pp. 167-179; Bassford et al., 1978, "Genetic fusions of the lac operon: a new approach to the study of biological process in Miller J. H. and Reznikoff W. S. (eds) The operon" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., pp. 245-261; Guarente et al., 1980, "Improved methods for maximizing expression of a cloned gene: bacterium that synthesizes rabbit beta-globin" Gell 20: 543-553).
  • Diese Hybridproteine wurden durch Ausnutzung ihrer Galaktosidase-Wirksamkeit auf leichte Weise gereinigt, und verwendet, um die funktionalen Aminoendgruppen-Gebiete von Proteinen zu bestimmen (Müller-Hill et al., 1976, "Repressor-galactosidase chimaeras in Markam R. and Horne R. W. (eds) Structure-function relationship of proteins" North-Holland, New York, pp. 167-179; Silhavy et al., 1976, "Conversion of beta-galactosidase to a membrane- bound state by gene fusion" Proc. Natl. Acad. Bei. USA 73: 3423-3427; Hall M. et al., 1981, "Gene analysis of the major outer membrane proteins of Escherichia coli in Roman H. L., Campbell A., and Sandler L. M. (eds)" Annual Reviews of Genetics, vol. 15, Annual Reviews, Palo Alto CA 91- 142), und um Antikörperbildung gegen antigenische Amino- Endgruppen-Determinanten auszulösen (Schuman et al., 1988, "Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion Identification of a cytoplasmic membrane component of Escherichia coli maltose transport System" J. Chem. 225: 168-174).
  • Ein weiteres Reportergen ist das Luciferase- Reportergen. Bakterielle Luciferaseenzyme katalysieren eine lichtaussendende Reaktion bei Leuchtbakterien. Die luciferase-katalysierte, lichtaussendende Reaktion ist:
  • RCHO + O&sub2; + FMNH&sub2; → RCOOH + FMN + H&sub2;O + Photon (490 nm),
  • wobei R ein aliphatischer Teil ist, der mindestens sieben Kohlenstoffatome, vorzugsweise 7 bis 14 Kohlenstoffatome, enthält, FMN ein Flavin-Mononukleotid, und FMNH&sub2; reduziertes Flavin-Mononukleotid ist (Meighen E. A., 1988, "Enzymes and genes from the lux operon of bioluminescent bacteria" Ann. Rev. Microbiol. 42: 151-176).
  • In Bakterien wird das oxydierte Flavin wirksam reduziert, und es ist für zytoplastische Enzyme, wie Luciferase, kontinuierlich verfügbar.
  • Bei externer Zugabe des Aldehydsubstrats, das sofort in lebende Zellen eindringt, kann die Aktivität von Luciferase durch Messen der Lichtemission in vivo verfolgt werden. Das Licht kann nach mehreren Methoden und mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden. Da ein bakterielles Luciferase-Molekül bei der Luciferase-Reaktion ungefähr ein Photon erzeugt, können mit einem Luminometer noch 10 Luciferase-Moleküle nachgewiesen werden (Olsson O. et al., 1988, "The use of the luxA gene of the bacterial luciferase operon as a reporter gene", Mol. Gen. Genet. 215: 1-9).
  • Die Luciferase-Gengruppe von den Meeres- Mikroorganismen Vibrio fischeri, die strukturellen luxAB- Gene von V. harveyi und die Leuchtkäfer-cDNA von Photinus pyralis wurden kürzlich als Reportergene eingeführt in prokaryontische Organismen (Engebrecht J. et al., 1985, "Measuring gene expression with light" Sciences 227: 1345- 1347; Legocki R. P. et al., 1986, "Bioluminescence in soybean root nodules: Demonstration of a general approach to assay gene expression in vivo by using bacterial luciferases" Proc. Natl. Acad. Bei. USA 83: 9080-9084; Karp M. T. et al., 1986, "Continous in vivo monitoring of gene expression using cloned bacterial luciferase genes" Biolum. Chemil. pp. 385-389; Schmetterer G. et al., 1986, "Expression of luciferases from Vibrio harveyi and Vibrio fischeri in filamentous cyanobacteria. J. Bacteriol. 167: 411-414; Carmi O. A. et al., 1987, "Use of bacterial luciferases to establish a promoter probe vehicle capable of non destructive real-time analysis of gene expression in Bacillus" spp. J. Bacteriol. 169: 2165-2170; Nussbaum A. et al., 1989, "Use of a bioluminescence gene reporter for the investigation of a red-dependent and gram-dependent plasmid recombination in Escherichia coli K12" J. Mol. Biol. 203: 402), sowie in eukaryontische Organismen (Ow D. W. et al., 1986, "Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants" Science 234: 856-859; Dewet J. R. et al., 1985, "Cloning of firefly luciferase cDNA and expression of active luciferase in E. coli" Proc. Natl. Acad. Bei. USA 82: 7870-7873; Williams T. M. et al., 1989, "Advantages of firefly luciferase as reporter gene: application to the interleukin-2 gene promoter", Anal. Biochem. 176: 28-32; Riggs C. D. et al., 1987, "Luciferase reporter gene cassettes for plant gene expression studies" Nucleic Acids Res. 155: 8115; Dilella G. A. et al., 1987, "Utility of firefly luciferase as reporter gene for promoter activity in transgenic mice" Nucl. Acids Res. 16: 4159).
  • Das Leuchtkäfer-Luciferaseenzym katalysiert die ATP- abhängige Oxydation eines Substrats mit hohem Molekulargewicht, Luciferin (Deluca et al., 1978, Purification and properties of firefly luciferase. Methods Enzymol. 57, 3-15; Mc Elroy et al., 1985, Firefly luminescence, p. 387-399 in J. G. Burr (ed.) Chemibioluminescence, Marcel Dekker Inc., New York). Diese Substanz wird nur langsam durch Zellmembranen transportiert, im Gegensatz zu dem Aldehydsubstrat bei der bakteriellen Reaktion.
  • In dem Journal of Biotechnology (September 1990, p.4749-4757, Burlage, Sayler and Larimer) wird die Fusion der lux-Gene von Vibrio fischeri mit einem Fragment von dem Plasmid NAH7 beschrieben, das den Promotor für den oberen Weg der Zersetzung von Naphtalen (verwandt mit einigen natürlich vorkommenden Verbindungen), und die ersten drei Cistrons des nahA-Gens enthält. Ein Pseudomonas-Stamm (gramnegatives Bakterium), der diese Konstruktion enthält, ist bei Anwesenheit eines geeigneten Substrats induzierbar für hohe Lichterzeugungsniveaus.
  • In Molecular Biology (1989), 3(8), p. 1011-1023, wird die Kopplung des proU an luxAB beschrieben, wobei proU der Promotor eines Gens ist, das die Osmolarität bei Salmonella typhimurium reguliert; das so erhaltene obige Plasmid wird in E. coli kloniert, und verwendet, um die Echtzeit-Kinetik der proU-Induktion im Anschluß an einen osmotischen Schock in vivo zu messen.
  • Das Ziel der Erfindung ist, einen Prozeß zum Nachweis von Metallen oder xenobiotischen Verbindungen anzugeben, der empfindlich, billig und einfach ist, und für eine automatische Verwendung oder eine Verwendung beim Kunden geeignet ist.
  • Das Ziel der Erfindung ist, eine Methode anzugeben, um Metalle oder xenobiotische Verbindungen nachzuweisen, die keine teure Ausrüstung und keine große Kapitalinvestition, und nur wenig Eingriffe einer Bedienungsperson erfordert.
  • Das Ziel der Erfindung ist außerdem, eine Methode anzugeben, die ermöglicht, bei Anwesenheit eines Metalls oder einer xenobiotischen Verbindung eine positive Reaktion (Lichtemission) zu geben.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, eine Methode zum Nachweis von Metallen und/oder xenobiotischen Verbindungen anzugeben, die spezifisch für das nachzuweisende Metall oder die nachzuweisende xenobiotische Verbindung ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auf ein fusioniertes Gen, enthaltend
  • - eine Promotorsequenz, die von einem Gen (Genen) des Alcaligenes eutrophus-Stamms erhältlich ist, und entweder die Resistenz gegen ein oder mehrere Metalle, oder den Katabolismus von einer oder mehreren xenobiotischen Verbindungen codiert, wobei der Promotor bei Anwesenheit des Metalls (der Metalle) oder der xenobiotischen Verbindung (Verbindungen), oder beidem induzierbar ist,
  • - und, stromabwärts von dem Promotor, ein Fünf-Gen- luxCDABE-Operon, wobei die Gene für eine Fettsäure- Reduktase, eine Acyltransferase, zwei Untereinheiten und der Luciferase bzw. eine Acylproteinsynthase codieren, und wobei das lux-Operon unter der funktionalen Kontrolle des A. eutrophus-Promotors ist.
  • Mit Metall werden die Übergangsmetalle, die seltenen Erden, und die Elemente mit metallischen Eigenschaften in den Familien IIIa, IVa, Va und Via des periodischen Systems der Elemente bezeichnet.
  • Als Metalle kann man zum Beispiel Kadmium, Zink, Kobalt, Kupfer, Blei, Quecksilber, Thallium, Chrom und Mangan in Form von Salzen, entweder in einem löslichen, oder einem unlöslichen Zustand, nennen.
  • Der Ausdruck "bei Anwesenheit des Metalls induzierbarer Promotor" bedeutet, daß es eine Mindestkonzentration des Metalls gibt, unterhalb der der Promotor nicht induziert wird. Dies hängt insbesondere von der Art des Promotorgebietes und seiner Regulation, dem Zugang des Metalls zu dem Promotorgebiet, und der Art und der Löslichkeit des Metalls ab.
  • Mit xenobiotischer Verbindung werden die Verbindungen bezeichnet, die die Gesundheit gefährden können, und die künstlich hergestellte Chemikalien (keine natürlich vorkommenden Verbindungen) sind. Als Beispiel kann man Fungizide, Herbizide, Pestizide, Insektizide, und chlororganische Verbindungen, insbesondere Biphenylverbindungen, nennen.
  • Im Folgenden entspricht der Ausdruck "Resistenzgen" dem Gen, das für die Resistenz gegen ein oder mehrere Metalle verantwortlich ist, und der Ausdruck "Katabolismusgen" dem Gen, das für den Katabolismus von einer oder mehreren xenobiotischen Verbindungen verantwortlich ist.
  • Die fusionierten Gene der Erfindung werden in eine Wirtszelle, z. B. eine Bakterie, eingebracht, um eine Lichterzeugung hervorzurufen.
  • In der Biolumineszenzzelle erfolgt die Lichterzeugungsreaktion bei der Oxydation von langkettigen Aldehyden und reduziertem Mononukleotidflavin (FMNH&sub2;). Die Energiequelle dieser Reaktion ist die Umwandlung von Aldehyd (RCHO) in seine entsprechende Fettsäure (RCOOH) gemäß der folgenden Reaktion:
  • RCHO + FMNH&sub2; + O&sub2; → RCOOH + FMN + H&sub2;O + h
  • wobei RCHO ein Aldehyd mit 7 bis 14 Kohlenstoffatomen darstellt.
  • Die Reaktion tritt immer auf, weil in der Wirtszelle immer eine kleine Menge Aldehyd vorhanden ist.
  • Wenn in der Wirtszelle kein Aldehyd mehr vorhanden ist, ist es erforderlich, zusätzliches Aldehyd hinzuzufügen, um eine Lichterzeugung zu erhalten. Aldehyd hat jedoch den Nachteil, daß es giftig ist, und außerdem gibt es bei diesem System eine Ansammlung von Fettsäure, die von der Wirtszelle gespeichert wird und auf die Dauer giftig ist.
  • Außerdem hängt die Lichterzeugung von dem zugegebenen exogenen Aldehyd ab.
  • Um diese Nachteile zu vermeiden, ist das Gen, das das nachweisbare Signal erzeugt, so beschaffen, daß es Fettsäure gemäß der folgenden Reaktion in Aldehyd rezyklisieren kann:
  • RCOOH + NADPH&sub2; + ATP → RCHO + NADP + AMP + PPi.
  • Dies vermeidet die Verwendung von exogenem Aldehyd, und dies verhindert, daß sich Fettsäure in der Wirtszelle ansammelt.
  • Es kann möglich sein, einen Lumineszenztest zu machen, der auf mehrere Analyten mit verschiedenen Signalen antwortet. Die Vibrio fischeri-Gene (die grünes Licht ergeben) könnten verwendet werden, um einen Analyten (zum Beispiel: ein Metall) nachzuweisen, und ein anderes Luciferase-Gen, das Licht mit einer ein wenig verschiedenen Wellenlängen erzeugt (zum Beispiel: lux-Gen von Käfer (beetle)-Luciferase, das rotes Licht ergibt) würde bei einer weiteren Fusion einen weiteren Analyten (zum Beispiel: eine xenobiotische Verbindung oder ein weiteres Metall) nachweisen. Wenn noch mehr Gene verschiedene Signale haben, würde es möglich sein, die verschiedenen Analyten im Prinzip innerhalb derselben Bakterie zu unterscheiden.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält das fusionierte Gen außer dem induzierbaren Promotor auch die codierende Sequenz des Gens, das für die Resistenz gegen ein oder mehrere Metalle verantwortlich ist, oder für den Katabolismus von einer oder mehreren xenobiotischen Verbindungen verantwortlich ist.
  • Wenn das fusionierte Gen die codierende Sequenz des Gens, das für die Resistenz gegen ein oder mehrere Metalle verantwortlich ist, oder für den Katabolismus von einer oder mehreren xenobiotischen Verbindungen verantwortlich ist, nicht enthält, ist diese Ausführungsform sehr empfindlich gegen Metall oder xenobiotische Verbindungen.
  • Wenn das fusionierte Gen die codierende Sequenz des Gens, das für die Resistenz gegen ein oder mehrere Metalle verantwortlich ist, oder für den Katabolismus von einer oder mehreren xenobiotischen Verbindungen verantwortlich ist, enthält, ist die Ausführungsform weniger empfindlich gegen Metall oder xenobiotische Verbindungen, ermöglicht aber, Konzentrationen von Metall oder xenobiotischen Verbindungen zu messen, die höher als die letalen Konzentrationen sind.
  • In diesem Fall (d. h., wenn der codierende Teil des Gens, das für die Resistenz gegen Metall - oder für den Katabolismus einer xenobiotischen Verbindung verantwortlich ist, vorhanden ist) kann eine Translation des Resistenzgens oder des Katabolismusgens erfolgen, wenn die Translationsmaschinerie in der Wirtszelle betätigt werden kann.
