EP1402057A2 - Verfahren zur detektion von mutagenen substanzen - Google Patents

Verfahren zur detektion von mutagenen substanzen

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EP1402057A2
EP1402057A2 EP02735423A EP02735423A EP1402057A2 EP 1402057 A2 EP1402057 A2 EP 1402057A2 EP 02735423 A EP02735423 A EP 02735423A EP 02735423 A EP02735423 A EP 02735423A EP 1402057 A2 EP1402057 A2 EP 1402057A2
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EP
European Patent Office
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test
reporter system
detection
gene
test strain
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02735423A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Georg Reifferscheid
Claudia Schmid
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Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP1402057A2 publication Critical patent/EP1402057A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/142—Toxicological screening, e.g. expression profiles which identify toxicity

Definitions

  • the invention relates to a method and means for the rapid detection of mutagenic substances.
  • VITOTOX ® assay van der Lelie D, Regnier, L, Borremans, B., Provoost, A., Verschaeve, L, Mutation Res. 389 (1997) 279-90).
  • the present invention also relates to a test kit for carrying out mutation tests, which contains at least one test strain according to the invention.
  • the selection marker and reporter system are identical, a direct detection of the mutation is possible.
  • One example is the ß-lactamase, which mediates ampicillin resistance.
  • the activity of the ampicillin gene restored by reverse mutation can be directly, for example, by using the substrate nitrocefin (O'Callaghan, CH, Morris, A., Kirkby, SK and Shingler, AH, Antimicrob. Agents Chemother. 1 (1972) 282-288 ; Sutton, LD, Biedenbach, DJ., Yen, A. and Jones, RN, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 21 (1995) 1-8).
  • the cells are then pre-incubated for a certain period of time. Depending on the mode of action, the selection agent is added immediately or at a certain time during the preincubation. Pre-incubation is particularly necessary so that the cells can come into contact with the substances to be tested for a sufficiently long period of time so that damage that has been set can manifest itself as a mutation during replication.
  • the pre-incubation is typically 0.5 to 2 hours.
  • the test strains used in the implementation example carry a plasmid with a pBR322 [Sutcliffe, JG; Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43, 1997, 77-90] derived replication origin (pMB1). Additional cloning of the par ('partition') region from pSC101 [Meacock, PA and Cohen, SN, Cell 20, 1980, 529-542] ensured the stable inheritance of the plasmid on the daughter cells.
  • the plasmid pBR328 (National Institute of Genetics, Yata, Japan) served as the donor plasmid for the second resistance gene (in the example given, the cam resistance gene).
  • the muc> 4 ⁇ operon was taken from plasmid pGW1700 [Perry, KL and Walker, GG, Nature 300, 1982, 278-281].
  • Galactosidase reporter gene the lacZY gene sequence had to be cloned in the correct reading frame behind the promoter / operator region (tet p / 0 ) of the teM gene into the plasmid pASK75 [Skerra, Gene 151, 131-135, 1994].
  • the base substitution or raster shear mutation was introduced into the ß-lactamase gene.
  • base substitution a transition from adenine to guanine was carried out in the active center 67 amino acids after the start ATG.
  • amino acid glycine was introduced instead of the amino acid serine (5'-AGC-3 '- 5'-GGC-3') and, as a result, the ⁇ -lactamase was reversibly inactivated.
  • base substitution a transition from adenine to guanine was carried out in the active center 67 amino acids after the start ATG.
  • amino acid glycine was introduced instead of the amino acid serine (5'-AGC-3 '- 5'-GGC-3') and, as a result, the ⁇ -lactamase was reversibly inactivated.
  • base substitution a transition from adenine to guanine was carried out in the active center 67 amino acids after the start ATG.
  • amino acid glycine was introduced instead of the
  • the plasmid was isolated into the Escherichia coli EE122 strain [ ⁇ (lac proB) ⁇ (uvrB gal bio) ara thi rfa] [Eisenstadt, E., Warren, AJ, Porter, J., Atkins, D. and Miller, JH, Proc , Natl. Acad. Be. USA 79, 1982, 1945-1949].
  • test batches are diluted 1:10 with LB medium (+ 50 ⁇ g / ml ampicillin) and for 6 (short-term test at 37 ° C) to 16 hours (long-term test at 28 - 30 ° C) in 24Well, 96Well or 384Well Incubated plates.
  • the evaluation is carried out either by counting the 'positive' wells or by measurement with a photometer (nitrocefin: E492 nm).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zum Schnellen Nachweis von Mutationen. Die erfindungsgemäss verwendeten bakteriellen Teststämme besitzen ein Reportersystem und einen Selektionsmarker. Als Selektionsmarker dient ein (Antibiotikum) Resistenzprotein, welches nach Mutation das selektive Wachstum der Revertanten und die gezielte Induktion des induzierbaren Reportersystems der wachsenden Revertanten ermöglicht. Als Reporter werden Proteine verwendet, die direkt oder indirekt ein Messsignal auslösen können. Der Nachweis der Mutationen erfolgt über das Reportersignal der wachsenden Revertanten, so dass die Auswertung bereits nach wenigen Stunden erfolgen kann.

Description

Verfahren zur Detektion von mutagenen Substanzen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zum schnellen Nachweis von mutagenen Substanzen.
Bakterielle Mutagenitäts- bzw. Gentoxizitätstests spielen heute eine entscheidende Rolle als Screeningverfahren in der Produktentwicklung der Chemischen- und Pharmazeutischen Industrie und in der routinemäßigen Untersuchung von Umweltproben (industrielle Abwässer,
"10 Oberflächengewässer, Raumluftkondensate, Sedimente, Schwebstoffe,
Bodenproben etc.). Der am häufigsten angewandte Mutationsassay ist der Arnes (Salmonella/Mikrosomen)-Mutagenitätstest, welcher auch Bestandteil von Zulassungsverfahren bzw. Toxikologieprüfungen ist (Arnes, B.N., Lee, F.D. and Durston, W.E.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70
-j 5 (1973) S. 782-786; OECD guidelines for the testing of chemicals). Weitere bekannte Gentoxizitätstests sind beispielsweise der umu-Test, dessen Mikroplattenversion in die Standardisierung nach DIN (DIN 38415-3) und ISO Eingang gefunden hat (Reifferscheid, G., Heil, J., Oda, Y. und Zahn, R.K., Mutation Res. 253 (1991 ) S. 215-222), der SOS-Chromotest
20 (Quillardet, P., Hofnüng, M., Mutation Res. 147 (1985) 65-78) und der
Vitotox®-Assay (van-der-Lelie-D, Regniers, L, Borremans, B., Provoost, A., Verschaeve, L, Mutation Res. 389 (1997) 279-90).
Umu-Tesi, SOS-Chromotest und Vitotox®-Assay weisen durch Gentoxine verursachte Veränderungen an der molekularen Struktur der DNA des Testorganismus Salmonella typhimurium bzw. Escherichia co// nach. Die Tests basieren auf der Messung der gentoxizitätsbedingten Induktion von Genen des bakteriellen SOS-Regulons. Diese Gene sind z.B. an einem fehleranfälligen DNA-Reparatursystem (SOS-Reparatur; umuDC-Gene im umu-Test), an der Inhibition der Zellteilung im SOS-Chromotest) und an Reparatur und Rekombination (recN im Vitotox®-Assay) beteiligt. Der Nachweis wird durch photometrische, luminometrische oder fluorometrische Messung geführt. Die Detektionsmethode richtet sich nach der Art des (oft plasmidlokalisierten) Reportersystems (z. B. Galaktosidase, Luciferase), welches mit dem jeweiligen SOS-Gen gekoppelt ist.
