DE60129028T2

DE60129028T2 - Zelluläre arrays zur identifizierung von veränderter genexpression

Info

Publication number: DE60129028T2
Application number: DE60129028T
Authority: DE
Inventors: Gregory E. Wilmington GONYE; Robert A. West Chester LAROSSA; Tina K. Wilmington VAN DYK; Antoni J. Wilmington RAFALSKI; Michael K. Wilmington HANAFEY
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2000-04-14
Filing date: 2001-04-12
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2021-04-13
Also published as: JP2003530845A; US20040146922A1; DE60129028D1; KR20020089462A; WO2001079419A2; US20040142373A1; EP1320629A2; IL151346A0; CA2400635A1; EP1320629B1; WO2001079419A3; US6716582B2; US20030219736A1; ATE365228T1

Description

Die vorliegende Patentanmeldung beansprucht den Nutzen aus der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/197 348 , eingereicht am 14. April 2000.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der bakteriellen Genexpression. Noch spezieller beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Monitoring von transkriptionellen Änderungen an einer genomweiten Skala unter Anwendung einer genomregistrierten Genfusion-Sammlung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die DNA-Arrayanalyse ist eine leistungsstarke Methode für eine umfassende Analyse der Genexpression. Gegenwärtig ist diese Vorgehensweise die einzige verfügbare Methode für im großen Rahmen parallele Analysen, die die Expression jedes Gens eines bakteriellen Genoms ermöglichen, das gleichzeitig charakterisiert werden soll (Richmond et al., (1999) Nucleic Acids Res. 27:3821-3835, 17, 25; Tao et al., (1999), J. Bacteriol. 181:6425-6440; Wilsonb et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 96:12833-12838).
Von Richmond et al. ((1999) Nucleic Acids Research, 27:3821-3835) wurde kürzlich eine genomweite Expressionsprofilbestimmung von E. coli an der einzigen ORF-Stufe der Auflösung veröffentlicht. Änderungen in den RNA-Stufen nach Exponierung an einem Hitzeschock oder IPTG wurden unter Anwendung umfassender Blots niedriger Dichte einzelner ORFs an eine Nylon-Matrix und umfangreicher Arrays hoher Dichte einzelner ORF analysiert, die auf Objektträgern getüpfelt waren. Es wurden die Ergebnisse der zwei Methoden verglichen. Richmond et al. erklären, dass radioaktive Sonde/Spot-Blots den Fluoreszenz-Sonde/Mikroarrays unterlegen sind. Darüber hinaus ist der Vergleich der Hitzeschockbehandlung zwischen den zwei Methoden grundsätzlich fehlerbehaftet, da die mit den Spot-Blots analysierten RNA von auf Kulturmedium gezogenen Kulturen abgeleitet war, während solche, die mit Mikroarrays analysiert wurden, von Zellen abgeleitet waren, die in definierten Medien aufgezogen wurden. Trotz der Leistungsfähigkeit dieser neuartigen Methodik bestehen mehrere Probleme, die die Zuverlässigkeit der Ergebnisse einschränken. Beispielsweise können Artefakte während der Isolation mikrobieller RNA entstehen (Tao et al., (1999) J. Badteriol. 181:6425-6440) oder aus Kreuzhybridisierung zu paralogen Genen (Richmond et al., (1999) Nucleic Acids Res. 27:3821-3835, 17, 25).
Eine andere Einschränkung der Methode des DNA-Arrays besteht darin, dass RNA isoliert werden muss, in DNA mit Hilfe von Revertase umgewandelt werden muss mit gleichzeitigem Einbau von Fluoreszenzmarkern. Diese Schritte lassen es unwahrscheinlich erscheinen, dass auf der Grundlage der Technologie des DNA-Arrays oberflächlich leistungsstarke Screenings entwickelt werden könnten. Es besteht daher eine Notwendigkeit für eine Methode, mit der die Ergebnisse aus der Technologie des DNA-Arrays in leistungsstarke Screenings adaptiert werden. Aus den vorstehend ausgeführten Gründen und anderen werden alternative Methoden genomweiter Expressionsprofilbestimmung sowie schnelle Methoden zur unabhängigen Verifizierung der Ergebnisse aus Versuchen des DNA-Arrays benötigt.
Die Technologie der Genfusion ist eine etablierte Methode für das Monitoring der Genexpression. Beispielsweise wurde die erste Entdeckung des SOS (DNA-Schadensanwort)-Regulon von E. coli von Kenyon und Walker ((1980) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 77:2819-2823) ausgeführt, indem die Transkriptionsantworten von Escherichia coli auf Mitomycin C (MMC), einem DNA-Schadensmittel, verglichen wurden, das in eine kovalente Anhaftung mit doppelsträngiger DNA interkaliert und diese bildet. Während diese anfänglichen Versuche darauf ausgerichtet waren, die Masse des E. coli-Genoms abzutasten, indem ein Transposon verwendet wurde, welches das LacZYA-Operon unter die Kontrolle zahlreicher Promotorregionen bringt, war nicht bekannt, ob das gesamte Genom erfasst wurde, was auf die regellose Beschaffenheit der Transposition und den unbekannten Ort der Mehrzahl der Transpositionsereignisse zurückzuführen ist. Dementsprechend sind seit diesen anfänglichen Experimenten zusätzliche SOS-Regulongene identifiziert worden (Lomba et al., (1997) Microbiol Lett 156:119-122; Walker, (1996) In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. ASM Press, S. 1400-1416).