  • Eine Translation des Resistenzgens oder des Katabolismusgens kann erforderlich sein, wenn die zu messende Konzentration des Metalls oder der xenobiotischen Verbindung höher als die letale Konzentration des Metalls oder der xenobiotischen Verbindung für die das fusionierte Gen enthaltende Wirtszelle ist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein fusioniertes Gen, bei dem das Gen, das ein nachweisbares Signal erzeugt,
  • - entweder stromabwärts von dem Promotor und stromaufwärts von dem die Resistenz oder den Katabolismus codierenden Gen gelegen ist,
  • - oder stromabwärts von dem Promotor und stromabwärts von dem die Resistenz oder den Katabolismus codierenden Gen gelegen ist,
  • - oder stromabwärts von dem Promotor und in dem die Resistenz oder dem Katabolismus codierenden Gen gelegen ist.
  • Wenn das fusionierte Gen nur den induzierbaren Teil des Resistenzgens oder des Katabolismusgens, ohne die codierende Sequenz des Gens, enthält, liegt das Gen, das das nachweisbare Signal erzeugt, stromabwärts von dem Promotor, und es kann in einem gewissen Abstand angeordnet werden durch eine Basenpaarsequenz, die eine solche Länge hat, daß das Gen, das ein nachweisbares Signal erzeugt, noch durch den Promotor induziert wird.
  • Wenn das fusionierte Gen außer dem Promotor des Resistenzgens oder des Katabolismusgens auch den codierenden Teil des Gens enthält, kann das Gen, das das nachweisbare Signal erzeugt,
  • - stromabwärts von dem Promotor und stromaufwärts von dem die Resistenz oder den Katabolismus codierenden Gen (d. h., zwischen dem induzierbaren Promotor und dem codierenden Teil des Resistenzgens oder Katabolismusgens) gelegen sein,
  • - oder stromabwärts von dem codierenden Teil des Resistenzgens oder Katabolismusgens gelegen sein,
  • - oder innerhalb des die Resistenz oder den Katabolismus codierenden Gens gelegen sein.
  • Wenn das Gen, das das Signal erzeugt, stromabwärts von dem codierenden Teil des die Resistenz oder den Katabolismus codierenden Gens gelegen ist, muß der Promotor stark genug sein, um die Transkription des Gens, das das Signal erzeugt, hervorzurufen.
  • Die Stärke eines Promotors ist definiert als die Fähigkeit, die Transkription von Genen zu induzieren, die fern von dem Promotor gelegen sind.
  • Wenn das Gen, das das Signal erzeugt, innerhalb des codierenden Teils des Resistenzgens oder des Katabolismusgens gelegen ist, könnte eine Transkription und Translation des Resistenzgens oder des Katabolismusgens erfolgen, wenn das Resistenzgen oder Katabolismusgen nicht durch den eingefügten Abschnitt, der das signalerzeugende Gen enthält, beschädigt ist, oder es könnte eine teilweise Transkription und eine teilweise Translation des Resistenzgens oder des Katabolismusgens erfolgen.
  • Wenn das Gen, das das Signal erzeugt, innerhalb des induzierbaren Promotors gelegen ist, ist es nicht mehr unter der Kontrolle des induzierbaren Promotors.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein fusioniertes Gen, bei dem eine Endsequenz unmittelbar stromaufwärts von dem Promotor gelegen ist.
  • Diese Endsequenz ermöglicht, eine Störtranskription durch andere stromaufwärts gelegene Promotoren zu vermeiden, und sie würde das Signal/Rausch-Verhältnis durch Verringerung der Expression des von den Bakterien bei Abwesenheit von Metallen oder xenobiotischen Verbindungen ausgesandten Lichtes erhöhen.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist das Gen, das ein nachweisbares Signal erzeugt, das Luciferase-Gen.
  • Luciferase ist aus den folgenden Gründen interessant:
  • 1) Extrem niedrige Lichtniveaus können genau gemessen werden, und Licht kann über viele Größenordnungen linear gemessen werden.
  • 2) Es gibt keine signifikante endogene Untergrundaktivität (wie zum Beispiel bei Galaktosidase).
  • 3) Die Transkription kann in vitro, in Flüssigkeit oder in einer natürlichen Umgebung über die Zeit nicht- invasiv gemessen werden, weil die wiederholte Aufbringung des Substrats (Luciferin oder n-Dekanal) im allgemeinen nicht giftig ist.
  • 4) Die Untersuchungen sind sehr einfach und nicht teuer.
  • 5) Das Licht wird in situ nicht zerstreut oder akkumuliert; die Quelle der Genexpression kann mit hoher Auflösung räumlich lokalisiert werden.
  • Das Luciferase-Gen kann von Vibrio fischeri oder von Vibrio harveyi oder von Photobacterium phosphoreum oder von Xenorhabdus luminescens stammen.
  • Ein bevorzugtes Luciferase-Gen ist dasjenige, das von Xenorhabdus luminescens stammt, und in E. coli kloniert ist (Frackman S. et al., 1990, "Cloning, Organization and expression of the bioluminescence genes of Xenorhabdus luminescens" J. Bact. 122: 5767-5773).
  • Ein bevorzugtes Luciferase-Gen ist dasjenige, das von V. fischeri stammt; die Sequenz, die für die Regulation, sowie die Expression der Biolumineszenz, sowie die Synthese der bei der Biolumineszenz beteiligten Enzyme verantwortlich ist, ist bekannt (siehe Devine et al., 1988, Nucleotide sequence of the lux R and lux I genes and structure of the primary regulatory region of lux regulon of V. fischeri ATCC 7744. Biochem. 27, 837-842; Engebrecht et al., 1986).
  • Die fünf Gene lux A, B, C, D, E codieren für eine Untereinheit und von Luciferase, eine Fettsäurereduktase, eine Acyltransferase bzw. eine Acylproteinsynthase. Diese Enzyme ermöglichen die Oxydation von Aldehyd zu Fettsäure, mit Erzeugung von Photonen. Das Aldehyd wird dann durch Reduktion der Fettsäure, die gebildet wurde, rezyklisiert.
  • Die Gene lux A, B, C, D, E wurden ohne ihr Regulon luxR und luxI kloniert und bilden so ein Operon ohne den Promotor, das lux-Kassette genannt wird (Schaw J. J. et al., 1988, "Transposon Tn4431 mutagenesis of Xanthonomas campestris pv campestris: characterization of a nonpathogenic mutant and cloning of a locus for pathogenicity" Mol. Plant-Microbe Interaction. 1: 39-45).
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung stammt das Gen, das die Resistenz gegen ein Metall codiert, oder den Katabolismus einer xenobiotischen Verbindung codiert, von Bakterien des Typs Alcaligenes eutrophus.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein fusioniertes Gen, bei dem:
  • - der Promotor und das Gen, die die Resistenz codieren, ein Promotor und ein Gen sind, die Resistenz gegen Zink codieren, erhalten aus pBR325, das das czc-Fragment von pMOL30 aus dem Alcaligenes eutrophus-Stamm CH34 und das umgebende EcoRI-Fragment enthält, verdaut mit SalI, und der Promotor und das Gen, die für die Resistenz codieren, an der multiplen Klonierungsstelle des Plasmids pUCD615 angeordnet sind, wobei das Plasmid das lux-Operon von Vibrio fischeri enthält.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein fusioniertes Gen, bei dem:
  • - der Promotor und das Gen, die die Resistenz codieren, ein Promotor und ein Gen sind, die Resistenz gegen Kobalt codieren, erhalten aus pBR325, das das czc-Fragment von pMOL30 aus dem Alcaligenes eutrophus-Stamm CH34 enthält, verdaut mit EcoRI-PstI, und der Promotor und das Gen, die für die Resistenz codieren, an der multiplen Klonierungsstelle des Plasmids pUCD615 angeordnet sind, wobei das Plasmid das lux-Operon von Vibrio fischeri enthält.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf einen rekombinanten Vektor, insbesondere für die Klonierung und/oder Expression, der eine Vektorsequenz, insbesondere von dem Typ Plasmid, Cosmid oder Phage, und ein erfindungsgemäßes fusioniertes Gen an einer der für seine Replikation nicht-wesentlichen Stellen aufweist.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf einen rekombinanten Vektor, der an einer für seine Replikation nicht-wesentlichen Stellen Elemente enthält, die notwendig sind, um in einem zellularen Wirt die Transkription und Translation des Gens, das ein nachweisbares Signal erzeugt, zu fördern, und die Transkription und eventuell die Translation des Gens, das für die Resistenz gegen ein Metall verantwortlich ist, oder für den Katabolismus einer xenobiotischen Verbindung verantwortlich ist, zu fördern, und zusätzlich zu dem induzierbaren Promotor eventuell eine Signalsequenz und/oder Verankerungssequenz enthält.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf einen zellularen Wirt, insbesondere E. coli, transformiert durch einen erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor, oder Alcaligenes eutrophus, transkonjugiert durch einen erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor, wobei dieser zellulare Wirt die Regulationselemente aufweist, die die Expression des Gens ermöglichen, das ein nachweisbares Signal erzeugt, und eventuell die Expression des Gens ermöglichen, das die Resistenz gegen ein Metall codiert, oder den Katabolismus einer xenobiotischen Verbindung codiert.
  • Ein vorteilhafter zellularer Wirt der Erfindung ist E. coli. transformiert durch ein fusioniertes Gen, bei dem:
  • - der Promotor und das Gen, die die Resistenz codieren, ein Promotor und ein Gen sind, die Resistenz gegen Zink codieren, erhalten aus pBR325, das das czc-Fragment von pMOL30 aus dem Alcaligenes eutrophus-Stamm CH34 und das umgebende EcoRI-Fragment enthält, verdaut mit SalI, und der Promotor und das Gen, die für die Resistenz codieren, an der multiplen Klonierungsstelle des Plasmids pUCD615 angeordnet sind, wobei das Plasmid das lux-Operon von Vibrio fischeri enthält.
  • Dieser zellulare Wirt bildet einen Biosensor, der ermöglicht, einen Bereich von ungefähr 10 bis ungefähr 65 ppm Zink, und vorzugsweise eine Konzentration von nur 0,1 ppm zu erfassen.
  • Ein weiterer vorteilhafter zellularer Wirt der Erfindung ist E. coli, transformiert durch ein fusioniertes Gen, bei dem:
  • - der Promotor und das Gen, die die Resistenz codieren, ein Promotor und ein Gen sind, die Resistenz gegen Kobalt codieren, erhalten aus pBR325, das das czc-Fragment von pMOL30 aus dem Alcaligenes eutrophus-Stamm CH34 enthält, verdaut mit EcoRI-PstI, und der Promotor und das Gen, die für die Resistenz codieren, an der multiplen Klonierungsstelle des Plasmids pUCD615 angeordnet sind, wobei das Plasmid das lux-Operon von Vibrio fischeri enthält.
  • Dieser zellulare Wirt bildet einen Biosensor, der ermöglicht, einen Bereich von ungefähr 30 bis ungefähr 120 ppm Kobalt, und vorzugsweise eine Konzentration von nur 0,1 ppm zu erfassen.
  • Ein weiterer vorteilhafter zellularer Wirt der Erfindung ist Alcaligenes eutrophus erhalten durch
  • - die Konjugation von Alcaligenes eutrophus und E. coli, wobei E. coli den Vektor pUCD623 enthält, der wiederum ein Transposon Tn4431 enthält, das das Transposon Tn1721 ist, das die Tetracyclinresistenz und das lux-Operon von Vibrio fischeri ohne seinen eigenen Promotor enthält,
  • - die Selektion der erhaltenen Transkonjuganten, ausgeführt auf Tetracylin-Platten,
  • - die Replikation der Transkonjuganten auf Medien mit verschiedenen Konzentrationen von Metallen,
  • - den Nachweis der lichterzeugenden Transkonjuganten, der dann ausgeführt wird.
  • Ein weiterer vorteilhafter zellularer Wirt der Erfindung ist Alcaligenes eutrophus erhalten durch Konjugation von Alcaligenes eutrophus und des E. coli- Stamms CM601, wobei AE714 erhalten wird, der in A5.3 transferiert wird, um AE859 zu erhalten, der Lichtexpression bei Anwesenheit von Chrom ergibt.
  • Dieser zellulare Wirt bildet einen Biosensor, der ermöglicht, einen Bereich von ungefähr 20 bis ungefähr 60 ppm Chrom, und vorzugsweise eine Konzentration von nur 0,1 ppm zu erfassen.
  • Ein weiterer vorteilhafter zellularer Wirt der Erfindung ist Alcaligenes eutrophus, erhalten durch Konjugation von Alcaligenes eutrophus und des E. coli- Stamms CM601, wobei AE453 erhalten wird, der in A5.3 transferiert wird, um AE891 zu erhalten, der Lichtexpression bei Anwesenheit von Nickel ergibt.
  • Dieser zellulare Wirt bildet einen Biosensor, der ermöglicht, einen Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 120 ppm Nickel, und vorzugsweise eine Konzentration von nur 0,1 ppm zu erfassen.
  • Ein weiterer vorteilhafter zellularer Wirt der Erfindung ist Alcaligenes eutrophus, erhalten durch Konjugation von Alcaligenes eutrophus und des E. coli- Stamms CM601, wobei AE866 erhalten wird, der Lichtexpression bei Anwesenheit von Kupfer ergibt.
  • Dieser zellulare Wirt bildet einen Biosensor, der ermöglicht, einen Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 100 ppm Kupfer, und vorzugsweise eine Konzentration von nur 0,1 ppm zu erfassen.
  • Ein weiterer vorteilhafter zellularer Wirt der Erfindung ist Alcaligenes eutrophus, erhalten durch Konjugation von Alcaligenes eutrophus und des E. coli- Stamms CM601, wobei AE890 erhalten wird, der Lichtexpression bei Anwesenheit von Kupfer ergibt und auf Minimalplatten, die Blei enthalten, nicht wachsen kann.
  • Ein weiterer vorteilhafter zellularer Wirt der Erfindung ist Alcaligenes eutrophus, erhalten durch Konjugation von Alcaligenes eutrophus und des E. coli- Stamms CM601, wobei A5.23 oder A5.24 erhalten wird, der Lichtexpression bei Anwesenheit von Biphenylverbindungen ergibt.