Der umu-Test wird in mit Umweltanalytik befaßten Landesbehörden und in
Unternehmen der Chemisch-Pharmazeutischen Industrie für das Umweltmonitoring und in der Substanztestung eingesetzt. Als Indikatortests für Gentoxizität erfassen umu-Test, SOS-Chromotest und Vitotox®-Assay zwar ein breites Spektrum primärer DNA-Schäden, sie erbringen allerdings keinen direkten Nachweis für Mutationen. Im
Gegensatz zu Mutationen können primäre DNA-Schäden noch korrekt repariert werden und sind danach ohne Bedeutung für den betroffenen Organismus.
Ein weiterer gelegentlich angewandter Gentoxizitätstest ist der Mutatox®
Test (Bulich-A, Schriftenr. Ver. Wasser. Boden. Lufthyg. 89 (1992) 763- 70). Dieses Testverfahren weist Gentoxizität in Dunkelmutanten des lumineszenten Salzwasserbakteriums Vibrio fisheri nach. Der genaue Mechanismus der Wiedererlangung der Lumineszenz nach Behandlung mit Gentoxinen ist nicht geklärt. Es wird angenommen, dass die
Reversion der Lumineszenz durch verschiedene Mutationen vor allem aber durch Geninduktion (ähnlich den SOS-Tests umu-Test, SOS- Chromotest und Vitotox®-Assay) oder auch DNA-Interkalation zustande kommen kann (Bulich und Ulitzur: The mode of action of genotoxic agents in the Mutatox®-Test-System, Microbics Corp., nicht publiziertes
Rundschreiben; Arfsten, D.P., Davenport, R., Schaeffer, DJ. ,Biomed. Environ. Sei. 7 (1994) 144-9). Da der Test nur gelegentlich Anwendung findet, liegt noch keine Aussage über die Korrelation zu Mutagenitätstests wie dem Arnes-Test vor. Entgegen der durch die Bezeichnung 'Mutatox®' implizierten Annahme des Nachweises von Mutationen, handelt es sich bei diesem Testverfahren wie bei allen anderen SOS-Tests um einen Indikatortest. Im Ames-Test werden Stämme von Salmonella typhimurium verwendet, die durch Mutationen im Histidin-Operon (His-Operon) die Fähigkeit verloren haben, auf histidinfreiem Nährboden (Agarplatten mit Minimalnährmedium) zu wachsen. Als Maß für die Mutagenität der untersuchten Probe dient die Zahl der prototrophen His-Revertanten, die unter Einfluß von gentoxischen Substanzen durch Mutationen im His- Operon gebildet werden. Der konventionelle Ames-Test wird mit mehreren Stämmen unterschiedlicher mutagener Spezifität (z.B. TA98, TA100, TA1535, TA97) als Platteninkorporationsassay [Maron, D.M. und Arnes, B.N.; Mutation Res. 113 (3-4), 1983, 173-215] durchgeführt. Dabei wird die zu testende Probe zusammen mit Weichagar, einem Puffer bzw. S9- Mix zur metabolischen Aktivierung nicht direkt mutagener Substanzen und den Testbakterien auf den Agar gegeben. Da die Testsubstanzen während der Inkubationszeit (48 Stunden) in Abhängigkeit ihrer Löslichkeit mehr oder weniger schnell in den Agar diffundieren, ist eine genaue, auf die Bakterien einwirkende Konzentration der zu testenden Probe nicht bestimmbar. Diese Applikationsart wird daher als Dosis bezeichnet (z.B. 100 μg/Platte).
Der auf Flüssigkultur umgestellte und als Fluktuationsassay in 384-well Mikrotiterplatten durchgeführte Amesll™-Test [Gee, P., Maron, D.M. und Arnes, B.N.; Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91 , 1994, 11606-11610] stellt eine Weiterentwicklung des konventionellen Arnes-Tests dar, die nun konzentrations-bezogene Untersuchungen ermöglicht. Das Wachstum der His-Revertanten bewirkt eine Ansäuerung und wird durch den Farbumschlag eines pH-abhängigen Indikators im Selektionsmedium angezeigt. Gezählt werden dabei alle bezüglich des Farbumschlags positiven Wells ohne Berücksichtigung der Farbintensität. Neben dem Rasterschub utationsstamm TA98 können sechs Stämme (TA7001-
7006), spezifisch für die sechs möglichen Basensubstitutionstypen, zum Einsatz kommen. In beiden Testformaten bietet der Ames-Test nur wenig Möglichkeiten der Automatisierung für den routinemäßigen Betrieb. Voraussetzung für eine Teilautomatisierung des Amesll™-Tests ist eine spezielle Laborausstattung für das Beimpfen und die Auswertung der 384-well Mikrotiterplatten.
Sowohl das Auswachsen der Revertanten zu zählbaren Kolonien (konventioneller Ames-Test) wie auch die stoffwechselbedingte pH- Absenkung (Amesll™) setzt eine 48stündige Inkubationsphase voraus, welche für die lange Testdauer verantwortlich ist. Die Selektion der
Revertanten über einen Nährstoffmangel birgt außerdem die Gefahr von falsch positiven Ergebnissen bei der Untersuchung von Umweltgemischen, die mit Nährstoffen verunreinigt sein können. Die lange Inkubationsdauer und die Art der Selektion erfordern weiterhin ein hohes Maß an Sterilität während der Testdurchführung, um ein
Anwachsen nicht testspezifischer Bakterien oder Pilze zu vermeiden.
