DE69310207T3

DE69310207T3 - Methode zum Nachweis von unweltbedingten Vergehen

Info

Publication number: DE69310207T3
Application number: DE69310207T
Authority: DE
Inventors: Robert Larossa; William Majarian; Tina Van Dyk
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1992-12-04
Filing date: 1993-12-02
Publication date: 2001-11-15
Anticipated expiration: 2013-12-03
Also published as: US5683868A; ES2102811T3; IL107815A; AU5730494A; ATE152181T1; WO1994013831A1; DE69310207T2; EP0673439B2; EP0673439B1; IL139794A0; IL107815A0; KR100262681B1; CA2150232A1; EP0673439A1; CA2150232C; KR950704511A; DE69310207D1; ES2102811T5; JPH08504101A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf den Nachweis von Umweltbelastungsfaktoren, die in einem Ausmaß unterhalb des Ausmaßes vorhanden sind, das zur Beeinträchtigung des Zellstoffwechsels notwendig ist. Insbesondere stellt die Erfindung einen transformierten bakteriellen Wirt bereit, der ein DNA-Konstrukt enthält, das einen streßinduzierbaren Promotor umfaßt, der operabel mit einem Reportergen oder -genkomplex verbunden ist, so daß die Gegenwart eines Umweltbelastungsfaktors die Expression der Reportergene induziert. Bevorzugte Reportergene sind solche, die für bakterielle Biolumineszenz verantwortlich sind.

Hintergrund

Wachsendes Interesse der Öffentlichkeit und zunehmende gesetzliche Vorschriften haben die Entwicklung von Umweltsensorsystemen, mit denen sich Verunreinigungen in Boden und Grundwasser nachweisen lassen, vorangetrieben. Hochempfindliche und spezifische Nachweissysteme, die Analysemethoden wie Gaschromatographie und Massenspektrophotometrie umfassen, sind seit mehreren Jahren bekannt; diese Systeme erfordern jedoch eine teure Ausrüstung und geschultes Bedienungspersonal. Außerdem ist die Probenvorbereitung und Datenanalyse häufig mühsam und zeitaufwendig. Toxizitätsassays, bei denen lebende Organismen wie Daphnia beteiligt sind und die im Standard-US-Wassertoxizitätstest verwendet werden, sind einfacher; diese Tests sind jedoch unspezifisch und nicht besonders schnell. Etwas schneller sind auf Zellen beruhende Toxizitätsassays, die eine Bakterienzelle als Sensorelement beinhalten. Diese Systeme verwenden Bakterienzellen als Reagentien in einem herkömmlichen automatisierten Analysesystem. Das RODTOX-System (Central Kagaku, Tokyo, Japan) ist zum Beispiel ein Chargenassay, der den bakteriellen Sauerstoffverbrauch mißt, und wurde zur Verwendung in Kläranlagen entworfen. Weitere auf Bakterien beruhende Systeme, wie das GBI-TOXIYLARM-System (Genossenschaft Berliner Ingenieurkollektive, Berlin, Deutschland), können die Anwesenheit spezieller Chemikalien messen. Es ist bekannt, daß das GBI-TOXALARM-System die Anwesenheit von nur 0,1 ppm Kaliumcyanid in einer Probe nachzuweisen vermag. Diese Nachweissysteme sind nützlich, werden jedoch durch aufwendige und komplexe Nachweissysteme behindert. Vor kurzem erkannte man, daß das Phänomen der bakteriellen Biolumineszenz eine einfachere und empfindlichere Nachweismethode für Umweltsensorsysteme liefert.
Das Phänomen der Biolumineszenz wurde erstmals 1885 von Raphel Dubois ernsthaft wissenschaftlich untersucht, als er beobachtete, daß die aus dem Leuchtkäfer Pyrophorus und der Leuchtmuschel Pholas erhaltenen zelifreien Extrakte in vitro eine Licht emittierende Reaktion ergaben, wenn sie bei Raumtemperatur gemischt wurden. Seit dieser Zeit wurden biolumineszente Systeme in einer Vielzahl verschiedener Organismen identifiziert und untersucht, zu denen der gewöhnliche Leuchtkäfer, Meereshohltiere, Fische, Boden- und Süßwasserwürmer sowie Bakterien-, Algen- und Pilzarten gehören.
Die bakterielle Biolumineszenz ist ein Phänomen, bei dem die Produkte von 5 Strukturgenen (luXA, luxB, luxC, luxD und luxE) zusammenwirken, wobei Licht entsteht. Das luxD-Produkt erzeugt aus einer Vorstufe eine C&sub1;&sub4;-Fettsäure. Die C&sub1;&sub4;-Fettsäure wird in einer ATP-abhängigen Reaktion durch die Wirkung des luxE-Produkts, das die bakterielle Biolumineszenz an den Energiezustand der Zelle koppelt, zu einem Acylenzym-Konjugat aktiviert. Das Acylenzym (luxE-Produkt) dient als Übertragungsmittel und gibt die Acylgruppe an das luxC-Produkt ab. Der binäre Acyl-luxC-Komplex wird dann in einer Reaktion reduziert, bei der NADPH als Elektronenpaar- und Protonendonor dient, der das Acylkonjugat zum C&sub1;&sub4;- Aldehyd reduziert. Diese Reaktion koppelt die Reduktionskraft der Zelle an die bakterielle Lichtemission. Bei der Lichterzeugungsreaktion, die durch Luciferase (das Produkt von luxA und luxB) katalysiert wird, entsteht Licht. Die Energie für die Lichtemission wird durch die Umsetzung des Aldehyds zur Fettsäure und die FMNH&sub2;-Oxidation geliefert, was eine weitere Kopplung zwischen der Lichterzeugung und dem Energiezustand der Zelle ergibt.
Vor kurzem wurden natürliche biolumineszente Organismen als Sensorelemente in Toxizitätstests verwendet. Das MICROTOX-System (Microbics Corp., Carlsbad, CA) ist ein Beispiel dafür. Das MICROTOX-System mißt die natürliche Grundlumineszenz von Photobacterium phosphoreum und setzt sie mit der Feindlichkeit der Umgebung des Organismus in Beziehung. Da die drei Kopplungen, über ATP-Menge, NADPH-Menge und FMNH&sub2;-Menge, zwischen der Lichterzeugung und den zentralen Stoffwechselereignissen der Energieerzeugung für die Lichterzeugung in Photobacterium phosphoreum notwendig sind, bewirkt jeder Belastungsfaktor, der die Verfügbarkeit oder die Wechselwirkung dieser Metabolite stört, eine Abnahme der Aktivität des Biolumineszenzsystems (lux-Systems) und daher eine damit verbundene Abnahme der Lichterzeugung durch den Organismus.
Ein Hauptattribut biolumineszenter Systeme ist, daß die Abnahme der Lichterzeugung rasch erfolgt; sie tritt innerhalb von Minuten der Einwirkung eines Belastungsfaktors auf. Ein weiterer entscheidender Vorteil dieser Systeme ist, daß die Lichtdetektion außerordentlich empfindlich sein kann (bis zum Niveau einzelner Photonen) und sich leicht an tragbare Feldeinheiten anpassen läßt. Weiterhin verhindert die Logistik der Lichtdetektion, daß der Detektor mit einer nassen biologischen Probe in Kontakt kommen muß, was eine entscheidende Schwäche bei konkurrierenden Techniken (wie ionenselektiven Elektroden) ist, wo die Verschmutzung und Korrosion des Detektors für erhebliche Ausfallzeiten verantwortlich sind.
Jüngere Fortschritte in der DNA-Rekombinationstechnik ermöglichten die Expression des Luciferase-(lux)-Genkomplexes als heterologe Genprodukte. Dies wird im allgemeinen dadurch erreicht, daß man den lux-Strukturgenkomplex unter die Kontrolle eines Wirtspromotors stellt. So wurde zum Beispiel cDNA, die Leuchtkäfer- Luciferase codiert, in E. coli unter der Kontrolle des lacZ- Promotors exprimiert (Tatsumi et al., Biochem. Biophys. Acta, 1131, (2), S. 161-165 (1992)), und das luxAB-Fusionsgen wurde in Bacillus in Mengen exprimiert, die mit denen vergleichbar sind, die sich in E. coli erreichen lassen, indem man es unter die Kontrolle des wirkungsvollen Pxyn-Promotors stellte (Jacobs et al., Mol. Gen. Genet., 230 (1-2), S. 251-256 (1991)).
Als Alternative zum MICROTOX-System wurden Systeme entwickelt, bei denen Bakterien mit Hilfe der Gentechnik so transformiert werden, daß sie das lichtemittierende Element in dem Assay darstellen. Rychert et al. (Environ. Toxic. Water Qual., 6 (4), S. 415-422 (1991)), haben gezeigt, daß rekombinantes E. coli, das das Plasmid pJE202 beherbergt, welches den lux-Genkomplex enthält, gegenüber Zn²&spplus;, Ethidiumbromid, Natriumpentachlorphenolat, Cu2~ und 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure empfindlich ist. Ein Ansprechen wurde bei diesem Assay anhand einer Abnahme der von dem transformierten E. coli emittierten Grundlichtmenge aufgezeichnet.
Obwohl das MICROTOX- und ähnliche Systeme nützlich sind, ist ihre Empfindlichkeit auf den Nachweis von Ausmaßen von Belastungsfaktoren beschränkt, die die Zelle töten oder metabolisch verkrüppeln. Um von diesen Systemen nachgewiesen zu werden, muß der Belastungsfaktor ein so hohes Ausmaß erreicht haben, daß er entweder den zentralen Stoffwechsel der Zelle stört oder die Lux- Proteine inaktiviert.
Häufig ist es notwendig, Umweltbelastungen in einem Ausmaß nachweisen zu können, das unterhalb von dem liegt, das man benötigt, um den Zellstoffwechsel zu beeinträchtigen. Dies ist der Fall bei Abwasseraufbereitungsanlagen, wo letale Konzentrationen von Schadstoffen die nützliche Mikrobenpopulation vernichten können, was zu erheblichen Kosten und Ausfallzeiten der Anlage führt. Ein bevorzugtes Sensorsystem wäre eines, das die Gegenwart von Belastungsfaktoren auf subletalem Niveau nachzuweisen vermöchte, bevor eine nützliche Mikrobenpopulation geschädigt werden könnte. Eine solche Frühwarnung könnte zum Auslösen einer unverzüglichen Maßnahme verwendet werden, um die ansässige Mikrobenpopulation zu retten.
Vor kurzem wurden rekombinante Bakterien entwickelt, indem man die lux-Strukturgene mit chemisch ansprechenden Bakterienpromotoren verschmolz und diese Chimären dann in geeignete Wirte einsetzte. Diese rekombinanten Bakterien sind Sensororganismen, die als Reaktion auf spezifische Reize aufglühen. Ein Beispiel für diesen Typ von Genfusion ist in Burlage et al. (J. Bacteriol., 172 (9), S. 4749-4757 (1990)) beschrieben, wo ein DNA-Fragment aus dem Plasmid NAH7, das einen Promotor für den Naphthalinabbauweg enthielt, mit den lux-Genen von Vibrio fischeri verschmolzen und zur Transformation eines Pseudomonas-Stammes verwendet wurde. Die resultierende Transformante zeigte in Gegenwart von Naphthalin eine Erhöhung der Lichtemission. Es wurde gezeigt, daß die Induktion der Biolumineszenz mit dem Naphthalinabbau durch den transformierten Organismus zusammenfiel.
Ein weiteres Testsystem, das spezifisch auf Quecksilber (Hg) reagiert, wird von H. Molders (EP 456 667) beschrieben. Hier werden Indikatorbakterienstämme bereitgestellt (durch vektorvermittelte Genübertragung), die einen mer-Promotor enthalten, der spezifisch durch Hg-Ionen induzierbar ist und der mit einem Komplex bakterieller Luciferase-Gene (luxAB) verschmolzen ist, der für die Biolumineszenz verantwortlich ist. Das Testsystem von Molders beruht auf der Induktion des mer-Promotors durch die Gegenwart von Quecksilber und die anschließende Zunahme der Lichtemission durch die rekombinanten Bakterien, die die Testergebnisse liefert.
Die Verfahren von Burlage et al. und Molders bieten gegenüber dem früheren Stand der Technik insofern mehrere Vorteile, als sie mit dem Verfahren der erhöhten Biolumineszenz spezifisch einen einzelnen Belastungsfaktor nachweisen. Diese Systeme eignen sich zum Nachweis der Gegenwart spezieller Chemikalien in einer Umweltprobe, sind jedoch schlechte Indikatoren für allgemeine Zelltoxizität. Der von Burlage verwendete Promotor übt seine Funktion im Naphthalinabbauweg aus und wird in einen Wirt eingesetzt, der Naphthalin als Kohlenstoffquelle verwerten kann. Daher hängt dieses Nachweissystem in keiner Weise mit der Zelltoxizität zusammen. Ähnlich kommt der mer-Promotor von Molders in E. coli ursprünglich nicht vor und ist daher kein nativer Indikator für Toxizität in E. coli. Ein allgemeineres Testystem für den primären Nachweis unbekannter Belastungsfaktoren würde eher einen Promotor verwenden, der spezifisch mit der Zelltoxizität oder Belastungen verknüpft ist, als einen, der durch eine spezielle Chemikalie aktiviert wird.
Gene, die als Ergebnis von Zellbelastungen aktiviert werden, liefern eine vorteilhafte alternative Strategie für den Nachweis von Umweltbelastungsfaktoren. Streßgene findet man in allen Zellen; sie sind als diejenigen Gene definiert, die als Ergebnis irgendeiner Art von äußerer Belastung (Streß) aktiviert werden, die den normalen Zellstoffwechsel verändern könnte. Belastungen aus der Umwelt induzieren häufig die Synthese einer überlappenden Gruppe von Proteinen. Die am besten anerkannte Klasse von Streßgenen sind die Hitzeschockgene, die eine Gruppe zellulärer Proteine codieren, von denen man glaubt, daß sie eine Rolle bei der Neufaltung, Wiederverwertung und Neusynthese von Proteinen spielen. Das Hitzeschockphänomen wurde zuerst als Reaktion auf eine erhöhte Temperatur beschrieben. Anschließende Arbeiten haben gezeigt, daß die Einwirkung einer Vielfalt von Belastungen einschließlich Phageninfektion, Makrophagenumhüllung sowie der Gegenwart von organischen Molekülen und Schwermetallen ebenfalls die Hitzeschockreaktion auslösen kann. Das gemeinsame Merkmal der induzierenden Agentien könnte das Auffalten einiger Proteine innerhalb der Zelle sein. (LaRossa et al., Mol. Microbiol., 5 (3), S. 529-534 (1991)). So kann die Reaktion einen weiten Bereich von Umweltbelastungsfaktoren zusammenfassend anzeigen. Van Bogelen et al. (J. Bacteriol., 169 (1), S. 26-32 (1987)) zeigten, daß eine Vielzahl von Chemikalien in der Lage ist, die Hitzeschockgene in E. coli zu induzieren; dazu gehören CdCl&sub2;, H&sub2;O&sub2;, Ethanol, Puromycin und Nalidixinsäure. Blom et al. (Appl. Environ. Microbiol., 58 (1), S. 331-334 (1992)) lehren, daß die Einwirkung von Benzol, CdCl&sub2;, Chlorpyrivos, 2,4-Dichloranilin, Dioctylphthalat, Hexachlorbenzol, Pentachlorphenol, Trichlorethylen und Tetrapropylbenzosulfonat auf E.-coli-Kulturen zur Induktion von bis zu 39 verschiedenen Streßproteinen führt, die durch zweidimensionale Gelelektrophorese analysiert wurden.
Da die Zelle versucht, einen stationären Zustand aufrechtzuerhalten, werden Streßreaktionen für jede Bedingung, die als auslösender Faktor dient, weit unterhalb der minimalen inhibitorischen Konzentration aktiviert. Wegen dieser Tatsache wäre die Verwendung von Streßreaktionen in jedem Umweltüberwachungssystem besonders vorteilhaft, da der Nachweis von Belastungsfaktoren vor dem Tod der Mikrobenzellen gelingen könnte. Ein solches System wäre in Abwasseraufbereitungsanlagen, wo Umweltschadstoffe häufig erst nachgewiesen werden, wenn die Mikrobenpopulation zerstört ist, äußerst nützlich.
Bisher wird die Induktion von Streßreaktionen im Bereich der Umwelttests nur mit mäßigem Erfolg verwendet. Koehler et al. (Arch. Environ. Contam. Toxicol., 22 (3), 334-8 (1992)) beschreiben ein Testsystem zur Bestimmung der Konzentration von HSP70-Protein in verschiedenen Arten von Mollusken und Nacktschnecken als Reaktion auf die Gegenwart von Schwermetallen und Pestiziden. Obwohl das System als Reaktion auf die Gegenwart von Pb²&spplus; erhöhte Mengen an HSP70 zeigte, ist die Technik aufwendig und zu wenig empfindlich. Eine ausgeklügeltere Technik wird von Saunders et al. (WO 90/02947) beschrieben. Die Technik von Saunders et al. beinhaltet den Nachweis erhöhter Mengen an HSP60 und HSP70 in Organismen, die in einer wäßrigen Umgebung Schadstoffen ausgesetzt sind.
Obwohl gezeigt wurde, daß Streßreaktionen für den Nachweis der Gegenwart verschiedener Umweltbelastungsfaktoren geeignet sind, müssen sie noch mit einem empfindlichen, leicht nachzuweisenden Reporter verknüpft werden. Daher besteht ein Bedürfnis nach einem hochempfindlichen biologischen Testsystem, das einen leichten Nachweismechanismus verwendet und eine große Vielfalt von Belastungsfaktoren in einem Ausmaß weit unterhalb des Ausmaßes, das zum Abtöten von Mikrobenpopulationen benötigt wird, nachzuweisen vermag. Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, dieses Bedürfnis zu befriedigen. Es ist zu erwarten, daß diese Erfindung einen weiten Anwendungsbereich haben wird. Zu den möglichen Verwendungen gehören die Überwachung der Luft- und Wasserqualität, die Entwicklung von Agrochemikalien und Pharmaka, die Kontrolle von Herstellungs- und Fermentationsverfahren, die Verfahrensüberwachung und das Toxizitäts-Screening. Von diesen Anwendungen können viele Unternehmen profitieren, einschließlich der chemischen, Getränke-, Lebensmittel- und Geschmacksstoff-, Kosmetik-, Agrikultur-, Umwelt-, Überwachungs- und Gesundheitsindustrie.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Umweltbelastungsfaktors bereit, umfassend die Schritte: Kultivieren eines geeigneten biolumineszenten Detektororganismus, der auf die Gegenwart eines Umweltbelastungsfaktors mit einer Änderung der Lumineszenz zu reagieren vermag; Einwirkenlassen einer Probe, von der man annimmt, daß sie einen Umweltbelastungsfaktor enthalten könnte, auf den Detektororganismus; Messen der Änderung der durch den Detektororganismus erzeugten Lumineszenz; und Korrelieren der Änderung der Lumineszenz mit der Menge des in der Probe vorhandenen Umweltbelastungsfaktors.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine transformierte biolumineszente bakterielle Wirtszelle bereit, die auf die Gegenwart eines Umweltbelastungsfaktors mit einer Änderung der Lumineszenz zu reagieren vermag, wobei die Wirtszelle ein heterologes DNA-Konstrukt enthält, das durch die Gegenwart des Belastungsfaktors aktiviert werden kann.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine fusionierte DNA bereit, die ein erstes DNA-Fragment umfaßt, das einen streßinduzierbaren Promotor codiert, wobei der Promotor auf einen globalen Regelkreis anspricht, und das mit einem zweiten DNA-Fragment verbunden ist, das den lux-Genkomplex codiert, so daß dieses operabel und exprimierbar ist.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen und der biologischen Hinterlegungen