LaRossa et al. ( US-P-5683868 ) haben E. coli mit einem Konstrukt transformiert, das einen luxCDABE aufweist, welches funktionsfähig mit einer Varietät von Stresspromotoren verknüpft ist. Sie haben Mikroorganismen verwendet, um eine Varietät von Umweltbelastungen zu detektieren, wie beispielsweise Ethanol, CdCl₂ und Toluol. Das Vorhandensein einer subletalen Konzentration von Belastungen zeigt sich durch eine Zunahme der Biolumineszenz. Um allerdings einen transformierten Wirt zu erzeugen, müssen die Stresspromotoren identifiziert und charakterisiert werden. Darüber hinaus ist diese Methode ausschließlich auf die Stressreaktion beschränkt.
Ashby und Rine ( US-P-5569588 ) haben eine Methode zur Messung transkriptioneller Responsivität eines Organismus eines in Frage kommenden Arzneimittels veröffentlicht, in dem Signale von Reportergenprodukt aus separat isolierten Zellen eines Targetorganismus auf genomweiter Basis detektiert wurden. Jede Zelle enthält ein rekombinantes Konstrukt mit dem Reportergen, das funktionsfähig mit einem anderen endogenen transkriptionellen regulatorischen Element des Targetorganismus verknüpft ist. Wenn Zellen mit einem in Frage kommenden Arzneimittel behandelt wurden, wurde die transkriptionelle Ansprechempfindlichkeit des Organismus auf das in Frage kommende Arzneimittel gemessen, indem das Reportersignal von jeder der Zellen detektiert wurde. Allerdings ist diese Methode mit dem Organismus lediglich dann von Nutzen, nachdem die Mehrzahl der transkriptionellen regulatorischen Elemente des Targetorganismus erkannt und kartiert ist. Außerdem werden die Reportersignale erst dann gemessen, nachdem die Zellen in Gegenwart von Arzneimittel Homeostasis erreicht haben. Die anfänglichen transkriptionellen Reaktionen auf Chemikalien wurden nicht erörtert.
Es ist eine Lux-A-Sammlung von regelloser E. coli Genom-DNA, fusioniert mit der luxCDABE, zum Screening auf derartige Genfusionen verwendet worden, für die die Expression durch Behandlung mit dem Herbizidsulfometuronmethyl induziert wurde. Die DNA-Sequenz von 19 dieser Sulfometuronmethylinduzierbaren Genfusionen (smi-lux) wurde ermittelt und verwendet, um den Promotor zu identifizieren, der die Expression des luxCDABE-Reporters kontrolliert (Van Dyk et al., (1998) J. Bactetiol. 180:785-792); wobei 8.047 Genfusionen nicht identifiziert blieben.
LaRossa und Van Dyk ( US-P-6025131 ) entwickelten eine Methode für die Identifikation von genregulatorischen Regionen, die auf speziellen zellulären Stress reaktionsfähig sind, wie beispielsweise der durch Herbizide oder durch chemische Substanzen zum Pflanzenschutz erzeugte, indem regellos regulatorische Regionen mit einem bakteriellen, lumineszenten Genkomplex fusioniert wurden, wo das Kontaktieren der Fusion in einem geeigneten Wirt mit einer zellulären Schädigung zelluläre Stressergebnisse bei Detektion dieses zellulären Stress durch eine Zunahme der zellulären Lumineszenz erzeugt. Allerdings war diese Methode auf die Perturbationen in flüssigen Medien beschränkt; Lumineszenzreaktionen wurden auf festem Medium nach einem Wachsen in Gegenwart eines chemischen Stressfaktors nicht detektiert. Darüber hinaus war keine Analyse für regulatorischen Regionaktivität in genomweitem Maßstab möglich.
Die US-P-5397697 beschreibt ein Verfahren zum Identifizieren von bakteriellen Promotoren, die auf einen Pflanzenstimulus über Transposon-Mutagenese ansprechbar sind, wobei das Markergen des Transposons keinen Promotor hat.
Das zu lösende Problem besteht daher in der Bereitstellung einer Möglichkeit zur Messung und zum Verfolgen der Änderungen in der Genexpression unter Anwendung einer genomregistrierten Sammlung von Reportergen-Fusionen in einer solchen Weise, mit der die Detektion von anfänglichen transkriptionellen Reaktionen möglich ist, und in der Bereitstellung einer Möglichkeit zur Vergleichsprüfung der Ergebnisse aus anderen Methoden (d.h. ein Mikroarray) sowie zur Bestimmung von Promotor- und Operonstruktur von Genen sowie ferner zur Bereitstellung einer Möglichkeit zum Testen zellulärer Reaktionen auf verschiedene umweltbedingte und genetische Änderungen in einer Form mit hoher Durchsatzleistung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wird eine neuartige Methode für die Anwendung einer genomregistrierten Sammlung von