Durch den hohen Zeit-, Arbeits- und Materialaufwand ist der Einsatz des Ames-Tests somit als Screening Methode bei großem Probendurchlauf limitiert. Die Position des Zielgens innerhalb des Chromosoms erschwert zudem eine gezielte Untersuchung der erfolgten Mutation. Das Zielgen für die Mutation ist Teil eines großen Operons bestehend aus mehreren Genen, so dass das eigentliche Reversionsereignis durch Mutationen in den anderen Genen überlagert sein kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen Mutationstest zu entwickeln, der die positiven Eigenschaften der schnellen Indikatortests und des empfindlichen Ames-Tests vereint. Er soll sich entsprechend der bekannten Indikatortests durch eine schnelle und automatisierbare Durchführung auszeichnen und so für das High-Throughput-Screening (HTP-Screening) geeignet sein. Es wurde gefunden, dass mit Hilfe speziell modifizierter Teststämme aus der Gruppe der Enterobacteriaceaen ein schneller und empfindlicher Mutationstest durchgeführt werden kann. Die Stämme tragen ein Reportersystem und einen durch gezielte Mutagenese ausgeschalteten Selektionsmarker. Als Selektionsmarker dient bevorzugt ein Antibiotikum-
Resistenzgen, welches nach Rückmutation das selektive Wachstum der Revertanten ermöglicht. Als Reporter werden Proteine verwendet, die bevorzugt proportional zur Zellzahl gebildet werden. Nur mutierte, wachsende Zellen können den stringent kontrollierten Reporter nach Induktion exprimieren. Die Messung erfolgt direkt oder indirekt über eine Farbreaktion, ein Lumineszenzsignal, ein Fluoreszenzsignal oder ein elektrochemisches Signal. Durch diese spezielle Kombination können unterschiedliche Mutationen in dem Selektionsmarker indirekt über das nur von wachsenden Zellen gebildete Reportersystem nachgewiesen werden. Es ist auch ein direkter Nachweis der durch Rückmutation wiedererlangten Funktionsfähigkeit des Zielgens möglich, wenn ein Selektionsmarker mit den Eigenschaften eines Reportersystems verwendet wird. Der eigentliche Mutagenitäts-Nachweis erfolgt nicht über das Zellwachstum wie im Stand der Technik, sondern über die Expression eines Reportersystems, so dass die Auswertung bereits nach wenigen Stunden erfolgen kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher isolierte prokaryontische Teststämme zum Einsatz in einem Mutagenitätstest, die folgende Merkmale aufweisen: a) einen revertierbar mutierten Selektionsmarker in Form eines Resistenzgens gegen bakteriotoxische oder bakteriostatische Stoffe oder Einflüsse, b) ein Reportersystem, das direkt oder indirekt zu einem meßbaren Signal führt und so selektiv in revertierten Bakterien nachgewiesen werden kann. In einer Ausführungsform kann der Selektionsmarker zugleich auch als Reportersystem dienen. Beispielsweise können dabei Selektionsmarker und Reportersystem identisch sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem
Selektionsmarker um ein Antibiotikum-Resistenzgen gegen ein bakteriolytisch wirkendes oder die Proteinbiosynthese hemmendes Antibiotikum.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Selektionsmarker um ein Tetrazyklin-Resistenzgen, ein Ampicillin-Resistenzgen, ein Kanamycin- Resistenzgen, ein Chloramphenicol-Resistenzgen oder ein Streptomycin- Resistenzgen.
in einer bevorzugten Ausführungsform führt das Reportersystem bei seiner Expression direkt oder indirekt zu einer Farbreaktion, einem Lumineszenz- oder Fluoreszenzsignal.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden als Reportersysteme das ß-Galactosidase-, Luciferase- oder ß-Lactamase-Gen bzw. -Operon verwendet.
Bevorzugt sind auch Teststämme, die zusätzlich über eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften verfügen: . eine für große lipophile Moleküle durchlässige Zellwand,
- eine defekte Exzisionreparatur,
- eine funktionsfähige Regulationseinheit des SOS-Systems
- die Mutatorgene umuDC und/oder mucAB
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis von mutagenen Agentien im Wesentlichen gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellen mindestens eines erfindungsgemäßen Teststammes; b) Inkubation der Teststämme aus Schritt a) mit dem potentiellen Mutagen; c) Selektion der zum Wachstum befähigten Revertanten; d) gegebenenfalls Induktion des Reportersystems (entfällt, wenn das
Reportersystem gleichzeitig Selektionsmarker ist oder falls nur ein Nachweis über Wachstumskontrolle durchgeführt werden soll); e) direkter oder indirekter Nachweis des Genprodukts des
Reportersystems und/oder Nachweis des Wachstums der revertierten Stämme.
In Schritt a) bedeutet das Bereitstellen mindestens eines Teststamms, dass ein oder mehrere Teststämme oder ein Gemisch mindestens zweier Teststämme bereitgestellt werden.
In einer Ausführungsform dient in Schritt e) der Selektionsmarker als Reportersystem, so dass der Nachweis des Genprodukts des Selektionsmarkers als Nachweis des Genproduktes des Reportersystem erfolgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis des Wachstums in Schritt e) mittels eines pH-Indikators im Medium.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Testkit zur Durchführung von Mutationstests, der mindestens einen erfindungsgemäßen Teststamm enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Teststamms für das HTP- Screening. Abbildung 1 zeigt die Genkarte des Plasmids eines Teststammes, der für den erfindungsgemäßen Mutationstest eingesetzt werden kann.
Teststämme, die für den erfindungsgemäßen Mutationstest eingesetzt werden können, enthalten einen bevorzugterweise Plasmid-Iokalisierten
Selektionsmarker, dessen Funktionsfähigkeit durch gezielte Mutagenese reversibel ausgeschaltet wurde, sowie ein induzierbares Reportersystem, falls der Selektionsmarker nicht gleichzeitig Reportersystem ist.
Als Teststämme werden Bakterien verwendet. Bevorzugt werden prokaryontische Teststämme der Gruppe der Enterobacteriaceae, besonders bevorzugt Escherichia coli oder Salmonella typhimurium mit einer im Genotyp festgelegten Kombination spezifischer Eigenschaften eingesetzt. Als Ausgangsorganismus werden bevorzugt die Stämme Salmonella typhimurium TA1535 (rfa, AuvrB) (McCann, J., Choi, E.,
Yamasaki, E. and Arnes, B.E.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72 (1975), S. 5135-5139) oder Escherichia coli EE122 (/fa-ähnliche Mutation, AuvrB) (Eisenstadt, E., Warren, A.J., Potter, J., Atkins, D. und Miller, H .; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 1982, 1945-1949) verwendet. Der Stamm EE122 zeichnet sich z.B. durch Robustheit und ein aktives chromosomales u uDC-Operon aus.
Aus dem Stand der Technik ist eine Vielzahl von Stämmen bekannt, die einen Selektionsmarker und ein induzierbares Reportersystem tragen. Im Gegensatz zu diesen Organismen ist der Selektionsmarker der erfindungsgemäßen Teststämme jedoch unter Funktionsverlust revertierbar mutiert. Erst durch die Einführung eines derart mutierten
Selektionsmarkers kann ein Teststamm für das erfindungsgemäße
Verfahren eingesetzt werden. Nach Behandlung des Teststamms mit mutagenen Agentien wird die Wiederaufnahme des Wachstums in dem Selektionsmedium als Folge eines Reversionsereignisses in dem Zielgen, welches für den Selektionsmarker codiert, durch das Reportersystem vorzugsweise quantitativ bestimmt.
Das Reportersystem der erfindungsgemäßen Teststämme ist bevorzugt induzierbar und wird bevorzugt proportional zu der vorhandenen Zellzahl gebildet. Der nicht induzierte Basallevel sollte möglichst niedrig sein. Das Reportersystem kann ein einzelnes Gen oder auch ein Operon sein.
Als Reporter kommen dabei Genprodukte in Frage, die direkt oder indirekt photometrisch, fluorimetrisch, luminometrisch oder elektrochemisch nachgewiesen werden können. Bevorzugte Genprodukte sind das GFP (Grün Fluoreszierendes Protein), die ß-Lactamase, die Luciferase und besonders bevorzugt die ß-Galactosidase, welche auf verschiedene bekannte Arten nachgewiesen werden kann.
Der Vorteil des GFPs liegt in der Möglichkeit des Nachweises ohne Zugabe von Substrat. Eine Beeinflußung der Aktivität des Reporters durch hemmende Inhaltsstoffe des Testgutes kann damit weitgehend ausgeschlossen werden.