  • Dieser zellulare Wirt bildet einen Biosensor, der ermöglicht, einen Bereich von ungefähr 10 ppm, und vorzugsweise eine Konzentration von nur 0,1 ppb Biphenylverbindungen, wie 4-Chlorbiphenyl, zu erfassen.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Prozeß zur In-vitro-Herstellung eines zellularen Wirtes, der ein fusioniertes Gen enthält, wobei der Prozeß die folgenden Schritte aufweist:
  • - Bestimmung des Promotors und des Gens, die Resistenz gegen ein oder mehrere Metalle codieren, oder den Katabolismus von einer oder mehrerer xenobiotischer Verbindungen codieren, und Isolierung des entsprechenden Nukleinsäurefragments des Promotors und des Gens, wobei der Promotor und das Gen eventuell einen Marker für das Vorhandensein des Gens aufweisen,
  • - Fusionieren des Nukleinsäurefragments mit einem Gen, das ein von seinem eigenen Promotor ausgelöschtes Signal erzeugt, wobei das Gen ein Signal erzeugt, das eventuell einen Marker für das Vorhandensein des Gens aufweist,
  • - Einbringen des Ergebnisses der obenerwähnten Fusion in einen zellularen Wirt, wie E. coli,
  • - eventuell Selektieren des zellularen Wirtes, wobei der oder die Marker in ein Medium eingebracht werden, wo der oder die Marker nachgewiesen werden können,
  • - Nachweisen der lichterzeugenden, zellularen Wirte, die in ein geeignetes Medium eingebracht werden, das ein oder mehrere Metalle oder eine xenobiotische Verbindung enthält.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Prozeß zum Herstellen eines zellularen Wirtes, der bei Anwesenheit von Zink Licht aussendet, wobei:
  • - der Promotor und das Gen, die die Resistenz codieren, ein Promotor und ein Gen sind, die Resistenz gegen Zink codieren, erhalten aus pBR325, das das czc-Fragment von pMOL30 aus dem Alcaligenes eutrophus-Stamm CH34 und das umgebende EcoRI-Fragment enthält, verdaut mit SalI,
  • - das Ergebnis der Verdauung bei der multiplen Klonierungsstelle in das Plasmid pUCD615 eingefügt wird, das das lux-Operon von Vibrio fischeri enthält,
  • - das Ergebnis der Insertion in E. coli einkloniert wird,
  • - eine Selektion auf Ampicillinplatten mit verschiedenen Konzentrationen von Zink ausgeführt wird,
  • - der Nachweis der lichterzeugenden E. coli-Bakterien bei Anwesenheit von Zink ausgeführt wird.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Prozeß zum Herstellen eines zellularen Wirtes, der bei Anwesenheit von Kobalt Licht aussendet, wobei:
  • - der Promotor und das Gen, die die Resistenz codieren, ein Promotor und ein Gen sind, die Resistenz gegen Kobalt codieren, erhalten aus pBR325, das das czc-Fragment von pMOL30 aus dem Alcaligenes eutrophus-Stamm CH34 enthält, verdaut mit EcoRI-PstI,
  • - das Ergebnis der Verdauung bei der multiplen Klonierungsstelle in das Plasmid pUCD615 eingefügt wird, das das lux-Operon von Vibrio fischeri enthält,
  • - das Ergebnis der Insertion in E. coli einkloniert wird,
  • - die Selektion auf Ampicillin-Platten mit verschiedenen Konzentrationen von Kobalt ausgeführt wird,
  • - der Nachweis der lichterzeugenden E. coli-Bakterien bei Anwesenheit von Kobalt ausgeführt wird.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf einen Prozeß zur In-vivo-Herstellung eines zellularen Wirtes, der ein fusioniertes Gen enthält, wobei der Prozeß die folgenden Schritte aufweist:
  • - Konjugation, um Transkonjuganten zu erhalten, eines zellularen Wirtes, der einen Promotor und ein Gen, die die Resistenz gegen ein Metall codieren, oder den Katabolismus einer xenobiotischen Verbindung codieren, und eventuell einen Marker für das Vorhandensein des Gens enthält, mit einem weiteren zellularen Wirt, der ein Transposon enthält, das das Gen, das das nachweisbare Signal ohne seinen eigenen Promotor aussendet, und eventuell einen Marker für das Vorhandensein des Gens enthält,
  • - Rückgewinnung der Transkonjuganten,
  • - eventuelle Selektion von Transkonjuganten, wobei der oder die Marker in ein Medium eingebracht werden, in dem der oder die Marker nachgewiesen werden können,
  • - eventuelle Aufbringung der Transkonjuganten auf Medien mit verschiedenen Konzentrationen von Metall oder xenobiotischen Verbindungen,
  • - Selektion von Transkonjuganten, die bei Anwesenheit eines Mediums, das ein Metall oder eine xenobiotische Verbindung enthält, Licht aussenden.
  • Ein bevorzugter Prozeß für die In-vivo-Herstellung eines zellularen Wirtes, der ein fusioniertes Gen enthält, weist die folgenden Schritte auf:
  • - Konjugation, um Transkonjuganten zu erhalten, eines zellularen Wirtes, der einen Promotor und ein Gen, die die Resistenz gegen ein Metall codieren, oder den Katabolismus einer xenobiotischen Verbindung codieren, enthält, mit einem weiteren zellularen Wirt, der ein Transposon enthält, das das Gen, das das nachweisbare Signal ohne seinen eigenen Promotor aussendet, und einen Marker für das Vorhandensein des Gens enthält, wobei der Marker in vorteilhafter Weise Tetracyclin ist,
  • - Rückgewinnung des zellularen Wirtes, der den Promotor und das Gen enthält, die die Resistenz gegen ein Metall codieren, oder den Katabolismus einer xenobiotischen Verbindung codieren, mit Elimination des zellularen Wirtes, der das Transposon enthält, mittels des Markers und mittels einer Minimalmediumkultur, die ermöglicht, nur dem zellularen Wirt zu selektieren, der den Promotor und das Gen enthält, die die Resistenz gegen ein Metall codieren, oder den Katabolismus einer xenobiotischen Verbindung codieren,
  • - Aufbringung der obigen Transkonjuganten auf Medien, die das Metall oder die xenobiotische Verbindung enthalten oder nicht enthalten, um die Transkonjuganten zu selektieren, die nur bei Anwesenheit eines spezifischen Schwermetalls oder einer spezifischen xenobiotischen Verbindung Licht aussenden.
  • Wenn zum Beispiel der zellulare Wirt, der den Promotor und das Gen enthält, die die Resistenz gegen ein Schwermetall oder gegen eine xenobiotische Verbindung codieren, Alcaligenes eutrophus ist, und wenn der zellulare Wirt, der das Transposon enthält, E. coli CM601 (der das Transposon Tn4431 enthält) ist, ermöglicht die Resistenz gegen Tetracyclin, einerseits Alcaligenes eutrophus, in die das Transposon Tn4431 eingefügt wurde, und andererseits den Stamm CM601, der das Transposon enthält, zu selektieren.
  • Ein Minimalmedium:
  • - 284 Gluconat oder
  • - Schatz-Azelat,
  • auf dem CM601 nicht leben kann, weil C601-Stämme von HB101 stammen, der autotroph für Leucin und Prolin ist, was ermöglicht, nur Alcaligenes eutrophus zu selektieren.
  • Das 284 Gluconat-Medium ist:
  • Die Grundzusammensetzung dieses Kulturmediums ist beschrieben in "Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemilithotroph with plasmid-bound resistance to heavy metals" M. Mergeay et al. (1985), J. Bacteriol. 162: 328-334; (Gluconat (0,2%) wird als Kohlenstoffquelle verwendet).
  • Schatz-Azelat ist beschrieben in Schatz A. et al. (1952) "Growth and hydrogenase activity of a new bacterium, Hydrogenomonas facilis". J. Bacteriol. 63: 87- 98; (die verwendete Kohlenstoffquelle ist Azelat (0,2%)).
  • Da das Transposon irgendwo in das Genom von Alcaligenes eutrophus eingefügt werden kann, ist es notwendig, die Transkonjuganten zu selektieren, in die das Transposon an einer richtigen Stelle eingefügt wird.
  • Zu diesem Zweck wird ein Film auf die Schalen aufgebracht, die die Transkonjuganten auf dem Minimalmedium, mit oder ohne Schwermetall oder xenobiotische Verbindung, enthalten. Diese Technik ermöglicht, die konstitutiven Konjugationen (Lichtaussendung unabhängig von der Anwesenheit von Metall) gegenüber den nicht-spezifischen induzierbaren Fusionen (Lichtaussendung bei Anwesenheit von einem oder mehreren Metallen, oder unter bestimmten Beanspruchungsbedingungen), und gegenüber den spezifischen induzierbaren Fusionen (Lichtaussendung bei Anwesenheit eines spezifischen Metalls) zu selektieren.
  • Der Nachweis von Bakterien, die ihre Resistenz verloren haben, wird ebenfalls auf Minimalmedium bei Anwesenheit von Metallen ausgeführt. Dieser Verlust oder diese Abnahme_er Resistenz ist entweder auf die Insertion des Transposons in das Resistenzgen oder in seinen Promotor, oder auf den Verlust des Plasmids, das die Resistenz aufweist, oder auf den Verlust eines Teils dieses Plasmids zurückzuführen.
  • Im einzelnen kann die In-vivo-Fusion wie folgt ausgeführt werden:
  • 1) Die Stämme CM601 und die Stämme, die Resistenz gegen Metalle und/oder xenobiotische Verbindungen aufweisen, werden in einem flüssigen Medium aus 5 ml Medium 869 während 16 h unter Rühren bei 30 C gezüchtet. Das Medium 869 entspricht dem Luria-Broth-Medium: Für 1 l Milli-q-Wasser:
  • 10 q NaCl
  • 5 g Bacto-Yeast-Extrakt
  • 10 g Bacto-Trypton
  • den pH mit Natriumhydroxid auf 7,5 einstellen.
  • 2) 100 ul der Kultur werden auf eine Agarschale (Medium 869) auf eine solche Weise aufgebracht, daß die Stämme CM601 auf ein Drittel der Schale, die Stämme, die Resistenz aufweisen, auf ein zweites Drittel der Schale, und sowohl die Stämme CM601, als auch die Stämme, die Resistenz aufweisen, auf das letzte Drittel der Schale aufgebracht werden.
  • 3) Nach 2 Tagen bei 30 C werden die Bakterien in dem Kreuzungsgebiet zurückgewonnen, und auf dem selektiven Medium (Sz-Azelat + Tet 20 ug/ml = hist- medium, Tet +) selektiert, auf dem nur die Rekominanten (= Bakterien, in die das Transposon Tn4431 eingefügt wurde) wachsen.
  • 4) Die Rekombinanten werden auf Schalen repliziert, die verschiedene Metalle (in dem 284 Gluconat-Medium) enthalten, und die Mutanten, die bei Anwesenheit spezifischer Metalle Licht aussenden, werden für eine weitere Untersuchung selektiert.
  • Die Konzentrationen des Metalls auf den Petrischalen sind:
  • - 284 Gluconat + Chrom 40 ug/ml
  • - 284 Gluconat + Nickel 2 mM
  • - 284 Gluconat + Kobalt 2 mM
  • - 284 Gluconat + Zink 2 mM
  • - 284 Gluconat + Kadmium 0,8 mM
  • - 284 Gluconat + Blei 0,3 mM
  • - 284 Gluconat + Kupfer 0,8 mM
  • Ein bevorzugter zellularer Wirt ist Alcaligenes eutrophus, wobei dieser Typ aus den folgenden Gründen interessant ist:
  • - Er weist eine hohe Expressionsfähigkeit für die spezifische Resistenz gegen ein Metall auf.
  • - Diese Mechanismen sind induzierbar (Siddiqui et al., 1988. Inductible and constitutive expression of pMOL 28- encoded nickel resistance in Alcaligenes eutrophus N9A. J. Bacteriol. 170, 4188-4193; Nies et al., 1989, Plasmiddetermined inductible efflux is responsible for resistance to cadmium, zinc, cobalt and nickel in Alcaligenes eutrophus. J. Bacteriol. 171, 896-900; Senfuss et al., 1989. Plasmid pMOL 28 encoded resistance to nickel is due to a specific efflux. FEMS Microbiol. Lett. 55, 295-298).
  • - Er ist ein guter Rezipient für exogene Gene bei heterospezifischen Konjugationen (Lejeune et al., 1983, Chromosomal transfer and R-prime plasmid formation mediated by plasmid pULB113 (RP4::Mini-Mu) in Alcaligenes eutrophus CH34 and Pseudomonas fluorescens 6.2. J. Bacteriol. 155, 1015-1026).
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Prozeß, bei dem
  • - der zellulare Wirt, der einen Promotor und ein Gen enthält, die die Resistenz gegen ein Metall codieren, Alcaligenes eutrophus ist, und der zellulare Wirt, der ein Transposon enthält, E. coli ist, die den Vektor pUCD623 enthält, der wiederum ein Transposon Tn4431 enthält, das das Transposon Tn1721 ist, das die Tetracyclinresistenz und das lux-Operon von Vibrio fischeri ohne seinen eigenen Promotor enthält,
  • - die Selektion der erhaltenen Transkonjuganten auf Tetracyclinplatten ausgeführt wird,
  • - die Transkonjuganten werden Medien mit verschiedenen Konzentrationen von Metallen repliziert werden,
  • - der Nachweis der lichterzeugenden Transkonjuganten ausgeführt wird.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Prozeß zum Herstellen eines zellularen Wirtes, der bei Anwesenheit von Chrom Licht aussendet, wobei der zellulare Wirt, der einen Promotor und ein Gen enthält, die resistent gegen ein Metall sind, Alcaligenes eutrophus SV661 ist, und der zellulare Wirt, der das Transposon enthält, der E. coli-Stamm CM601 ist, was AE714 ergibt, der in A5.3 transferiert wird, um AE859 zu erhalten, der Lichtexpression bei Anwesenheit von Chrom ergibt.