Fig. 1 ist eine Darstellung des Aufbaus der Plasmide pGrpELux.3 und pGrpELux.5.
Fig. 2 ist eine Darstellung des Aufbaus des Plasmids pRY006.
Fig. 3 ist eine Darstellung des Aufbaus der Plasmide pRY001 und pRY002.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Erhöhung der Lumineszenz von TV1060 als Reaktion auf die Gegenwart von Ethanol.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Erhöhung der Lumineszenz von TV1060 als Reaktion auf die Gegenwart zunehmender Konzentrationen von Ethanol.
Fig. 6a ist eine graphische Darstellung der Erhöhung der Lumineszenz von WM1021 als Reaktion auf die Gegenwart variierender Konzentrationen von Ethanol.
Fig. 6b ist eine graphische Darstellung der Erhöhung der Lumineszenz von WM1026 als Reaktion auf die Gegenwart variierender Konzentrationen von Ethanol.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der relativen Empfindlichkeiten von tolC&spplus;- und tolC&supmin;-Detektorzellen, die mit pGrpE- Lux.5 transformiert sind, gegenüber Pentachlorphenol.
Die folgenden Stämme wurden unter den Bedingungen des Budapester Abkommens bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt (12301 Packlawn Drive, Rockville, MD 20852, USA):
TV1060 (ATCC Nr. 69142)&spplus; WM1202 (ATCC Nr. 69313) * TV1061 (ATCC Nr. 69315)* WM1021 (ATCC Nr. 69141)&spplus; TV1076 (ATCC Nr. 69314)* WM1026 (ATCC Nr. 69143)&spplus; WM1302 (ATCC Nr. 69316)*
(* hinterlegt am 13. Mai 1993)
(&spplus; hinterlegt am 3. Dezember 1992)