Reportergen-Fusion offenbart. Es wurden Fragmente genomischer DNA von Wirtsorganismus mit promotorlosem Reportergen fusioniert. Die Reportergen-Fusionen wurden unter Anwendung einer Restriktionsenzym-Digestion, einer physikalischen Scherung genomischer DNA, PCR und von Transpositionsmethoden erzeugt. Die Reportergen-Komplexe waren genomregistriert gegen das Wirtsgenom auf der Basis der Homologie. Genexpression des jeweiligen Reportergen-Komplexes wird als Reportergen-Aktivität gemessen. Die vorliegende Erfindung gewährt eine Möglichkeit zur Messung der Änderungen in den Genexpressionsprofilen auf genomweiter Basis unter verschiedenen Bedingungen in Form eines Hochleistungsdurchsatzes. Zusätzlich dazu, dass es sich um eine eigenständige Hochleistungsmethode handelt, gewährt die vorliegende Erfindung außerdem eine Möglichkeit zur Validierung anderer genomweiter Assays, wie beispielsweise DNA-Mikroarray. Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls eine Methode zur Bestätigung der Reaktion mehrerer verschiedener Promotoren auf einen speziellen Insult (ein Zustand oder chemische Substanz, die von Interesse sind) sowie zur Identifikation einer Reihe bisher unbekannter Operonen, die auf diesen Insult reaktionsfähig sind. Ein Vergleich der Genexpressionsmuster zweier Proben, die sich in einer der Variablen unterscheiden, ist unter Anwendung dieser Methode ebenfalls möglich. Die vorliegende Erfindung gewährt außerdem die Methode zur Verwendung eines Arrays von Arrays durch Erzeugen von Genexpressionsprofilen, die eine zum Verständnis der Genfunktion und der chemischen Wirkungsweisen relevante Information liefern. Eine solche Information kann durch Analyse von genetischen Veränderungen erhalten werden, die zum Funktionsverlust führen, zu verringerten Mengen von Genprodukten oder zur Überexpression von Genprodukten. Damit lässt sich ein Array von Arrays verwenden, um sowohl Untersuchungen der Wirkungsweise zu verbessern als auch die funktionelle Genomik.
In der vorliegenden Erfindung wurde das Sequenzieren und Genomregistrieren der Mehrzahl der Vertreter der Lux-A-Sammlung vervollständigt. lux-Fusionen in der Lux-A-Sammlung waren Fragmente von E. coli Genom-DNA, fusioniert mit promotorlosem luxCDABE-Gen. Die genomregistrierte Sammlung von lux-Fusionen wurde auf biologische Reaktionen untersucht, die mit Hilfe von Änderungen der Biolumineszenz gemessen werden. Die vorliegende Erfindung gewährt eine Möglichkeit zur Messung der Änderungen in Genexpressionsprofilen unter verschiedenen Bedingungen.
Zusätzlich dazu, dass es sich um eine eigenständige Hochleistungsmethode handelt, gewährt die vorliegende Erfindung außerdem eine Möglichkeit zur Validierung oder Detektion von falsch-positiven Ergebnissen aus anderen genomweiten Assays, wie beispielsweise einem Mikroarray.
Die vorliegende Erfindung gewährt eine Methode zur Bestätigung der Reaktion mehrerer Promotoren auf einen speziellen Insult sowie zur Identifizierung einer Reihe von bisher unbekannten, auf diesen Insult reaktionsfähigen Operonen.
Die vorliegende Erfindung gewährt eine Methode zum Vergleichen von Genexpressionsmustern von zwei Proben, die sich in einer der Variablen unterscheiden. In die Variablen können einbezogen sein: Gentyp, Medium, Temperatur, Abreicherung oder Zugabe von Nährstoff, Zugabe eines Inhibitors, physikalischer Angriff, biologische Angriffe, Bestrahlung, Hitze, Kälte, erhöhter oder abgesenkter Druck, Austrocknung, geringe oder hohe Innenkonzentration und Wachstumsphasen, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Ebenfalls gewährt die vorliegende Erfindung die Methode zur Anwendung eines "Array von Arrays", indem Genexpressionsprofile erzeugt werden, die eine für das Verständnis der Genfunktion und für die chemische Wirkungsweise relevante Information liefern. Eine solche Information lässt sich mit Hilfe einer Analyse von genetischen Veränderungen erhalten, die zu einem Funktionsverlust führen, zu verringerten Mengen an Genprodukten oder Überexpression von Genprodukten. Ein derartiger Array von Arrays kann sowohl zur Verbesserung der Untersuchung von Wirkungsweisen als auch in der funktionellen Genomik angewendet werden.
Damit gewährt die Erfindung eine Methode zum Identifizieren einer veränderten Genexpression zwischen mindestens zwei genregistrierten Sammlungen, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Zusammenfügen mindestens zweier genomweitskaliger, genomregistrierter Sammlungen;
(b) Perturbieren jeder Sammlung von (a) mit mindestens einer Perturbation;
(c) Messen der Reaktion jeder Sammlung auf jede Perturbation von (b);
(d) Analysieren der Ergebnisse der mindestens einen Perturbation, um genetische