  • Die Selektion des Chrom-Biosensors wird (außer mittels des Markers und des Minimalmediums) in vorteilhafter Weise bei Anwesenheit von Zink ausgeführt, das ermöglicht, die Transkonjuganten zu selektieren, bei denen das Transposon nicht in das Zinkresistenzgen eingefügt wurde.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Prozeß zum Herstellen eines zellularen Wirtes, der bei Anwesenheit von Nickel Licht aussendet, wobei der zellulare Wirt, der einen Promotor und ein Gen enthält, die resistent gegen ein Metall sind, Alcaligenes eutrophus AE631 ist, und der zellulare Wirt, der das Transposon enthält, der E. coli-Stamm CM601 ist, was AE453 ergibt, der in A5.3 transferiert wird, um AE891 zu erhalten, der Lichtexpression bei Anwesenheit von Nickel ergibt.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Prozeß zum Herstellen eines zellularen Wirtes, der bei Anwesenheit von Kupfer Licht aussendet, wobei der zellulare Wirt, der einen Promotor und ein Gen enthält, die resistent gegen ein Metall sind, Alcaligenes eutrophus DS185 ist, und der zellulare Wirt, der das Transposon enthält, der E. coli-Stamm CM601 ist, was AE866 ergibt, der Lichtexpression bei Anwesenheit von Kupfer ergibt.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Prozeß zum Herstellen eines zellularen Wirtes, der bei Anwesenheit von Kupfer Licht aussendet, wobei der zellulare Wirt, der einen Promotor und ein Gen enthält, die resistent gegen ein Metall sind, Alcaligenes eutrophus DS310 ist, und der zellulare Wirt, der das Transposon enthält, der E. coli-Stamm CM601 ist, was AE890 ergibt, der Lichtexpression bei Anwesenheit von Kupfer ergibt, und auf Minimalplatten, die Blei enthalten, nicht wachsen kann.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Prozeß zum Herstellen eines zellularen Wirtes, der bei Anwesenheit einer Biphenylverbindung Licht aussendet, wobei der zellulare Wirt, der einen Promotor und ein Gen enthält, die den Katabolismus von Biphenylverbindungen codieren, Alcaligenes eutrophus A5 ist, und der zellulare Wirt, der das Transposon enthält, der E. coli-Stamm CM601 ist, was A5.23 oder A5.24 ergibt, der Lichtexpression bei Anwesenheit von Biphenylverbindungen ergibt.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf E. Coli. die gemäß dem Prozeß der Erfindung leicht transformiert werden kann.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Alcaligenes eutrophus, die gemäß der Prozeß der Erfindung leicht transkonjugiert werden kann.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Prozeß, um auf einem festen Medium ein Metall oder eine xenobiotische Verbindung nachzuweisen, vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von ungefähr 1 bis ungefähr 120 ppm, aufweisend:
  • - die Verwendung eines festen Trägers, wie einer Agarscheibe, die ein geeignetes festes Medium für einen zellularen Wirt der Erfindung enthält,
  • - die Aufbringung eines in einem flüssigen Medium enthaltenen, zellularen Wirtes der Erfindung auf die Agarscheibe,
  • - die Anordnung eines radiographischen Films unter der obenerwähnten Agarscheibe,
  • - den Nachweis der Biolumineszenz durch Vergleich der Schwärzung auf dem Film.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Prozeß, um in einem flüssigen Medium ein Metall oder eine xenobiotische Verbindung nachzuweisen, vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von ungefähr 1 bis ungefähr 120 ppm, aufweisend:
  • - Einbringen von zellularen Wirten der Erfindung, die lyophilisiert und auf einem festen Träger immobilisiert wurden, in ein flüssiges Medium,
  • - Einbringen einer Probe des flüssigen Kulturmediums, das zellulare Wirte der Erfindung enthält, in eine aus einem flüssigen Medium, wie Wasser, entnommene Probe, bei der das Vorhandensein eines Metalls oder einer xenobiotischen Verbindung nachgewiesen werden soll,
  • - Nachweisen des Signals, zum Beispiel, des Lichtes, das durch die Anwesenheit des Metalls oder die Anwesenheit der xenobiotischen Verbindung erzeugt wird, durch Nachweismittel, wie ein Luminometer.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Prozeß, um in einem flüssigen Medium ein Metall oder eine xenobiotische Verbindung nachzuweisen, vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von ungefähr 1 bis ungefähr 120 ppm, aufweisend:
  • - Einbringen eines in einem flüssigen Medium enthaltenen, zellularen Wirtes der Erfindung in eine aus einem flüssigen Medium, wie Wasser, entnommene Probe,
  • - Nachweisen des Signals, zum Beispiel des Lichtes, das durch die Anwesenheit des Metalls oder die Anwesenheit der xenobiotischen Verbindung erzeugt wird, durch Nachweismittel, wie ein Luminometer.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine Ausrüstung, um ein Metall in einem Konzentrationsbereich von nur 0,1 ppm, und eine xenobiotische Verbindung in einem Konzentrationsbereich von nur 1 ppb nachzuweisen, aufweisend:
  • - einen zellularen Wirt der Erfindung,
  • - Nachweismittel, zum Beispiel, um das Licht nachzuweisen, das durch die Anwesenheit des Metalls oder der xenobiotischen Verbindung erzeugt wird, wie ein Luminometer.
    • Beispielsweise:
  • 1) Eine Vorkultur wird erhalten durch Überimpfung einer isolierten Kolonie eines zellularen Wirtes der Erfindung in ein reiches, flüssiges Medium, wie 869, das vorzugsweise 20 ug/l Tetracyclin enthält, um nur die zellularen Wirte zu selektieren, in die das Transposon eingefügt wurde.
  • 2) Die Kultur wird in der flüssigen Probe, die das zu bestimmende Metall oder die zu bestimmende xenobiotische Verbindung enthält, verdünnt, zum Beispiel 1 : 20, bei einem Endvolumen von ungefähr 0,5 ml.
  • 3) Die Biolumineszenz wird gemessen, zum Beispiel mit einem Luminometer.
    • KOMMENTARE ZU DEN FIGUREN: Fig. 1:
  • Die Fig. 1 gibt die Biolumineszenz des durch Zink (in Form von Zn²&spplus;) induzierten Stammes CM685 wieder, ausgedrückt in Biolumineszenzeinheiten (cpm), aufgetragen gegen die Zeit (in Stunden).
  • Der Stamm CM865 wurde über Nacht in dem flüssigen Medium 869 gezüchtet. Teilmengen von 10 ul wurden auf genormte Agarscheiben mit oder ohne 1 mM Zink aufgebracht (siehe Materialien und Methoden), die in sterile Fläschchen eines Szintillationszählers transferiert wurden. Die Biolumineszenz wurde jede Stunde automatisch gemessen.
  • Die Ergebnisse geben Mittelwerte von dreifachen Proben und den zugehörigen Standardfehler des Mittelwertes (S. F. M.) wieder. Die Kurve mit den Dreiecken entspricht Proben, die 1 mM Zn²&spplus; enthalten. Die Kurve mit den Kreisen entspricht Kontrollproben.
    • Fig. 2:
  • Die Fig. 2 gibt das Signal/Rausch-Verhältnis, aufgetragen gegen die Zeit (in Stunden), für die Biolumineszenz des durch Zink (in Form von Zn²&spplus;) induzierten Stammes CM685 auf Agarscheiben wieder.
  • Der Stamm CM865 wurde über Nacht in dem flüssigen Medium 869 gezüchtet. Teilmengen von 10 ul wurden auf genormte Agarscheiben, die 1 mM Zink enthielten, aufgebracht. Das gemessene Biolumineszenzsignal wurde durch das Signal von parallelen Fläschchen geteilt, die die gleiche Menge von auf Agarscheiben ohne Zink wachsenden Bakterien enthielten.
    • Fig. 3:
  • Die Fig. 3 gibt die durch Kobalt (in Form von Co&spplus;&spplus;) auf festem Agar induzierte Biolumineszenz, ausgedrückt in mV, aufgetragen gegen die Zeit (in Stunden) wieder.
  • Der Stamm CM781 wurde über Nacht in dem flüssigen Medium 869 gezüchtet. Nach Verdünnung von 1 : 20 wurden 10 ul-Teilmengen über die Oberfläche von ausgestanzten Miniagarscheiben, die zunehmende Konzentrationen von Co&spplus;&spplus; enthielten, gleichmäßig verteilt.
  • Nach dem Transfer der Agarscheiben auf den Boden von sterilen Luminometer-Röhrchen wurde die Biolumineszenz alle 30 min automatisch gemessen. Bei diesem Gerät wird die Verstärkung des Photomultipliers automatisch stabilisiert, wodurch Messungen über lange Perioden erleichtert werden.
  • Die Ergebnisse sind der Mittelwert von 5 doppelten Proben.
  • Die Kurve mit "+" entspricht Proben, die kein Co&spplus;&spplus; enthielten.
  • Die Kurve mit Dreiecken entspricht Proben, die 0,2 mM Co&spplus;&spplus; enthielten.
  • Die Kurve mit Kreisen entspricht Proben, die 0,5 mM Co&spplus;&spplus; enthielten.
  • Die Kurve mit "+" entspricht Proben, die 1,0 mM Co&spplus;&spplus; enthielten.
    • Fig. 4:
  • Die Fig. 4 gibt die durch Chrom (in Form von Chromat) induzierte Biolumineszenz (ausgedrückt in relativen Lichteinheiten) auf Agar, der das Minimalmedium enthielt, aufgetragen gegen die zugegebene Menge Chrom, wieder.
  • Der Stamm AE859 wurde in dem flüssigem Minimalmedium 284 + Gluconat während 70 h gezüchtet. Teilmengen der unverdünnten Kultur wurden auf genormte Agarscheiben transferiert, wie bei Materialien und Methoden beschrieben wurde.
  • Der gesamte Lichtausbeute während des dreitätigen Wachstums in dem Luminometer wurde für jede Gruppe berechnet und für Unterschiede bei dem Wachstum, wie durch Trübungsmessung bestimmt, korrigiert. Die sich ergebende relative Lichtausbeute ist gegen die verwendeten Chromkonzentrationen aufgetragen.
    • Fig. 5:
  • Die Fig. 5 gibt das Signal/Rausch-Verhältnis des auf Agar 869 gezüchteten Stamms AE859, aufgetragen gegen die zugegebene Menge Chrom (in mM) (in Form von Chromat) wieder.
  • Der Stamm AE859 wurde während 23 h in dem flüssigen Medium 869 gezüchtet. Unverdünnte Teilmengen von 10 ul wurden auf genormte Agarscheiben transferiert, die das Wachstumsmedium 869 enthielten. Das Signal/Rausch- Verhältnis ist berechnet, wie in der Fig. 2 angegeben, außer für die Dauer des Wachstums in dem Luminometer, die 2 Tage betrug. Nach mehr als 20 Stunden wurde kein Licht erzeugt. Die Ergebnisse sind für kleine Unterschiede bei dem Wachstum korrigiert.
    • Fig. 6:
  • Die Fig. 6 gibt die Biolumineszenz (in mV) von AE866, aufgetragen gegen die Konzentration (ppm) von Kupfer (in Form von Cu²&spplus;) wieder.
  • Der Stamm AE866 wurde während 16 h in dem flüssigen Medium 869 gezüchtet. Unverdünnte Teilmengen von 10 ul wurden transferiert, wie oben beschrieben wurde. Jeder Wert repräsentierte den maximalen Mittelwert von 15 Teilmengen bei den verschiedenen Kupferkonzentrationen.
    • Fig. 7:
  • Die Fig. 7 gibt die Biolumineszenz (ausgedrückt in cpm), aufgetragen gegen die Zeit, von Stämmen wieder, die bei Anwesenheit von chlorierten Verbindungen Licht hervorrufen.
  • Der Stamm A5.24 wurde auf Agarscheiben, die das Minimalmedium 284 + Gluconat enthielten, während der angegebenen Zeit gezüchtet. Kleine Kristalle aus Biphenyl oder 4-Chlorbiphenyl wurden auf den Boden des Szintillationsfläschchens gelegt, ohne direkten Kontakt mit den Agarscheiben. Außerdem wurde Transformatorenöl (Askarel) (10 Mikroliter) nahe bei den Agarscheiben auf eine solche Weise abgesetzt, daß nur flüchtige Komponenten die Bakterienkultur erreichen konnten.
  • Die Kurve mit Kreisen entspricht Kontrollproben.
  • Die Kurve mit nach unten weisenden schwarzen Dreiecken entspricht Proben, die Biphenyl enthalten.
  • Die Kurve mit schwarzen Quadraten entspricht Proben, die 4-Chlorbiphenyl enthalten.
  • Die Kurve mit nach oben weisenden schwarzen Dreiecken entspricht Proben, die Transformatorenöl enthalten.
    • Fig. 8:
  • Die Fig. 8 gibt eine erhöhte Biolumineszenz des Stamms A5.23 nach Voranpassung an Biphenyl wieder.
  • Die Kurve mit nach unten weisenden schwarzen Dreiecken entspricht der Biolumineszenz, bei Anwesenheit von Biphenyl, des Stamms A5.23 nach Voranpassung an Biphenyl.
  • Die Kurve mit Kreisen entspricht der Biolumineszenz, bei Abwesenheit von Biphenyl, des Stamms A5.23 nach Voranpassung an Biphenyl.
  • Der während 3 Tagen auf Minimalagar 284 + Gluconat bei Anwesenheit von Kristallen aus flüchtigem Biphenyl gezüchtete Stamm A5.23 wurde geerntet, in einem kleinen Volumen (50 ul) flüssigem Medium 284 + Gluconat ohne Inducer resuspendiert, und in 8 ul-Teilmengen auf frische Agarscheiben mit Biphenylkristallen oder ohne Biphenylkristalle transferiert. Mit den Biolumineszenzmessungen wurden unmittelbar danach begonnen.
    • Fig. 9:
  • Die Fig. 9 gibt die Kartographie des Plasmids pBR325 (5,6 kb) wieder.
    • Fig. 10:
  • Die Fig. 10 gibt die Kartographie des Plasmids pMOL149 (20,7 kb) wieder.
    • Fig. 11:
  • Die Fig. 11 gibt eine DNA-Sequenz des EcoRI-SalI- Fragments von aE23 von pMOL149 (siehe Fig. 10) wieder, wobei die DNA-Sequenz die Induktion von lux-Genen durch Zink ermöglicht. Die ORFs sind mit dunkleren Buchstaben wiedergegeben.
    • Fig. 12:
  • Die Fig. 12 gibt die Spezifizität eines Kupfer- Biosensors (AE984 in dem Medium 869, das Tetracyclin [Tc] enthält), verglichen mit Cu, Cd, Co, Zn, Pb, Ni und Biphenyl wieder. Die gesamte Biolumineszenz nach 24 h ist in mV ausgedrückt.
    • Fig. 13:
  • Die Fig. 13 gibt die Spezifizität desselben Kupfer- Biosensors wie in der Fig. 12, verglichen mit Cu, Cd, Zn, Ni, Co, Cr, Mn, Ag, Hg und Tl (bei verschiedenen Konzentrationen) wieder. Die Biolumineszenz wird während 10 Sekunden gemessen und in relativen Lichteinheiten (R. L. E.) ausgedrückt.
  • Die Metalle wurden bei den folgenden Konzentrationen verwendet:
  • Mit anderen Worten:
  • - Das schwarze Muster entspricht einer Konzentration von 0,01 mM Metall.
  • - Das feine kreuzschraffierte Muster entspricht einer Konzentration von 0,1 mM Metall.
  • - Das Muster mit diagonalen Linien entspricht einer Konzentration von 0,2 mM Metall.
  • - Das grobe kreuzschraffierte Muster entspricht einer Konzentration von 0,4 mM Metall.
    • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Bei dem folgenden Beispiel werden die zellularen Wirte, die bei Anwesenheit eines Metalls oder bei Anwesenheit einer xenobiotischen Verbindung Licht aussenden, "Biosensoren" genannt.
    • Bakterienstämme und Plasmide
  • Die für die Genfusionen verwendeten, metallresistenten Gene werden isoliert aus Alcaligenes eutrophus CH34 ("Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemilitotroph with plasmid-bound resistance to heavy metals" M. Mergeay et al., (1985), J. Bacteriol. 162: 328-334), oder verwandten Stämmen (Diels L. et al., 1990, "DNA probe-mediated detection of resistant bacteria from soils highly polluted by heavy metals" Appl. Environ. Microbiol. 56: 1485-1491). Andererseits kommen die Gene, die Biphenyl zersetzen, von dem weiteren Alcaligenes eutrophus-Stamm A5 (Shields M. S. et al., 1985, "Plasmidmediated mineralization of 4-chlorobiphenyl", J. Bacteriol. 161: 882-889).
