KR20020041603A

KR20020041603A - 발광유전자 ｌｕｘＣＤＡＢＥ를 포함하는 재조합플라스미드, 이 플라스미드에 의해 형질 전환된 대장균ＳＢ０１(ＫＦＣＣ１１１７６) 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20020041603A
Application number: KR1020000071267A
Authority: KR
Inventors: 신평균; 배희경; 오현주; 송방호
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2002-06-03

Abstract

본 발명은 발광유전자 luxCDABE를 포함하는 재조합 플라스미드, 이 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 SB01 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 육지발광미생물 포토하버드스 루미네슨스(Photorhabdus luminescens)의 발광유전자(luxCDABE)가 삽입된 미니(mini)-F pKLJ12를 포함하는 재조합 플라스미드 pBS1, 이 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 SB01(KFCC 11176)을 제공하며, 이렇게 형질전환된 대장균 SB01이 600 세대(25 일)까지 항생제가 첨가되지 않은 배지상에서 안정된 플라스미드 유지를 보여 플라스미드의 안정성과 발광유전자를 이용해 독성탐지용 연속배양 장치에서의 미생물원으로 이용이 가능하고, 시판중인 발광미생물 킷(kit)의 수입 대체로 인한 경제적인 효과도 나타내는 발광유전자 luxCDABE를 포함하는 재조합 플라스미드, 이 플라스미드에 의해 형질 전환된 대장균 SB01 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

발광유전자 ｌｕｘＣＤＡＢＥ를 포함하는 재조합 플라스미드, 이 플라스미드에 의해 형질 전환된 대장균 ＳＢ０１(ＫＦＣＣ１１１７６) 및 이의 용도{Use of plasmid containing luxCDABE and recombinant E. coli SB01 which was transformed by this plasmid}

반딧불의 불빛과 같은 자연적 생물발광현상(Bioluminescence)은 루시퍼라아제(luciferase)라는 효소와 에너지를 많이 지닌 루시페린(luciferin)이라는 화학물질이 반응하여 빛을 내는 현상이다. 이와 유사하게 미생물 중에서 빛을 발산하는 종들이 있는데 주로 해상에 존재하며 크게 나누어 포토박테리움(Photobacterium)종과 비브리오(Vibrio)종이 있다. 이밖에 민물에 사는 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)와 육지에 사는 포토하버드스 루미네슨스가 있다[Baumann et al., 1983]. 미생물의 발광반응은 세포간 루시퍼라제(intracellular luciferase)의 촉매반응, FMNH2(flavin mononucleotide reduced form)의 산화, 도데칸알(dodecanal)과 같은 긴 사슬 방향족 알데히드(long-chain aliphatic aldehyde) 및 산소가 필요하며, lux 유전자 카셋(gene cassette)은 5개의 유전자(luxCDABE)로 구성되고 그 크기는 약 7 Kb의 DNA이며, 박테리아 루시퍼라제(bacterial luciferase)는 헤테로다이머 효소(heterodimeric enzyme)로 서브유닛(subunit) α(≒40 kDa), β(≒37 kDa)로 구성되며, luxA, luxB 유전자에 의해 각각 코드(code)되고, luxCDE는 알데히드 기질(aldehyde substrate)를 만드는데 필요한 지방산 환원효소 복합체(fatty acid reductase complex)를 인코드(encode)한다.