Wenn Selektionsmarker und Reportersystem identisch sind, ist ein direkter Nachweis der Mutation möglich. Als Beispiel ist die ß-Lactamase zu nennen, welche eine Ampicillinresistenz vermittelt. Die durch Rückmutation wieder hergestellte Aktivität des Ampicillinasegens kann direkt direkt, z.B. durch Verwendung des Substrates Nitrocefin (O'Callaghan, C.H., Morris, A., Kirkby, S.K. and Shingler, A.H, Antimicrob. Agents Chemother. 1 (1972) 282-288; Sutton, L.D., Biedenbach, DJ., Yen, A. and Jones, R.N., Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 21 (1995) 1-8), nachgewiesen werden.
Durch die Verwendung der ß-Galactosidase kann andererseits ein - durch Akkumulation des Produktes der Enzymreaktion hervorgerufener -
Verstärkereffekt ausgenutzt werden. Die alternative luminometrische Meßmethode schaltet außerdem bestimmte Störfaktoren wie z.B. stark gefärbte Testsubstanzen aus.
Reportersystem und/oder Selektionsmarker können auf dem Chromosom enthalten sein oder auf einem stringent oder relaxiert kontrollierten Plasmid mit konstanter Kopienzahl vorliegen. Die bevorzugte Anzahl der Iow copy Plasmide beträgt 15-20 Kopien. Die gleichmäßige Verteilung auf die Tochterzellen sollte gewährleistet sein.
Das Reportersystem steht bevorzugt unter der Kontrolle eines streng regulierten, induzierbaren Promotors. Derartige Promotoren sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt wird der feM-Promotor verwendet, der durch das teπ^-codierte Repressorprotein reprimiert wird und durch die Zugabe von Tetrazyklin oder eines Tet-Derivates, z.B. Anhydrotetrazyklin eine gezielte Induktion des Reporters nach der Manifestation der Mutation ermöglicht. Für eine optimale Induktion des in resistenten (rückmutierten) Bakterienzellen werden bevorzugt atypische Tetrazykline wie das Anhydrotetrazyklin eingesetzt. Das Anhydrotetrazyklin-Derivat ist mit einem MIC ('Minimal Inhibition Concentration')-Wert von 2 μg/ml im
Vergleich zu 0,5 μg/ml für Tetrazyklin weniger antibiotisch wirksam [Olivia, B., Gordon, G., McNicholas, P., Ellestad, G. and Chopra, I Antimicrob. Agents Chemother. 36, 1992, 913-919] und bindet gleichzeitig ungefähr 35fach stärker an den Tet-Repressor [Degenkolb, J., Takahashi, M., Ellestad, G.A. and Hillen, W. Antimicrob. Agents Chemother. 35, 1991 , 1591-1595]. Durch Induktion der ß-Galactosidase unter der fetA-Promotor-Kontrolle mit Anhydrotetrazyklin erreicht man stärkere Signalwerte bereits bei sehr niedrigen, nicht hemmenden Antibiotikum-Konzentrationen.
Als Selektionsmarker in den erfindungsgemäßen Teststämmen wird ein durch Mutation inaktiviertes Resistenzgen eingesetzt, welches nach Rückmutation das selektive Wachstum der Revertanten ermöglicht. Als Genprodukte der Selektionsmarker kommen generell Resistenzproteine in Frage, die gezieltes Wachstum unter selektiven Bedingungen ermöglichen und deren codierendes Gen durch Mutation reversibel ausgeschaltet werden kann. Bei der durch das (intakte) Resistenzgen vermittelten Resistenz kann es sich um eine Resistenz gegen einen bakteriotoxischen oder bakteriostatischen Stoff wie beispielsweise ein Antibiotikum oder eine Einwirkung bzw. einen Einfluss (Noxe, z.B. Temperatur oder Strahlung) handeln. Bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Resistenzgen um ein Antibiotikumresistenzgen. Besonders bevorzugt werden als Selektionsmarker Resistenzgene gegen Antibiotika verwendet, die die Proteinbiosynthese hemmen oder bakteriolytisch wirken. Durch diese spezielle Art von Selektionsmarker wird nicht nur ein Wachstumsstopp der nicht mutierten und damit sensitiven Bakterien im Antibiotikum-haltigen Selektionsmedium erreicht, sondern auch das Ausschalten der Proteinbiosynthese bewirkt. Dadurch bleibt der Signal-Hintergrund durch nichtmutierte Bakterien nach Induktion niedrig. Es muß gewährleistet sein, dass der Selektionsdruck über die Testdauer aufrecht erhalten wird.
Als Selektionsmedium werden für die Teststämme übliche Medien verwendet, die, falls die Selektion nicht durch Einwirkungen wie z.B. Strahlung oder Temperatur hervorgerufen wird, Zusätze des entsprechenden Selektionsagens enthalten. Der Fachmann ist in der Lage, in Abhängigkeit des verwendeten Teststammes, des jeweiligen Resistenzmechanismus und der Anzahl der Resistenzgene geeignete Selektionsmedien zusammenzustellen. Die Konzentrationen der Antibiotika im Selektionsmedium bewegen sich im üblichen Rahmen. Im Falle von Ampicillin werden bevorzugt ca. 50 μg/ml verwendet. Die Konzentrationen der Antibiotika sind abhängig von der Art des Plasmids, auf dem das Resistenzgen lokalisiert ist, von der Art des
Resistenzmechanismus und vom verwendeten Teststamm.
Durch die erfindungsgemäß zur Selektion verwendete Antibiotikums- Resistenz sind der Auswahl des Mediums weniger Grenzen gesetzt als z.B. im Stand der Technik bei der Durchführung konventioneller Mutagenitätstests. Solche Tests beruhen z.B. auf der Bildung von prototrophen His-Revertanten. Dadurch können nur Minimal-Medien verwendet werden, um sicherzustellen, dass das Selektionsmedium kein Histidin enthält. Für das erfindungsgemäße Verfahren dagegen kann jede Art von Medium verwendet werden, das alle Bestandteile enthält, die für das Wachstum der verwendeten Keimsorte notwendig sind. Die Selektion erfolgt nicht über einen fehlenden Nährstoffbestandteil sondern bevorzugt über den Zusatz eines Antibiotikums. Daher werden erfindungsgemäß statt eines Minimalmediums bevorzugt Vollmedien eingesetzt. Dies führt zu einem besseren und schnelleren Wachstum der revertierten Keime und ermöglicht so eine besonders schnelle Durchführung und Auswertung des Tests.
Das als Selektionsmarker dienende Gen kann zum Nachweis eines Mutationstyps eine bestimmte Art von Mutation aufweisen. Weiterhin können durch unterschiedlich mutierte Varianten des Zielgens auf einem Plasmid verschiedene Mutationstypen mit nur einem Teststamm abgedeckt werden, sofern die Spontanmutationsraten der kombinierten Mutationstypen in der gleichen Größenordnung liegen. Dies führt zu einer deutlichen Reduktion des Arbeits- und Materialaufwands, da die
Verwendung vieler Stämme und aufwendige Parallelbestimmungen nicht mehr notwendig sind. Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Teststämme durch gezielte Mutagenese [Kunkel , T.A; Proc.Natl. Acad. Sei. USA; 82 (2) 488-92] werden mit Hilfe der PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion)-Technik und anderer DNA-modifizierender Enzyme die verschiedenen Mutationstypen
(Rasterschub- und Basensubstitutionsmutationen) direkt bei der Synthese des betroffenen Plasmides mittels eines mutierten Primerpaares in bekannte oder künstlich erzeugte Regionen mit besonderer Empfindlichkeit für mutagene Ereignisse (Hot-Spot Regionen) bzw. in aktive Zentren der Antibiotikumresistenzgene eingeführt. Die verschiedenen Mutationstypen sowie geeignete Hot-Spot Regionen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Mutationstests bekannt. Besonders anfällig sind beispielsweise repetitive Basenabfolgen mit hohem Guaninanteil oder alternierende GC-Boxen. Bei Basensubstitutionen kommen häufig G-A-Transitionen und G-T Transversionen vor.