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die folgenden Definitionen werden hier verwendet und sollten bei der Interpretation der Ansprüche zu Rate gezogen werden.
Die Ausdrücke "Promotor" und "Promotorbereich" beziehen sich auf eine DNA-Sequenz, gewöhnlich stromaufwärts (zum 5'-Ende hin) von der proteincodierenden Sequenz eines Strukturgens, die die Expression des codierenden Bereichs steuert, indem sie für die Erkennung für RNA-Polymerase und/oder andere Faktoren sorgt, die erforderlich sind, damit die Transcription an der richtigen Stelle beginnt. Promotorsequenzen sind notwendig, aber nicht immer ausreichend, um die Expression des Gens zu aktivieren.
Ein "Fragment" bildet einen Bruchteil der DNA-Sequenz des besonderen Bereichs.
"Nucleinsäure" bezieht sich auf ein Molekül, das einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann und das aus Monomeren (Nucleotiden) zusammengesetzt ist, die einen Zucker, einen Phosphatrest und entweder ein Purin oder ein Pyrimidin enthalten. Bei Bakterien und höheren Pflanzen bezieht sich "Desoxyribonucleinsäure" (DNA) auf das genetische Material, während "Ribonucleinsäure" (RNA) an der Übersetzung der Information von der DNA in Proteine beteiligt ist.
"Regulation" und "regulieren" beziehen sich auf die Modulation der Genexpression, die durch DNA-Sequenzelemente gesteuert wird, die sich vorwiegend, aber nicht ausschließlich stromaufwärts (zum 5'-Ende hin) von dem Transcriptionsstartpunkt eines Gens befinden. Regulation kann zu einer Alles-oder-nichts-Reaktion auf einen Reiz führen, oder sie kann zu Variationen des Ausmaßes der Genexpression führen.
Der Ausdruck "codierende Sequenz" bezieht sich auf den Teil eines Gens, der ein Protein, ein Polypeptid oder einen Teil davon codiert, unter Ausschluß der regulatorischen Sequenzen, die die Initiation der Transcription aktivieren. Eine codierende Sequenz kann eine sein, die man normalerweise in der Zelle findet, oder es kann eine sein, die man normalerweise nicht an einer Stelle in der Zelle findet, in die es eingeführt wird; in diesem Fall nennt man es ein heterologes Gen. Die codierende Sequenz kann sich aus Segmenten zusammensetzen, die aus verschiedenen, natürlich vorkommenden oder synthetischen Quellen stammen.
Der Ausdruck "Konstruktion" oder "Konstrukt" bezieht sich auf ein Plasmid, ein Virus, eine autonom replizierende Sequenz, einen Phagen oder eine Nucleotidsequenz, die linear oder zirkulär sein können, aus einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen DNA oder RNA, die aus irgendeiner Quelle stammt und bei der eine Anzahl von Nucleotidsequenzen zu einer einzigen Konstruktion zusammengefügt oder rekombiniert wurden, die in der Lage ist, ein Promotorfragment und eine DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt zusammen mit einer geeigneten 3'-untranslatierten Sequenz in eine Zelle einzuführen.
Der Ausdruck "Transformation" bezieht sich auf den Erwerb neuer Gene durch eine Zelle nach dem Einbau von Nucleinsäure.
Der Ausdruck "operabel verknüpft" bezieht sich auf die Verschmelzung zweier DNA-Fragmente in der richtigen Orientierung und dem richtigen Leseraster, so daß sie zu funktioneller RNA transcribiert werden können.
Der Ausdruck "Expression" bezieht sich auf die Transcription und Translation in ein Genprodukt ausgehend von einem Gen, das für die Sequenz des Genprodukts codiert. Bei der Expression wird zuerst eine DNA-Kette, die für die Sequenz des Genprodukts codiert, in eine komplementäre RNA transcribiert, bei der es sich häufig um eine Messenger-RNA handelt, und dann wird die so transcribierte Messenger-RNA in das oben genannte Genprodukt translatiert, wenn das Genprodukt ein Protein ist.
Der Ausdruck "Translationsinitiationssignal" bezieht sich auf eine Einheit aus drei Nucleotiden (Codon) in einer Nucleinsäure, die den Start der Proteinsynthese angibt.
Der hier verwendete Ausdruck "Plasmid" bezieht sich auf ein zusätzliches chromosomales Element, das häufig Gene trägt, die kein Teil des zentralen Stoffwechsels der Zelle sind, und das gewöhnlich in Form zirkulärer doppelsträngiger DNA-Moleküle vorliegt.
Der Ausdruck "Restriktions-Endonuclease" bezieht sich auf ein Enzym, das an eine spezifische Nucleotidsequenz innerhalb doppelsträngiger DNA bindet und diese zerschneidet.
Der Ausdruck "Biolumineszenz" bezieht sich auf das Phänomen der Lichtemission durch irgendeinen lebenden Organismus.
Der Ausdruck "lux" bezieht sich auf die lux-Strukturgene, zu denen luxA, luXB, luxC, luxD und luxE gehören und die für das Phänomen der bakteriellen Biolumineszenz verantwortlich sind. Ein lux-Genkomplex kann alle unabhängigen lux-Gene, die zusammenwirken, oder jede Teilmenge der lux-Strukturgene umfassen, solange luxA und luxB Teil des Komplexes sind.
Der Ausdruck "Belastung" oder "Umweltbelastung" bezieht sich auf den Zustand, der in einer Zelle als Ergebnis der Einwirkung eines Umweltbelastungsfaktors entsteht.
Der Ausdruck "Belastungsfaktor" oder "Umweltbelastungsfaktor" bezieht sich auf jede Substanz oder Umweltveränderung, die bei einer Bakterienzelle oder Population von Bakterienzellen zu einer Änderung des normalen Zellstoffwechsels führt. Umweltbelastungsfaktoren können Chemikalien, Umweltschadstoffe, Schwermetalle, Temperaturänderungen, Änderungen des pH-Werts sowie Agentien, die oxidative Schäden, DNA-Schäden, Anaerobiose, Änderungen der Nitratverfügbarkeit oder Pathogenese erzeugen, umfassen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Der Ausdruck "Streßreaktion" bezieht sich auf die Reaktion einer Zelle, die entweder zur Induktion nachweisbarer Mengen von Streßproteinen oder zu einem Zustand führt, der gegenüber der Einwirkung eines anderen Belastungsfaktors oder einer erhöhten Dosis des Umweltbelastungsfaktors toleranter ist.
Der Ausdruck "Streßprotein" bezieht sich auf jedes Protein, das als Ergebnis einer Umweltbelastung oder durch die Gegenwart eines Umweltbelastungsfaktors induziert wird. Typische Streßproteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die von den Escherichia-coli-Genen groEL, groES, dnaK, dnaJ, grpE, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP, uspA, kate, uvrA, frdA, sodA, sodB, soi-28, narG, recA, xthA, his, Iac, phoA, glnA und fabA codiert werden.
Der Ausdruck "Streßgen" bezieht sich auf jedes Gen, dessen Transcription als Ergebnis einer Umweltbelastung oder durch die Gegenwart eines Umweltbelastungsfaktors induziert wird. Typische E.-coli-Streßgene umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, groEL, groFJS, dnaK, dnaj, grpE, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP, uspA, katG, uvrA, frdA, sodA, sodB, soi-28, narc, recA, xthA, his, lac, phoA, glnA, micF und fabA.
Der Ausdruck "Hitzeschockgen" bezieht sich auf jedes Gen, dessen Synthese durch das Strukturgen, das das sigma-32-Protein codiert (rpoH), positiv gesteuert wird.
Der Ausdruck "streßinduzierbarer Promotor" bezieht sich auf jeden Promotor, der in der Lage ist, ein Streßgen zu aktivieren und eine erhöhte Expression des Streßgenprodukts zu bewirken.
Der Ausdruck "Detektororganismus" bezieht sich auf einen Organismus, der ein fusioniertes Gen enthält, das aus einem streßinduzierbaren Promotor besteht, der mit einem Strukturgen verschmolzen ist und der als Reaktion auf einen Umweltbelastungsfaktor die lux-Genprodukte zu exprimieren vermag. Typische Detektororganismen umfassen Bakterien, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Der Ausdruck "Phase des exponentiellen Wachstums" oder "exponentielles Wachstum" ("logarithmische Phase") bezieht sich auf Zellkulturen von Detektororganismen, die unter Bedingungen wachsen, die eine exponentielle Vermehrung der Zahl der Detektorzellen erlaubt.
Der Ausdruck "relative Lichteinheit" wird "RLU" abgekürzt und bezieht sich auf ein Maß für die Lichtemission, wie sie mit einem Luminometer gemessen wird, das gegen einen internen Standard geeicht ist, der einzigartig für das verwendete Luminometer ist.
Die Bezeichnung "ATCC" bezieht sich auf die Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection, die sich in Rockville, Maryland befindet. Die "ATCC Nr. " ist die Zugriffsnummer zu Kulturen, die bei der ATCC hinterlegt sind.
Zu den Umweltbelastungsfaktoren, die sich mit dem Detektororganismus der vorliegenden Erfindung nachweisen lassen, gehört eine Vielzahl organischer und anorganischer Schadstoffe, die man gewöhnlich auf Industriegelände, in Abwasserströmen und landwirtschaftlichen Abflüssen findet. Solche Verbindungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die polyaromatischen Kohlenwasserstoffe (PAH), die halogenierten Aromaten sowie eine Vielzahl von Schwermetallen, wie Blei, Cadmium, Kupfer, Zink und Cobalt. Zu den Verbindungen, von denen gezeigt wurde, daß sie sich mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nachweisen lassen, gehören Atrazin, Benzol, Kupfersulfat, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Ethanol, Methanol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, Pentachlorphenol, Phenol, Toluol, Dimethylsulfoxid, Bleinitrat, Cadmiumchlorid, Natriumchlorid, Acetat, Propionat, Wasserstoffperoxid, Puromycin, Quecksilberchlorid, 2,4-Dichloranilin, Propanol, Butanol, Isopropanol, Methylenchlorid, Triton X100®, Acrylamid, Methylviologen, Mitomycin C, Menadion, Ethidiumbromid, Serinhydroxamat und Xylol. Weitere nachgewiesene Umweltbelastungen waren niedrige Phosphatkonzentrationen, Mangel an Stickstoffquellen, Mangel an Kohlenstoffquellen sowie Bestrahlung mit ultraviolettem Licht.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von Umweltbelastungsfaktoren in subletalem Ausmaß bereit und umfaßt einen Detektororganismus, der eine exprimierbare Genverschmelzung zwischen einem streßinduzierbaren Promotor, wobei der Promotor auf einen globalen Regelkreis anspricht, und einem Strukturgen enthält, die zur Expression der lux-Gene führt.
Die Detektororganismen können eine Vielzahl sowohl prokaryontischer als auch eukaryontischer Organismen umfassen, wobei Bakterienzellen bevorzugt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt einen streßinduzierbaren Promotor bereit, der für die Gegenwart eines Umweltbelastungsfaktors empfindlich ist, wobei der Promotor auf einen globalen Regelkreis anspricht. Es können streßinduzierbare Promotoren sowohl aus prokaryontischen als auch aus eukaryontischen Zellen verwendet werden, jedoch sind Promotoren aus Bakterien bevorzugt, und Promotoren aus E. coli sind am meisten bevorzugt. Geeignete streßinduzierbare Promotoren können aus der Liste von Genen ausgewählt werden, die in Tabelle I unten in der Spalte "ansprechende Gene" angegeben sind, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Tabelle I
* Gene, deren Expression durch den entsprechenden Reiz erhöht wird und deren Expression durch die entsprechenden regulatorischen Gene gesteuert wird.
a Neidhardt und von Bogelen in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1334-1345, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))
b Walker in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1346-1357, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))
c Christman et al., Cell 41: 753-762 (1985); Storz et al., Science 248: 189-194 (1990); Demple, Ann. Rev. Genet. 25: 315-337 (1991)
d Demple, Ann. Rev. Genet. 25: 31, 337 (1991)
e Magnuson et al., Microbiol. Rev. 57: 522-542 (1993)
f Nystrom und Neidhardt, J. Bacteriol., 175: 2949-2956 (1993); Nystrom und Neidhardt (Mol. Microbiol. 6: 3187-3198 (1992)
g Kolter et al., Ann. Rev. Microbiol. 47: 855-874 (1993)
h Cashel und Rudd in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1410-1438, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)); Winkler in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 395-411, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))
i Neidhardt, Ingraham und Schaecter. Physiology of the Bacterial Cell: A Molecular Approach, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1990), S. 351-388; Magasanik und Neidhardt in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1318-1325, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))
j Wanner in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1326-1333, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))
k Rietzer und Magasanik in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1302-1320, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)); Neidhardt, Ingraham und Schaecter. Physiology of the Bacterial Cell: A Molecular Approach, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1990), S. 351-388
Tabelle I gibt die Beziehung zwischen ansprechenden Genen mit den besonderen regulatorischen Genen und einem Regelkreis und der durch einen bestimmten Reiz ausgelösten assoziierten zellulären Streßreaktion an.
Obwohl man von der Mehrzahl der in Tabelle I oben aufgeführten Streßgene weiß, daß sie positiv reguliert sind, stellt die als Ergebnis eines DNA-Schadens auftretende SOS-Reaktion einen negativ regulierten Regelkreis dar. Zur Definition positiver und negativer Kontrollmechanismen, siehe Beckwith in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1439-1443, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)).
Die SOS-Reaktion auf einen DNA-Schaden ist bei E. coli gut verstanden. Das Produkt des lexA-Gens (der LexA-Repressor) bindet an Operatorelemente, die die Expression von wenigstens 17 chromosomalen Genen steuern (Walker in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1346-1357, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))). Bei DNA-Schäden oder Störung der DNA- Replikation wird ein unbekanntes SOS-induzierendes Signal erzeugt. Dieses Signal wechselwirkt mit dem recA-Genprodukt und wandelt es in eine Form um, die die Geschwindigkeit der Proteolyse einer beschränkten Zahl von Repressormolekülen erhöht (Little, J. Bacteriol., 175: 4943-4950). Bei diesen Repressormolekülen handelt es sich um die Produkte des chromosomalen lexA-Gens sowie um Repressoren, die von Phagengenomen im lysogenen Zustand codiert und exprimiert werden, die durch ultraviolettes Licht induzierbar sind. SOS-Promotoren werden durch RecA-Proteinvermittelte Proteolyse des LexA-Repressors von der Repression befreit. Zu den SOS-Promotoren gehören recA und uvrA. Es wurde gefunden, daß die recA-Promotor/lux-Fusion auf einem in mehreren Kopien vorhandenen Plasmid Biolumineszenz erzeugt und dazu führt, daß eine transformierte Wirtszelle als Reaktion auf DNA-Schäden die Biolumineszenz erhöht. Obwohl der genaue Mechanismus dieses Ergebnisses nicht bekannt ist, ist klar, daß die Erfindung nicht auf die Untersuchung positiv regulierter globaler Regelkreise beschränkt ist, da (1) einige negativ regulierte Regelkreise mit Promotoren ansprechender Gene im Mehrkopienzustand operieren und (2) es mehrere Methoden gibt, um negativ gesteuerte Promotoren in einen Einkopienzustand zu versetzen [z. B. Oden et al., Gene 96: 29-36 (1990); Symons et al., Gene 53: 85-96 (1987); Winans et al., J. Bacteriol., 161: 1219-1221 (1985); Arps und Winkler, J. Bacteriol., 169: 1061-1070 (1987); Jasin und Schimmel, J. Bacteriol., 159: 783-786 (1984)].
Die Erfindung stellt auch einen Transformationsvektor bereit, der eine Verschmelzung von streßinduzierbarem Promotor und lux-Gen enthält und in der Lage ist, eine bakterielle Wirtszelle für die Expression der Lux-Proteine zu transformieren. Eine Vielzahl von Transformationsvektoren kann verwendet werden, jedoch werden diejenigen bevorzugt, die in der Lage sind, E. coli zu transformieren. pGrpELux.3, pGrpELux.5, pRY001, pRY002 und pRY006 sind fünf spezielle Beispiele für geeignete Transformationsvektoren, deren Aufbau im folgenden Text im einzelnen angegeben ist. Diese Vektoren stellen nur eine Auswahl aus der Gesamtzahl der Vektoren dar, die zum Zweck der Einführung von Streßpromotor/lux-Reporter- Fusionen in Wirtszellen geschaffen wurden. Der Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie wird jedoch leicht erkennen, daß die bei ihrem Aufbau verwendeten Verfahren und Materialien repräsentativ für alle anderen beschriebenen Vektoren sind. Weitere bevorzugte Vektoren sind in Tabelle V von Beispiel 10 aufgeführt.
pGrpELux.3 und pGrpELux.S sind Vektoren, die den grpE-Promotor enthalten, während pRY001, pRY002 und pRY006 den dnaK-Promotor enthalten. pGrpELux.3, pGrpELux.5 und pRY006 wurden alle nach dem Verfahren der direkten Klonierung hergestellt, während als Teil des Aufbauverfahrens für pRY001 und pRY002 PCR-Vorschriften verwendet wurden. Transformationsvektoren wie diese sind häufig, und die Konstruktion eines geeigneten Vektors kann durch in der Technik wohlbekannte Methoden erreicht werden. Die bevorzugte Quelle für die lux-Gene ist ein bereits existierendes Plasmid, das einen promotorlosen lux-Genkomplex enthält. In ähnlicher Weise kandelt es sich bei den bevorzugten Quellen für die streßinduzierbare Promotor-DNA für den Aufbau des Transformationsvektors entweder ebenfalls um ein bereits existierendes Plasmid, bei dem die streßinduzierbare Promotor-DNA von zweckmäßigen Restriktionsstellen flankiert wird, die sich für die Isolierung durch Restriktionsenzym-Abbau eignen, oder um das Produkt einer PCR-Reaktion.
Die Vektoren pGrpELux.3 und pGrpELux.5 werden aus dem E.-coli- Streßgen grpE und dem lux-Genkomplex aufgebaut. pGrpE4 ist ein E.-coli-Vektor, der von pUCl8 (Pharmacia Kat.-Nr. 27-4949-01) abgeleitet ist. pGrpE4 enthält das grpE-Gen einschließlich seines Promotors, das am 5'-Ende durch eine EcoRI-Schnittstelle und am 3'-Ende durch eine BbuI-Schnittstelle begrenzt ist. Zusätzlich ist der grpE-Promotor am 3'-Ende durch eine PvuII-Schnittstelle sowie eine HaeIII-Schnittstelle unmittelbar stromabwärts der EcoRI-Schnittstelle begrenzt (Fig. 1). Ein Abbau mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Bbul ergibt ein 1,1-kb-Fragment, das dem grpE-Gen entspricht. Der weitere Abbau mit PvuII ergibt zwei Fragmente, von denen eines den grpE-Promotor enthält. Die 3'-PvuII-Schnittstelle auf dem grpE-Promotor-Fragment wird durch Ligasierung mit phosphorylierten EcoRI-Linkern in eine EcoRI- Schnittstelle umgewandelt. Der weitere Abbau mit HaeIII ergibt ein grpE-Promotor-Fragment, das zweckmäßigerweise durch eine 5'- HaeIII-Schnittstelle und eine 3'-PvuII-Schnittstelle begrenzt ist (Fig. 1).
Das pUCD615-Plasmid, das den lux-Genkomplex enthält, wird durch Rogowsky et al. ausführlich beschrieben (J. Bacteriol., 169 (11), S. 5101-512 (1987)). Das Plasmid pUCD615 ist ein 17,6-kb-Plasmid, das die Gene für Kanamycin- und Ampicillin-Resistenz trägt und das promotorlose lux-Gen-Operon enthält (Fig. 1). pUCD615 wird zuerst mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SmaI abgebaut, die das Plasmid öffnen, und danach mit den DNA-Fragmenten aus dem HaeIII-Abbau von pgrpE IV ligasiert.
Typischerweise werden die Produkte der Ligasierungsreaktionen durchmustert, indem man zuerst einen geeigneten Wirt transformiert und auf Biolumineszenz durchmustert. Eine Vielzahl von Wirten kann verwendet werden, wobei Wirte mit hohen Transformationshäufigkeiten bevorzugt werden. XL1Blue (Stratagene, LaJolla, CA) und DH5-a (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) sind zwei solche Wirte. Zu den bevorzugten Verfahren der Biolumineszenz-Durchmusterung gehören das Belichten eines geeigneten Röntgenfilms mit in Gittern angeordneten Kulturen von Transformanten mit anschließender visueller Analyse der entwickelten Filme auf Anzeichen einer Belichtung. Rückisolierung des Plasmids aus dem transformierten Wirt und Restriktionsabbauschritte mit anschließender Gelelektrophorese werden verwendet, um das Vorliegen des richtigen Plasmids zu bestätigen. Die Plasmide pGrpELux.3 und pGrpELux.S. die aus zwei verschiedenen transformierten Kolonien isoliert wurden, sind auf der Basis der Restriktionsenzymanalyse nicht voneinander zu unterscheiden. Unter einigen experimentellen Bedingungen zeigten mit pGrpELux.5 transformierte Zellen eine höhere Grundlumineszenz als die mit pGrpELux.3 transformierten, und daher wird pGrpELux.5 für den Nachweis vieler Umweltbelastungsfaktoren bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine transformierte Wirtszelle bereit, die in Gegenwart eines Umweltbelastungsfaktors seine Lumineszenz zu erhöhen vermag. Viele geeignete Wirte stehen zur Verfügung, wobei E. coli bevorzugt wird und der E.-coli-Stamm RFM443 am meisten bevorzugt wird. RFM443 ist von W3102 abgeleitet, das von B. Bachmann in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt et al. (Hrsg.), S. 1190-1220, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)) ausführlich beschrieben wird. Die Transformation von RFM443 mit pGrpELux.3 ergibt den neuen Stamm TV1060, der bei der ATCC unter den Bedingungen des Budapester Abkommens hinterlegt wurde. Die Transformation von RFM443 mit pGrpELux.5 ergibt den neuen Stamm TV1061. Das Grundniveau der Biolumineszenz ist bei dem Stamm TV1061 höher als das bei dem Stamm TV1060. E. coli TV1060 wurde die ATCC-Nr. 69142 zugeordnet, und TV1061 wurde die ATCC-Nr. 69315 zugeordnet.
Der Aufbau des Plasmids pRY006, das den dnaK-Promotor enthält, folgte einer ähnlichen Vorschrift wie der von pGrpELux.3. DNA, die den dnaK-Promotor codiert, wurde aus dem Lambda-Phagen 9E4 durch Abbau mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI erhalten. 9E4 wird von Kohara et al. (Cell 50, 495-508, 1987) ausführlich beschrieben, auf das Bezug genommen werden kann. Beim Abbau mit den Restriktionsenzymen entstand ein 3,7-kb-DNA-Fragment, das den dnaK-Promotor-Bereich umfaßt, der am 5'-Ende durch eine BamHI- Schnittstelle und am 3'-Ende durch eine EcoRI-Schnittstelle begrenzt ist. Wie beim Aufbau von pGrpELux.3 ist pUCD615 die Quelle für den lux-Genkomplex. pUCD615 wurde zuerst mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI abgebaut und danach mit den dnak-Promotor-Fragmenten unter Bildung des Plasmids pRY006 ligasiert (Fig. 2).
Der Aufbau von pRY001 und pRY002 verläuft ähnlich wie der von pRY006, außer daß PCR-Vorschriften verwendet wurden, um die DNA, die den dnak-Promotor aus 9E4 codiert, zu amplifizieren. Kurz gesagt, die PCR-Amplifikation des dnak-Promotors aus 9E4 wurde unter Verwendung der dnak-Promotor-Sequenz erreicht, wie sie von Cowing et al., PNAS 82, 2679-2683, 1985, beschrieben wird, auf das Bezug genommen werden kann.
Die Amplifikation wurde durchgeführt, wie es vom Hersteller beschrieben wird (Geneamp PCR Reagent Kit, Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT), auf das Bezug genommen werden kann. Das amplifizierte Produkt, das dem dnak-Promotor-Bereich entsprach, enthielt zweckmäßige BamHI- und EcoRI-Schnittstellen, die durch den Aufbau der Amplifikationsprimer bestimmt waren. Der dnak-Promotor- Bereich wurde mit pUCD615 ligasiert, das zuvor mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI abgebaut worden war.
Ligasierte DNA wurde verwendet, um den E.-coli-Stamm DH5α zu transformieren, und die resultierenden Transformanten wurden durch Belichtung von Röntgenfilm und durch Restriktionsabbau mit anschließender Analyse auf Agarosegelen auf Biolumineszenz durchmustert. Wegen seiner hohen Transformationshäufigkeit wurde der Stamm DH5-α für diese anfängliche Durchmusterung gewählt. Zwei unabhängige Kolonien wurden gewählt. Obwohl sie aus unabhängigen Kolonien isoliert wurden, sind die beiden aus diesen Transformanten isolierten Plasmide, pRY001 und pRY002, auf der Basis der Restriktionsenzymanalyse nicht voneinander zu unterscheiden und werden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als identisch angesehen. Unter einigen experimentellen Bedingungen zeigten mit pRY002 transformierte Zellen als Reaktion auf Umweltbelastungsfaktoren eine höhere Biolumineszenz als die mit pRY001 transformierten, und somit wird pRY002 für den Nachweis bevorzugt. Dann wurden pRY001, pRY002 und pRY006 verwendet, um RFM443 zu transformieren, wobei man die E.-coli-Stämme WM1021, WM1202 bzw. WM1026 erhielt. E. coli WM1021, WM1202 und WM1026 wurden bei der ATCC unter den Bedingungen des Budapester Abkommens hinterlegt. E. coli WM1021 vmrde die ATCC-Nr. 69141 zugeordnet. E. coli WM1202 wurde die ATCC-Nr. 69313 zugeordnet. E. coli WM1026 wurde die ATCC-Nr. 69143 zugeordnet. Wie oben erwähnt, war der Aufbau der Promotoren anderer Streßgene, die mit dem lux-Reporter verschmolzen wurden, mit dem Aufbau von pRY001 und pRY002 identisch, abgesehen davon, daß die PCR-Primer und die Quelle der Matrizen- DNA andere waren, wie es durch die Sequenzen der Promotoren bestimmt wurde. Die Sequenzen aller dieser Promotoren sind veröffentlicht und sind über die Genbank-Datenbank für Nucleinsäuresequenzen leicht verfügbar.
Es ist wohlbekannt, daß hydrophobe Verbindungen durch die Zellhülle wirksam vom Eintritt in Gram-negative Bakterien, wie E. coli, ausgeschlossen sind. Vor kurzem wurde gefunden, daß mehrere E.-coli-Stämme, die eine Mutation für Toleranz gegenüber Colicinen (tolC&supmin;) enthielten, die unerwartete zusätzliche Eigenschaft einer erhöhten Durchlässigkeit von Wirtszellhüllen für verschiedene organische Moleküle besitzen. (Austin et al., J. Bacteriol. 172: 5312-5325 (1990)). Gegebenenfalls liegt es innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, einen transformierten bakteriellen Wirt, der die tolC&supmin;-Mutation enthält, als geeigneten Detektororganismus bereitzustellen.
Um einen hochempfindlichen Detektororganismus mit verstärkter Zellhüllendurchlässigkeit für toxische organische Stoffe zu schaffen, wurde eine tolC&supmin;-Mutation in den E.-coli-Stamm RFM443 eingeführt.
Die E.-coli-Transduktante DE112 ist mit dem Stamm RFM443 isogenisch, abgesehen von der Mutation am tolC-Locus. Sie wurde durch Phage-P1-vermittelte generalisierte Transduktion unter Verwendung eines Lysats aufgebaut, das aus dem Stamm CS1562 (tolC::miniTn10) (Austin et al., J. Bacteriol. 172: 5312-5325 (1990)) als Spender und dem Stamm RFM443 als Empfänger gezüchtet wurde. Die resultierenden Tetracyclin-resistenten Transduktanten wurden auf Hypersensitivität gegenüber der hydrophoben Verbindung Kristallviolett durchmustert.
DE112 wurde nach Standard-Transformationsverfahren, wie sie oben beschrieben sind, entweder mit pGrpELux.5 oder mit pRY002 transformiert, um die Detektororganismen TV1076 (grpE-lux-Fusion) und WM1302 (dnaK-lux-Fusion) zu gewinnen, die die tolC&supmin;-Mutation enthalten. TV1076 und WM1302 wurden bei der ATCC unter den Bedingungen des Budapester Abkommens hinterlegt und wurden als ATCC Nr. 69314 bzw. ATCC Nr. 69316 bezeichnet.
Das Plasmid mit der Sequenz streßinduzierbarer Promotor/lux liegt in dem transformierten Wirt der vorliegenden Erfindung als autonom replizierendes Plasmid vor; der Routinier wird jedoch erkennen, daß es auch möglich ist, einen transformierten Wirt bereitzustellen, bei dem das Plasmid mit der Sequenz streßinduzierbarer Promotor/lux in das Genom des transformierten Wirts integriert ist. Dies kann durch Methoden erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind. Der streßinduzierbare Promotor kann die Expression eines Genprodukts aktivieren, das wiederum die Expression des lux-Genkomplexes aktiviert. In diesem Fall könnten der Promotor und der lux-Genkomplex auf verschiedenen genetischen Elementen vorkommen.
Als Beispiel kann irgendeiner von mehreren Suppressionsmechanismen genannt werden [Hartman und Roth, Advances in Genetics, 17: 1-105 (1973)]. Bei einem enthält ein in ein Chromosom integrierter lux-Genkomplex eine Nonsense-Mutation in einem der Gene luxe, luXD, luxA, luxB oder IuxE und wird von einem konstitutiven Promotor aktiviert. Der streßinduzierbare Promotor ist so verschmolzen, daß er die Expression eines Nonsense-Suppressor-Gens aktiviert. Wenn keine Belastung vorhanden ist, wird keine Biolumineszenz beobachtet, da der Organismus nicht in der Lage ist, die fünf erforderlichen Lux-Proteine zu synthetisieren. Wenn der Organismus eine Belastung erfährt, wird das Suppressor-Gen transcribiert. Die Expression des Suppressor-Gen-Produkts erlaubt die Expression der fünf erforderlichen Lux-Proteine, und daher erzeugt der Organismus Licht.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist so gestaltet, daß es eine Überwachung von Proben im Hinblick auf die Gegenwart von Umweltbelastungsfaktoren erlaubt, indem man einen Detektororganismus verwendet, der in der Lage ist, als Reaktion auf die Gegenwart eines Belastungsfaktors eine Änderung der Biolumineszenz zu zeigen. Die transformierten Stämme TV1060, TV1061, TV1076, WM1021, WM1202, WM1302 und WM1026 sind alle für die Verwendung als Detektororganismen geeignet und bevorzugt. Wie bei den bevorzugten Vektoren stellen diese Detektororganismen nur eine Auswahl aus der Gesamtzahl der Detektororganismen dar, die zum Zweck des Nachweises von Umweltbelastungsfaktoren geschaffen wurden. Der Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie wird jedoch leicht erkennen, daß die bei ihrem Aufbau verwendeten Verfahren und Materialien repräsentativ für alle anderen beschriebenen Vektoren sind. Weitere bevorzugte transformierte Detektororganismen sind in Tabelle V von Beispiel 10 aufgeführt. Unter optimalen Wachstumsbedingungen erzeugt der Detektororganismus ein Grundniveau der Lumineszenz. Die Einführung eines Umweltbelastungsfaktors in die aktiv wachsenden Kulturen induziert den streßinduzierbaren Promotor, der wiederum den lux-Komplex aktiviert, was zu einer Erhöhung der Menge des von dem Detektororganismus emittierten Lichts führt. Die Menge des emittierten Lichts wird mit dem Ausmaß der Belastung korreliert. Zum Zweck der vorliegenden Erfindung wird es am meisten bevorzugt, wenn die Detektororganismen, unmittelbar bevor man sie einer Probe aussetzt, von der man annimmt, daß sie einen Belastungsfaktor enthalten könnte, aktiv wachsen und sich in der Phase des exponentiellen Wachstums befinden und eine Zelldichte von etwa 10 Klett-Einheiten bis 50 Klett- Einheiten aufweisen, wobei etwa 20 Klett-Einheiten am meisten bevorzugt sind. Die Lichtemission kann mit einer Vielzahl von Verfahren überwacht werden, mit denen sich Photonen nachweisen lassen; diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, visuelle Analyse, Belichten eines photographischen Films, Szintillationszählung oder jede Vorrichtung, die ein Photomultiplier-Rohr beinhaltet, wobei ein Luminometer bevorzugt wird, das demjenigen ähnlich ist, das von der DynaTech Corporation hergestellt wird.
In einer Ausführungsform wurden variierende Ethanolkonzentrationen verwendet, um einen Detektororganismus einer Belastung auszusetzen. Wie man in Fig. 4 erkennt, ergab eine Endkonzentration von 4% Ethanol bei den TV1060-Kulturen (die die grpE-Promotor/- lux-Fusion enthalten) 1000 Sekunden nach der Belastung eine dramatische Erhöhung der Lumineszenz. Ähnlich erzeugten zunehmende Ethanolkonzentrationen in Fig. 5 eine entsprechende Erhöhung der Lumineszenz bei den der Belastung ausgesetzten Kulturen. Außerdem wurden mit der vorliegenden Erfindung die organischen Schadstoffe Atrazin, Pentachlorphenol (PCP), Phenol, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), Benzol, Methanol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, Atrazin, Toluol, Dimethylsulfoxid, Acetat, Propionat, Puromycin, 2,4-Dichloranilin, Propanol, Butanol, Isopropanol, Methylenchlorid, Triton X100®, Acrylamid, Methylviologen, Serinhydroxamat, Menadion, Ethidiumbromid, Mitomycin C und Xylol sowie die Schwermetallsalze Kupfersulfat, Bleinitrat, Cadmiumchlorid und Quecksilberchlorid [Kupfer] nachgewiesen. Nachgewiesen wurden auch ein hoher osmotischer Druck, Bestrahlung mit ultraviolettem Licht (UV), das Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid sowie Wachstumsbedingungen mit Phosphateinschränkung, Mangel an Stickstoffquellen und Mangel an Kohlenstoffquellen. Die Chemikalien wurden je nach ihren Löslichkeitseigenschaften entweder in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und zum Testen in Zellkulturen gegeben oder direkt zu den Wachstumsmedien hinzugefügt. Benzol, Ethanol, Methanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Methylenchlorid, Dimethylsulfoxid, Triton X100®, Phenol, Toluol und Xylol wurden direkt zu LB-Medium gegeben, während 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol und Atrazin zuerst in Methanol gelöst wurden, bevor sie mit LB- Medium verdünnt wurden. Kupfersulfat, Bleinitrat, Cadmiumchlorid, Quecksilberchlorid, Natriumchlorid, Natriumacetat, Natriumpropionat, Wasserstoffperoxid, Puromycin, Methylviologen,Acrylamid, Menadion, Ethidiumbromid, Serinhydroxamat und Mitomycin C wurden zuerst in Wasser gelöst, bevor sie mit LB-Medium verdünnt wurden. Pentachlorphenol (PCP), 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und 2,4-Dichloranilin wurden zuerst in Ethanol gelöst und schließlich zum Testen mit LB-Medium verdünnt. In allen Fällen war die Endkonzentration entweder des Ethanols oder des Methanols oder die leichte Verdünnung des Mediums mit Wasser derart, daß sie keine wesentliche Reaktion induzierten.
Die in Fig. 7 und in den Tabellen II und III gezeigten Daten zeigen zwei Aspekte des vorliegenden Nachweissystems. Erstens, daß organische und anorganische Schadstoffe mit dem vorliegenden Verfahren in geringen Konzentrationen nachgewiesen werden können, und zweitens, daß die Empfindlichkeit des Systems durch die Verwendung eines Wirtsdetektororganismus, der die tolC--Mutation enthält, erhöht werden kann.
Fig. 7 vergleicht die relativen Empfindlichkeiten von Detektororganismen, die mit der GrpELux.5-Fusion transformiert wurden, mit und ohne die tolC&supmin;-Mutation gegenüber der Gegenwart von Pentachlorphenol. Wie man anhand der Daten erkennt, zeigen die tolC&supmin;-Mutanten eine erheblich höhere Empfindlichkeit gegenüber der Gegenwart des PCP als der tolC&spplus;-Parentalstamm. Tabelle IIT (Beispiel 9) enthält Daten, die die relativen Empfindlichkeiten von Detektororganismen, die mit der pRY002-Fusion transformiert wurden, mit und ohne die tolC&supmin;-Mutation gegenüber der Gegenwart von PCP, 2,4-D, Phenol, Atrazin, Ethanol, Methanol, 2-Nitrophenol und Kupfersulfat vergleichen. In ähnlicher Weise ist offensichtlich, daß PCP und 2,4-D von dem tolC&supmin;-mutanten Wirt vorzugsweise nachgewiesen werden. Der tolC&supmin;-Wirt scheint auch gegenüber Phenol empfindlicher zu sein, obwohl in einem geringeren Ausmaß als bei PCP und 2,4-D. Die tolC&supmin;-Mutation scheint nur eine geringe Wirkung auf die Empfindlichkeit des Detektororganismus gegenüber anorganischen Kontaminanten, wie Kupfersulfat, zu haben, was man im Hinblick auf die Tatsache, daß man von der tolC&supmin;-Mutation weiß, daß sie die Durchlässigkeit der Wirtszellenhülle nur gegenüber hydrophoben Verbindungen erhöht, auch erwarten würde.
Gegebenenfalls kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden, um letale Mengen eines Belastungsfaktors nachzuweisen, indem man die Abnahme der von dem Detektororganismus erzeugten Grundlumineszenz mißt. Letale Ausmaße von Belastungen werden entweder den zentralen Stoffwechsel oder irgendeine lux- Proteinfunktion des Detektororganismus stören, was durch eine Abnahme des von den Kulturen emittierten Lichts angezeigt würde.
Die Fig. 6a und 6b veranschaulichen die Empfindlichkeit der Transformanten WM1021 und WM1026 (die die dnaK-Promotor/lux- Fusion enthalten) gegenüber einer Belastung durch variierende Ethanolkonzentrationen.Interessanterweise nahm die Lichtemission bei subletalen Ethanolkonzentrationen, die von 1% bis 4% variierten, in ähnlicher Weise wie bei den TV1060-Kulturen zu. Dagegen erzeugten letale Ethanolkonzentrationen im Bereich von 8% bis 16% eine Abnahme der Lichtemission durch die Detektorkulturen. Ähnlich führen höhere PCP-Konzentrationen bei dem Stamm TV1076 ebenfalls zu einer Abnahme der Lichtabgabe (Fig. 7). Man sieht also, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu einer bimodularen Funktion in der Lage ist. In einem Modus ist der Nachweis von Belastungen in subletalem Ausmaß über den Mechanismus der Induktion des streßinduzierbaren Promotors und der anschließenden Erhöhung der Lichterzeugung durch den Detektororganismus möglich. In einem alternativen Modus können auch Ausmaße von Belastungen nachgewiesen werden, die in der Lage sind, den zentralen Zellstoffwechsel zu stören, da die Biolumineszenz ein von der Energie und der Reduktionskraft abhängiges Phänomen ist und jede Störung des zentralen Stoffwechsels zu einer Senkung der Grundlumineszenz führt. Außerdem ist offensichtlich, daß die Induktion der Lichterzeugung durch die Streßpromotor/lux-Fusionen bei geringeren Konzentrationen spezieller Schadstoffe auftritt, als erforderlich sind, um zu einer Abnahme der Lichtabgabe zu führen.
Die folgenden nicht einschränkenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, sie jedoch in keiner Weise einschränken.