상기 미생물 발광 유전자는 여러 가지 측면에서 이용되는데 처음 발광유전자를 이용한 것은 1966년 포토박테리엄 피쉐리(Photobacterium fischeri)를 한천(agar)에서 24시간 배양하여 우주선 내의 유독가스를 탐지하는데 이용되었는데[Sie et al., 1966], 공해물질, 폭발물, 토양과 물에 있는 화학물질을 측정하기 위한 생물발광성 리포터(Bioluminescent biorepoter)로 폭발물이나 공해물질과 같은 목표물질이 존재하면 미생물은 눈으로 볼 수 있는 청록색의 빛을 내게 된다. 상기 기술은 의학분야에서도 유전자 치료법을 모니터링하거나에이즈(AIDS)를 포함하는 여러 감염 질병의 과정을 관찰, 동물이나 식물이 자랄 때의 유전자 발현을 연구하는데 이용되어 살아있는 생물체의 유전자 조절 과정을 눈으로 볼 수 있는 강력한 연구 수단이 될 수 있다. 현재 발광 미생물은 상업적으로 이용되고 있고, 1981년 마이크로톡스(Microtox)라는 시스템으로 시판되어 1993년 스위스에서 침출과정을 통해 실제 오염도 측정에 응용되었으며, 1994년 스페인에서도 강물의 오염도 측정에 이용하였다.

상기 마이크로톡스 분석법(Microtox assay)은 발광 미생물인 포토박테리움 포스포리움(Photobacterium phosphoreum)을 이용하는데, 빛 생성은 세포의 대사활동을 반영한 것으로 화학물질의 저해 또는 방해로 빛 생성이 감소하게 된다. 그러나 마이크로톡스 분석법의 경우 해양 미생물에 맞는 낮은 온도(15 ℃)와 높은 염화나트륨 농도를 유지시켜야 하는 단점이 있다[Patrick and Dubow, 1998]. 그리고 이러한 단점을 보안하기 위해 연구된 문헌상에서는 재조합 대장균의 경우 luxAB 유전자만을 재조합하였기 때문에 n-데칸알(decanal)과 같은 고가의 기질을 적정 농도 첨가해야 하는 번거러움이 있고, 특정 독성물질에 대해서만 민감한 유전자를 lux 유전자와 접합시킴으로써 독성물질의 종류에 대한 한계성을 나타내었다.

상업적 용도에 의하여 이종의 유전자의 세균 발현에 관한 플라스미드 벡터의 개발이 광범위하게 연구되어 왔고, 클로닝 운반자로서 대장균 및 다른 세균에서 단백질의 생산을 위해 사용되어 왔다. 외래 단백질의 발현에 적당한 클로닝 운반자의 개발에 있어서, 통상의 전략은 다수 또는 조절된 복사수를 갖는 저분자량 플라스미드를 고안하는 것이었는데 이들 전략은 때때로 안정한 플라스미드를 유전될분배기능의 제거를 초래했고, 생산 미생물의 구성을 위한 다수 복사 클로닝 벡터는 종종 불안정성을 나타내었다.

플라스미드의 안정성은 실제 재조합 DNA 기술의 발효산업에의 이용성에서 매우 중요하다. 왜냐하면 플라스미드가 가장 중요한 유전자 조작된 미생물 부분을 포함하는 공정의 핵심 구성요소이기 때문이다. 미생물 배양에서 재조합 플라스미드의 불안정성은 발효 중 필요로 하는 생산물의 전체적인 수준을 떨어뜨리고, 단백질 활성에 좋지 않은 영향을 주고, 비생산성 세포의 영양분 소비로 인한 생산 단가를 높이기도 하는데, 이는 플라스미드를 가지고 있지 않은 세포의 비증식 속도가 상대적으로 크기 때문이다. 안정한 플라스미드의 복제 및 유전을 얻기 위한 가장 일반적인 전략은 클로닝 운반 벡터상에 내약품성 결정인자를 포함시키는 것이다. 증식배지에 약품 첨가는 플라스미드 함유 세포의 선택을 가능케 하지만 항생물질의 첨가는 비용 및 최종생성물이 오염될 수 있어 많은 경우에 이용할 수 없다.