    • Konstruktion neuer Fusionen durch In-vitro-Klonierung a) Konstruktion eines Zink-Biosensors:
  • Ein Zink-Biosensor wurde durch Klonieren in E. coli (S17/1) konstruiert. Ein SalI-Fragment (3,5 kb) aus pMOL149 (nachstehend beschrieben) (pBR325 mit dem czc- Fragment von pMOL30 aus CH34 und seinem umgebenden EcoRI- Fragment) wurde in den Promotor eingefügt, der den Vektor pUCD615 exprimiert (wobei der Vektor in dem Stamm CM600 von E. Coli enthalten ist, der bei dem C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75015 Paris, am 28. Februar 1991 unter der Nr. I-1050 angemeldet wurde). Das Plasmid pBR325 weist eine vollständige Kopie von pBR322 (ATCC Nr. 31344; US-Patente Nr. 4.342.832 und Nr. 4.366.246) (I-A-iv-I) geöffnet bei der EcoRI-Stelle, und ein 1,2 kb-HaeII-Fragment, das das cm1-Gen enthält, auf. Das Plasmid pBR325 wurde von dem NIH Recombinant DNA Advisory Committee als ein EK2-Vektor bestätigt (Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH5 (1982)). Die Nukleotidsequenz von pBR325 ist bekannt. Die Verdauung mit SalI bei der multiplen Klonierungsstelle von pUCD615 und bei pMOL149 werden gemäß Maniatis et al. (1982), p. 104- 105 gemacht. Nach der Entphosphorylierung (Maniatis et al., 1982, p. 133-134) von pUCD615 wurde die Ligation (Maniatis et al., 1982, p. 125-126) mit den SalI- Fragmenten ausgeführt. Die Selektion wurde auf Ampicillin- Platten mit 0,5 mM ZnCl&sub2; ausgeführt. Die lichterzeugenden Kolonien wurden mit Autoradiographie und mit Polaroid- Photographie selektiert.
  • Dieser Biosensor ist nachstehend mit CM685 bezeichnet.
  • Das ausführliche Protokoll ist nachstehend wiedergegeben.
  • 1. Behandlung von CH34 und Erzeugung von AE128:
  • Ein Erlenmeyerkolben (50 ml), der 5 ml 284-Gluconat- Medium mit Mitomycin C (4 ug/l) enthielt, wurde bei 30 C während 5 Tagen geschüttelt. Die Zellen in dem Kolben wurden geerntet, gewaschen, verdünnt und auf Agarplatten, die 284-Gluconat mit 2 mM NiCl&sub2; enthielten, ausgebreitet. Plasmid-defiziente Mutanten kamen mit einer Häufigkeit von 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup5; pro Mitocin C-behandelter Zelle vor. Ni- empfindliche Zellen enthielten nur pMOL30, und dies wurde durch Agarose (0,8%)-Gel-Elektrophorese nachgewiesen. Dieser sich ergebende Stamm wurde als AE128 registriert.
  • 2. Isolierung von pMOL30 aus AE128:
  • Eine Übernacht-Kultur von AE128 in dem Medium M3 (Nutrient Broth (Difco) 8 g/l) (30 ml) wurde während 10 Minuten bei 4000 Upm in 6 Röhrchen von 5 ml zentrifugiert. Jedes Pellet wurde in 1 ml E-Puffer (0,04 M Tris-acetat pH 7,9; 0,002 M EDTA) suspendiert. Danach wurden 2 ml Lysepuffer (3% SDS; 0,05 M Tris-OH pH 12,55) zugegeben und in Glasröhrchen bei 65 C während 60 Minuten inkubiert.
  • Danach wurden 400 ul 5 M NaCl und 6 ml Phenol/CHCl&sub3; zugegeben und gemischt, worauf eine Zentrifugation von 10 Minuten Dauer folgte. Dann wurden die Röhrchen bei 4 C während 1 Stunde inkubiert. Die Bodenphase wurde eliminiert, und die obere Phase wiederum zentrifugiert (10 Minuten).
  • Die obere Phase wurde in ein silikonisiertes Glasröhrchen gegossen. Dann wurden 30 ul 10% Essigsäure und 6 ml Diäthyläther zugegeben, und danach wurde geschüttelt. Nach Zentrifugieren und Entfernen der Ätherschicht wurden die Röhrchen bei 65 C während 10 Minuten inkubiert, um die Ätherspuren zu entfernen. Die DNA wurde mit 50 ul 5 mM NaCl und 2 ml Äthanol ausgefällt. Nach einer Inkubation während 2 Stunden bei -15 C wurden die Röhrchen während 15 Minuten zentrifugiert. Alle sechs Pellets wurden in 2,0 ml Wasser aufgelöst, und dann wurden 200 ul 5 M NaCl und 4,4 ml Äthanol zugegeben. Nach einer Inkubation während 2 Stunden bei -15 C wurden die Röhrchen zentrifugiert, und das Pellet wurde getrocknet und in 200 ul H&sub2;O aufgelöst.
  • 3. Verdauung von pMOL30 mit EcoRI:
  • Zu 20 ul pMOL30 wurden 2,5 ul 10 · EcoRI-Puffer, 4 ul RNase-Lösung, und 1 ul EcoRI (50 U/ul) zugegeben. Nach Inkubation bei 37 C während 2 Stunden wurde die DNA mit einer Phenolextraktion behandelt und mit Äthanol ausgefällt. Das DNA-Pellet wurde in 50 ul TE-Puffer aufgelöst.
  • 4. Verdauung von pBR325 mit EcoRI:
  • Zu 20 ul pBR325 (vgl. Fig. 9) (2 ug/10 ul) wurden 2,5 ul 10 · EcoRI-Puffer, 4 ul RNase-Lösung und 0,5 ul EcoRI (50 U/ul) zugegeben. Nach Inkubation bei 37 C während 2 Stunden wurde die DNA mit einer Phenolextraktion behandelt und mit EtOH ausgefällt.
  • 5. Entphosphorylierung von EcoRI-verdautem pBR325:
  • Zu einem Pellet wurden 35 ul 10 mM Tris-HCl pH 8- Puffer und 4 ul CIP-Puffer (0,5 M Tris-HCL pH 9,0; 10 mM MgCl&sub2;; 1 mM ZbCl&sub2;; 10 mM Spermidin + 2 ul CIP (0,5 U) zugegeben, und dann wurde bei 37 C während 30 Minuten inkubiert. Danach wurden wiederum 2 ul C/P für eine zweite Inkubation von 30 Minuten zugegeben.
  • Danach wurden 50 ul Wasser und 10 ul 10 · STE (100 mM Tris-HCl pH 8; 1 mM NaCl; 10 mM EDTA und 1 ul 20% SDS) zugegeben, und dann wurde bei 68 C während 15 Minuten inkubiert. Danach wurden eine Phenol/CHCl&sub3;- und eine CHCl&sub3;- Extraktion gemacht, worauf eine Äthanolausfällung mit 10 ul 5 M NaCl und 330 ul EtOH (Ausfällung bei -70 C während 15 Minuten) folgte.
  • 6. Ligation von pBR325 EcoRI mit EcoRI-verdautem pMOL30:
  • Zu dem Pellet von (5) wurden 40 ul H&sub2;O und 5 ul Ligationspuffer (0,5 m Tris pH 7,4; 0,1 m MgCl&sub2;; 0,1 M Dithiotreitol; 10 mM Spermidin; 10 mM ATP; 1 mg/ml BSA und 12 ul von (3) zugegeben, und die Ligation wurde mit 4 ul Ligase (10 bis 20 U) ausgeführt.
  • Dann wurde eine Übernacht-Inkubation dieses Ligationsgemisches bei 12 C gemacht. Danach wurden 50 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 mM EDTA) zugegeben, und nach einer Phenol/CHCl&sub3;- und CHCl&sub3;-Extraktion wurde die DNA mit 10 ul 5 M NaCl und 330 ul EtOH ausgefällt.
  • 7. Transformation von HB101:
  • Die Transformation von E. coli HB101 wurde gemäß der CaCl&sub2;-Methode von Maniatis et al. ausgeführt. Die Selektion wurde für TetR-, AmpR- und CmS-Klone ausgeführt. Der Klon CM485 enthielt pMOL149 (vgl. Fig. 10), das pBR325 mit aE8, aE23, aE38 und aE39 von pMOL30 ist. pMOL149 wurde gemäß Birnboin und Dolly (Nucl. Acid. Res. 7: 1513) isoliert.
  • 8. SalI-Verdauung von pMOL149:
  • pMOL149 wurde auf die gleiche Weise, wie bei (3) erklärt, verdaut. Es wurden 1 ul SalI-Enzym (50 U) und 2,5 ul SalI-Verdauungspuffer verwendet.
  • 9. SalI-Verdauung von pUCD615:
  • pUCD615 (isoliert aus E. Coli CM600, angemeldet bei dem C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 rue du docteur Roux, 75015 Paris, am 28. Februar 1991 und der Nr. 1-1050, gemäß Birnboin, wie oben erwähnt) wurde auf die gleiche Weise wie pMOL149 (8) verdaut.
  • 10. Entphosphorylierung von pUCD615 SalI:
  • Die Entphosphorylierung von pUCD615 wurde so ausgeführt, wie dies bei (5) erklärt wurde.
  • 11. Ligation von pMOL149 SalI mit pUCD615 SalI:
  • Die Ligation zwischen pMOL149 SalI und pUCD615 SalI wurde gemäß (6) ausgeführt.
  • 12. Transformation des Ligats in S17/1:
  • Das Ligat wurde gemäß Maniatis et al. (p250) in S17/1 transformiert. Die Selektion wurde auf AmpR-Transformanten ausgeführt.
  • 13. Selektion des Phänotyps lux&spplus; mit 0,5 mM Zn:
  • AmpR-Transformanten wurden auf Petrischalen mit LB broth + 50 ug Amp mit Zugabe von 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 mM ZnCl&sub2; repliziert. Diese Schalen wurden während der Inkubation in Pappkartons auf Röntgenfilme gestellt. Die Kolonien, die bei zunehmenden Zn-Konzentrationen immer mehr Licht ergeben, wurden selektiert und gereinigt, und ihr Phänotyp wurde bei einem Luminometer-Experiment weiter analysiert.
    • b) Konstruktion eines Kobalt-Biosensors:
  • Ein Kobalt-Biosensor wurde auf die gleiche Weise wie der oben beschriebene Zink-Biosensor durch Einfügen eines EcoRI-PstI-Fragments (< 0,1 kb) aus pMOL149 in pUCD615 verwirklicht. Die PstI-Stelle wurde stumpfendig gemacht (Maniatis et al. (1982, p. 394-395), und danach wurde an dieser Stelle ein phosphorylierter EcoRi-Linker befestigt (Maniatis et al. (1982), p. 396-397). Der Linker wurde mit EcoRI verdaut (Maniatis et al. (1982), p. 104-105), und das Fragment wurde mit pUCD615 ligiert (Maniatis et al. (1982), p. 125-126). Die Selektion wurde auf Ampicillin- Platten mit 0,5 mM CoCl&sub2; ausgeführt. Die lichterzeugenden Kolonien wurden mit Autoradiographie selektiert.
  • Dieser Biosensor ist nachstehend mit CM781 bezeichnet.
    • Konstruktion von neuen Fusionen durch In-vivo-Klonierung
  • Verschiedene Alcaligenes-Stämme wurden mit dem E. coli-Stamm CM601 (angemeldet bei dem C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75015 Paris, am 28. Februar 1991 unter der Nr. 1-1051) konjugiert, der den Suizidvektor pUCD623 mit dem lux-Transposon Tn4431 (ohne seinen eigenen Promotor) aufweist. Nach der Konjugation wurden die Transkonjuganten auf Tetracyclin-Platten selektiert. Danach wurden die Transkonjuganten auf Medien mit verschiedenen Konzentrationen von Schwermetallen repliziert. Auf diese Weise konnten verschiedene Biosensoren konstruiert werden.
    • a) Konstruktion eines Chrom-Biosensors:
  • Ein Chrom-Biosensor konnte durch Konjugation des chromresistenten Alcaligenes eutrophus-Stamms SV661 (angemeldet bei dem C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75015 Paris, am 28. Februar 1991 unter der Nr. I- 1046) (Diels L. et al., 1990, "DNA probe-mediated detection of resistant bacteria from soils highly polluted by heavy metals" Appl. Environ. Microbiol. 56: 1485-1491) mit CM601 erhalten werden. Die Selektion wurde auf einem anorganischen Medium (Schlegel H. G. et al., 1961, "Ein Submersverfahren zur Kultur wasserstoffoxidierender Bakterien: Wachstumsphysiologische Untersuchungen" Arch. Mikrobiol. 38: 209-222) mit 20 mg/l Tetracyclin und 2 mM Zink ausgeführt. Die erhaltenen Transkonjuganten wurden auf anorganische Platten mit 1 mM CrO&sub4;&supmin;&supmin; transferiert. Die lichtaussendenden Kolonien wurden durch Autoradiographie selektiert.
  • Dieser Biosensor ist nachstehend mit AE714 bezeichnet.
  • Die in AE714 enthaltene Konstruktion der Erfindung wurde in A5.3 transferiert, um den stabilen Stamm AE859 zu erhalten.
    • b) Konstruktion eines Nickel-Biosensors:
  • Ein Nickel-Biosensor wurde nach Paarung zwischen AE453 und CM601 erhalten (AE453 wurde angemeldet bei dem C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75015 Paris, am 28. Februar 1991 unter der Nr. I-1049). Nach Selektion auf Tetracyclin wurden die Transkonjuganten auf einem anorganischen Medium mit 0,5 mM NiCl&sub2; selektiert.
  • Dieser Biosensor ist nachstehend mit AE631 bezeichnet.
  • Die in AE631 enthaltene Konstruktion der Erfindung wurde in A5.3 transferiert, um den stabilen Stamm AE891 zu erhalten.
    • c) Konstruktion eines Kupfer-Biosensors:
  • Kupfer-Biosensoren wurden nach Paarung zwischen DS185 oder DS310, von denen jeder pMOL90, 85 und 80 aufweist (Diels L. et al., 1990, "DNA probe-mediated detection of resistant bacteria from soils highly polluted by heavy metals" Appl. Environ. Microbiol. 56: 1485-1491), und CM601 erhalten.
  • DS185 wurde bei dem C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75015 Paris, am 28. Februar 1991 unter der Nr. I-1048 angemeldet.
  • DS310 wurde aus DS185 wie folgt erhalten:
  • Eine 5 ml-Kultur von DS185 in dem 284 Gluconat-Medium mit SDS (0,01%) wurde in einem Erlenmeyerkolben (50 ml) bei 30 C während 4 Tagen geschüttelt. Die Zellen in dem Kolben wurden geerntet, gewaschen, verdünnt, und auf Agarplatten, die 284 Gluconat mit 2 mM Zn enthielten, ausgebreitet. Eine Plasmid-Analyse wurde ausgeführt gemäß Kado C. I. et al. (1981), "Rapid procedure for detection and Isolation of large and small Plasmids" J. Bacteriol. 145: 1365-1373. DS310 wurde auf diese Weise erhalten und hatte das Plasmid pMOL80 (4 kb) verloren.