Materialien und Verfahren

Der Abbau mit Restriktionsenzymen, Phosphorylierungen, Ligasierungen und Transformationen wurden durchgeführt, wie es in Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben ist. Bei der Isolierung von Restriktionsfragmenten von Agarosegelen wurden Qiagen-Säulen verwendet (Qiagen, Inc.); sie wurde gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Strataclean (Stratagene, LaJolla, CA) und GeneClean (Bio101) wurden gemäß den Angaben der Hersteller verwendet, um Enzyme von Restriktionsabbauprodukten zu entfernen. Die Bedeutung der Abkürzungen ist wie folgt: "h" bedeutet Stunde (n), "min" bedeutet Minute(n), "s" bedeutet Sekunde(n), und "d" bedeutet Tag(e).

Beispiele

Beispiel 1

Aufbau der Plasmide pGrpELux.3 und pGrpELux.5 und Transformation von RFM443

Das zum Aufbau dieser Plasmide verwendete Schema ist in Fig. 1 skizziert. Fig. 1 soll die Ereignisse des Aufbaus veranschaulichen, doch sind die DNA-Konstrukte nicht maßstabsgerecht gezeichnet.
Das Plasmid pGrpE4 wurde von pUCIS (Pharmacia, Kat.-Nr. 27-4949- 01) abgeleitet und enthält das Escherichia coli-Streßgen grpE einschließlich seiner Promotorsequenzen. Das Plasmid pGrpE4 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BbuI abgebaut, und nach der Elektrophorese auf Agarosegel wurde ein 1,1-kb-Fragment isoliert, das dem grpE-Promotor und -Strukturgen entsprach (Fig. 1). Der grpE-Promotor ist zweckmäßigerweise am 5'-Ende durch eine EcoRI- Schnittstelle und am 3'-Ende durch eine PvuII-Schnittstelle begrenzt. Das isolierte Fragment wurde weiterhin mit dem Restriktionsenzym PvuII abgebaut, wodurch der Promotorbereich von dem Strukturgen abgetrennt wurde (Fig. 1). Ein EcoRI-Linkerfragment (Stratagene, Katalog-Nr. 901027) wurde phosphoryliert und dann mit den Produkten des PvuII-Abbaus ligasiert, wobei die 3' -PvuII- Schnittstelle an dem Promotor durch eine EcoRI-Schnittstelle ersetzt wurde. Der weitere Abbau mit HaeIII ergab eine Reihe von Fragmenten, von denen eines den grpE-Promotor enthielt, der am 5'-Ende durch HaeIII und am 3'-Ende durch EcoRI begrenzt war (Fig. 1).
Das Plasmid pUCD615 (J. Bacteriol., 169 (11), S. 5101-512 (1987)) ist ein 1716-kb-Plasmid, das die Gene für Kanamycin- und Ampicillin-Resistenz enthält und das promotorlose lux-Gen-Operon mit mehrfachen Klonierungsstellen stromaufwärts des Startcodons von lux enthält (Fig. 1). Das pUCD615 wird zuerst mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SmaI abgebaut, die das Plasmid öffnen, und danach mit den DNA-Fragmenten aus dem HaeIII-Abbau ligasiert (Fig. 1).
Um auf aktive grpE/lux-Fusion zu durchmustern, wurde ligasierte DNA verwendet, um den E.-coli-Stamm XL1Blue (Stratagene) mit Standard-CaCl&sub2;-Transformationsvorschriften zu transformieren, der dann mit Hilfe der Kanamycin-Resistenz auf die Gegenwart der Plasmide durchmustert wurde. Kolonien wurden bei 37ºC über Nacht in Gitteranordnung auf LB-Medium gezüchtet, das Kanamycin (25 ug/ml) enthielt, und weiterhin auf Biolumineszenz durchmustert, um zu bestimmen, welche Transformanten Promotorsequenzen enthielten, die mit den lux-Genen von pUCD615 verschmolzen waren. Die Biolumineszenzdurchmusterung erfolgte durch Belichten von X-OMAT-AR-Film (Kodak, Rochester, NY) bei Raumtemperatur mit den in einem Gitter angeordneten Kolonien und visuelles Analysieren der entwickelten Filme. Die weitere Bestätigung der Transformation mit dem erwarteten Plasmid erhielt man im Anschluß an Restriktionsspaltungen durch Agarosegel-elektrophoretische Analyse von Plasmid-DNA aus lichterzeugenden Zellen auf die Gegenwart und Größe der Restriktionsfragmente. Restriktionsfragmente aus dem Abbau mit Hindill, BamHI und SalI bestätigten die Gegenwart und Orientierung des grpE-Promotors in den Plasmiden pGrpELux.3 und pGrpELux.5.
Die Plasmide pGrpELux.3 und pGrpELux.5 wurden durch Transformation in den E.-coli-Wirtsstamm RFM443 befördert, was die E.-coli- Stämme TV1060 bzw. TV1061 ergab. E. coli RFM443 war ursprünglich von EX coli W3102 abgeleitet, das von B. Bachmann in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C. et al. (Hrsg.), S. 1190-1220, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)) ausführlich beschrieben wird.