Durch eine Rückmutation in dem durch Deletion, Insertion oder dem Austausch von Basen veränderten Sequenzabschnitt soll das Stadium der Antibiotikumresistenz wiedererlangt werden. Bei der Veränderung der Sequenzabschnitte, die für die Bildung des aktiven Zentrums verantwortlich sind, sollte berücksichtigt werden, dass meist nur exakte Rückmutationen die Funktionsfähigkeit des Zielgens wieder vollständig herstellen können. Bei einer Lokalisation des Mutations-Hot-Spots am Anfang des Leserahmens des Zielgens steht ein längerer Genbereich für eine Rückmutation zur Verfügung. Bei einem Basenaustausch wird bevorzugt entweder eine für die Funktionsfähigkeit des Proteins wichtige Aminosäure verändert oder aber ein Stoppcodon eingeführt. Dieses liegt dann bevorzugt vor dem für die Funktionsfähigkeit des Proteins wichtigen Genabschnitt. Bei der Einführung von Rasterschubmutationen muß die Möglichkeit der Eröffnung alternativer Leserahmen berücksichtigt werden. Vorzugsweise besitzen die Teststämme neben Selektionsmarker und Reportersystem weitere Eigenschaften, die sie für den erfindungs- gemäßen Test empfindlicher und universell einsetzbar machen. Dies ist vor allem eine für große, lipophile Moleküle durchlässige Zellwand (z.B. rfa- oder rfa-ähnliche Mutation) und/oder eine defekte Excisionsreparatur (z.B. Mutation im uvrA- oder ß-Gen).
Zusätzlich sollte das Testbakterium bevorzugt über eine funktionsfähige Regulationseinheit des SOS-Systems verfügen. Verschiedene Gene des SOS-Systems sind für einen empfindlichen und vollständigen Nachweis mutagener Substanzen sehr vorteilhaft. Dazu zählen die Gene recA, lexA, umuDC und/oder mucAB. Die homologen Genprodukte UmuDC bzw. MucAB bezeichnet man auch als Mutatorgene, da sie im Zuge gentoxischer Ereignisse die Ausbildung von Mutationen in den Bakterien verstärken bzw. erst ermöglichen. Während umuDC funktionsfähig auf dem Chromosom von E.coli lokalisiert ist, wurde das muc \ß-Operon von natürlich vorkommenden Plasmiden isoliert (McCann, J. and Arnes, B.E.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73 (1976) S. 950-954). Diese Genprodukte wirken vielfach synergistisch und verhindern einen ansonsten letalen Replikationsstopp. Die Genprodukte RecA und LexA dienen der Erkennung von DNA-Schäden und regulieren die Induktion der Gene des SOS-Systems.
Von Vorteil ist zusätzlich das Fehlen von Antibiotikumresistenzen im Ausgangsstamm.
Bei Verwendung von Testbakterien, die über kein chromosomales Umu- Operon verfügen, kann dieses oder bevorzugt das Muc-Operon zusätzlich über ein Plasmid eingebracht werden. Als Quelle für die Sequenz des Muc-Operons kann das Plasmid pKM101 [McCann, J., Spingarn, N.E., Kobori, J. und Arnes, B.N.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72(3), 1975, 979-983] dienen, welches aus dem Stamm Salmonella typhimurium TA100 oder TA98 isoliert werden kann. Nach Amplifizierung mittels PCR [Mullis, K.B. und Falaona, F.A.; Methods Enzymol. 155, 1987, 335-350] und Klonierung kann die Funktionsfähigkeit des Muc-Operons auf dem neuen Plasmid im Ames-Test überprüft werden. Mit der Testsubstanz Nitrofurazon, welche ihre mutagene Wirkung hauptsächlich über das SOS-System entfaltet [Bryant und McCalla; Chem. Biol. Interact. 31 (2) 1980, 151-66], sollte bei den Stämmen mit dem klonierten Muc-Operon eine deutlich erhöhte Mutationsrate gegenüber der Kontrolle beobachtet werden [Zeiger, E., Anderson, B., Haworth, S., Lawlor, T., Mortelmans, K. and Speck, W; Environm. Mutagen. 9 (9) 1987, 1-110]. Dieses über Transformationsmethoden eingebrachte Plasmid muß einen für die Vermehrung in dem Teststamm geeigneten Replikationsursprung und einen Marker für die Aufrechterhaltung des Plasmids während des Wachstums enthalten. Auf diesem Plasmid können außerdem das mutierte Zielgen sowie das induzierbare Reportersystem lokalisiert sein.
Die Herstellung mehrerer Plasmide, welche jeweils nur eine spezielle Mutation aufweisen, ermöglicht eine Differenzierung der Mutagene, so dass ein Mutationsspektrum erstellt werden kann. Die Mutationsanalyse mittels molekularbiologischer Methoden wird dabei durch die bevorzugte Lage des mutierten Gens auf dem Plasmid erleichtert. Ferner ist es möglich, durch die Amplifizierung des mutierten und als Selektionsmarker dienenden Gens mit verschiedenen Mutationstypen auf einem Plasmid mehrere mögliche Mutationsvarianten gleichzeitig zu erfassen.
Durch simultanen Einsatz eines vom Genotyp her analogen jedoch nicht revertierbaren Teststammes kann die Zytotoxizität des Testgutes verfolgt werden.
Die bisher eingesetzten Teststämme (Ames-Test) basieren auf der Wiedererlangung eines prototrophen Wachstums und sind daher anfällig für wachstumsfördernde Substanzen, was sich vor allem bei der Untersuchung von Umweltproben mit hohem organischem Anteil negativ auswirken kann. Durch die erfindungsgemäße Selektion der Revertanten, bevorzugt über eine Antibiotikumresistenz, kann die Erzeugung falsch positiver Ergebnisse drastisch reduziert und Verunreinigungen mit nicht testspezifischen Mikroorganismen vermieden werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Testkit zum schnellen Nachweis von mutagenen Substanzen. Dieser Testkit zur
Durchführung von Mutationstests umfaßt zumindest einen oder mehrere erfindungsgemäße Teststämme, die auch als Stammgemisch enthalten sein und/oder eingesetzt werden können. Weiterhin können zusätzlich optionale Bestandteile, wie das Substrat des Reportersystems, eine Stopp-Lösung oder spezielle Selektions- bzw. Selektions/Indikatormedien in dem Testkit enthalten sein. Bei diesen Zusätzen handelt es sich typischerweise um Reagenzien, die auch unabhängig von dem Testkit käuflich zu erwerben sind. Um Anwendern die Durchführung des Tests nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu erleichtern, enthält der Testkit bevorzugt zusätzlich eine Versuchsanleitung und ein
Auswerteprogramm. Die erfindungsgemäßen Testkits können für den Einzelnachweis mutagener Substanzen oder für das HTP-Screening verwendet werden.