Verschiedenheiten zwischen den mindestens zwei genomregistrierten Sammlungen zu identifizieren.
Zusätzlich gewährt die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer genomregistrierten Sammlung von Reportergen-Fusionen, welches Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Erzeugen einer Reihe von Genfusionen, welche aufweist: 1) ein Reportergen oder Reportergenkomplex, funktionsfähig verknüpft mit 2) einem Genomfragment von einem Organismus, von dem mindestens 15% der genomischen Nucleotidsequenz bekannt sind;
(b) Einführen von Reportergen-Fusionen vom Schritt (a) in einen Wirtsorganismus in vitro;
(c) Registrieren der Reportergen-Fusionen auf der Grundlage der Sequenz-Homologie der Genomsequenz des Organismus;
(d) Wiederholen von (a), (b) und/oder (c) solange bis Reportergen-Fusionen zu mindestens 15% der bekannten genomischen Nucleotidsequenzen des Organismus erzeugt worden sind.

In ähnlicher Weise gewährt die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer genregistrierten Sammlung von Reportergen-Fusionen, welches Verfahren umfasst:

(a) Erzeugen von Random-Nucleinsaure-Fragmenten von der DNA eines Organismus, von dem mindestens 15% der Nucleotidsequenz bekannt sind;
(b) funktionsfähiges Verknüpfen der im Schritt (a) erzeugten Random-Nucleinsäure-Fragmente mit einem Vektor, der ein promotorloses Reportergen oder einen Reportergenkomplex enthält;
(c) Einführen des Vektors (b), der die Genfusionen enthält, in einen Wirtsorganismus;
(d) Bestimmen der Nucleinsäure-Sequenz der distalen und proximalen Enden der Random-Nucleinfragmente in Bezug auf das Reportergen oder den Reportergenkomplex;
(e) Registrieren der sequenzierten Fusionen von Schritt (d) auf der Grundlage von Sequenzhomologie zu der Genomsequenz des Wirtsorganismus;
(f) Wiederholen von (a), (b) und/oder (c), bis Reportergen-Fusionen zu mindestens 15% der bekannten genomischen Nucleotidsequenzen des Organismus erzeugt worden sind. Die Erzeugung der Random-Nucleinsäurefragmente von Schritt (a) kann eine Restriktionsenzymdigestion, ein physikalisches Scheren des Genoms und eine Polymerasekettenreaktion umfassen.

In einer anderen Ausführungsform gewährt die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer genomregistrierten Sammlung von Reportergen-Fusionen, umfassend die Schritte:

(a) Einführen von einem oder mehreren Transposonen in das Genom eines Organismus, von dem mindestens 15% der Nucleotidsequenz bekannt sind und wobei jedes Transposon ein promotorloses Reportergen oder Reportergenkomplex enthält;
(b) Bestimmen der Nucleinsäuresequenz der Verbindung zwischen dem proximalen Ende der Genom-DNA und dem Transposon, welches das Reportergen oder den Reportergenkomplex enthält, und Registrieren der Reportergen-Fusionen in Bezug auf die Genomsequenz des Organismus;
(c) Wiederholen von (a) und (b) bis Reportergen-Fusionen zu mindestens 15% der bekannten genomischen Nucleotidsequenz des Organismus erzeugt worden sind.

Alternativ gewährt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Profils zum Einleiten von Bedingungen für eine Reportergen-Fusion, welches Verfahren umfasst:

(a) Erhalten eines Genexpressionsprofils eines Organismus unter induzierten und nichtinduzierten Bedingungen, unter denen induzierte Gene identifiziert werden;
(b) Bereitstellen einer genomregistrierten Sammlung von Reportergen-Fusionen, wobei die Fusionen für das Genom des Organismus von (a) registriert sind;
(c) Auswählen der Reportergen-Fusionen von (b), die den induzierten Genen von (a) entsprechen, um eine Unterreihe der genomregistrierten Sammlung zu erzeugen;
(d) Kontaktieren der Unterreihe der genomregistrierten Sammlung von (c) mit den induzierten Bedingungen von (a), um mindestens eine der repräsentativen Reportergen-Fusionen zu identifizieren, deren Expression in einer ähnlichen Weise wie in (a) verändert wurde;
(e) Kontaktieren von mindestens einer der repräsentativen Reportergen-Fusionen von (d) in Hochleistungsform mit einer Mehrzahl unterschiedlicher induzierender Bedingungen, um ein Profil von induzierenden Bedingungen für diese Reportergen-Fusion zu identifizieren.