Beispiel 2

Aufbau des Plasmids pRY006 und Transformation von RFM443

Das zum Aufbau von pRY006 verwendete Schema ist in Fig. 2 skizziert. Fig. 2 soll die Ereignisse des Aufbaus veranschaulichen, doch sind die DNA-Konstrukte nicht maßstabsgerecht gezeichnet.
DNA, die den dnaK-Promotor enthält, wurde aus dem Lambda-Phagen 9E4 erhalten (Kohara, Y. et al.; Cell 50, 495-508, 1987), wobei man einen Magic Lambda Prep verwendete und die von den Herstellern vorgeschlagene Vorschrift (Promega Corp., Madison, WI) befolgte. Die Phagen-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI abgebaut. Durch diese Behandlung wurden mehrere DNA- Fragmente freigesetzt, zu denen ein 3,7-kb-BamHI-EcoRI-Restriktionsfragment gehört, das den dnaK-Promotor-Bereich, wie er von Cowing et al. (PNAS 82, 2679-2683, 1985) beschrieben wird, sowie ungefähr 3,0 kb DNA in 5'-Richtung von diesem Bereich und 700 bp in 3' -Richtung von dem Promotorbereich, die den Aminoterminus des dnaK-Proteins codieren, umfaßt. Die abgebaute DNA wurde mit pUCD615 ligasiert, das zuvor mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI abgebaut worden war (Fig. 2). Die resultierenden Plasmid-Konstrukte wurden verwendet, um den E.-coli-Stamm DH5-α (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, Katalog-Nr. 82635a) zu transformieren, und die transformierten Bakterien wurden auf LB-Medium ausgestrichen, das 50 ug/ml Kanamycin enthielt, und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die resultierenden Kolonien wurden zunächst durch Belichtung von X-OMAT-AR-Film auf Biolumineszenz durchmustert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Gegenwart der gewünschten Plasmidkonstruktion wurde durch Restriktionsenzym-Analyse der Plasmid-DNA von transformierten Bakterien bestätigt. Der Abbau mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI ergab nach der Agarosegel-Elektrophorese ein 3,7-kb-Restriktionsfragment, was die Gegenwart der gewünschten Konstruktion bestätigte. Dieses Plasmid wurde als pRY006 bezeichnet. pRY006 wurde durch Transformation in den E.-coli-Stamm RFM443 eingeführt, wobei der Stamm WM1026 entstand.

Beispiel 3

Aufbau der Plasmide pRY001 und PRY002 und Transformation von RFM443

Das zum Aufbau dieser Plasmide verwendete Schema ist in Fig. 3 skizziert. Fig. 3 soll die Ereignisse des Aufbaus veranschaulichen, doch sind die DNA-Konstrukte nicht maßstabsgerecht gezeichnet.
DNA, die den dnaK-Promotor enthält (beschrieben von Cowing et al., PNAS 82, 2679-2683, 1985), wurde aus dem Lambda-Phagen 9E4 erhalten (Kohara, Y. et al.; Cell 50, 495-508, 1987), wobei man einen Magic Lambda Prep (Promega Corp., Madison, WI) verwendete und die von den Herstellern beschriebene Vorschrift befolgte. Die PCR-Amplifikation des dnaK-Promotor-Bereichs erfolgte unter Verwendung der folgenden Amplifikationsprimer:
obere r: 5'-GTTAGCGGATCCAAAAGCACAAAAAAT-3' (SEQ ID NO. 1) unterer: 5AGCAGTGAATTCCATCTAAACGT!!cTcCTCCA-3' (SEQ ID NO. 2)
Die DNA-Amplifikation wurde durchgeführt, wie es vom Hersteller (GeneAmp PCR Reagent Kit, Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) beschrieben wird. Die Reagenskonzentrationen waren:
1x Puffer
200 uM dATP
200 uM dCTP
200 uM dGTP
200 uM dTTP
2,5 Einheiten Amplitaq-Polymerase (Perkin-Elmer Cetus) - 100 pM oberer Primer
100 pM unterer Primer
1 ng 9E4-Phagen-DNA-Matrize
dH&sub2;O auf 100 ul
Die Reaktion wurde unter Verwendung eines Thermocyclusautomaten Perkin-Elmer Cetus GeneAmp PCR System 9600 durchgeführt, der wie folgt programmiert war:
Schmelzen: 94ºC, 10 s
Reassoziieren: 50ºC, 10 s
Verlängerung: 72ºC, 15 s
Cyclen: 30
Das resultierende amplifizierte Produkt hat eine Länge von 207 Basenpaaren und enthält das gesamte 182-bp-Segment, das den dnaK- Promotor-Bereich codiert und das in GeneBank hinterlegt ist (Zugriff 10420; Locus ECODNAK), sowie kurze 5'- und 3'-flankierende Sequenzen. Die PCR-amplifizierte DNA wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI abgebaut und mit pUCD615 ligasiert, das zuvor mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI abgebaut worden war (Fig. 3). Die resultierenden Plasmid-Konstrukte wurden nach Standard-Transformationsvorschriften in den E.-coli-Stamm DH5-α (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, Katalog-Nr. 82635a) eingeführt, und die Bakterien wurden auf LB-Medium ausgestrichen, das 50 ug/ml Kanamycin enthielt, und über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Die resultierenden Kolonien wurden zunächst durch Belichtung von Röntgenfilm auf Biolumineszenz durchmustert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Zwei Kolonien wurden für die Transformationsanalyse herausgesucht, und die Gegenwart der gewünschten Plasmidkonstruktion wurde durch Restriktionsenzym-Analyse der Plasmid-DNA von transformierten Bakterien bestätigt. Das Auftreten eines 193- bp-BamHI-EcoRI-Restriktionsfragments nach der Agarosegel-Elektrophorese bestätigte die Gegenwart der gewünschten Konstruktion. Diese Plasmide wurden als pRY001 und pRY002 bezeichnet. Obwohl pRY001 und pRY002 verschiedene Transformationskolonien darstellen, sind sie auf der Basis der Restriktionsenzymkartierung ununterscheidbar und werden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als identisch angesehen. pRY001 und pRY002 wurden durch Transformation in den E.-coli-Stamm RFM443 eingeführt, wobei die Stämme WM1021 bzw. WM1202 entstanden.

Beispiel 4

Induktion der Biolumineszenz durch Belastung mit 4% Ethanol

Der Stamm TV1060 wurde bei 37ºC in LB-Medium gezüchtet, das Kanamycin (25 ug/ml) enthielt, bis er Klett 56 erreichte (gemessen mit einem Klett-Summerson-Colorimeter mit einem Rotfilter #66); dann wurde er bei Raumtemperatur mit demselben Medium 1 : 11 verdünnt und bei Raumtemperatur 3 h wachsen gelassen, bis eine Dichte von 20 Klett-Einheiten erreicht war. 100 pl Zellen wurden in die Näpfe einer Mikrotiterplatte gegeben, und anschließend wurden entweder 10 ul 40%iges Ethanol (experimentell, Endkonzentration 4% Ethanol) oder 10 ul destilliertes Wasser (Kontrolle) hinzugefügt. Die Platte wurde sofort in ein Luminometer (Luminoskan, Finnland) eingebracht, und die Biolumineszenz wurde als RLU gegen die Zeit gemessen. Wie man in Fig. 4 erkennt, nahm die Lichtemission der mit 4% Ethanol belasteten transformierten TV1060-Kulturen 1000 s nach der Belastung dramatisch zu und erreichte einen Maximalwert von 130 RLU. Die Zugabe des destillierten Wassers zu den Kontrollkulturen führte zu keiner Variation der Grundlumineszenz (Fig. 4).

Beispiel 5

Induktion der Biolumineszenz durch Belastung mit variierenden Ethanolkonzentrationen

Der Stamm TV1060 wurde über Nacht in LB-Medium gezüchtet, das Kanamycin (25 ug/ml) enthielt, und dann mit demselben Medium 1 : 100 verdünnt und bei Raumtemperatur gezüchtet, bis eine Dichte von 20 Klett-Einheiten erreicht war. 100 ul Zellen wurden in die Näpfe einer Mikrotiterplatte gegeben, die entweder 100 ul 2%iges, 4%iges, 8%iges oder 16%iges Ethanol (was Endkonzentrationen von 1%, 2%, 4% bzw. 8% Ethanol ergab, experimentell) oder 100 ul desselben Mediums (Kontrolle) enthielten. Die Platte wurde sofort in ein Luminometer, Modell ML3000 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) eingebracht, und die Biolumineszenz wurde als RLU gegen die Zeit gemessen. Wie man in Fig. 5 erkennt, zeigte die Lichtemission der mit Ethanol belasteten transformierten TV1060- Kulturen eine Zunahme der Lumineszenz, die zunehmenden Ethanolkonzentrationen entspricht. Wie in Beispiel 4 wurden die Zunahmen der Lumineszenz 1000 s nach der Belastung beobachtet. Kontrollkulturen ergaben keine Variation der Grundlumineszenz (Fig. 5). Die maximale Lichtemission wurde 3000 s nach der Belastung mit 8% Ethanol erhalten und zeigte eine 263fache Zunahme der Lichterzeugung im Vergleich zur Kontrolle. Geringere Ausmaße der Ethanolbelastung ergaben entsprechend geringere Ausmaße der Lichtabgabe, wobei Ethanolkonzentrationen von 4%, 2% und 1% 96-, 13,5- bzw. 3,9fache Zunahmen der Lichtemission im Vergleich zur Kontrolle ergaben.

Beispiel 6

Induktion der Biolumineszenz durch Belastung bei den Stämmen WM1021 und WM1026

Die Stämme WM1021 und WM1026 wurden ungefähr 18 h lang bei 37ºC in LB-Medium gezüchtet, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt. Dann wurden die Kulturen mit frischem Medium 1 : 50 verdünnt und ungefähr 3 h bei Raumtemperatur gezüchtet. Als die Zellen eine Dichte von 20 Klett-Einheiten erreicht hatten, wurden 80 ul der Zellsuspension in die Näpfe einer Mikrotiterplatte gegeben, die 20 il Ethanol verschiedener Konzentrationen enthielten, und die Platte wurde sofort in ein Luminometer Modell ML3000 von Dynatech eingebracht. Ethanol war in Endkonzentrationen von 16%, 8%, 4%, 2% bzw. 1% vorhanden, und eine Kontrolle mit entionisiertem Wasser wurde ebenfalls mit aufgenommen. Das Luminometer wurde zuvor so programmiert, daß es die Lumineszenz in Abständen von 2 min maß. Die Fig. 6a und 6b stellen die resultierenden Lumineszenzdaten dar, die als Reaktion auf variierende Ethanolkonzentrationen von dem Stamm WM1021 bzw. WM1026 erzeugt wurden. Wie in Fig. 6a gezeigt, nimmt die Lumineszenz bei den Kulturen, die die subletalen Konzentrationen von 1%, 2% und 4% Ethanol erhalten hatten, 1000 s nach der Belastung scharf zu. Bei den höheren, letalen Ethanolkonzentrationen von 8% und 16% zeigte sich, daß die Lumineszenz unter die Grundwerte abnahm, was auf Zelltod hinwies. Fig. 6b zeigt ähnliche Ergebnisse bei Verwendung der Wirtszelle WM1026. Als Reaktion auf subletale Ethanolmengen nimmt das Licht also zu, während die Lichtabgabe bei höheren, letalen Mengen abnimmt. Dieses Beispiel zeigt, daß sich mit der Erfindung die Gegenwart sowohl von subletalen als auch von letalen Mengen eines Belastungsfaktors nachweisen läßt.

Beispiel 7

Vergleich der Induktion von Biolumineszenz durch Belastung mit Pentachlorphenol bei mit pGrpELux.5 transformierten tolC&spplus;- und tolC&supmin;-Stämmen

Um einen E.-coli-Detektororganismus mit verstärkter Durchlässigkeit für organische Verbindungen zu erhalten, wurde aus RFM443 die tolC&supmin;-Mutante DE112 konstruiert. Der E.-coli-Stamm DE112 ist mit dem Stamm RFM443 isogenisch, abgesehen von der Mutation am tolC&supmin;-Locus. Er wurde durch Phage-Pl-vermittelte Transduktion unter Verwendung eines auf dem Stamm CS1562 (tolC::miniTnlO) gezüchteten Lysats als Donor und Stamm RFM443 als Empfänger konstruiert. CS1562 (tolC::miniTnlO) wird in Austin et al., J. Bacteriol., 172, 5312 (1990), ausführlich beschrieben, und das Transduktionsverfahren ist in Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics (1972), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,New York, S. 201-205, beschrieben. RFM443 war ursprünglich von W3102 abgeleitet, das von B. Bachmann in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt et al. (Hrsg.), S. 1190-1220, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)) ausführlich beschrieben wird. Die resultierenden Tetracyclin-resistenten Rekombinanten wurden auf Hypersensitivität gegenüber der hydrophoben Verbindung Kristallviolett durchmustert.
DE112 und RFM443 sind, außer am tolC-Locus, isogenisch. Beide Stämme wurden mit dem Plasmid pGrpELux.5 transformiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, und als TV1076 (tolC::miniTnlO) bzw. TV1061 (tolC&spplus;) bezeichnet.
Beide Stämme wurden über Nacht bei 25ºC in LB-Medium gezüchtet, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt. Die Übernachtkulturen wurden mit frischem LB-Medium, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, 1 : 50 verdünnt und 4 h bei 25ºC unter Schütteln inkubiert. Die Zelldichte wurde mit einem Klett-Summerson-Colorimeter bestimmt. Als beide Stämme Ablesungen zwischen 25 und 29 Klett-Einheiten erreicht hatten, wurden die Zellen zum Testen verwendet.
Zellen (50 ul) aus jeder Kultur wurden in den Näpfen einer Mikrotiterplatte in LB-Medium gegeben, das Kanamycin (50 ug/ml) sowie verschiedene Konzentrationen von Pentachlorphenol (PCP) enthielt, so daß das Endvolumen in jedem Napf 100 ul betrug.
Eine Stammlösung (100 mg/ml) von PCP in Ethanol wurde verwendet, um eine Lösung (75 ug/ml) von PCP in LB-Medium herzustellen, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt. Diese Lösung (50 ul) wurde in Näpfe einer Mikrotiterplatte gegeben, und daraus wurde eine Verdünnungsreihe mit jeweils zweifacher Verdünnung hergestellt. Als das gleiche Volumen an Zellen hinzugefügt worden war, betrug die höchste Ethanolkonzentration 0,037%, eine Konzentration, von der man weiß, daß sie bei diesen Zellen keine merkliche Reaktion hervorruft.
Lichtablesungen wurden in einem Mikrotiterplatten-Luminometer ML3000 von Dynatech bei 25ºC in periodischen Abständen vorgenommen, und die Daten sind in dem Graph von Fig. 7 gezeigt, bei dem die PCP-Konzentration als Funktion des Induktionsverhältnisses aufgetragen ist. Das Induktionsverhältnis ist definiert als die Lichtabgabe (RLU) in Anwesenheit von PCP, dividiert durch die Lichtabgabe (RLU) in Abwesenheit von PCP.
Fig. 7 zeigt das Induktionsverhältnis 60 min nach der Zugabe gegen die Dosis des PCP. Bei niedrigen Dosen war keine Induktion der Lichtabgabe (Verhältnis = 1) durch den tolC&spplus;-Stamm TV1061 zu sehen. Bei diesen geringeren Dosen zeigte der tolJ-Stamm TV1076 jedoch eine erhebliche Zunahme der Lichtabgabe. Bei höheren Dosen wird bei dem tolC&spplus;-Stamm ebenfalls eine Induktion beobachtet, und bei dem tolC&supmin;-Stamm beobachtet man eine toxische Wirkung des PCP (Verlust der Lichtabgabe). Der tolC&supmin;-Stamm eignet sich also zum Nachweis niedrigerer Konzentrationen dieser Verbindung, als mit dem tolC&spplus;-Stamm nachgewiesen werden können. Wahrscheinlich werden durch die Kombination dieses Wirtsstammes mit den Plasmiden, die grpE::lux-Fusionen enthalten, auch andere hydrophobe Verbindungen leichter nachgewiesen.