Abbildung 1 zeigt das Beispiel eines Plasmids eines erfindungsgemäßen Teststamms. Der Teststamm enthält ein Single copy Plasmid oder ein Iow copy Plasmid mit mittlerer Kopienzahl (15-20 Kopien). Bestandteile des Plasmides sind:
- ein Replikationsursprung, der ein Einzelplasmid bzw. eine mittlere Kopienzahl garantiert (z. B. pMB1-Origin)
- die par-Region, welche eine gleichmäßige Verteilung des Plasmides auf die Tochterzellen sicherstellt
- das mutierte Selektionsgen als Zielgen für Mutationen (amps)
- das konstitutiv exprimierte Repressorgen für das Tet-Repressorprotein (tetR)
- das muc \ß-Operon
- ein Resistenzgen zur Erhaltung des Plasmides (R) - das /acZ-Reportersystem unter Kontrolle des tetA-Promotors
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ein oder mehrere erfindungsgemäße Teststämme in einer Zellzahl von typischerweise 107 bis 109 / ml bereitgestellt. Geeignete Medien für die
Kultur von Bakterien sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt wird ein Vollmedium wie z.B. Luria-Bertani (LB-) Medium verwendet.
Die Durchführung des Tests kann in Mikrotiterplatten oder ähnlichen für die Bakterienkultur geeigneten Gefäßen erfolgen.
Den Zellen wird zunächst die zu untersuchende Substanz oder das zu untersuchende Substanzgemisch und gegebenenfalls weitere Reagenzien, wie z.B. S9-Mix zugesetzt. Anschließend werden die Zellen für einen bestimmten Zeitraum vorinkubiert. Das Selektionsagens wird je nach Wirkungsweise sofort oder aber zu einem bestimmten Zeitpunkt der Vorinkubation zugesetzt. Eine Vorinkubation ist insbesondere notwendig, damit die Zellen über einen ausreichend langen Zeitraum in Kontakt mit den zu testenden Substanzen kommen können, so dass sich ein gesetzter Schaden während der Replikation als Mutation manifestieren kann. Typischerweise beträgt die Vorinkubation 0,5 bis 2 Stunden.
Anschließend werden die Zellen in der Selektionsphase für einen Zeitraum von typischerweise 5 bis 24 Stunden inkubiert. Die Inkubationszeit ist u.a. abhängig von der Vorinkubationszeit, der Inkubationstemperatur, der Selektionsart, vom Reportersystem, vom Medium und der Vorverdünnung der Testansätze. Bei 37 °C werden typischerweise 5 bis 8 Stunden zur Inkubation benötigt, bei z.B. 28-30 °C werden typischerweise 15 bis 20 Stunden benötigt. Anschließend wird das Reportersystem durch Zugabe des entsprechenden Induktionsagens induziert und das Gemisch typischerweise 1 bis 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Falls das Reportersystem mit dem Selektionsmarker identisch ist, entfällt dieser Induktionschritt. Die Bestimmung der Mutagenität der zu untersuchenden Substanz erfolgt durch den Nachweis des Genproduktes des Reportersystems. Dazu wird je nach Reportersystem eine photometrische, fluorimetrische, luminometrische oder elektrochemische Messung durchgeführt.
Anstelle oder zusätzlich zu dem Nachweis der Revertanten durch Induktion des Reportergens können diese auch über ihr Wachstum nachgewiesen werden. Insbesondere bei der Verwendung eines Vollmediums erfolgt das Wachstum der Revertanten in der Regel so schnell, dass der Nachweis schon nach ca. 16-18 Stunden erfolgen kann. Der Nachweis des
Wachstums kann entweder über direkte Trübungsmessung oder einen im Medium vorhandenen Indikatorfarbstoff erfolgen. Bei der durch das Bakterienwachstum bewirkten Veränderung des pH-Werts des Mediums erfolgt ein Farbumschlag des Indikators. Geeignete Indikatoren sollten einen Farbumschlag zwischen pH 7 und pH 5 zeigen. Beispiele geeigneter Indikatoren sind z.B. Bromkresolrot oder Bromthymolblau. Der Indikator darf kein gentoxisches Potential besitzen und das Bakterienwachstum nicht entscheidend beeinflussen.
Mit Hilfe dieser zusätzlichen Möglichkeit des Nachweises revertierter
Keime, stehen dem Anwender zwei einfache und empfindliche Nachweis- Systeme zur Verfügung. Der Nachweis über das Zellwachstum ist sehr einfach und benötigt keine Induktion des Reportergens. Die Auswertung kann durch Detektion des Farbumschlags erfolgen. Diese Nachweismethode führt nur zu qualitativen Ergebnissen. Eine quantitative Aussage ist dann möglich, wenn Aliquots des Testansatzes auf mehrere Ansatz (z.B. Wells) verteilt werden und die Anzahl der Ansätze, die einen Farbumschlag zeigen, in Beziehung zur jeweiligen Konzentration des Testguts gesetzt wird. Der bevorzugte Nachweis über die Induktion des Reportergens dagegen läßt eine direkte quantitative Aussage zu, da die Intensität des Signals bestimmt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den Vorteil, Mutationen sehr schnell nachweisen zu können. Durch die wesentliche Verkürzung der Inkubationszeit gegenüber bisherigen Testsystemen und die erfindungsgemäße Selektionsmethode wird eine weitreichende Automatisierung der Testdurchführung möglich. Während bislang nur 1 bis 2 Testtage pro Woche durchgeführt werden konnten, ist es nun möglich, 4 bis 5 Testzyklen pro Woche durchzuführen.
Bei Verwendung luminometrischer Meßmethoden sind bereits wenige mutierte Zellen innerhalb kürzester Zeit nachweisbar, so dass durch das erfindungsgemäße Verfahren sowohl für Substanzscreenings in der Industrie als auch für die Testung umweltrelevanter Substanzen oder Multikomponentengemische ein in wenigen Stunden durchführbarer Mutationstest zur Verfügung steht.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Unempfindlichkeit der verwendeten Teststämme gegenüber Mutationen in metabolisch relevanten Genen. Bei Mutationstests, in denen aufgrund des Selektionsverfahrens Minimalmedien verwendet werden müssen, führen Mutationen in anderen für den Metabolismus und die Nährstoffversorgung relevanten Genen häufig zu einem deutlich verminderten Wachstum der Revertanten bis hin zu einem Absterben der Keime. Die erfindungsgemäßen Keime dagegen können in Vollmedien selektiert werden, so dass die Keime viele Nährstoffe aus dem Medium beziehen können und auf Mutationen in metabolisch relevanten Genen wesentlich unempfindlicher reagieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zum Einsatz in der Produktentwicklung der Chemischen, Pharmazeutischen und Kosmetischen Industrie sowie in der Umweltanalytik (Abwässer,
Oberflächenwässer, Sedimente, Schwebstoffe, Raumluft, Altlasten, Reinsubstanzen). Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, insbesondere der korrespondierenden Anmeldung DE 101 32 280.1 , eingereicht am 04.07.2001 , ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.