In einer anderen Ausführungsform gewährt die Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen einer genregistrierten Sammlung von Reportergen-Fusionen, welches Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen eines Genoms von einem Organismus, worin mindestens 15% der Nucleotidsequenz bekannt sind;
(b) Bereitstellen einer Reihe von Amplifikationsprimern mit Homologie zu speziellen bekannten Regionen des Genoms von (a);
(c) Amplifizieren von Teilen des Genoms von (a) mit den Primern von (b), um eine Sammlung von Nucleinsäure-Amplifikationsprodukten zu erzeugen;
(d) funktionsfähiges Verknüpfen der Amplifikationsprodukte von (c) mit einem Vektor, der ein promotorloses Reportergen oder Reportergenkomplex enthält;
(e) Einführen der Reportergen-Fusionen in den Organismus;
(f) Wiederholen von (a) bis (e) bis Reportergen-Fusionen mit mindestens 15% der bekannten genomischen Nucleotidsequenz des Organismus erzeugt worden sind.

In einer anderen Ausführungsform gewährt die Erfindung ein Verfahren zum Analysieren einer Genexpression auf Basis eines Hochleistungsassays, welches Verfahren umfasst:

(a) Analysieren eines genomweiten Genexpressionsassays einer mikrobiellen Kultur mit einem Gentyp, der von Interesse ist, in Bezug auf den eines kongerenten Stammes, um Gene zu identifizieren, deren Expression als eine Funktion des Alleles differiert;
(b) Auswählen entsprechender Reportergen-Fusionen, die Promotorregionen enthalten, die funktionsfähig mit den Genen mit veränderter Expression verknüpft sind von (a) oder coregulierten Reportergen-Fusionen, die Promotorregionen enthalten, die funktionsfähig mit den Genen verknüpft sind, die mit denen coreguliert sind, die eine veränderte Expression zeigen von (a) der genomregistrierten Sammlung der Reportergen-Fusion;
(c) Testen der Expression der Reportergen-Fusionen, ausgewählt aus (b), durch Einführen der Reportergen-Fusionen in die kongenen Stämme;
(d) Auswählen mindestens einer der repräsentativen Reportergen-Fusionen, deren Expression sich in den zwei (c) getesteten Stämmen unterscheidet;
(e) Verwenden der Reportergen-Fusion als ein Hochleistungs-Screening, um andere chemische Substanzen oder Gene zu finden, die die Expression der Fusion verändern.

In ähnlicher Weise besteht ein Gegenstand der Erfindung in der Gewährung eines Verfahrens zum Validieren von Ergebnissen aus einer umfassenden Genomanalyse, welches Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Analysieren eines genomweiten Genexpressionsassays eines Organismus, der mit einer Bedingung oder einer chemischen Substanz von Interesse behandelt ist, um Gene mit veränderter Expression zu identifizieren;
(b) Auswählen einer genomregistrierten Sammlung von Reportergen-Fusionen, deren Reportergen-Fusionen Promotorregionen enthalten, die funktionsfähig mit Genen entsprechend den veränderten Genen aus (a) oder Genen verknüpft sind, die mit Genen entsprechend den veränderten Genen am (a) coreguliert sind;
(c) Testen der Expression der Reportergen-Fusionen ausgewählt aus (b), mit den Bedingungen oder chemischen Substanzen von Interesse, die in (a) angewendet wurden; und
(d) Vergleichen der Ergebnisse der Genexpression von (c) mit dem Ergebnis der Genexpression von (a).

Die Erfindung gewährt zusätzlich ein Verfahren zum Bestimmen einer Operonstruktur, umfassend die Schritte:

(a) Auswählen einer Unterreihe von Reportergen-Fusionen aus einer genomregistrierten Sammlung von Reportergen-Fusionen, welche die Region eines möglichen Operons kartieren;
(b) Assayieren der Unterreihe für die Reportergenfunktion und
(c) Bestimmen einer vermutlichen Operonstruktur auf Basis der Größen der Reportergenfunktion.