Beispiel 8

Induktion von Biolumineszenz durch Belastung mit organischen und anorganischen Schadstoffen bei mit DGrpELux.5 transformierten tolC&spplus;- und tolC&supmin;-Stämmen

TV1061 und TV1076 wurden wie oben beschrieben gentechnisch hergestellt. Beide Stämme wurden über Nacht bei 25ºC in LB-Medium gezüchtet, das 50 ug/ml Kanamycin enthielt. Die Übernachtkulturen wurden mit frischem LB-Medium, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, auf das 40- bis 100fache verdünnt und bei 25ºC unter Schütteln inkubiert. Die Zelldichte wurde mit einem Klett-Summerson-Colorimeter bestimmt. Als beide Stämme Ablesungen zwischen 15 und 30 Klett-Einheiten ergaben, wurden die Zellen zum Testen verwendet.
Zellen (50 ul) aus jeder Kultur wurden in den Näpfen einer Mikrotiterplatte in LB-Medium gegeben, das Kanamycin (50 ug/ml) sowie verschiedene Konzentrationen von Benzol, Ethanol, Methanol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, PCP, Phenol, Toluol und Xylol enthielt, so daß das Endvolumen in jedem Napf 100 ul betrug. Kontrollnäpfe enthielten geeignete Volumina von Lösungsmitteln, die verwendet wurden, um die Testverbindungen aufzulösen.
Benzol, Ethanol, Methanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Methylenchlorid, Dimethylsulfoxid, Triton X100, Phenol, Toluol und Xylol wurden direkt zu LB-Medium gegeben, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt. Stammlösungen von 2-Nitrophenol (136 mg/ml) und 4-Nitrophenol (112 mg/ml) in Methanol wurden mit LB-Medium, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, auf die getesteten Konzentrationen verdünnt. Die Endkonzentration an Methanol war so groß, daß es bei diesen Zellen keine merkliche Reaktion hervorrief. Eine Stammlösung von PCP in Ethanol (100 mg/ml) wurde mit LB- Medium, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, auf die getesteten Konzentrationen verdünnt. Die Endkonzentration an Ethanol war so groß, daß es bei diesen Zellen keine merkliche Reaktion hervorrief. Stammlösungen von Kupfersulfat (250 mM), Bleinitrat (100 mM), Quecksilberchlorid (100 mM), Natriumchlorid (20%), Natriumacetat (2 M), Natriumpropionat (2 M), Wasserstoffperoxid (30%), Puromycin (10 mg/ml), Methylviologen (200 mg/ml) und Acrylamid (1 M) in Wasser wurden mit LB-Medium, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, auf die getesteten Konzentrationen verdünnt. Eine Stammlösung von Cadmiumchlorid (100 mM) in Wasser wurde mit LB- Medium, das kein Kanamycin enthielt, auf die getesteten Konzentrationen verdünnt.
Lichtablesungen wurden über zwei Stunden hinweg in periodischen Abständen vorgenommen, und die Daten sind in Tabelle II gezeigt. Alle Lumineszenzablesungen erfolgten bei 25ºC in einem Mikrotiterplatten-Luminometer ML3000 von Dynatech.
Die Daten in Tabelle II stellen Ablesungen dar, die 1 h nach der Einwirkung der Testverbindungen vorgenommen wurden, und sind als Konzentration der Testverbindung ausgedrückt, die die maximale Lumineszenz ergibt. Es sind auch Daten angegeben, die das Ausmaß der induzierten Lumineszenz als Vielfaches der Grundlumineszenz zeigen. Tabelle II Induktion der Lichterzeugung durch das Plasmid pGrpELux.5 durch Chemikalien
* maximale getestete Konzentration
Aus den Daten in Tabelle II ist zu ersehen, daß eine große Vielfalt an chemischen Verbindungen und Umweltbedingungen die Biolumineszenz von E.-coli-Stämmen induziert, die das Plasmid pGrpELux.5 enthalten. Daher kann man schließen, daß Detektororganismen, die die tolC&supmin;-Mutation enthalten, für einige Umweltbelastungsfaktoren einen bevorzugten Wirt darstellen.

Beispiel 9

Induktion von Biolumineszenz durch Belastung mit organischen und anorganischen Schadstoffen bei mit pRY002 transformierten tolC&spplus;- und tolC&supmin;-Stämmen

DE112 (tolC::miniTnlO) wurde wie in Beispiel 7 beschrieben gentechnisch hergestellt, und die Quelle fürRFM443 wurde bereits besprochen. Beide Stämme wurden nach Standardverfahren, wie sie in Beispiel 3 beschrieben sind, mit dem Plasmid pRY002 transformiert und als WM1302 (tolC::miniTnlO) bzw. WM1202 (tolC&spplus;) bezeichnet.
Beide Stämme wurden über Nacht bei 25ºC in LB-Medium gezüchtet, das Kanamycin (50 gg/ml) enthielt. Die Übernachtkulturen wurden mit frischem LB-Medium, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, 1 : 100 verdünnt und 4 h bei 25ºC unter Schütteln inkubiert. Die Zelldichte wurde mit einem Klett-Summerson-Colorimeter bestimmt. Als beide Stämme Ablesungen von 28 Klett-Einheiten ergaben, wurden die Zellen zum Testen verwendet.
Zellen (50 ul) aus jeder Kultur wurden in Näpfe einer Mikrotiterplatte gegeben, die LB-Medium enthielten, das Kanamycin (50 ug/ml) sowie verschiedene Konzentrationen von PCP, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D), Phenol, Ethanol, Methanol, 2-Nitrophenol, Atrazin und Kupfersulfatenthielt, so daß das Endvolumen in jedem Napf 100 ul betrug. Kontrollnäpfe enthielten geeignete Volumina von Lösungsmitteln, die verwendet wurden, um die Testverbindungen aufzulösen.
Die Chemikalien wurden zum Testen im wesentlichen so vorbereitet, wie es in Beispiel 8 beschrieben ist. Kupfersulfat wurde direkt zu dem Kulturmedium gegeben, und Atrazin wurde zuerst in Methanol gelöst, bevor es zu Zellkulturen gegeben wurde. Mit Ausnahme von Atrazin wurden alle Lösungsmittel in Mengen hinzugefügt, die unterhalb von denen lagen, die notwendig waren, um eine Streßreaktion in dem System hervorzurufen. Die in der Atrazinprobe vorhandene Methanolmenge rief eine schwache, aber nachweisbare Reaktion hervor; die Daten in Tabelle III stellen die Nettoreaktion dar, die oberhalb der Reaktion nachgewiesen wurde, die man mit einer äquivalenten Menge Methanol allein erhielt.
Lichtablesungen wurden über zwei Stunden hinweg in periodischen Abständen vorgenommen, und die Daten sind in Tabelle I I I gezeigt. Alle Lumineszenzablesungen erfolgten bei 25ºC in einem Mikrotiterplatten-Luminometer ML3000 von Dynatech.
Die Daten in Tabelle III stellen Ablesungen dar, die 1 h nach der Einwirkung der Testverbindungen vorgenommen wurden, und sind als Konzentration der Testverbindung ausgedrückt, die die maximale Lumineszenz ergibt. Es sind auch Daten angegeben, die das Ausmaß der induzierten Lumineszenz als Vielfaches der Grundlumineszenz zeigen. Tabelle III Induktion von Biolumineszenz bei mit Plasmid pRY002 transformierten Zellen durch Chemikalien
* maximale getestete Konzentration
** "Konz. für max. Ind." bedeutet Konzentration für maximale Induktion
*** "Zun. als Vielf." bedeutet Zunahme als Vielfaches der Grundlumineszenz
Aus den Daten in Tabelle III ist zu ersehen, daß mehrere Klassen chemischer Verbindungen die Biolumineszenz von E.-coli-Stämmen induzieren, die das Plasmid pRY002 enthalten. Die tolC - und die tolt-Wirte zeigten ähnliche Empfindlichkeiten gegenüber weniger hydrophoben Verbindungen. Daraus kann man schließen, daß Detektororganismen, die die tolC&supmin;-Mutation enthalten, für einige Umweltbelastungsfaktoren einen bevorzugten Wirt darstellen.

Beispiel 10

Aufbau der mit dem lux-Operon verschmolzenen Promotoren lon, recA, uvrA, katG, micF, uspA, xthA, his, lac, phoA, glnA

Das Schema zum Aufbau zusätzlicher Plasmide ist mit dem Aufbau von pRY001 und pRY002 identisch, wie er in Fig. 3 dargestellt und in Beispiel 3 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß für die PCR-Reaktionen andere Primer und Matrizen verwendet wurden und daß bei den PCR-Reaktionen 40 Cyclen verwendet wurden. Die verwendeten Primer und Matrizen sind unten in Tabelle IV aufgeführt. Tabelle IV
a Die Promotorsequenzen sind in Genbank erhältlich.
b Der unterstrichene Bereich des oberen Primers ist eine BamHI-Restriktionsenzym-Schnittstelle. 3' von der Restriktionsschnittstelle befindet sich eine Sequenz (im allgemeinen 18 Nucleotide), die komplementär zu dem Bereich stromaufwärts des gewünschten Promotors ist.
c Der unterstrichene Bereich des unteren Primers ist eine EcoRI-Restriktionsenzym-Schnittstelle. 3' von der Restriktionsschnittstelle befindet sich eine Sequenz (im allgemeinen 18 Nucleotide), die komplementär zu dem Bereich stromabwärts des gewünschten Promotors ist.
d Bei der Matrize für die PCR-Reaktionen handelte es sich entweder um ein Präparat aus chromosomaler DNA (C, hergestellt nach Zyskind & Bernstein, Recombinant DNA Laborstory Manual, Academic Press, New York, 1992) oder eine in Wasser resuspendierte Plaque von einem einer überlappenden Gruppe spezialisierter transduzierender λ-Phagen, die das E.-coli-Chromosom abdecken [Kohara et al., Cell 50; 495-508 (1987)], die durch ihre zugeordnete Nummer angegeben wird [siehe Bouffard et al., CABIOS 8: 563-567 (1992)] und auf E. coli K12 gezüchtet wurde. Die Amplifikation aus Plaques wurde nach dem Verfahren von Berg durchgeführt [Krishnan, Blakesley und Berg (1992), Nucleic Acids Research 19: 1153], während die aus dem chromosomalen Präparat sich dadurch von der Bergs unterschied, daß 1 ul des Präparats aus chromosomaler DNA als Matrize verwendet wurde.
e Die berechnete Größe des PCR-Produkts. Die Größe des Produkts wurde durch Agarosegel-elektrophoretische Analyse bestätigt.
Alle in Tabelle IV aufgeführten Promotorsequenzen sind veröffentlicht und von GenBank erhältlich. Der unterstrichene Bereich des oberen Primers ist eine BamHI-Restriktionsenzym-Schnittstelle. 3' von der Restriktionsschnittstelle befindet sich eine Sequenz (im allgemeinen 18 Nucleotide), die komplementär zu dem Bereich stromaufwärts des gewünschten Promotors ist. Der unterstrichene Bereich des unteren Primers ist eine EcoRI-Restriktionsenzym- Schnittstelle. 3' von der Restriktionsschnittstelle befindet sich eine Sequenz (im allgemeinen 18 Nucleotide), die komplementär zu dem Bereich stromabwärts des gewünschten Promotors ist. Bei der Matrize für die PCR-Reaktionen handelte es sich entweder um ein Präparat aus chromosomaler DNA (C, hergestellt nach Zyskind & Bernstein, Recombinant DNA Laboratory Manual, Academic Press, New York, 1992) oder eine in Wasser resuspendierte Plaque von einem einer überlappenden Gruppe spezialisierter transduzierender X-Phagen, die das E.-coli-Chromosom abdecken [Kohara et al., Cell 50; 495-508 (1987)], die durch ihre zugeordnete Nummer angegeben wird (Bouffard et al., CABIOS 8: 563-567 (1992)) und auf E. coli K12 gezüchtet wurde. Die Amplifikation aus Plaques wurde nach dem Verfahren von Berg, Nucleic Acids Research 19, 1153 (1991), durchgeführt. Die Amplifikationen aus den chromosomalen Präparaten unterschieden sich dadurch von der Bergs, daß 1 jtl des Präparats aus chromosomaler DNA als Matrize verwendet wurde. Die berechnete Größe des PCR-Produkts wurde durch Agarosegel-Elektrophorese bestätigt.
Jedes der resultierenden Plasmide wurde in drei E.-coli-Wirtsstämme eingebracht: RFM443, DE112 und W3110. Die Plasmide und die transformierten Wirtszellen sind unten in Tabelle V aufgeführt. Tabelle V
Promotor-Reporter-Fusionen wurden in transformierten Detektorwirtszellen getestet, wobei eine Vielzahl von Umweltbelastungsfaktoren verwendet wurde, die für die bekannte Empfindlichkeit des Promotors geeignet waren. Die Promotoren und ihre entsprechenden induzierenden Belastungsfaktoren sind in Tabelle VI zusammengefaßt. Tabelle VI
b bewirkt eine pleiotrope regulatorische Reaktion.
c chemische Induktion, die die Reaktion einer erhöhten Biolumineszenz auslöst.
d genetische Konstruktion, die die Expression der Biolumineszenz durch Zerstörung eines positiven Regelkreises verhindert.
e Ethanol ist ein starker Induktor der Hitzeschockreaktion [Neidhardt und von Bogelen in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1334-1345, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))].
f Mitomycin C ist ein bekannter Induktor der SOS-Reaktion - [Walker in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1346-1357, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))].
g Von Cadmium wurde berichtet, daß es genetische Schäden induziert (Neidhardt und von Bogelen in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1334-1345, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))].
h Diese Verbindung fördert Redoxkreisläufe unter Bildung von Superoxid. Superoxid wird zu Wasserstoffperoxid dismutiert. Superoxid induziert die Synthese von 40 Proteinen zusätzlich zu den 40 Proteinen, die durch Einwirkung von Wasserstoffperoxid induziert werden [Demple, Ann. Rev. Genet. 25: 315-337 (1991)].
i Wasserstoffperoxid induziert das oxyR-Regulon und mehrere andere Proteine von den ungefähr 40 Polypeptiden, die in E. coli und Salmonella typhimurium induziert werden [Christman et al., Cell 41: 753-762 (1985); Storz et al., Science 248: 189-194 (1990); Demple, Ann. Rev. Genet. 25: 315-337 (1991)].
j T. von Dyk, unveröffentlicht.
k Diese Chemikalie verhindert die Aminoacylierung von tRNAser und induziert so die stringente Reaktion [Cashel und Rudd in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1410-1438, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)); Winkler in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 395-411, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))].
l Die Katabolitenaktivierungsreaktion wird durch das Fehlen einer guten Kohlenstoffquelle ausgelöst [Neidhardt, Ingraham und Schaecter. Physiology of the Bacterial Cell: A Molecular Approach, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1990), S. 351-388; Magasanik und Neidhardt in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1318-1325, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))]
m Die Verwendung eingeschränkter Phosphatkonzentrationen induziert das Phosphatmangelregulon [Wanner in E, coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1326-1333, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))].
n Verwendung von Glutamin als einzige N-Quelle induziert die Expression des N-Mangel-Regulons [Rietzer und Magasanik in E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et al. (Hrsg.), S. 1302-1320, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))].

Beispiel 11

Reaktion einer lon-transformierten Wirtszelle auf Ethanol oder Kupfersulfat

Der E.-coli-Stamm pLonE6/RFM443 wurde über Nacht bei 26ºC in LB- Medium gezüchtet, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, und mit frischem LB-Medium, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, verdünnt und bei 26ºC bis zur frühen Phase des exponentiellen Wachstums gezüchtet. 50 ul Zellen wurden zu 50 ul LB-Medium gegeben, das Kanamycin (50 ug/ml) sowie verschiedene Konzentrationen von Ethanol (direkt zum Medium gegeben) oder Kupfersulfat (aus einer 250 mM Stammlösung in Wasser verdünnt) enthielt. Die Lichtabgabe wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC als Funktion der Inkubationszeit quantifiziert. Die durch Ethanol induzierte maximale Reaktion wurde beobachtet, als die Endkonzentration des Ethanols 4% betrug; 60 min nach der Zugabe des Ethanols war die Lumineszenz in Gegenwart von Ethanol 134mal so groß wie bei der unbehandelten Kontrolle. Die maximale Kupfersulfatinduktion ergab sich, als die Endkonzentration 5 mM betrug; nach 60 min betrug das Induktionsverhältnis 408.

Beispiel 12

Reaktion einer recA-transformierten Wirtszelle auf Mitomycin C, Ethidiumbromid oder Cadmiumchlorid

E.-coli-Stämme, die das Plasmid pRecALux3 enthielten, wurden über Nacht bei 26ºC in LB-Medium gezüchtet, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, und mit frischem LB-Medium, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, verdünnt und bei 26ºC bis zur frühen Phase des exponentiellen Wachstums gezüchtet. 50 ul Zellen wurden zu 50 ul LB- Medium gegeben, das Kanamycin (50 ug/ml) sowie verschiedene Konzentrationen von Mitomycin C (aus einer Stammlösung von 2 mg/ml in Wasser verdünnt) enthielt. Die Lichtabgabe wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. 100 min nach der Zugabe von 0,5 ug/ml Mitomycin C waren die Induktionsverhältnisse wie folgt:
Stamm DPD2791 (pRecALux3/W3110) 4,74
Stamm DPD2794 (pRecALux3/RFM443) 20,00
Stamm DPD2797 (pRecALux3/DE112) 15,70
Der E.-coli-Stamm DPD2794 zeigte eine Reaktion auf die Gegenwart von Ethidiumbromid. Zellen wurden über Nacht bei 26ºC in LB- Medium gezüchtet, das Kanamycin (25 ug/ml) enthielt, und mit frischem LB-Medium verdünnt und bei 26ºC bis zur frühen Phase des exponentiellen Wachstums gezüchtet. 50 ul Zellen wurden zu 50 ul LB-Medium gegeben, das verschiedene Konzentrationen von Ethidiumbromid (aus einer Stammlösung von 10 mg/ml in Wasser verdünnt) enthielt. Die Lichtabgabe wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. 180 min nach der Zugabe von 0,25 mg/ml Ethidiumbromid betrug das Induktionsverhältnis 1,9.
Durch ein Disk-Diffusionsassay wurde auch gezeigt, daß der E.-coli-Stamm DPD2794 auf die Gegenwart von Cadmiumchlorid reagiert. Zellen wurden auf einer LB-Agarplatte ausbegreitet, die Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, und eine Filterscheibe, die mit 20 ul einer 100 mM Cadmiumchloridlösung befeuchtet worden war, wurde auf die Agarplatte gelegt. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC ließ man die Agarplatte auf Raumtemperatur abkühlen. Reflection®-Film von DuPont wurde 10 min mit der Platte belichtet. Um eine Zone der Wachstumshemmung herum (18 mm Durchmesser) wurde eine Zone der verstärkten Biolumineszenz (35 mm Durchmesser) beobachtet.