Beispiele
Das folgende Durchführungsbeispiel bezieht sich auf die Verwendung von Ampicillin-sensitiven Stämmen mit einem Plasmid-Iokalisierten mutierten Ampicillin-Resistenzgen (Rasterschubstamm und Basenaustauschstamm) und dem feM-Promotor kontrollierten Reportersystem ß-Galaktosidase. Das Plasmid ist in den Teststamm E. coli EE122 oder Salmonella typhimurium TA1535 eingebracht. Als Detektionsmethode wird die chemiluminometrische Messung beschrieben. Der Stamm zur Detektion von Rasterschubmutationen wird im Folgenden und in den angegebenen Ergebnisbeispielen als 4S bzw. 6S, der Stamm zur Detektion von Basenaustauschmutationen als 3S bzw. 14S bezeichnet.
Die im Duchführungsbeispiel verwendeten Teststämme tragen ein Plasmid mit einem vom pBR322 [Sutcliffe, J.G.; Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43, 1997, 77-90] abgeleiteten Replikationsorigin (pMB1 ). Durch zusätzliche Klonierung der par('partition')-Region aus pSC101 [Meacock, P.A. und Cohen, S.N., Cell 20, 1980, 529-542] wurde die stabile Vererbung des Plasmides auf die Tochterzellen sicher gestellt. Als Spenderplasmid für das zweite Resistenzgen (in aufgeführten Beispiel das cam-Resistenzgen) diente das Plasmid pBR328 (National Institute of Genetics, Yata, Japan). Das muc>4ß-Operon wurde dem Plasmid pGW1700 [Perry, K.L. und Walker, G.G., Nature 300, 1982, 278-281] entnommen. Für die stringent kontrollierte Expression des ß-
Galaktosidase-Reportergens musste die lacZY-Gensequenz im richtigen Leserahmen hinter die Promotor/Operator-Region (tetp/0) des teM-Gens in das Plasmid pASK75 [Skerra, Gene 151 , 131-135, 1994] kloniert werden. Dieses enthält zusätzlich das für den fef-Repressor (TetR) codierende Gen transkriptionell fusioniert an das konstitutiv exprimierte bla-Gen (Ampicillin-Resistenz), wodurch eine starke Repression des tetA- Promotors erzielt wird [Skerra , Gene 151 , 131-135, 1994]. Als Quelle für die lacZY-Gene diente das Plasmid pMC1403, in dem die Promotorregion und die ersten acht Aminosäuren (inklusive des Start-ATG's) der ß- Galaktosidase fehlen [Casadaban et al., J. Bacteriol. 143, 1980, 971-980]. Da für die Isolierung der Sequenz aus pMC1403 nur wenige Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stehen, wurden die /acZY-Gene zunächst in den pGFPuv Vektor kloniert. Die nun am 5'-Ende der lacZ- Sequenz liegenden Restriktionsenzyme der 'Multiple Cloning Site' (MCS) ermöglichten dann eine gerichtete Klonierung in den Leserahmen hinter das Start-ATG des teM-Gens.
Durch gezielte Mutagenese wurden die Basensubstitution bzw. Rasterschubmutation in das ß-Lactamase-Gen eingeführt. Als Beispiel einer Basensubstitution wurde im aktiven Zentrum 67 Aminosäuren nach dem Start-ATG eine Transition von Adenin zu Guanin vorgenommen. Dadurch wurde anstelle der Aminosäure Serin die Aminosäure Glycin eingeführt (5'-AGC-3' - 5'-GGC-3') und infolge dessen die ß-Lactamase reversibel inaktiviert. Als weiteres Beispiel einer Basensubstitution
(Stamm 14S) wurde 66 Aminosäuren nach dem Start-ATG eine
Transversion von Thymin zu Guanin vorgenommen. Dadurch wurde anstelle der Aminosäure Methionin die Aminosäure Arginin eingeführt (5'- ATG-3' → 5'-AGG-3'). Als Beispiel einer Rasterschubmutation (Samm 4S) wurden in einer alternierenden GC-Box neun Aminosäuren nach dem aktiven Serin-Rest die Basen Guanin und Cytosin eingeführt, wodurch 44 Aminosäuren nach der Mutation ein Stopp-Codon (TGA) resultierte. Bei einem weiteren Rasterschubmutationsstamm (Stamm 6S) wurde 17 Aminosäuren nach dem aktiven Zentrum ein zusätzliches Guanin integriert, wodurch 19 Aminosäuren nach der Mutation ein Stopp-Codon resultierte. In allen Fällen wurde die ß-Lactamase reversibel inaktiviert. Das Plasmid wurde in den Stamm Escherichia coli EE122 [Δ(lac proB) Δ(uvrB gal bio) ara thi rfa] [Eisenstadt, E., Warren, A.J., Porter, J., Atkins, D. und Miller, J.H., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 1982, 1945-1949] eingebracht.
1. Vorkultur
Die Bakterien (3S, 14S, 4S bzw. 6S) werden über Nacht (oder mindestens für 3 bis 4 Stunden) in einem Inkubator unter Schütteln bei 37° C in Luria- Bertani (LB)-Medium unter Zusatz des Antibiotikums zur Aufrechterhaltung des Plasmides inkubiert. Am nächsten Morgen (bzw. nach 3 bis 4 Stunden) werden die Bakterien mit LB-Medium auf eine Zellzahl von ca. 2,5 x 107 (entspricht E60o von ca. 0,05) eingestellt und bis zur Inkubation mit den Testsubstanzen auf Eis gehalten.
2. Vorbereitung der Testplatten und Inkubation 2.1 Vorinkubationsphase
Die Vorinkubation kann z.B. mit 24Well- oder 96Well-Testplatten durchgeführt werden.
Bei der Inkubation ohne S9-Mix werden 10 μl verschiedener Konzentrationen der Testsubstanz, der Negativkontrollsubstanz (Lösungsmittelkontrolle) sowie der Positivkontrollsubstanz zu jeweils 1 ml der nach Absatz 1 eingestellten Bakterien gegeben. Bei Substanzen, die zur Ausprägung ihres mutagenen Potentials S9 bedürfen, wird ein S9- Kofaktormix und S9 zugesetzt. Die Herstellung des Kofaktormix erfolgt stets frisch am Testtag nach Maron und Arnes (Maron und Arnes; Mutation Res. 113, 1983, 173-215). Zur Inkubation mit S9 wird 1 ml der nach Absatz 1 eingestellten Bakterien vorgelegt. Dazu werden 70 μl Kofaktormix und 10 μl S9 gegeben. Danach werden 10 μl der zu testenden hinzugeben. Der Ansatz wird gut gemischt. Es schließt sich eine 90minütige Vorinkubation bei 37 °C unter Schütteln an.
2.2 Selektionsphase
Nach der Vorinkubation werden die Testansätze 1 :10 mit LB-Medium (+ 50 μg/ml Ampicillin) verdünnt und für 6 (Kurzzeittest bei 37 °C) bis 16 Stunden (Langzeittest bei 28 - 30 °C) in 24Well, 96Well oder 384Well Platten inkubiert.
3. Induktion des Reportersystems
Zur Induktion des Reportersystems werden die Ansätze mit 100-200 ng/ml
Anhydrotetrazyklin versetzt und 1-2 Stunden bei 37° C inkubiert.