현재 대한민국 특허공보 제 99-69400 호에 공지된 독성탐지 연속 배양장치에서도 플라스미드의 안정성을 위해 항생제가 첨가된 배지를 이용하여 100 시간 정도의 운전만이 최대인 것으로 나타나있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 육지발광미생물 포토하버드스 루미네슨스(Photorhabdus luminescens)의발광유전자(luxCDABE)가 삽입된 미니-F pKLJ12를 포함하는 재조합 플라스미드 pBS1 및 이 플라스미드에 의해 형질 전환된 대장균 SB01(KFCC 11176)을 이용하여 의학 및 환경 분야에서 유전자 조절 기작 탐색을 위한 다각적인 응용이 가능하고, 이렇게 형질전환된 대장균은 600 세대(25일)까지 항생제가 첨가되지 않은 배지상에서 안정된 플라스미드 유지를 보여, 플라스미드의 안정성과 발광유전자를 이용해서 독성탐지용 연속배양 장치에서의 미생물원으로 이용될 수 있음을 알게 됨으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 발광유전자 luxCDABE를 포함하는 재조합 플라스미드, 이 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 SB01(KFCC 11176)을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 대장균 SB01(KFCC 11176)의 용도를 제공하는데 또다른 목적이 있다.

도 1은 불안정한 다중 복사 벡터인 pACYC184에 발광유전자 luxCDABE가 클로닝된 재조합 플라스미드 pSB311의 구성을 나타낸다.

도 2는 불안정한 다중 복사 벡터인 pACYC184에 삽입된 발광유전자 luxCDABE를 제한효소EcoRI으로 절단하여 얻은 6.9 Kb 단편을 안정한 미니-F 플라스미드인 pKLJ12에 삽입한 재조합 플라스미드 pBS1의 구성을 나타낸다.

도 3은 본 발명에 따른 형질전환된 대장균 SB01을 항생제 암피실린(Ampicillin)이 첨가되지 않은 배지상에서 배양하는 동안 성장에 따른 생물학적 빛 발산정도와 플라스미드의 안정성을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 대조구로 형질전환된 대장균 DH5α/pSB311를 항생제 암피실린(Ampicillin)이 첨가되지 않은 배지상에서 배양하는 동안 성장에 따른 생물학적 빛 발산정도와 플라스미드의 안정성을 나타낸 것이다.

도 5는 재조합 대장균 SB01(DH5α/pBS1)과 대조구 대장균 DH5α/pSB311를 25㎖ 반응기에서 연속 배양하면서 성장에 따른 생물학적 빛 발산정도와 플라스미드의 안정성을 나타낸 것이다.

본 발명은 발광유전자 luxCDABE를 포함하는 재조합 플라스미드, 이 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 SB01(KFCC 11176)와 이의 용도를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 불안정한 다중 복사 벡터인 pACYC184에 삽입된 육지발광미생물 포토하버드스 루미네슨스의 발광유전자 luxCDABE를 제한효소EcoRI으로 절단하여 얻은 6.9 Kb 단편을 안정한 미니-F 플라스미드인 pKLJ12에 삽입한 재조합 플라스미드를 pBS1라 명명하였다.

상기 재조합 플라스미드 pBS1를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 대장균 SB01(DH5α/pBS1)은 한국 종균협회(KCCM)에 수탁번호 KFCC 11176으로 2000 년 6 월 7 일자로 기탁하였다.

또한, 상기 형질전환된 대장균 SB01(KFCC 11176)을 항생제 암피실린(Ampicillin)이 첨가되지 않은 배지상에서 배양하는 동안 성장에 따른 생물학적 빛 발산정도와 플라스미드의 안정성을 실험한 결과, 600 세대(25일)까지 안정된 플라스미드 유지를 보여주었다.