Alternativ gewährt die Erfindung ein Verfahren zum Konstruieren eines zellulären Arrays, das Reportergen-Fusionen enthält, welches Verfahren umfasst:

(a) Erzeugen einer Reihe von Genfusionen, aufweisend: 1) ein Reportergen oder Reportergenkomplex, funktionsfähig verknüpft mit 2) einem Genomfragment aus einem Organismus, von dem mindestens 15% der genomischen Nucleotidsequenz bekannt sind;
(b) Auswählen einer nichtredundanten Unterreihe von Reportergen-Fusionen aus der Reihe von (a), die für mindestens 15% der bekannten oder vermuteten Promotorregionen repräsentativ sind, am einer genomregistrierten Sammlung von Reportergen-Fusionen, wobei jede eine bekannte oder vermutete Promotorregion enthält, die funktionsfähig mit einem Reportergen oder Reportergenkomplex verknüpft ist; und
(c) Fixieren der nichtredundanten Unterreihe von Reportergen-Fusionen von (b) in einem Arrayformat.

In einer bevorzugten Ausführungsform gewährt die Erfindung ein Verfahren zum Messen der Genexpressionsreaktionen auf Perturbation, umfassend:

(a) Konstruieren von mindestens zwei identischen zellulären Arrays, von denen jeder zelluläre Array eine Reportergen-Fusion aufweist, aufweisend: 1) ein Reportergen oder Reportergenkomplex, funktionsfähig verknüpft mit 2) einem Genomfragment von einem Organismus, von dem mindestens 15% der genomischen Nucleotidsequenz bekannt sind; wobei mindestens ein zelluläres Array ein Kontrollarray ist und mindestens ein zelluläres Array ein Versuchsarray ist;
(b) Kontaktieren des Versuchsarrays von (a) mit einer perturbierenden Bedingung;
(c) Vergleichen der Unterschiede zwischen der Genexpressionsaktivität des Kontroll- und des