Beispiel 13

Reaktion einer katG-transformierten Wirtszelle auf Methylviologen, Wasserstoffperoxid oder Menadion

E.-coli-Stämme, die die Plasmide pKatGLux2 und pKatGLux6 enthielten, wurden über Nacht bei 37ºC in LB-Medium gezüchtet und mit frischem LB-Medium verdünnt und bei 37ºC bis zur frühen Phase des exponentiellen Wachstums gezüchtet. 40 ul Zellen wurden zu 60 ul LB-Medium gegeben, das verschiedene Konzentrationen von Methylviologen (MV), das aus einer Stammlösung von 200 mg/ml in Wasser verdünnt wurde, oder Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;), das aus einer 0,3%igen Lösung in Wasser verdünnt wurde, enthielt. Die Lichtabgabe wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. Die Daten sind unten in den Tabellen VII und VIII gezeigt. Tabelle VII
* maximale getestete Konzentration. Tabelle VIII
Es wurde auch gezeigt, daß der E.-coli-Stamm DPD2511 auf die Gegenwart von Menadion mit erhöhter Biolumineszenz reagiert. Zellen wurden über Nacht bei 26ºC in LB-Medium gezüchtet, das Kanamycin (25 ug/ml) enthielt, und mit LB-Medium verdünnt und bei 26ºC bis zur Phase des exponentiellen Wachstums gezüchtet. 20 ul Zellen wurden in Näpfe von Mikrotiterplatten gegeben, die verschiedene Konzentrationen von Menadion (aus einer Lösung von 200 mg/ml in Wasser verdünnt) in 80 ul LB-Medium enthielten. Die Lichtabgabe wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. Nach 80 min war die Biolumineszenz der mit 2, 3 mM Menadion behandelten Zellen 1200mal so groß wie die der unbehandelten Kontrolle.

Beispiel 14

Reaktion einer MicF-transformierten Wirtszelle auf Methylviologen oder Wasserstoffperoxid

E.-coli-Stämme, die die Plasmide pMicFLux1 und pMicFLux2 enthielten, wurden über Nacht bei 37ºC in LB-Medium gezüchtet und mit frischem LB-Medium verdünnt und bei 37ºC bis zur frühen Phase des exponentiellen Wachstums gezüchtet. 40 4 Zellen wurden zu 60 ul LB-Medium gegeben, das verschiedene Konzentrationen von Methylviologen (aus einer Stammlösung von 200 mg/ml in Wasser verdünnt) oder Wasserstoffperoxid (aus einer 0, 3%igen Lösung in Wasser verdünnt) enthielt. Die Lichtabgabe wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. Die Daten sind unten in den Tabellen IX und X gezeigt. Tabelle IX
# längste analysierte Induktionszeit.
* maximale getestete Konzentration. Tabelle X

Beispiel 15

Reaktion einer UspA-transformierten Wirtszelle auf Ethanol oder Kupfersulfat

Der E.-coli-Stamm DE134, der das Plasmid pUspALux.2 enthält, wurde über Nacht bei 26ºC in LB-Medium gezüchtet, das Kanamycin (50 ug/ml) enthielt, und mit frischem LB-Medium, das Kanamycin (50 ug/rnl) enthielt, verdünnt und bei 26ºC bis zur frühen Phase des exponentiellen Wachstums gezüchtet. 50 ul Zellen wurden zu 50 ul LB-Medium gegeben, das Kanamycin (50 ug/ml) sowie verschiedene Konzentrationen von Ethanol (direkt zum Medium gegeben) oder Kupfersulfat (aus einer 250 mM Stammlösung in Wasser verdünnt) enthielt. Die Lichtabgabe wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. Die durch Ethanol induzierte maximale Reaktion wurde beobachtet, als die Endkonzentration des Ethanols 4% betrug; 60 min nach der Zugabe des Ethanols betrug das Induktionsverhältnis 148. Die maximale Kupfersulfatinduktion ergab sich, als die Endkonzentration 5 mM betrug; nach 60 min betrug das Induktionsverhältnis 6,9.

Beispiel 16

Reaktion einer xthA-transformierten Wirtszelle auf Propionat, Acetat oder Wasserstoffperoxid

E.-coli-Stämme, die Plasmide mit dem xthA-Promotor enthielten, der mit dem lux-Operon verschmolzen war, wurden über Nacht bei 26ºC in LB-Medium, das Kanamycin (25 ug/ml) enthielt, gezüchtet und mit frischem LB-Medium, das Kanamycin (25 ug/ml) enthielt, verdünnt und bei 26ºC bis zur frühen Phase des exponentiellen Wachstums gezüchtet. 50 ul Zellen wurden zu 50 ul LB-Medium gegeben, das Kanamycin (25 ug/ml) sowie verschiedene Konzentrationen von Acetat (aus einer 2 M Stammlösung in Wasser verdünnt), Propionat (aus einer 2 M Stammlösung in Wasser verdünnt) oder Wasserstoffperoxid (aus einer 30%igen Stammlösung in Wasser verdünnt) enthielt. Die Lichtabgabe wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. 9 h nach der Zugabe von 0, 025% Wasserstoffperoxid zu dem Stamm DPD2778 war die Biolumineszenz 70mal so groß wie bei der Kontrolle ohne Zugabe; 1d nach der Zugabe von 100 mM Acetat betrug das Induktionsverhältnis 54; und 3d nach der Zugabe von 100 mM Propionat betrug das Reaktionsverhältnis 207. Bei dem Stamm DPD2781 war die Biolumineszenz nach der Zugabe von 0,05% Wasserstoffperoxid 660mal so groß wie bei der Kontrolle ohne Zugabe; 1 Tag nach der Zugabe von 100 mlvi Acetat betrug das Induktionsverhältnis 61; und 3d nach der Zugabe von 100 mlvi Propionat betrug das Induktionsverhältnis 291.

Beispiel 17

Reaktion einer his-transformierten Wirtszelle auf Genexpression

Bei E.-coli-Stämmen, die Plasmide mit dem his-Promotor enthielten, der mit dem lux-Operon verschmolzen war, wurde in einem genetischen Experiment gezeigt, daß sie durch das System der stringenten Reaktion reguliert werden, was die Abhängigkeit der Genexpression von der Gegenwart der entsprechenden regulatorischen Elemente zeigt. Plasmid-DNA wurde durch CaCl&sub2;-vermittelte Transformation in ansonsten isogenische Stämme eingebracht, die eine normale Regulation aufwiesen (Stamm CF1648), im regulatorischen Gen relA mutiert waren (Stamm CF1693) oder sowohl im regulatorischen Gen relA als auch spoT mutiert waren (Stamm 1651) Diese Stämme wurden von M. Cashel erhalten (Xiao et al. (1991); die restliche Guanosin-3',5'-bis(pyrophosphat)-Syntheseaktivität von relA-Nullmutanten kann durch spoT-Nullmutationen beseitigt werden; J. Biol. Chem., 266: 5980-5990). Die Stämme wurden über Nacht bei 37ºC in LB-Medium, das Ampicillin (150 ug/ml) enthielt, gezüchtet und mit demselben Medium verdünnt und bei 37ºC bis zur frühen Phase des exponentiellen Wachstums gezüchtet. Die Lumineszenz wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. Drei Plasmide zeigten jeweils in einer relA-Mutante reduzierte Biolumineszenz und in der relA spoT-Doppelmutante drastisch reduzierte Biolumineszenz. Die Daten sind unten in Tabelle XII gezeigt. Tabelle XII
Diese Fusionen konnten auch durch Einwirkung von Serinhydroxamat induziert werden. Diese Verbindung ist ein spezifischer Inhibitor der tRNAser Aminoacylierung durch Seryl-tRNA-Synthetase [Pizer und Tosa (1971), J. Bacteriol. 106: 972-982]. Die Zellen wurden über Nacht bei 29ºC unter Schütteln in Minimal-E-Medium (Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1980) gezüchtet, dem Uracil (25 ug/ml), Kanamycinsulfat (10 ug/ml) und Glucose (0,4%) zugesetzt war. Die Zellen wurden mit demselben Medium, das nur dadurch modifiziert war, daß Kanamycinsulfat weggelassen wurde, auf das 20fache verdünnt und wie oben angegeben auf eine Zelldichte von 19 bis 34 Klett-Einheiten gezüchtet. Eine Lösung (2 mg/ml) von D, L-Serinhydroxamat in Wasser wurde mit demselben Medium, das nur dadurch modifiziert war, daß Kanamycinsulfat weggelassen wurde, verdünnt (Verdünnungsreihe mit jeweils 2facher Verdünnung). Diese Verdünnungen (50 ul) wurden in einer Mikrotiterplatte mit 50 ul aktiv wachsender Kulturen verdünnt. Die Lichtabgabe wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. Nach 1180 min Inkubation wurden die folgenden Induktionsverhältnisse beobachtet: Tabelle XIII
Aus diesen Daten geht hervor, daß wir uns die Kenntnis des Mechanismus der stringenten Reaktion zunutze gemacht haben, um einen Biosensor zu entwickeln, mit dem sich ein weiter Bereich von Inhibitoren der Aminosäurebiosynthese nachweisen läßt. Da viele Herbizide Inhibitoren der Aminosäurebiosynthese sind, kann dieser Biosensor ein nützlicher Detektor für mehrere Herbizide sein [z. B. gegen Acetolactat-Synthase gerichtete Herbizide (einschließlich solcher aus der Sulfonylharnstoff-, der Imidazolinon- und der Triazolopyrimidinklasse), Phosphinothricin und Glyphosat].

Beispiel 18

Reaktion einer phoA-transformierten Wirtszelle auf Phosphatmangel

Bei den E.-coli-Stämmen DPD1522 bis DPD1533, die Plasmide mit dem phoA-Promotor enthielten, der mit dem lux-Operon verschmolzen war, wurde gezeigt, daß sie auf Phosphatmangel reagieren. Diese Stämme wurden zur Bildung von Einzelkolonien auf MOPS-Medium (Bochner et al. (1982), Complete analysis of cellular nucleotides by two-dimensional thin layer chromatography, J. Biol. Chem. 257: 9759-9769) ausgestrichen, das kein Tricin enthielt und Glucose (0,4%) als Kohlenstoffquelle, Vitamin B1 (0,00002%) sowie eine Standardkonzentration an Phosphat (2,0 mlvi) oder eine begrenzte Konzentration an Phosphat (0,1 mlvi) enthielt. Nach einer Inkubation über nacht bei 37ºC ließ man die Platten auf Raumtemperatur abkühlen und belichtete Reflection®-Film von DuPont damit während verschiedener Zeitspannen. Die Stämme, die auf der Standard- Phosphatkonzentration wuchsen, benötigten 3 h, um eine merkliche Belichtung des Films zu bewirken. Dagegen benötigten die Stämme, die auf dem Medium mit begrenzter Phosphatkonzentration wuchsen, nur 1 min. um eine merkliche Belichtung des Films zu bewirken, was beweist, daß die Biolumineszenz durch eine begrenzte Phosphatquelle induziert wird.
Dieses Ergebnis wurde durch ein mit einem Luminometer durchgeführtes Experiment bestätigt. Die Kulturen wurden über Nacht bei 29ºC unter Schütteln in dem obigen Minimalmedium gezüchtet, das 2 mlvi Kaliumphosphat enthielt und dem Glucose (0,4%), Uracil (25 ug/ml) und Kanamycinsulfat (10 ug/ml) zugesetzt war. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen, bevor sie in einem gleichen Volumen desselben Mediums resuspendiert wurden, das nur dadurch modifiziert war, daß Kanamycinsulfat und Kaliumphosphat weggelassen wurden. 50 ul Zellen wurden zu 50 ul desselben Mediums gegeben, das kein Kanamycinsulfat enthielt und so modifiziert war, daß man Endkonzentrationen von Kaliumphosphat erhielt, die in einem Bereich von 0-2000 uM lagen. Die Lichtabgabe wurde nach der Zugabe der resuspendierten Zellen mehr als 300 min lang mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC als Funktion der Zeit quantifiziert. Typische Ergebnisse für zwei Stämme [DPD1522 (pPhoALux3/W3110) und DPD1523 (pPhoALux4/W3110)] sind unten angegeben: Tabelle XIV
ki: keine Induktion beobachtet
* Zeit der meßbaren Erhöhung der Lumineszenz über die Grundablesung

Beispiel 19

Reaktion einer glnA-transformierten Wirtszelle auf Glutamin als einzige Stickstoffguelle

Der E.-coli-Stamm DPD2831 wurde über Nacht in minimalem Phosphatmedium (Bender et al. (1977), Biochemical parameters of glutamine synthetase from Klebstella aerogenes, J. Bacteriol., 129: 1001- 1009) gezüchtet, das 0,1% (NH4)2504 enthielt. Diese Kulturen wurden durch Zentrifugation gewonnen und entweder in demselben Medium (Kontrolle) oder in diesem Medium, das kein (NH4)2504, sondern 0,004% Glutamin als einzige Stickstoffquelle enthielt, resuspendiert. Die Lumineszenz wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. 62 min nach der Resuspension wiesen die Zellen in dem Medium mit der schlechten Stickstoffquelle (Glutamin) eine 62mal so große Biolumineszenz wie die Kontrollkultur auf.

Beispiel 20

Aufbau lac-enthaltender Plasmide und Wirtszellen

E.-coli-Stämme wurden so aufgebaut, daß die plasmidgestützten lux-Gene von Vibrio fischeri unter der Kontrolle des E.-coli-lac- Promotors standen. Ein PvuII-bis-EcoRI-Fragment mit 232 Basenpaaren von pUC19 (Yanisch-Perron et al. (1985); Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors; Gene 33: 103-119) wurde in mit SmaI und EcoRI abgebautes pUCD615 (Rogowsky et al. (1987); Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58, J. Bacteriol., 169: 5101-5112) einligasiert, wobei man pLacLux erhielt. Dieses Plasmid wurde ursprünglich aus dem E.-coli-Stamm XL1-Blue isoliert (Bullock et al. (1987), XL1-Blue: A high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection, Biotechniques, 4 : 376-379), der ein F'lacIq enthält, so daß die lux-Gene durch IPTG induzierbar waren. Das Plasmid wurde ebenfalls durch CaCl&sub2;-vermittelte Transformation in die E.-coli-Stämme W3110, RFM443 und DE112 eingeführt (siehe Tabelle V, Beispiel 10).

Beispiel 21

Reaktion einer lac-transformierten Wirtszelle auf Konzentrationen der Kohlenstoffguelle

Glucose ist für E. coli die bevorzugte Kohlenstoffquelle. Die E.-coli-Stämme TV1058 und TV1068, die jeweils das Plasmid pLacLux enthalten, wurden über Nacht bei 26ºC in LB-Medium gezüchtet, das Kanamycin (25 gg/ml) enthielt und entweder 0,4% Glucose enthielt oder keine enthielt. Die Übernachtkulturen wurden verdünnt und in demselben Medium wie die Übernachtkultur bis zur frühen Phase des exponentiellen Wachstums gezüchtet. Die Trübung der Kultur wurde mit einem Klett-Summerson-Colorimeter mit einem Rotfilter #66 gemessen. Die in 50 ul Zellkultur vorhandene Lumineszenz wurde mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. Die Daten sind unten in Tabelle XIV angegeben. Tabelle XV
Zellen, die das Plasmid pLacLux enthalten, erhöhen also die Biolumineszenz, wenn sie auf den in LB-Medium vorhandenen suboptimalen Kohlenstoffquellen gezüchtet werden.