4. Messung der Mutagenität
Für den luminometrischen Enzymtest des Reportersystems werden 60 μl der Bakteriensuspension mit 90 μl Lysepuffer und 30 μl Substrat-Lösung (Galacton-Plus®; Applied Biosystems, PE Deutschland GmbH) gemischt. Zum Abstoppen der Reaktion nach 30 min Inkubation bei 28 °C werden 120 μl Stopp-Lösung zugesetzt. Anschließend werden 100 μl des
Gesamtansatzes für die luminometrische Messung entnommen. Nach automatischer Injektion von 100 μl Lumineszenz-Enhancer-Lösung (Luminescent Enhancer, Emerald®; Applied Biosystems, PE Deutschland GmbH) wird jeder Ansatz im Luminometer nach einer Wartezeit von 2 sec über einen Zeitraum von 5 sec gemessen. Zur Messung der Chemolumineszenz können 96Well Luminometer (z.B. Labsystems, Luminoscan) oder Einkanalluminometer (z.B. Berthold, Lumat) verwendet werden.
5. Toxizitätskontrolle
Der Ansatz zur Toxizitätskontrolle wird analog dem Ansatz zur Mutagenitätstestung durchgeführt. Als Teststamm kann ein nicht revertierbarer, jedoch vom sonstigen Genotyp her identischer Stamm verwendet werden. Die Toxizitätskontrolle kann ebenfalls mit den revertierbaren Teststämmen durchgeführt werden. Der Ansatz hierzu ist analog dem Ansatz zur Mutagenitätstestung. Nach 90 min Vorinkubation ohne Selektionsagenz wird sofort die optische Dichte der Testansätze (EΘOO nm) gemessen. Sind die gemessenen E600-Werte der Substanzansätze geringer als die der Kontrollansätze, so liegt Zytotoxizität vor.
Hinweise auf die Toxizität einer mutagenen Substanz können auch aus dem Kurvenverlauf der rlu-Werte gezogen werden. Von zunehmend toxischer Wirkung einer Testsubstanz kann gesprochen werden, sobald die Kurve der rlu-Werte abzuflachen beginnt und eventuell mit weiter zunehmenden Substanzkonzentrationen absinkt.
6. Auswertung
Die Rohdaten (rlu-Werte: relative Lumineszenzeinheiten) werden in ein MS Excel Auswerteprogramm transferiert. Berechnet werden die Mittelwerte der rlu abzüglich der Leerwertkontrolle und die Verhältnisse der Testansätze gegen Kontrollansätze.
In dem hier vorgestellten Beispiel wird eine Substanz als mutagen betrachtet, wenn das Signal/Hintergrundverhältnis den Faktor 2 bei mindestens 2 Konzentrationen erreicht und eine Konzentrations- Wirkungsbeziehung vorliegt.
Ergebnisbeispiel 1
Kurzzeittest: Vorinkubation: 90 min.; Selektionsphase: 6 Stunden
Langzeittest: Vorinkubation: 90 min.; Selektionsphase: 16 Stunden
Ergebnisbeispiel 2
Langzeittest und Detektion über Farbumschlag (Bromkresolrot)
Wird der Langzeittest durchgeführt, kann die Detektion der Revertanten auch über einen Farbumschlag (durch Zusatz von z.B. Bromkresolrot zum Selektionsmedium) erfolgen. Nach der Vorinkubation werden die Bakterien mit LB-Medium (+ Ampicillin + Bromkresolrot ) verdünnt und für 16-18 Stunden in 24Well-, 96Well- oder 384Well-Platten bei 37° C inkubiert. Die Induktion des Reportergens entfällt. Die Auswertung erfolgt entweder durch Auszählen der .positiven' (im Falle von Bromkresolrot der gelben) Wells oder durch Messung mit einem Photometer.
* Rückgang der positiven Wells durch Zytotoxizität bei hohen NQO-Konzentrationen
Ergebnisbeispiel 3:
Langzeittest und Detektion über Farbumschlag (ß-Lactamaseaktivität)
Wird der Langzeittest durchgeführt, kann die Detektion der Revertanten auch über den direkten Nachweis der nach Rückmutation zurückerlangten ß-Lactamaseaktivität erfolgen. Nach der Vorinkubation werden die Bakterien mit LB-Medium (+ Ampicillin) verdünnt und für 16-18 Stunden in 24Well-, 96Well- oder 384Well-Platten bei 37° C inkubiert. Die Induktion des Reportergens entfällt. Nach Zusatz von 50μl ß-Lactamasesubstrat (z. B. Nitrocefin [Testkonzentration 50 μg/ml]) werden die Testansätze 5 bis 10min. inkubiert.
Die Auswertung erfolgt entweder durch Auszählen der , positiven' Wells oder durch Messung mit einem Photometer (Nitrocefin: E492 nm).

Claims

Ansprüche
1. Isolierter prokaryontischer Teststamm zum Nachweis von Mutagenen zumindest aufweisend a) einen revertierbar mutierten Selektionsmarker in Form eines
Resistenzgens gegen bakteriotoxische oder bakteriostatische Stoffe oder Einflüsse; b) ein Reportersystem, dessen Expression selektiv in revertierten Bakterien nachgewiesen werden kann.
2. Teststamm nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker zugleich auch als Reportersystem dient.
3. Teststamm nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker ein Antibiotikum- Resistenzgen gegen ein bakteriolytisch wirkendes oder die Proteinbiosynthese hemmendes Antibiotikum ist.
4. Teststamm nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Selektionsmarker um ein
Tetrazyklin-Resistenzgen, ein Ampicillin-Resistenzgen, ein Kanamycin- Resistenzgen, ein Chloramphenicol-Resistenzgen oder ein Streptomycin- Resistenzgen handelt.
5. Teststamm nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Reportersystem bei seiner Expression direkt oder indirekt zu einer Farbreaktion, einem Lumineszenz- oder Fluoreszenzsignal führt.
6. Teststamm nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Reportersystem das ß-Galactosidase-, ß- Lactamase- oder Luciferase-Gen bzw. -Operon verwendet wird.
7. Teststamm nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 zusätzlich aufweisend eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: a) eine für große, lipophile Moleküle durchlässige Zellwand; b) eine defekte Excisionsreparatur c) eine funktionsfähige Regulationseinheit des SOS-Systems d) die Mutatorgene umuDC und/oder mucAB
8. Verfahren zum Nachweis von Mutagenen im wesentlichen gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellen mindestens eines Teststamms entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 7; b) Inkubation des Teststamms mit dem potentiellen Mutagen; c) Selektion der Revertanten; d) gegebenenfalls Induktion des Reportersystems; e) Nachweis des Genprodukts des Reportersystems und/oder Nachweis des Wachstums der revertierten Stämme.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt e) der Nachweis des Genprodukts des Selektionsmarkers als Nachweis des
Gen Produktes des Reportersystem erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des Wachstums in Schritt e) mittels eines pH-Indikators im Medium erfolgt.
11. Testkit zur Durchführung von Mutationstests im wesentlichen enthaltend einen oder mehrere Teststämme entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 7.
12. Verwendung mindestens eines Teststamms nach einem der Ansprüche 1 bis 7 für das HTP-Screening.
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