Versuchsarrays, wobei die Genexpressionsreaktion auf eine perturbierende Bedingung bestimmt wird.
Organismen, die für das vorliegende Verfahren zugänglich sind, schließen Prokaryoten und Fungi und speziell Enterobakterien ein.
Reporter, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind, schließen ein: luxCDABE, lacZ, gfp, cat, galK, inaZ, luc, luxAB, bgaB, nptII, phoA, uidA und xylE.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm von Fusionen des lac-Operons aus der Lux-A-Sammlung. Die Richtung der Pfeilspitze zeigt, ob die DNA des klonierten chromosomalen Segments so orientiert ist, dass ein eventuell vorhandener Promotor die Expression von Genen in die Richtung (Pfeilspitze nach rechts) oder komplementär (Pfeilspitze nach links) zum Stamm treiben würde.
2 beschreibt die Kinetik der Induktion einer erhöhten Biolumineszenz von E. coli-Stamm DPD3232, der eine yebF-luxCDABE-Fusion enthält, behandelt mit verschiedenen Konzentrationen von MMC.
3 (A bis C) beschreibt allgemein die Luxarray 0.5-Lumineszenz während des Wachstums in fester Phase. 3A beschreibt die Zellanordnung zum Replizieren des 96-Well-Abstandes, um von einem Mikroplatten-Luminometer aufgenommen zu werden. In dem weißen Licht an der linken Seite ist jedes Replikat der 12 Punkte umrissen. Das Biolumineszenzbild der gleichen Platte ist auf der rechten Seite gezeigt. 3B beschreibt das für jedes Klon in Abhängigkeit von der Zeit aufgenommene Signal. Jeder Zyklus betrug etwa 20 Minuten. 3C beschreibt Signale, die von 8 Replikaten des gleichen Klons aufgenommen wurden.
4 (A bis D) beschreibt allgemein die Luxarray 0.5-Perturbation mit Nalidixinsäure (NA). 4A repräsentiert Ergebnisse aus den Stellen, die das Elternplasmid und zwei nichtreagierende Reporter enthalten, osmY und lacZYA, während 4B die Ergebnisse aus drei DNA-schadenreaktiven Reporter, uvrA, recA, dinG repräsentiert.
5 beschreibt eine Luxarray 0.5-Perturbation hoher Dichte mit Nalidixinsäure. Die Rechtecke repräsentieren eine Reportergenreaktion von mit Nalidixinsäure behandelten Kulturen, während die Kreise die Reportergenaktivität von unbehandelten Kulturen darstellen.
6 beschreibt eine graphische Darstellung von Auswahlkriterien zur Auswahl von Luxarray 1.0-Klonen.
7 beschreibt die Biolumineszenz, aufgenommen von Luxarray 1.0-Reportern nach 14 Stunden Wachstum auf LB-Medium mit Hilfe einer gekühlten CCD-Array-Kamera (FluorChem 8000, AlphaInnotech).
8 beschreibt die vorhergesagten Promotoren in einem Gencluster von 20 Genen für Typ I extrazelluläres Polysaccharid in E. coli und die Promotoraktivität von luxCDABE-Genfusionen aus der Region, welche die Erzeugung von Typ I-extrazellulären Polysaccharid codiert. Die E. coli-Gene in dieser Region sind mit der oberen Reihe von Pfeilen dargestellt. Über dieser Linie sind die vorhergesagten Promotorregionen aus den zwei Quellen (P, Plattner et al., (1997) Science 277: 1453-1462); P, Thieffry et al. (1998) Bioinformatics 14: 391-400). Die zwei durch DNA geschützten Promotoren und Genfusionsdaten sind hierin in Fettdruck gezeigt. Angegeben sind die b-Kennzeichnung und der Trivialname für das jeweilige Gen. Auf der nächsten Linie sind die Verhältnisse der abgeleiteten mRNA-Menge in dem rpoC-Mutantenstamm zu der abgeleiteten mRNA-Menge in dem rpoC⁺-Stamm, ermittelt mit Hilfe der Mikroarray-Methode. Die kartierte Stelle der chromosomalen Insertionen der ausgewählten luxCDABE-Genfusionen in dieser Region ist mit der zweiten Reihe der dickeren Pfeile dargestellt. Unter diesen sind die lux-Klonidentifikationsnummer und die Biolumineszenzdaten (RLU/10⁹ cfu (kolloniebildende Einheiten)) für jedes Plasmid in dem rpoC⁺ E. coli-Wirtsstamm und der Wirtsstamm angegeben, der eine rpoC-Mutation trägt. Im Fall überlappender Genfusionen ist die Kürzere zuerst angegeben.
9 (A bis D) stellt allgemein die Induktion des Promotors b1728 mit Hilfe von Nalidixinsäure (NA) in lexA⁺-Wirt (9A) im Vergleich zu dem Promotor in lexind-Wirt (9C) und die Induktion des Promotors b1728 durch Mitomycin C (MC) in lexA-Wirt (9B) im Vergleich zu dem Promotor in lexind-Wirt (9D) dar.
10 stellt die Hinaufregulation durch Limonen dar.
Die Erfindung wird anhand der folgenden detaillierten Beschreibung der beigefügten Folge von Beschreibungen besser verstanden, die Bestandteil der vorliegenden Patentanmeldung bilden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Erzeugung und Verwendung eines zellulären Arrays oder eines zellulären Arrays in Kombination mit anderen genomregistrierten Arrays (ein Array von Arrays) für die Bestimmung von Genfunktion und/oder Wirkungsweise der Perturbation. Jedes zelluläre Array besteht aus einer Reihe von mikrobiellen Stämmen. Jeder Stamm weist eine Reportergen-Fusion auf, die aus einem Gen aus einem Genfragment besteht, das funktionsfähig mit einem Reportergen verknüpft ist. Jedes Gen oder jedes Genfragment ist an einer bestimmten Stelle in dem Genom des Organismus "registriert" oder kartiert worden. Zelluläre Arrays der vorliegenden Erfindung sind solche, die Reportergen-Fusionen mit mindestens 15% des Genoms des zu analysierenden Organismus enthalten. Zelluläre Arrays, die diese Reportergen-Fusionen enthalten, werden hierin bezeichnet als "registrierte Sammlungen".
Die genomregistrierte Sammlung der Erfindung lässt sich zur Bestimmung von Veränderungen in der Genexpression unter einer Reihe von Bedingungen verwenden. Derartige Sammlungen eignen sich für schnelle Assays und können zur Bestätigung, Korrektur oder Verstärkung von Daten verwendet werden, die aus der Technologie der DNA-Mikroarrays erzeugt werden.