  • Aus der Paarung zwischen DS185 und CM601 wurden 200 Kolonien getestet, und aus der Paarung zwischen DS310 und CM601 wurden ebenfalls 200 Kolonien getestet.
  • Die Selektion wurde, wie oben beschrieben, auf Minimalplatten mit 0,8 mM Kupfer als induktives Mittel, und Tetracyclin verwirklicht.
  • Diese mit DS185 bzw. DS310 erhaltenen Biosensoren sind nachstehend mit AE866 und AE890 bezeichnet,
    • d) Konstruktion von Biphenyl-Biosensoren:
  • Nach Paarung zwischen A5 und CM601 wurden zwei Biphenyl-Biosensoren erhalten. Nach Selektion auf Tetracyclin wurden die Transkonjuganten auf Minimalplatten mit Biphenyl als induktives Mittel bezüglich Lichtinduktion sortiert.
  • Diese Biosensoren sind nachstehend mit A5.23 und A5.24 bezeichnet.
    • Konjugation mit A5.3
  • Die bei Alcaligenes eutrophus var. metallotolerans in vivo hergestellten Konstruktionen enthielten ziemlich instabile Tn4431-Insertionen. Daher wurden die Plasmide nach A5.3 transferiert. Der Stamm A5.3 ist ein Rifampicin- Mutant des biphenyl-zersetzenden Stamms A5 (A5 wurde bei dem C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75015 Paris, am 28. Februar 1991 unter der Nr. I-1047 angemeldet). Dieser Mutant wird erhalten, wenn A5 auf Agarplatten ausgebreitet wird, die Luria Broth-Medium mit 100 ug/ml Rifampicin enthalten. Die resistenten Kolonien werden selektiert. Nach der Konjugation wurde die Selektion auf Minimalplatten ausgeführt, die Tetracyclin bzw. Rifampicin enthielten. Die erhaltenen Transkonjuganten wurden bezüglich ihrer Resistenz gegen Chrom (mit AE859 bezeichneter Biosensor) bzw. Nickel (mit AE891 bezeichneter Biosensor), und bezüglich ihrer Lichtexpression bei Anwesenheit dieser Metalle getestet.
    • Messung der Biolumineszenz
  • Die Lumineszenz wurde mit einem Szintillationszähler (Packard Tri-Carb Modell 2425), bei dem der Chemolumineszenzerfassungs-Modus eingestellt wurde, oder mit einem Luminometer (Bio-Orbit Modell 1251) quantitativ bestimmt. Bei dem ersteren Gerät wird die Biolumineszenzaktivität in cpm angegeben, während bei dem letzteren Gerät die Biolumineszenz in mV ausgedrückt wird.
  • Die Induktionsexperimente wurden bei Kulturen von Mutantenstämmen in sterilen Fläschchen ausgeführt, die während der Dauer des Experiments in dem Biolumineszenzzähler kontinuierlich bewegt wurden.
  • Um die optische Dichte bei flüssigen Kulturen zu messen, wurden Proben aus größeren parallelen Kulturen entnommen.
  • Um das Wachstum einer Bakterienkultur am Ende der Züchtung auf kalibrierten Agarscheiben (9 mm, 3,5 mm dick) zu messen, wurden die Bakterien durch heftiges Schütteln während 1 h in 2 ml MgSO&sub4; 10 mM in geschlossenen Röhrchen von dem Agar abgelöst.
  • Die Trübung des Überstandes wurde mittels eines Perkin Elmer- Spektrophotometers, Modell Lambda 3, bei 630 nm gemessen.
  • Die Experimente mit Fusionsstämmen wurden bei oder unter 30 C ausgeführt, da Luciferase bei höheren Temperaturen inaktiviert wird. Die Lumineszenz wurde dort, wo sie in relativen Lichteinheiten angegeben ist, mittels Teilung durch die gemessene Trübung der Kulturen vereinheitlicht.
  • Eine halbquantitative Vergleichsmessung der Biolumineszenz bei verschiedenen Stämmen auf verschiedenen Medien wurde folgendermaßen ausgeführt:
  • - Petrischalen, die das geeignete feste Medium enthielten, wurden nach Trocknen während 30 Minuten bei 30 C nach Gewicht kalibriert. Das Nettogewicht des Agars wurde so gewählt, daß eine mittlere Dicke des Agars von 3,5 ± 0,1 mm in dem mittleren Bereich der Platte erhalten wurde.
  • - Mittels eines sterilen Korkbohrers mit einem Innendurchmesser von 9 mm wurden Agarscheiben aus dem mittleren Bereich des Agars ausgestanzt, und mit einem kleinen Spatel nach sterilen, leeren Petrischalen transferiert.
  • - Eine während der richtigen Zeit gezüchtete, flüssige Vorkultur wurde, verdünnt oder nicht verdünnt, in Teilmengen von 10 Mikrolitern auf jede 9 mm-Agar- Minischeibe aufgebracht. Beim Pipettieren wurde darauf geachtet, daß die Kultur gleichmäßig über die ganze Oberfläche der Minischeiben verteilt wurde. Für jede Gruppe wurden jeweils drei (oder mehr) Proben verwendet.
  • - Die Petrischalen wurden in (4 mm dicken) dunklen Kunststoffplatten, die mit 6 kreisförmigen Ausschnitten versehen waren, in die die Schalen genau hineinpaßten, befestigt.
  • - Ein radiographischer Film (Kodak Ortho G) wurde unter den Petrischalen angeordnet und in dreifachen Pappkartons während mehrerer Stunden oder Tage bei der optimalen Temperatur belichtet.
  • - Am Ende der Belichtung wurde der Film entwickelt, und die Intensität der Biolumineszenz durch Vergleich der Schwärzung des Films unter den Minischeiben beurteilt. Wenn gewünscht, können Korrekturen für Unterschiede bei dem Gesamtwachstum mittels Trübungsmessung der resuspendierten Bakterien vorgenommen werden (siehe oben).
  • Diese Methode ergibt ein kumulatives Ergebnis der gesamten Lichtausbeute während einer vorgegebenen Periode, aber ermöglicht nicht, der zeitabhängigen Lichtaussendung, die mittels wiederholter Messungen in einem programmierbaren Luminometer besser quantitativ bestimmt werden kann, leicht zu folgen. Wenn quantitativere Ergebnisse über einen vorgegebenen Zeitabschnitt für auf festem Agar gezüchtete Bakterien erwünscht waren, wurden die kalibrierten Agar-Minischeiben in für den gewählten Biolumineszenzzähler geeignete Fläschchen transferiert, und dann wurden in regelmäßigen Abständen unter sterilen Bedingungen Messungen bei dreifachen Proben ausgeführt.
    • ERGEBNISSE A. Durch Schwermetalle induzierbare, lichtaussendende Bakterien 1) CM685: Zink-Biosensor:
  • In pUCD615 konnten verschiedene SalI-Fragmente eingefügt werden. Eines von ihnen, das das Plasmid pLD13 enthielt, erzeugte Licht auf Zinkplatten. Ein weiterer Stamm, der das Plasmid pLDIO aufwies, erzeugte ebenfalls Licht auf Zinkplatten, aber schien äußerst empfindlich gegen Zinkionen zu sein. Das Plasmid pLD13 enthält ein 3,5 kb SalI-Fragment, das die linke Stelle des czc-Operons von pMOL30 aus CH34 überlappt (ATCC 43123).
  • Die durch 1 mM Zink&spplus;&spplus; in einem festen Wachstumsmedium induzierte Biolumineszenz ist in der Fig. 1 wiedergegeben. Während der ersten 7 Stunden ist die Toxizität von 1 mM Zink&spplus;&spplus; bei diesem nicht-resistenten E. coli-Stamm hoch genug, um im Vergleich zu der Kontrollgruppe das Wachstum der Kultur zu verzögern und die Lichtaussendung zu verringern.
  • Nach der Induktionsperiode von ungefähr 8 h nimmt die Lichtaussendung gewaltig zu und erreicht ein Niveau, das mindestens 10 Mal höher als bei der Kontrollgruppe ist.
  • Diese erhöhte Lumineszenz ist nicht auf das bessere Wachstum der Bakterienkultur auf dem zink-enthaltenden Agar zurückzuführen, weil frühere Experimente das Gegenteil zeigten (Daten nicht wiedergegeben). Wenn die Biolumineszenz der Kontrollgruppe ohne Zink als Rauschen angesehen wird, kann ein Signal/Rausch-Verhältnis für jede Zeitperiode während der Messung von 25 h Dauer bestimmt werden. Aus der Fig. 2 ergibt sich, daß dieses Verhältnis sehr zeitabhängig ist, und zwar auf eine komplexe Weise. Das höchste Signal/Rausch-Verhältnis (86) wird nach 21 Stunden erhalten.
  • Wenn dieser Stamm in einem flüssigen Medium getestet wird, ergibt sich nur eine marginal erhöhte Lumineszenz (+ 21% n = 12) bei Anwesenheit von 0,5 mM Zink während 24 h bei 30 C mit intermittierendem Schütteln in dem Luminometer.
  • Der Zinkpromotor ist dadurch gekennzeichnet, daß er ein Fragment mit mindestens 20 aneinandergrenzenden Basenpaaren der in der Fig. 11 wiedergegebenen DNA aufweist, wobei das Fragment die Induktion von lux-Genen durch Zink ermöglicht.
    • 2) CM781: Kobalt-Biosensor:
  • Aus den verschiedenen Klonen, die sich nach der Einfügung des EcoRI-PstI-Fragments ergaben, konnte ein Klon erhalten werden, der auf Kobaltplatten Licht aussendet. Das eingeführte EcoRI-PstI-Fragment ist ein sehr kleines Fragment (< 0,1 kb), und konnte bisher nicht klar identifiziert werden.
  • Da Kobalt toxischer als Zink ist, wurden verschiedene Konzentrationen dieses Schwermetalls in festem Nähragar getestet.
  • Erhöhte Co&spplus;&spplus;-Konzentrationen rufen eine erhöhte Gesamtlichtausbeute über eine Periode von 48 Stunden hervor. Aus der Fig. 3 ist ebenfalls klar ersichtlich, daß die maximale Biolumineszenz später erreicht wird, wenn die Co&spplus;&spplus;-Konzentration zunimmt.
  • Bei diesem Stamm nimmt die Biolumineszenz bei flüssigen Kulturen während einer Meßperiode von 24 h bei Anwesenheit von zunehmenden Co&spplus;&spplus;-Konzentrationen ab (Daten nicht wiedergegeben). Neuere Experimente lassen jedoch erkennen, daß das Wachstum in den Luminometer-Fläschchen sehr langsam erfolgt, wobei nach 35 Stunden bei 28,0 C mit intermittierendem Schütteln alle 10 Minuten eine beträchtliche Zunahme der Biolumineszenz bei den Kontrollproben beobachtet wird.
    • 3) AE714: Chrom-Biosensor:
  • Die Konjugation zwischen SV661 und CM601 ergab unter anderem einen Ni&spplus;-, Cr&spplus;-Mutanten AE714, der durch Einführung von Tn4431 in pMOL28.661 erhalten wurde. Das Transposon Tn4431 war in Alcaligenes eutrophus var. metallotolerans nicht sehr stabil, und aus diesem Grund wurde das Plasmid pMOL28.661::T4431 nach dem Stamm A5.3, einem rifampicin-resistenten, biphenyl-zersetzenden Stamm transferiert. Dabei ergab sich der Stamm AE859 mit einer stabilen Lichtexpression bei Anwesenheit von Chromionen.
  • Auch bei diesem Stamm war das Wachstum der Bakterienkultur auf dem chrom-enthaltenden Agar deutlich geringer als bei den Kontrollproben, wie visuell beurteilt wurde. Bei höheren Chromkonzentrationen ist das Wachstum sehr gering und die Lichterzeugung schwach (Daten nicht wiedergegeben).
    • 4) AE859: Chrom-Biosensor:
  • Dieses Konstrukt ist stabiler als der Stamm AE714. Wenn es auf dem Minimalmedium 284 Glu während 3 Tagen gezüchtet wird, erzeugt die Anwesenheit von Chromionen bis 0,2 mM eine lineare Zunahme der Lichtausbeute (Fig. 4).
  • Das Wachstum und die Lichterzeugung sind stärker, wenn dieser Stamm auf einem Agar gezüchtet wird, der die reiche Nährlösung 869 enthält, aber das Signal/Rausch- Verhältnis erreicht bei der höchsten getesteten Chromkonzentration (0,5 mM) nur einen Wert von 2,06 + 0,03 (Fig. 5). Dies ist auf die hohe Untergrund-Biolumineszenz der Kontrollgruppe zurückzuführen, wo die lux-Gene bei Abwesenheit von zugegebenem Chrom nicht vollständig "stumm" sind. Eine Möglichkeit, um diesen Untergrund zu erklären, ist die Anwesenheit von verborgenen Promotorsequenzen, die ohne Beziehung zu dem bei diesem Mutanten anwesenden, schwermetall-induzierbaren Promotor sind.
    • 5) AE891: Nickel-Biosensor:
  • Der sich aus der Konjugation von AE453 mit CM601 ergebende Stamm war AE631, der eine Insertion von Tn4431 in das ZinB-Gen enthielt, was einen Zin&spplus;-Stamm ergab. Auch dieser Stamm war instabil, und daher wurde wiederum pMOL55::Tn4431 nach A5.3 transferiert, was AE891 ergab, der eine stabile, lichtaussendende Konstruktion auf Nickelplatten aufweist.
  • Bei Anwesenheit von mindestens 0,5 mM Ni&spplus;&spplus; in Minimalnähragar (284 Glu) wird nach einem Wachstum von 2 Tagen eine erhöhte Biolumineszenz beobachtet. Diese Zunahme ist bei 1 und 2 mM Ni&spplus;&spplus;, wo die Toxizität begrenzend für ein ausreichendes Wachstum wird, noch deutlich erkennbar. Das maximale Signal/Rausch-Verhältnis (8,2 ± 0,5) wurde bei Anwesenheit von 1 mM Ni&spplus;&spplus; erreicht. Die Induktionsperiode für erhöhte Lumineszenz beträgt bei Anwesenheit von 0,5 mM Ni&spplus;&spplus; mindestens 10 h bei 30 C. Bei höheren Ni&spplus;&spplus;-Konzentrationen nimmt die Induktionsperiode beträchtlich zu.