따라서, 상기 플라스미드의 안정성과 발광유전자를 이용하여 독성탐지용 연속배양 장치에서의 미생물원으로 상기 대장균 SB01이 가능하며, 시판중인 발광미생물 킷(kit)의 수입 대체효과로 인한 경제성도 제공한다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본

발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합 플라스미드 pBS1의 제작

육지발광미생물 포토하버드스 루미네슨스의 발광유전자 luxCDABE를 제한효소 EcoRI으로 절단하여 얻은 6.9 Kb 단편을 안정한 미니-F 플라스미드인 pKLJ12[Kristala L.J. 1998]에 삽입한 재조합 플라스미드를 pBS1라 명명하였다. 미니-F 플라스미드 pKLJ12는 미국 버클리 대학(UC Berkeley)의 크리스텔라 존스박사(Kristala L. Jones)로부터 분양받았으며, 이 플라스미드는β-락타마제(β-lactamase),rrnB 전사 종결암호(transcription terminator),araC 유전자(gene), 프로모터 P_BAD와 멀티-클로닝 사이트(multi-cloning site)[NheI,EcoRI,SalI,SphI]를 가지고 있고 그 크기는 12.4 kb이다.

상기 재조합 플라스미드 pBS1를 대장균 DH5α에 형질전환하였다.

형질전환된 대장균 SB01(DH5α/pBS1)은 한국종균협회에 수탁번호 KFCC 11176으로 2000 년 6 월 7 일자로 기탁하였다.

실시예 2: 대장균 SB01(DH5 α /pBS1)의 생물학적 빛 발산정도와 플라스미드의 안정성

5㎖ LB(Luria-Bertani ; 트립톤 10 g/L, 효모추출액 5 g/L, 염화나트륨 5g/L)배지에 재조합 대장균 SB01의 콜로니를 접종하여 37℃배양기에서 180 rpm 속도로 배양하여 매 24시간 간격으로 새로운 LB 배지에 2% 재접종하여 배양하여 25일간 연속배양하고, 그 배양액을 유브이 광도계(UV Spectrophotometer)의 660 nm의 파장에서 광도(Optical Density)를 측정하고, 발산하는 생물학적 빛은 생리 식염수에 희석하여 루미노미터(Luminometer)[Berthold GmbH & Co. KG]로 측정하였는데 생물학적 빛의 단위는 RLU(Relative Light Unit)로 1분 당 1 ㎖의 시료에서 발생하는 빛의 양을 mV로 나타낸 것이다. 그리고 생균수 측정은 평판도말법을 이용하여 적절한 수의 콜로니를 얻기 위해 각 시료를 10 배율로 생리 식염수에 희석하여 PCA(Plate Count Agar)배지에 도말하여 37℃에서 24 ∼ 36시간 동안 배양 한 후 형성된 콜로니 수를 세었다.

플라스미드 안정화 실험은 밤새 배양한 배양액을 접종액으로 하여 초기의 세포 수와 대수 증식기까지 6시간 배양하고 난 후의 세포 수를 세어 1 세대의 시간을 계산 한 후, 항생제가 첨가되지 않은 LB 액체 배지에서 24 세대 배양한 후 LB 고체 배지에서 배양하여 이것을 항생제 첨가 배지에서 레플리카(Replica)하여 자라는 콜로니 수를 세어 600 세대까지 배양한 후 플라스미드 안정성 정도를 확인하였다.

대장균의 1 세대간의 배양시간은 일반적으로 20분으로 알려져 있지만, 배양조건에 따라 영향을 받으므로 본 실험에서는 37℃, 150 ∼ 180 rpm, LB 배지에서 배양한 결과 1시간 정도로 계산되었다. 그 결과, 본 발명의 재조합 대장균 SB01은 항생제가 첨가되지 않은 배지에서 600 세대 25일까지 배양하는 동안 플라스미드는 100%의 안정성을 보이고, 발광량은 50 세대 이후 한 자릿수 떨어진 후 그 값이 그대로 유지되는 현상을 보였다. 유전자 조작으로 제작된 재조합 대장균 SB01은 600 세대 25일 이상 플라스미드 및 발광량의 안정성을 보여 줌으로써 연속배양장치에서의 이용이 적합함을 확인할 수 있었다[도 3].