Beispiel 22

Aufbau und Reaktion einer fabA-transformierten Wirtszelle auf Fettsäuremangel

Das fabA-Gen codiert das Enzym, das für die Einführung einer Doppelbindung in die Fettsäuren und somit die Membran von E. coli verantwortlich ist. Solche Doppelbindungen sind eine absolute Voraussetzung für das Wachstum. Die Synthese von fabA wird durch zwei Promotorelemente gesteuert: einen konstitutiven low-level- Upstream-Promotor und einen induzierbaren Downstream-Promotor. Die Lage der beiden Promotoren in der Sequenz, die fabA umgibt, wurde bestimmt. Die in Tabelle IV gezeigten PCR-Primer sind so gestaltet, daß sie eine Klonierung des induzierbaren Downstream- Promotors ohne den konstitutiven Upstream-Promotor erlauben. Die Transcription des Downstream-Promotors kann auf dem RNA-Niveau wenigstens um einen Faktor 10 moduliert werden (Henry et al., J. Mol. Biol. 222: 843-849 (1991)). Die Kontrolle der dualen fabA- Promotoren, die bei fabA-1ac-Fusionen untersucht wurde, zeigte eine 13fache Modulation auf dem Niveau der spezifischen Aktivität von β-Galactosidase (Henry et al., Cell, 70: 671-679 (1992)). Die Kontrolle der fabA-Expression wird durch das fadR-Genprodukt vermittelt (Nunn et al., J. Bacteriol., 154: 554-560 (1983)). Das FadR-Protein stimuliert die fabA-Transcription, indem es an den -40-Bereich des regulierten Downstream-fabA-Promotors bindet. Wenn es einen Überschuß an Membransynthesekapazität gibt, häufen sich langkettige Acyl-CoA-Moleküle an. Diese Moleküle binden an das FadR-Protein und dissoziieren es so von dem regulierten fabA- Promotor (Henry et al., Cell, 70: 671-679 (1992)). Daher wird erwartet, daß die fabA-lux-Fusion als Monitor des Zustands der Membransynthese dient. Unter den Bedingungen eines Fettsäuremangels werden die Vorräte an langkettigem Acyl-CoA gering sein, und die Expression von fabA-lux sollte hoch sein; überschüssige Fettsäuren sollten zu großen Vorräten an langkettigem Acyl-CoA und damit zu einem geringen Ausmaß der lux-Expression aus der Fusion führen. Diese Fusion sollte nicht nur die Hemmung der Fettsäuresynthese überwachen, sondern auch die CoA-Verfügbarkeit, die durch viele Faktoren begrenzt sein kann, zu denen die Hemmung des Isoleucin-Valin-Syntheseenzyms Acetolactat-Synthase gehört (LaRossa et al., S. 108-121 in Biosynthesis of Branched Chain Amino Acids, herausgegeben von Barak, Chipman und Schloss, VCH Publishers, New York, 1990). Zu den Verfahren zur Erzeugung der Belastung eines potentiellen Detektororganismus, der eine fabA::lux-Fusion enthält, durch Fettsäuremangel könnte die Hemmung der Einführung von Mehrfachbindungen in Fettsäuren durch Aufnahme von 3-Decenoyl-N-acetylcysteamin in das Wachstumsmedium (Nunn et al. (1983), J. Bacteriol., 154: 554-560) oder die Maskierung von intrazellulärem CoA als Propionyl-CoA durch die Einwirkung von Herbiziden, wie Sulfometuronmethyl (von Dyk et al.; Mol. Gen. Genet. (1987), 207: 435-440), oder der Aminosäure Valin (LaRossa et al., 169: 1372-1378) gehören.

Aufbau von fabALux und Transformation von RFM443

Der Aufbau eines transformierenden Plasmids, das die faM::lux- Genfusion enthält, erfolgt im wesentlichen unter Verwendung von Verfahren und Materialien, wie sie in Beispiel 3 für die Herstellung von pRY001 und pRY002 beschrieben sind. Die PCR-Amplifikation des fabA-Promotors wird mit den in Tabelle IV aufgeführten Primern erreicht. Die Sequenz des fabA-Gens ist bekannt und ist leicht von der Genbank-Datenbank für Nucleinsäuresequenzen erhältlich. Das Plasmid, das die fabA::lux-Fusion trägt, wird als pFabALux bezeichnet.
Der E.-coli-Wirt RFM443 wird mit pFabALux transformiert, wobei man die Materialien und Verfahren verwendet, wie sie in Beispiel 3 für den Aufbau von WM1021 und WM1202 beschrieben sind.
Der mit pFabALux transformierte E.-coli-Wirt RFM443 wird über Nacht bei 29ºC in Minimal-E-Medium gezüchtet, das Kanamycin (10 ug/ml) enthält. Die Übernachtkulturen werden verdünnt und in demselben Medium wie die Übernachtkultur bis zur frühen Phase des exponentiellen Wachstums gezüchtet. Die Trübung der Kultur wird mit einem Klett-Summerson-Colorimeter mit einem Rotfilter #66 gemessen. Die in 50 ul Zellkultur in Anwesenheit oder Abwesenheit von 50 ug/ml Sulfometuronmethyl vorhandene Lumineszenz wird mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC quantifiziert. Man erkennt, daß Kulturen in Gegenwart von Sulfometuronmethyl eine Erhöhung der Lumineszenz auf das 10- bis 25fache im Vergleich zu Kulturen in Abwesenheit von Sulfometuronmethyl zeigen.
Daher wird erwartet, daß Zellen, die das Plasmid pFabALux enthalten, die Biolumineszenz erhöhen, wenn sie unter den Bedingungen einer Hemmung der Fettsäuresynthese gezüchtet werden.

Beispiel 23

Reaktionen auf physikalische Reizung

Die Fusionen recA::lux, uvrA::lux, grpE::lux, dnaK::lux, katc::lux, micF::lux und uspA::lux wurden mit ultraviolettem Licht bestrahlt. Alle außer grpE:xlux reagierten auf diese physikalische Reizung durch Erhöhung der Biolumineszenz. Die Stämme wurden über Nacht bei 26ºC unter Schütteln in LB-Medium gezüchtet, dem Kanamycinsulfat (25 ug/ml) zugesetzt war. Nach 20facher Verdünnung mit LB-Medium wurde die Kultur bei 26ºC unter Schütteln fortgesetzt, bis Dichten von 20-40 Klett-Einheiten erreicht waren. Kulturen (50 ul) und frisches LB-Medium (50 ul) wurden in Näpfe einer Mikrotiterplatte gegeben, bevor sie mit einem Stratalinker-1800-Instrument (Stratagene) bei 254 nm bestrahlt wurden. Anschließend wurde die Lichtabgabe nach der Bestrahlung mit einem Luminometer ML3000 von Dynatech bei 26ºC als Funktion der Zeit quantifiziert. Nach 240 min Inkubation wurden die Reaktionsverhältnisse berechnet. Sie sind in Tabelle XVI angegeben: Tabelle XVI Reaktionsverhältnis:
Man erkennt, daß alle getesteten Konstrukte außer einem sowohl auf physikalische als auch auf chemische Belastungen reagierten.

Seguenzlisting

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder:
(A) Name: E. I. Du Pont de Nemours and Company
(B) Straße: 1007 Market Street
(C) Stadt: Wilmington
(D) Staat: Delaware
(E) Land: USA
(F) postalischer Code (ZIP): 19898
(G) Telefon: 302-892-4929
(H) Telefax: 302-892-7949
(ii) Titel der Erfindung: Hochempfindliches Verfahren zum Nachweis von Umweltbelastungsfaktoren
(iii) Zahl der Sequenzen: 24
(iv) Computerlesbare Form:
(A) Art des Mediums: 3,5"-Diskette, 1,0 MB
(B) Computer: Macintosh
(C) Betriebssystem: Macintosh System 6.0
(D) Software: Patentln Release 1.0,
Version 1.25 (EPO)
(v) derzeitige Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: CR-9279-B
(vi) frühere Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldungsnummer: US 08/063,173
(B) Einreichungstag: 14. Mai 1993
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 31 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 12:
AGCAGCGAAT TCGGGCATCC GGTTGAAATA G 31
(2) Informationen für SEQ ID NO: 13:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 13:
ACTTAAGGAT CCGCCATTAC GTTGGCTGAA 30
(2) Informationen für SEQ ID NO: 14:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 28 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 14:
AGCAGCGAAT TCCCACCCGT TTCGGTCATT 30
(2) Informationen für SEQ ID NO: 15:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 29 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 15:
ACTTAAGGAT CCCTCCCGAT ACGCTGCCA 2c
(2) Informationen für SEQ ID NO: 16:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 32 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 16:
AGCAGCGAAT TCGGCGATGA GAATGTGTTT AT 32
(2) Informationen für SEQ ID NO: 17:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 17:
ACTTAAGGAT CCAATTACTG CGCCATTCTG 30
(2) Informationen für SEQ ID NO: 18:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 18:
ACATCGGAAT TCTCATAGTC GCTGCCATTT 30
(2) Informationen für SEQ ID NO: 19:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 19:
ACTTAAGGAT CCCTAATTGT ACGCATGTCA 30
(2) Informationen für SEQ ID NO: 20:
(1) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 20:
AGCAGCGAAT TCAAAGTCTC TGTGAATGTT 30
(2) Informationen für SEQ ID NO: 21:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 21:
ACTTAAGGAT CCAGATTATC GTCACTGCAA 30
(2) Informationen für SEQ ID NO: 22:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 22:
AGCAGCGAAT TCGGCCAATC AGCAAAATAA 20
(2) Informationen für SEQ ID NO: 23:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 23:
ACTTTCGGAT CCTTGGTGCA ACATTCACAT 30
(2) Informationen für SEQ ID NO: 24:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 30 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 24:
AGCAGCGAAT TCTCAGCGGA CATCGTCAGT 3 G

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Umweltbelastungen, umfassend:

(a) Einwirkenlassen eines Umweltbelastungsfaktors auf einen Detektororganismus, wobei der Organismus gentechnisch so verändert ist, daß er einen exprimierbaren lux-Genkomplex unter der Kontrolle einer streßinduzierbaren Promotorsequenz enthält, wobei die Promotorsequenz auf einen globalen Regelkreis anspricht; und

(b) Messen einer Änderung der Lumineszenz des Detektororganismus.

2. Verfahren zum Nachweis von Umweltbelastungen, umfassend:

(a) Einwirkenlassen eines sublethalen Umweltbelastungsfaktors auf einen Detektororganismus, wobei der Organismus gentechnisch so verändert ist, daß er einen exprimierbaren lux-Genkomplex unter der Kontrolle einer streßinduzierbaren Promotorsequenz enthält, wobei die Promotorsequenz auf einen globalen Regelkreis anspricht; und

(b) Messen einer Erhöhung der Lumineszenz des Detektororganismus.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, das weiterhin das Korrelieren der Lumineszenzerhöhung mit dem Ausmaß der Umweltbelastung umfaßt.

4. Verfahren zum Nachweis einer Belastung, die auf eine Mikroorganismenpopulation einwirkt, umfassend:

(a) Einwirkenlassen eines Umweltbelastungsfaktors auf einen Detektororganismus, wobei der Organismus gentechnisch so verändert ist, daß er einen exprimierbaren heterologen lux-Genkomplex unter der Kontrolle einer streßinduzierbaren Promotorsequenz enthält, wobei die Promotorsequenz auf einen globalen Regelkreis anspricht; und

(b) Messen einer Änderung der Lumineszenz des Detektororganismus.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 4, wobei der Umweltbelastungsfaktor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Atrazin, Benzol, Kupfersulfat, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, Ethanol, Methanol, 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol, Pentachlorphenol, Phenol, Toluol, Dimethylsulfoxid, Bleinitrat, Cadmiumchlorid, Natriumchlorid, Acetat, Propionat, Wasserstoffperoxid, Puromycin, Quecksilberchlorid, 2,4-Dichloranilin, Propanol, Butanol, Isopropanol, Methylenchlorid, Triton X100®, Acrylamid, Methylviologen, Mitomycin C, Menadion, Ethidiumbromid, Serinhydroxamat, Xylol und ultravioletter Strahlung besteht.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 4, wobei sich der Detektororganismus in der Phase des exponentiellen Wachstums (logarithmischen Phase) befindet, wenn er dem Umweltbelastungsfaktor ausgesetzt wird.

7. Transformierter biolumineszenter Mikroorganismus, der seine Biolumineszenz zu erhöhen vermag, wenn er einer sublethalen Menge eines Umweltbelastungsfaktors ausgesetzt ist, wobei der Mikroorganismus

(a) eine streßinduzierbare Promotorsequenz, wobei die Promotorsequenz auf einen globalen Regelkreis anspricht; und

(b) einen exprimierbaren lux-Genkomplex unter der Kontrolle der streßinduzierbaren Promotorsequenz

umfaßt.

8. Transformierter biolumineszenter Mikroorganismus gemäß Anspruch 7, wobei der lux-Genkomplex heterolog in bezug auf den Mikroorganismus ist.

9. Mikroorganismus gemäß Anspruch 7, der eine tolC--Mutation enthält, wobei diese Mutation die Permeabilität der Zellhülle des Mikroorganismus für einen hydrophoben Umweltbelastungsfaktor verändert.

10. E. coli, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus

(i) TV1076 mit der ATCC-Nummer 69314, das eine tolcr- Mutation und einen exprimierbaren heterologen lux- Genkomplex unter der Kontrolle einer streßinduzierbaren grpE-Promotorsequenz umfaßt;

(ii) WM1302 mit der ATCC-Nummer 69316, das eine tolC- Mutation und einen exprimierbaren heterologen lux- Genkomplex unter der Kontrolle einer streßinduzierbaren dnaK-Promotorsequenz umfaßt;

(iii) TV1060 mit der ATCC-Nummer 69142, das einen expriprimierbaren heterologen lux-Genkomplex unter der Kontrolle einer streßinduzierbaren grpE-Promotorsequenz umfaßt;

(iv) TV1061 mit der ATCC-Nummer 69315, das einen exprimierbaren heterologen lux-Genkomplex unter der Kontrolle einer streßinduzierbaren grpE-Promotorsequenz umfaßt;

(v) WM1021 mit der ATCC-Nummer 69141, das einen exprimierbaren heterologen lux-Genkomplex unter der Kontrolle einer streßinduzierbaren dnaK-Promötorsequenz umfaßt;

(vi) WM1026 mit der ATCC-Nummer 69143, das einen exprimierbaren heterologen lux-Genkomplex unter der Kontrolle einer streßinduzierbaren dnaK-Promotorsequenz umfaßt; und

(vii) WM1202 mit der ATCC-Nummer 69313, das einen exprimierbaren heterologen lux-Genkomplex unter der Kontrolle einer streßinduzierbaren dnaK-Promotorsequenz umfaßt;

besteht.

11. Nucleinsäuremoleküle, umfassend:

(b) einen exprimierbaren bakteriellen lux-Genkomplex unter der Kontrolle der Promotorsequenz.

12. Nucleinsäuremoleküle gemäß Anspruch 11, wobei die streßinduzierbare Promotorsequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus groEL, dnaK, grpE, phoA, glnA, Ion, lysU, rpoD, clpB, clpP, uspA, katc, uvrA, frdA, mi cF, fabA, lac, his, sodA, sodB, soi-28, recA, xthA und narC besteht.

13. Nucleinsäuremoleküle gemäß Anspruch 11, wobei der exprimierbare lux-Genkomplex luxA und luxB umfaßt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Umweltbelastungsfaktor

(i) eine Proteinschädigung, die die Wirkung von rpoH oder seines Genprodukts verändert,

(ii) eine oxidative Schädigung, die die Wirkung von oxyR oder seines Genprodukts verändert,

(iii) eine oxidative Schädigung, die die Wirkung von soxRS oder von deren jeweiligen Genprodukten verändert,

(iv) eine Membranschädigung, die die Wirkung von fadre oder seines Genprodukts verändert,

(v) einen Aminosäuremangel, der die Wirkung von relA und spoT oder von deren jeweiligen Genprodukten verändert,

(vi) einen Kohlenstoffmangel, der die Wirkung von cya und crp oder von deren jeweiligen Genprodukten verändert,

(vii) einen Phosphatmangel, der die Wirkung von phoß, phoN, phoR und phoU oder von deren jeweiligen Genprodukten verändert,

(viii) einen Stickstoffmangel, der die Wirkung von glnB, glnD, glnG und glnL oder von deren jeweiligen Genprodukten verändert,

(ix) die universelle Streßreaktion, die die Wirkung ihrer Regulatoren verändert,

(x) die stationäre Phasenreaktion, die die Wirkung von rpoS oder seines Genprodukts verändert, oder

(xi) DNA-Schäden, die die Wirkung von lexA oder recA oder von deren jeweiligen Genprodukten verändert, stimuliert.