    • 6) AE866 und AE890: Kupfer-Biosensoren:
  • Die Konjugation DS185 mit CM601 ergab AE866 durch Insertion von Tn4431 in pMOL85. Die Insertion von Tn4431 ist auf pMOL85 gelegen. Der Transkonjugant AE890 ergibt sich aus der Konjugation zwischen DS310 und CM601. AE890 ist empfindlich gegen Blei. Bei AE866 wurde zwischen 1 und 100 ppm auf festem Agar, der die reiche Nährlösung 869 enthielt, eine lineare Lichtaussendung beobachtet (Fig. 6). Der Lichtaussendungs-Peak wird 9 bis 10 h nach der Induktion erreicht, und die Nachweisgrenze bei einem Signal/Rausch-Verhältnis von 2 betrug ungefähr 10 ppm Kupfer. Über 100 ppm war die Lichtaussendung wegen der Toxizität von Kupfer für das Wachstum der Bakterienkultur nicht mehr linear.
    • 7a) AE984: Kupfer-Biosensor:
  • Der Stamm AE984 ist ein Abkömmling des Stamms AE866, der pMOL85 spontan verloren hat, und der eine Insertion von Tn4431 in pMOL90 (pMOL90::Tn4431) enthält.
  • Die Fig. 12 gibt die Spezifizität von AE984 bezüglich Kupfer wieder. Das Untergrundrauschen wird bei der Kontrollprobe erhalten. Die Spezifizität wurde unter den folgenden Bedingungen bestimmt:
  • Der Stamm AE984 wurde über Nacht bei 30 C gezüchtet. Am nächsten Tag wurden Verdünnungen mit einer optischen Dichte von 0,1 gemacht.
  • Jeder Test wurde 3 Mal gemacht. Metallösungen wurden zu verschiedenen Röhrchen zugegeben, um die folgenden Endkonzentrationen zu erhalten:
  • - Kontrollprobe
  • - 0,5 mM Cu
  • - 0,25 mM Cd
  • - 0,25 mM Co
  • - 0,5 mM Zn
  • - 0,25 mM Pb
  • - 0,25 mM Ni
  • - 100 ppm Biphenyl.
  • Die Messungen wurden in einem Luminometer mit 49 Zyklen alle 30 Minuten gemacht. Das Licht ist in mV ausgedrückt, und die höchsten erhaltenen Werte sind wiedergegeben.
  • Wenn die getesteten Röhrchen eines der folgenden Elemente: Cd, Co, Zn, Pb, Ni oder chloriertes Biphenyl enthalten, wird keine signifikante Biolumineszenz beobachtet.
    • 7b) AE984: Kupfer-Biosensor:
  • Bei einem zweiten Experiment wurde der Stamm AE984 über Nacht bei 30 C gezüchtet. Am nächsten Tag wurden Verdünnungen mit einer optischen Dichte von 0,1 gemacht.
  • Metallösungen wurden zu verschiedenen Röhrchen zugegeben, um die Endkonzentrationen 0,01; 0,1; 0,2 und 0,4 mM der folgenden Metalle zu erhalten:
  • - Kontrollprobe,
  • - Cu,
  • - Cd,
  • - Zn,
  • - Ni,
  • - Co,
  • - Cr,
  • - Mn,
  • - Ag,
  • - Hg,
  • - Tl.
  • Die Messungen wurden mit einem Lumac-Luminometer nach einer Inkubation von 18 Stunden bei 21 C gemacht. Das Licht wurde in Relativen Lichteinheiten (R. L. E.) ausgedrückt.
  • Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der Fig. 13 wiedergegeben.
    • 8) Konstruktion von Thallium-Biosensoren: AE1053, AE1060, AE1101:
  • Ein Tl-Sensor wurde durch Konjugation zwischen E. coli CM601 und A. eutrophus AE126 konstruiert.
  • Der Stamm AE126 kann durch Behandlung von CH34 mit Mitomycin C (5 ug/ml, 2 Tage Inkubation) erhalten werden, und er enthält nur das Plasmid pMOL28. Dieser Stamm ist empfindlich gegen Zn (getestet mit ZnCl&sub2;), und resistent gegen Ni (getestet mit NiCl&sub2;).
  • Nach Konjugation wurde die Selektion von Transkonjuganten auf Minimalmedium-Platten mit Gluconat als Kohlenstoff quelle und mit 20 ug/ml Tetracyclin ausgeführt, um AE126-Stämme, die das Transposon aufweisen, zu selektieren. Danach wurden die Transkonjuganten auf reichen Medien (Nährlösung) mit oder ohne Tl getestet, und mit einem Autoradiographie-Film auf den Petrischalen inkubiert. Die Stämme, die bei Anwesenheit von Tl Licht induzieren, wurden selektiert. Die besten Stämme wurden mit AE1053 und AE1060 bezeichnet, und sie waren hochspezifisch für Tl. Mit Co, Cs oder Cd wurde keine Lichtinduktion erhalten. Mit Ni und Hg konnte eine sehr geringe Induktion erhalten werden. Das Licht wurde durch unlösliche Verbindungen (z. B. Tl&sub2;S) und lösliche Verbindungen (z. B. TlNO&sub3;) induziert.
  • Das Licht-Transposon Tn4431 wurde in das A. eutrophus-Chromosom eingefügt, wie durch Hybridisierung des Transposons mit dem A. eutrophus-Chromosom und der Plasmid-DNA gezeigt werden konnte.
  • Der Stamm AE1053 wurde danach mit A5.3 (einem rifampycin-resistenten A5-Stamm) konjugiert, und die Selektion wurde auf Minimalplatten mit Rifampycin (100 ug/ml) und Tetracyclin (20 ug/ml) ausgeführt. Der sich ergebende Stamm war AE1101 und sandte ebenfalls Licht in Abhängigkeit von zunehmenden Tl-Konzentrationen aus.
  • Bei den drei Stämmen AE1053, AE1060 und AE1101 wurde durch Tl-Konzentrationen zwischen 0,005 mM und 0,02 mM bei Tl&sub2;S, und zwischen 0,01 mM und 0,04 mM bei TlNO&sub3; Licht induziert.
    • 9) Durch chlorierte chemische Verbindungen induzierbare, lichtaussendende Bakterien A5.23 und A5.24: Chlorierte Biphenyl-Biosensoren:
  • Es wurden zwei Kolonien erhalten, die bei Anwesenheit von Biphenyl in spezifischer Weise Licht aussenden.
  • Diese Stämme A5.23 und A5.24 behielten noch das Merkmal, daß sie Biphenyl als Kohlenstoffquelle verwenden.
  • Bei Anwesenheit von Biphenyl, einigen verwandten aromatischen Verbindungen, und Transformatorenöl (Askarel: vertrieben von der Firma ACEC, Belgien) lösen diese Stämme eine stark erhöhte Biolumineszenz aus (Fig. 7).
  • Die Zeitverzögerung vor der Zunahme der Biolumineszenz kann bei diesen Stämmen wesentlich verkürzt werden, wenn die Bakterien vorher den interessierenden Verbindungen ausgesetzt werden (Voranpassung, d. h., Vorinduktion gewisser Gene), wahrscheinlich weil die Voranpassung (mit dem später nachzuweisenden, spezifischen Metall oder der später nachzuweisenden, spezifischen xenobiotischen Verbindung) die Synthese gewisser spezifischer Genprodukte hervorruft, und verantwortlich für den Beginn von Zersetzungsmechanismen oder Resistenzmechanismen ist.
  • Dies wurde für den Biphenyl-Biosensor gezeigt (Fig. 8).
  • Biphenyl wurde in fester Form verwendet. Es wurde auch in einer Äthanollösung verwendet, wobei die Endkonzentration des in Äthanol (0,5% nach Volumen) aufgelösten Biphenyls zwischen ungefähr 10 und ungefähr 500 ppm lag.
  • Bei dem Stamm A5.23 kann auch induziert werden, daß er bei Anwesenheit einiger flüchtiger chlorierter aliphatischer Lösungsmittel (Di- und Trichloräthan) Licht erzeugt. Der gemeinsame Nenner bei diesen Verbindungen und den obenerwähnten aromatischen Inducern ist das Vorhandensein von Cl-Atomen in allen diesen Molekülen.
    • Fig. 1
  • BAKTERIELLE BIOLUMINESZENZ, INDUZIERT DURCH ZINK
  • BIOLUMINESZENZ-EINHEITEN STUNDEN
  • MITTELWERT ± S. F. M. (N = 3)
  • KONTROLLPROBE
  • 1 mM Zn&spplus;&spplus;
    • Fig. 2
  • ZINK-BIOSENSOR CM685
  • BIOLUMINESZENZ AUF AGARSCHEIBEN + 1 mM Zn&spplus;&spplus;
  • SIGNAL/RAUSCH-WERT STUNDEN
  • MITTELWERT ± S. F. M. (N = 3)
    • Fig. 3
  • KOBALT-INDUZIERTE BAKTERIELLE LUMINESZENZ AUF FESTEM AGAR
  • BIOLUMINESZENZ-EINHEITEN STUNDEN
  • MITTELWERT VON 5 DOPPELPROBEN
  • KONTROLLPROBE
  • 0,2 mM Co&spplus;&spplus;
  • 0,5 mM Co&spplus;&spplus;
  • 1 mm Co&spplus;&spplus;
    • Fig. 4
  • CHROMAT-INDUZIERTE BIOLUMINESZENZ AUF AGAR MIT MINIMALMEDIUM
  • BIOLUMINESZENZ (mV) ZUGEGEBENES CHROMAT
  • MITTELWERT ± S. F. M. (N = 4)
    • Fig. 5
  • SIGNAL/RAUSCH-VERHÄLTNISSE AE859, GEZÜCHTET AUF AGAR 869
  • S/R-VERHÄLTNIS ZUGEGEBENES CHROMAT (mM)
  • MITTELWERT ± S. F. M. (N = 3)
    • Fig. 6
  • KUPFER-BIOSENSOR Biolumineszenz auf Agar
  • BIOLUMINESZENZ (mV) KUPFERKONZENTRATION (ppm)
  • Mittlerer Peak (n = 15)
    • Fig. 7
  • LICHTINDUKTION DURCH CHLORIERTE AROMATISCHE SUBSTANZEN
  • BIOLUMINESZENZ-EINHEITEN (CPM) STUNDEN
  • KONTROLLPROBE
  • BIPHENYL
  • 4-CHLORBIPHENYL TRANSFORMATORENÖL
    • Fig. 8
  • ERHÖHTE BIOLUMINESZENZ DES STAMMS A5.23 NACH VORANPASSUNG AN BIPHENYL
  • BIOLUMINESZENZ-EINHEITEN (CPM) STUNDEN
  • MITTELWERT ± S. F. M.
  • BIPHENYL (N = 3)
  • KONTROLLPROBE (N = 2)
    • Fig. 9 Fig. 10 Fig. 11 Fig. 12
  • STAMM AE984 IN KULTUREN AUF 869 Tc 0,5 ml BEI 25,0 C
  • RELATIVE BIOLUMINESZENZ (mV/OD) KONTR
    • Fig. 13
  • Spezifizität des Cu-Sensors AE984
  • R. L. E. Getestete Metalle

Claims (1)

1. Fusioniertes Gen mit:
- einer aus dem Gen, bzw. aus Genen, von Alcaligenes eutrophus erhältlichen und entweder für Resistenz gegen ein oder mehrere Metalle oder für den Abbau einer oder mehrerer xenobiotischer Verbindungen codierenden Promotersequenz, wobei dieser Promoter in der Gegenwart des (der) Metalls (Metalle) oder der xenobiotischen Verbindung(en) oder beider induzierbar ist,
- sowie stromabwärts des Promoters einem fünf Gene umfassenden luxCDABE-Operon, wobei die Gene jeweils für eine Fettsäurereduktase, eine Acyltransferase, zwei.
Untereinheiten &alpha; und &beta; der Luciferase und einer Acylproteinsynthase codieren, wobei das lux-Operon unter der funktionsmäßigen Kontrolle des Alcaligenes eutrophus-Promoters steht.
2. Fusioniertes Gen nach Anspruch 1 mit der Codiersequenz des bzw. der für die Resistenz gegen ein oder mehrere Metall(e) oder für den Abbau einer oder mehrerer xenobiotischer Verbindung(en) verantwortlichen Gens (Gene), sowie dem induzierbaren Promoter.
3. Fusioniertes Gen nach Anspruch 2, wobei die Codiersequenz des bzw. der für die Metallresistenz verantwortlichen, oder für den Abbau einer xenobiotischen Verbindung codierenden, Gens (Gene) von Bakterien des Typs Alcaligenes eutrophus stammt.
4. Fusioniertes Gen nach einem der Ansprüche 1 oder 3, wobei sich das ein nachweisbares Signal produzierende Operon
- entweder stromabwärts des Promoters und stromaufwärts des für die Resistenz oder den Abbau codierenden Gens,
- oder stromabwärts des Promoters und stromabwärts des für die Resistenz oder den Abbau codierenden Gens,
- oder stromabwärts des Promoters und in dem für die Resistenz oder den Abbau codierenden Gen befindet,
5. Fusioniertes Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Promotersequenz aus A. eutrophus erhältlich ist, und zwar ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Stämme CH34 (ATCC 43123), SV661 (unter der Nr. 1-1046 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M, Institut Pasteur, 28 Rue du Docteur Roux 75015 PARIS, hinterlegt), AE453 (unter der Nr. 1-1049 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M, Institut Pasteur, 28 Rue du Docteur Roux 75015 PARIS, hinterlegt), DS185 ((unter der Nr. 1-1048 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M, Institut Pasteur, 28 Rue du Docteur Roux 75015 PARIS, hinterlegt), A5 ((unter der Nr. 1-1047 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M, Institut Pasteur, 28 Rue du Docteur Roux 75015 PARIS, hinterlegt), sowie DS310, der von DS185 durch Entfernen von pMOL80 aus DS185 (1-1048) erhalten wurde.
6. Fusioniertes Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem ein nachweisbares Signal produzierenden Operon um das aus Vibrio fischeri oder das aus Vibrio harveyi oder aus Photobacterium phosphoreum oder aus Xenorhabdus luminescens, vorzugsweise Vibrio fischeri, stammende luxCDABE-Operon handelt.
7. Fusioniertes Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei dem Promoter und bei dem für Resistenz codierenden Gen um einen bzw. ein aus mit SalI verdautem pBR325 erhältlichen Promoter bzw. erhältliches Gen für Zinkresistenz mit einem czc- Fragment von pMOL30 aus dem Alcaligenes eutrophus-Stamm CH34 und dem umgebenden EcoRI-Fragment handelt, und,
wobei sich Promoter und für Resistenz codierendes Gen an der multiplen Klonierungsstelle des Plasmids pUCD615 (in dem unter der Nr. 1-1050 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegten E.coli CM600) befinden, wobei das Plasmid das lux-Operon aus Vibrio fischeri enthält.
8. Fusioniertes Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei es sich bei dem Promoter und dem für Resistenz codierenden Gen um den bzw. das aus mit EcoRI-PstI verdautem pBR325 erhältlichen Promoter bzw. erhältliche Gen für Cobaltresistenz mit einem czc-Fragment von pMOL30 aus dem Alcaligenes eutrophus-Stamm CH34 handelt, wobei sich Promoter und für Resistenz codierendes Gen an der multiplen Klonierungsstelle des Plasmids pUCD615 (in dem unter der Nr. 1-1050 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris-, hinterlegten E.coli CM600) befinden, wobei das Plasmid das lux-Operon aus Vibrio fischeri enthält.