비교예 : 대장균 DH5 α /pSB311의 생물학적 빛 발산정도와 플라스미드의 안정성

육지발광미생물 포토하버드스 루미네슨스의 발광유전자 luxCDABE 6.9 Kb 단편이 플라스미드 pACYC184의 EcoRI 제한효소에 삽입된 재조합 플라스미드를 pSB311을 영국 노팅검(Nottingham) 대학의 크리스틴(Christine)교수님으로부터 분양받았다.

상기 재조합 플라스미드 pSB311를 대장균 DH5α에 형질전환하였다.

형질전환된 대장균 DH5α/pSB311를 상기 실시예 2와 같은 방법으로 생물학적 발산정도와 플라스미드의 안정성을 측정하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 50 세대까지는 안정성을 보이다 그 이후 급격히 떨어져 72 세대에서는 67%, 96세대에서는 5.7%로 100 세대에서는 거의 0%에 가까운 플라스미드를 함유한 것으로 나타나고, 발광량도 플라스미드의 안정성과 비례적으로 100 세대이후 발광량은 사라졌다. 이것은 기존 발표된 문헌상에서 다중 복사 플라스미드의 경우와 유사한 경우인 것으로 확인되었다.

실시예 3: 대장균 SB01를 독성탐지용 연속배양장치에 이용

독성물질을 탐지하기 위한 연속배양에 있어 운전 부피는 25 ㎖인 반응기 내에 항생제를 첨가하지 않은 상태에서 생물 반응기내의 영양배지(LB 배지) 유입속도를 운전부피로 나눈 희석속도를 0.5/hr로 일정하게 유지한 후 시료를 채취하여 배양액을 유브이 광도계(UV Spectrophotometer)의 660 nm의 파장에서 광도(Optical Density)를 측정하고, 발산하는 생물학적 빛은 생리 식염수에 희석하여 루미노미터(Luminometer)로 측정하였는데 생물학적 빛의 단위는 RLU(Relative Light Unit)로 1분 당 1 ㎖의 시료에서 발생하는 빛의 양을 mV로 나타낸 것이다. 272 세대까지 배양한 결과 10³∼ 10⁴정도의 발광량이 유지되는 것을 확인할 수 있었다[도 5].

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 의학 및 환경 분야에서 응용이 가능한 육지발광미생물 포토하버드스 루미네슨스(Photorhabdus luminescens)의 발광유전자(luxCDABE)가 삽입된 미니-F pKLJ12를 포함하는 재조합 플라스미드 pBS1, 이 플라스미드에 의해 형질 전환된 대장균 SB01(KFCC 11176)이며, 상기 대장균 SB01은 600 세대(25일)까지 항생제가 첨가되지 않은 배지상에서 안정된 플라스미드 유지를 보여 플라스미드의 안정성과 발광유전자를 이용해 독성탐지용 연속배양 장치에서의 미생물원의 이용이 가능하고, 시판중인 발광미생물 킷(kit)의 수입 대체 효과로 인한 경제성도 제공한다.

Claims

포토하버드스 루미네슨스(Photorhabdus luminescens)의 발광유전자 luxCDABE를 삽입한 pKLJ12 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드 pBS1.
상기 청구항 1의 재조합 플라스미드 pBS1을 대장균 DH5α에 형질전환시킨 것을 특징으로 하는 대장균 SB01(KFCC 11176).
항생제가 첨가되지 않은 배지상에서의 배양방법에 있어서, 상기 청구항 2의 형질전환된 대장균 SB01(KFCC 11176)을 이용하는 것을 특징으로 하는 대장균 SB01(KFCC 11176)의 배양방법.
독성탐지방법에 있어서, 상기 청구항 2의 형질전환된 대장균 SB01(KFCC 11176)을 독성탐지용 연속배양장치에 이용하는 것을 특징으로 하는 대장균SB01(KFCC 11176)의 독성탐지방법.