9. Rekombinanter Vektor, insbesondere zur Klonierung und/oder Expression, mit einer Vektorsequenz wie z. B. einer eines Plasmids, Kosmids oder Phagen und einem fusionierten Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einer der für die Replikation dieses rekombinanten Vek-tors nicht unbedingt erforderlichen Stellen.
10. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 9, enthaltend, in einer der für dessen Replikation nicht unbedingt erforderlichen Stellen, notwendige Elemente für die Förderung der Transkription und Translation des ein nachweisbares Signal produzierenden Gens sowie Transkription und Translation des für Metallresistenz oder für den Abbau einer xenobiotischen Verbindung verantwortlichen Gens in einer Wirtszelle, sowie zusätzlich zu dem induzierbaren Promoter gegebenenfalls eine Signalsequenz.
11. Wirtszelle, insbesondere E.coli, transformiert mit einem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 9 oder 30, oder Alcaligenes eutrophus, transkonjugiert mit einem rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 9 oder 10, mit den die Expression des ein nachweisbares Signal produzierenden Gens und die Expression des für Metallresistenz codierenden Gens oder des für den Abbau einer xenobiotischen Verbindung codierenden Gens gestattenden Regulationselementen.
12. Verfahren zur in-vitro-Herstellung einer Wirtszelle mit einem Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem man:
- einen aus einem Gen bzw. mehreren Genen von Alcaligenes eutrophus erhältlichen Promoter und das für Resistenz gegen ein oder mehrere Schwermetalle oder für den Abbau einer oder mehrerer xenobiotischer Verbindungen codierende Gen bestimmt und das entsprechende Nukleinsäurefragment dieses Promoters und dieses Gens isoliert, wobei der Promoter und das Gen gegebenenfalls einen Marker für Vorhandensein des Gens enthalten,
- das Nukleinsäurefragment mit dem luxCDABE- Operon, dessen eigener Promoter deletiert wurde, fusioniert, wobei das signalproduzierende Gen einen Marker für das Vorhandensein des Gens enthält,
- das Produkt dieser Fusion in eine Wirtszelle wie z. B. E.coli einführt,
- gegebenenfalls die auf ein Medium, auf dem man den bzw. die gegebenenfalls vorhandenen Marker nachweisen kann, gegebene Wirtszelle mit dem bzw. den Markern selektiert,
- die auf ein geeignetes Medium, das ein oder mehrere Metalle oder eine xenobiotische Verbindung enthält, gegebenen lichtproduzierenden Wirtszellen nachweist.
13. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung einer Wirtszelle, die in der Gegenwart von Zink Licht abgibt, bei dem:
- der Promoter und das für Resistenz codierende Gen ein aus mit SalI verdautem pBR325 erhältlicher Promoter bzw. erhältliches Gen für Zinkresistenz mit dem czc-Fragment von pMOL30 aus dem Alcaligenes eutrophus- Stamm CH34 und dem umgebenden EcoRI-Fragment sind,
- das Verdauprodukt in das Plasmid pUCD615 (in dem unter der Nr. 1-1050 am 28. Februar 3991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegten E.coli CM600), das das lux-Operon aus Vibrio fischeri enthält, an dessen multipler Klonierstelle insertiert wird,
- das Produkt dieser Insertion in E.coli kloniert wird,
- auf Ampicillinplatten mit verschiedenen Zinkkonzentrationen selektiert wird und
- die in der Gegenwart von Zink Licht produzierenden E.coli nachgewiesen werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung einer Wirtszelle, die in der Gegenwart von Cobalt Licht abgibt, bei dem:
- der Promoter und das für Resistenz codierende Gen der bzw. das aus mit EcoRI-PstI verdautem pBR325 erhältliche Promoter bzw. Gen für Cobaltresistenz mit dem czc-Fragment von pMOL30 aus dem Alcaligenes eutrophus-Stamm CH34 sind,
- das Verdauprodukt, in das Plasmid pUCD615 (in dem unter der Nr. 1-1050 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegten E.coli CM600), das das lux-Operon aus Vibrio fischeri enthält, an dessen multipler Klonierstelle insertiert wird,
- das Produkt dieser Insertion in E.coli kloniert wird,
- auf Ampicillinplatten mit verschiedenen Cobaltkonzentrationen selektiert wird und
- die in der Gegenwart von Cobalt Licht produzierenden E.coli nachgewiesen werden.
15. Biosensorenbildende Transkonjuganten, die in der Gegenwart von Metallen oder Xenobiotika Licht abgeben, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Konjugation von Alcaligenes eutrophus und E.coli erhalten werden, wobei:
- Alcaligenes eutrophus ein für Metallresistenz oder für den Abbau einer xonobiotischen Vorbindung codierendes Gen enthält, sowie gegebenenfalls einen Marker für das Vorhandensein des Gens, und
- E. coli ein Transposon mit dem luxCDABE-Operon aus Vibrio fischeri ohne dessen eigenen Promoter sowie gegebenenfalls einen Marker für das Vorhandensein dieses Gens enthält.
36. Biosensorenbildende Transkonjuganten nach Anspruch 15, wobei:
- E.coli den Vektor pUCD623 enthält, der wiederum ein Transposon Tn4431 enthält, welches das Transposon Tn1721 ist, das die Tetracyclinresistenz und das lux- Operon aus Vibrio fischeri ohne dessen eigenen Promoter enthält.
17. Biosensorenbildende Transkonjuganten nach den Ansprüchen 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem ein für Chromresistenz codierendes Gen enthaltenden Alcaligenes eutrophus um Alcaligenes eutrophus SV661 handelt (unter der Nr. I-1046 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt) und daß es sich bei der das Transposon enthaltenden Wirtszelle um E.coli-Stamm CM601 handelt (unter der Nr. I-1051 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Ruo du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), durch den man AE714 erhält, übertragen in A5.3, bei dem es sich um eine Rifampicinmutante des biphenylabbauenden Stammes A5 (I-1047) handelt, durch den man AE859 erhält, der bei Vorhandensein von Chrom Licht exprimiert.
18. Biosensorenbildende Transkonjuganten nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem ein für Nickelresistenz codierendes Gen enthaltenden Alcaligenes eutrophus um Alcaligenes- eutro-phus AE453 (Nr. I-1049) handelt und daß es sich bei der das Transposon enthaltenden Wirtszelle um E.coli-Stamm CM601 handelt (unter der Nr. I-1051 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), durch den man AE631 erhält, übertragen in A5.3, bei dem es sich um eine Rifampicinmutante des biphenylabbauenden Stammes A5 (Nr. I-1047) ist, durch den man AE891 erhält, der bei Vorhandensein von Nickel Licht exprimiert.
19. Biosensorenbildende Transkonjuganten nach den Ansprüchen 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem ein für Kupferresistenz codierendes Gen enthaltenden Alcaligenes eutrophus um Alcaligenes eutrophus DS185 handelt (unter der Nr. I-1048 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt) und daß es sich bei der das Transposon enthaltenden Wirtszelle um E.coli-Stamm CM601 handelt (unter der Nr. I-1051 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), durch den man AE866 erhält, der bei Vorhandensein von Kupfer Licht exprimiert.
20. Biosensorenbildende Transkonjuganten nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den ein für Kupferresistenz codierendes Gen enthaltenden Alcaligenes eutrophus um Alcaligenes eutrophus DS310 handelt, das von DS185 durch Entfernen von pMOL80 aus DS185 (I-1048) erhalten wurde, und daß es sich bei der das Transposon enthaltenden Wirtszelle um E.coli-Stamm CM601 handelt (unter der Nr. I-1051 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), durch den man AE890 erhält, bei Vorhandensein von Kupfer Licht exprimiert und nicht zu Wachstum auf bleihaltigen Minimalplatten befähigt ist.
21. Biosensorenbildende Transkonjuganten nach Anspruch 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem ein für den Abbau von Biphenylverbindungen codierendes Gen enthaltenden Alcaligenes eutrophus um Alcaligenes eutrophus A5 handelt (unter der Nr. I-1047 am 28. Februar 1993 bei der C.N.C.M, Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt) und bei der das Transposon enthaltenden Wirtszelle um E.coli-Stamm CM601 handelt (unter der Nr. I-1051 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M, Institut Pasteur, 28 Rue, Dr Roux du 75015 Paris, hinterlegt), durch den man A5.23 oder A5. 24. erhält, welche bei Vorhandensein von Biphenylverbindungen Licht exprimieren.
22. Verfahren zur in-vivo-Produktion von Transkonjuganten nach Ansprüchen 15 bis 21 mit den folgenden Schritten:
- zwecks Erhalt von Transkonjunganten, Konjugation einer aus Alcaligenes eutrophus erhältlichen Wirtszelle mit einem für Metallresistenz oder für den Abbau einer xenobiotischen Verbindung codierenden Gen sowie gegebenenfalls einem Marker für das Vorhandensein dieses Gens und einer weiteren Wirtszelle mit einem Transposon mit dem luxCDABE-Operon ohne dessen eigenen Promoter, sowie gegebenenfalls einem Marker für das Vorhandensein dieses Gens,
- Gewinnung der Transkonjuganten,
- gegebenenfalls Selektion von in ein Medium, in dem der (die) Marker nachgewiesen werden kann (können), gegebenen Transkonjuganten mit dem Marker bzw. den Markern,
- gegebenenfalls Auftragen von Transkonjuganten auf Medien mit unterschiedlichen Metall- oder Xenobiotikakonzentrationen, und
- Selektion von Transkonjuganten, die bei Vorhandensein eines ein Metall oder eine xenobiotische Verbindung enthaltenden Mediums Licht abgeben.
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei es sich bei der Wirtszelle um Alcaligenes eutrophus und bei der ein Transposon enthaltenden Wirtszelle um E.coli mit dem Vektor pUCD623 handelt, der wiederum ein Transposon Tn4431 enthält, welches das die Tetracyclinresistenz und das lux-Operon aus Vibrio fischeri ohne dessen Promoter enthaltende Transposon Tn1721 ist,
- die erhaltenen Transkonjuganten auf Tetracyclinplatten selektiert werden,
- die Transkonjuganten auf Medien mit unterschiedlichen Metallkonzentrationen repliziert werden und
- die lichtproduzierenden Transkonjuganten nachgewiesen werden.
24. Verfahren nach Anspruch 23 zur Herstellung einer Wirtszelle, die bei Vorhandensein von Chrom Licht abgibt, wobei es sich bei der den Promoter und das Metallresistenzgen enthaltenden Wirtszelle um Alcaligenes eutrophus SV661 handelt (unter der Nr. I- 1046 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt) und bei der das Transposon enthaltenden Wirtszelle um E.coli-Stamm CM601 handelt (unter der Nr. I-1051 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M, Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), durch den man AE714 erhält, übertragen in A5.3, welcher eine Rifampicinmutante des biphenylabbauenden Stamms A5 (I- 1047) ist, wodurch man AB859 erhält, der bei Vorhandensein von Chrom Licht exprimiert.
25. Verfahren nach Anspruch 23 zur Herstellung einer Wirtszelle, die bei Vorhandensein von Nickel Licht abgibt, wobei es sich bei der den Promoter und das Metallresistenzgen enthaltenden Wirtszelle um Alcaligenes eutrophus AE631 und bei der das Transposon enthaltenden Wirtszelle um E.coli-Stamm CM601 handelt (unter der Nr. I-1051 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), durch den man AE453 erhält (unter der Nr. I-1049 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), übertragen in A5.3, bei dem es sich um eine Rifampicinmutante des biphenylabbauenden Stamms A5 handelt (I-1047), wodurch man AE891 erhält, der bei Vorhandensein von Nickel Licht exprimiert.
26. Verfahren nach Anspruch 23 zur Herstellung einer Wirtszelle, die bei Vorhandensein von Kupfer Licht abgibt, wobei es sich bei der den Promoter und das Metallresistenzgen enthaltenden Wirtszelle um Alcaligenes eutrophus DS185 handelt (unter der Nr. I- 1040 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), und bei der das Transposon enthaltenden Wirtszelle um E.coli-Stamm CM601 handelt (unter der Nr. I-1053 am 28. Februar 1993 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), durch den man AE866 erhält, der bei Vorhandensein von Kupfer Licht exprimiert.
27. Verfahren nach Anspruch 23 zur Herstellung einer Wirtszelle, die bei Vorhandensein von Kupfer Licht emittiert, wobei es sich bei der den Promoter und das Metallresistenzgen enthaltenden Wirtszelle um Alcaligenes eutrophus DS310 und bei der das Transposon enthaltenden Wirtszelle um den E.coli-Stamm CM601 handelt (unter der Nr. I-1051 am 28, Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), durch den man AE890 erhält, welcher bei Vorhandensein von Kupfer Licht exprimiert und nicht zu Wachstum auf bleihaltigen Minimalplatten befähigt ist.
28. Verfahren nach Anspruch 23 zur Herstellung einer Wirtszelle, die bei Vorhandensein von Biphenyl Licht emittiert, wobei es sich bei der den Promoter und das für den Abbau von Biphenylverbindungen codierende Gen enthaltenden Wirtszelle um Alcaligenes eutrophus A5 handelt (unter der Nr. I-1047 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), und bei der das Transposon enthaltenden Wirtszelle um E.coli-Stamm CM601 handelt (unter der Nr. I-1051 am 28. Februar 1991 bei der C.N.C.M., Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, hinterlegt), durch den man A5.23 oder A5.24 erhält, welche bei Vorhandensein von Biphenylverbindungen Licht exprimieren.
29. Verfahren zum Nachweis eines Metalls oder einer xenobiotischen Verbindung in einem flüssigen Medium, vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von ca. 1 bis ca. 120 ppm, bei dem man:
- eine lyophilisierte und auf einem festen Träger immobilisierte Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 oder 15 bis 21 in ein Kulturmedium bringt,
- eine Probe eines flüssigen Mediums, in dem das Vorhandensein eines Metalls oder einer xenobiotischen Verbindung nachzuweisen ist, mit einer Probe dieses flüssigen Kulturmediums, das eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 oder 15 bis 21 enthält, versetzt, und
- das Signal, zum Beispiel das durch das Vorhandensein des Metalls oder das Vorhandensein der xenobiotischen Verbindung erzeugte Licht, durch ein Nachweismittel wie z. B. ein Luminometer nachweist.
30. Besteck zum Nachweisen eines Metalls oder einer xenobiotischen Verbindung in einem Konzentrationsbereich von lediglich 0,1 ppm im Fall von Metall und von lediglich 1 ppb im Fall von Xenobiotika mit:
- einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 oder 15 bis 21 und
- einem Nachweismittel, zum Beispiel für den Nachweis des durch das Vorhandensein des Metalls oder der xenobiotischen Verbindung produzierten Lichts, wie z. B. ein Luminometer.
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