In der vorliegenden Offenbarung werden eine Reihe von Begriffen und Abkürzungen verwendet. Es werden die folgenden Festlegungen gewährt.
"Offenes Leseraster" wird abgekürzt mit ORF. Der Begriff "ORF" bezeichnet ein Gen, das ein Protein bestimmt.
"Polymerasekettenreaktion" wird abgekürzt mit PCR.
Wie hierin verwendet, ist ein "isoliertes Nucleinsäure-Fragment" ein Polymer von RNA und DNA, das einsträngig oder doppelsträngig ist und wahlweise synthetische, nichtnatürliche oder veränderte Nucleotidbasen enthält. Ein isoliertes Nucleinsäure-Fragment in Form eines Polymers aus einer DNA kann ein oder mehrere Segmente von cDNA, Genom-DNA oder synthetische DNA aufweisen.
Ein "zelluläres Array" bedeutet eine Reihe von Stämmen, die sich voneinander lediglich in dem chromosomalen Fragment unterscheiden, das mit einem Reportergen oder Reportergenkomplex fusioniert ist.
Der Begriff "Array von Arrays" bezeichnet eine Sammlung von zellulären Arrays, worin jedes einzelne zelluläre Array Reportergen-Fusionen enthält, die auf eine spezifische induzierende Bedingung oder Reihe von Bedingungen ansprechbar sind.
Die Begriffe "globale Skala" oder "genomweite Skala" beziehen sich, sofern sie auf Reportergen-Fusionen angewendet werden, auf ein Minimum einer 15%-igen Darstellung der Transkriptionseinheiten eines Organismus. Beispielsweise wird das Vorhandensein von 2.328 Transkriptionseinheiten (t.u.s.) in E. coli vorhergesagt (RegulonDB Database v.3.0, http:/www.cifn.unam.mx/Computational Biology/E.colipredictions/). Damit ist eine Reihe von einmaligen Fusionen, die 329 t.u.s. repräsentieren (15% von 2.328) "globalskalig". Der Begriff "globalskalig" oder "genomweitskalig" bezeichnet bei Anwendung auf Mutationen oder Überexpression ein Minimum von 15% Repräsentation der offenen Leserahmen eines Organismus.
Der Begriff "Genomregister" bezieht sich auf eine Prozedur der präzisen Lokalisierung oder Kartierung einer definierten Nucleinsäure-Sequenz im Inneren eines Genoms.
Der Begriff "genomregistrierte Sammlung" bezeichnet eine Reihe von Stämmen, die Reportergen-Fusionen enthalten, Verlust von Genfunktionmutationen, veränderte Genfunktionmutationen oder überexpremierte Gene, die "registriert" oder kartiert worden sind durch Homologie zu der Nucleinsäure-Sequenz des Genoms des Organismus. Diese genomregistrierten Sammlungen schließen Reportergen-Fusionen mit mindestens 15% und mehr bevorzugt mindestens 20% und am Meisten bevorzugt mindestens 50% aller bekannter oder vorhergesagter Promotorregionen ein, Verlust von Genfunktionmutationen in mindestens 15% und mehr bevorzugt mindestens 20% und am Meisten bevorzugt mindestens 50% aller bekannten oder vorhergesagten ORF's, veränderte Genfunktionmutationen in mindestens 15% oder mehr bevorzugt mindestens 20% und am Meisten bevorzugt mindestens 50% aller bekannten oder vorhergesagten ORF's oder Überexpression von mindestens 15% und mehr bevorzugt mindestens 20% und am Meisten bevorzugt mindestens 50% aller bekannten oder vorhergesagten ORF's.
Wie hierin verwendet, bedeutet der auf ein Gen oder ORF im Kontext mit einem Genom angewendete Begriff "bekannt", dass die Sequenz des Gens oder ORF bekannt ist und nicht auf die Kenntnis der Funktion dieses Gens oder ORF beschränkt sein soll.
Der Begriff "Reportergen-Fusion" bezieht sich auf chimäres Gen, das in einem Teil aus einem Gen oder Genen besteht, die zum Detektieren einer Transkription verwendbar sind, und/oder Translation, die in dem anderen Teil initiiert ist.
Der Begriff "Reportergenkomplex" bezieht sich auf jede beliebige Reihe von zwei oder mehreren Genen, die zusammen zur Erzeugung eines messbaren Signals verwendbar sind.
Der Begriff "Reportergenaktivität" oder "Reporterkonstruktaktivität" bezeichnet die Akkumulation, die beschränkende(n) Komponente(n) des Reportersystems, das verwendet wird, was zu einem messbaren Signal in Verbindung mit diesem Reportersystem führt. Die gemessene Aktivität ist die Ergebnissumme der neuen Erzeugung, des weitergehenden Abbaus oder der Deaktivierung und/oder Aktivierung der beschränkenden Komponente(n).
Der Begriff "Lux-A-Sammlung" bezeichnet eine spezielle Reihe von E. coli-Stämmen, die Plasmid-getragene luxCDABE-Fusionen enthalten.
Der Begriff "lux-Fusion" oder "luxCDABE-Fusion" bezeichnet ein chimäres Gen, das aus einer genomischen Sequenz besteht, die mit luxCDABE-Genen verknüpft ist.
Der Begriff "kongene Stämme" bezeichnet zwei oder mehrere Stämme, die sich voneinander durch eine einzige Mutation unterscheiden, oder einen Stamm, der sich in lediglich einem Gen unterscheidet, um Gene zu bezeichnen, deren Expression sich als eine Funktion des Alleles unterscheidet.
Der Begriff "DNA-Mikroarray" oder "DNA-Chip" bedeutet das Zusammenfügen von PCR-Produkten einer Gruppe von Genen oder Allergene innerhalb eines Genoms auf einer festen Oberfläche in einem Format hoher Dichte oder einem Array. Die allgemeinen Methoden für eine Arraykonstruktion und die Anwendung sind verfügbar (siehe Schema M, Shalon D, Davins RW, Brown PO., Quantitative monitorin of gene expression pattems with a complementary DNA microarray. Science. 1995 Oct 20; 270(5235):467-70. und http:/cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html). Ein DNA-Mikroarray ermöglicht die Analyse von Genexpressionsmustern oder Profil vieler Gene, die gleichzeitig ausgeführt wird, indem das DNA-Mikroarray, welches diese Gene oder PCR-Produkte dieser Gene aufweist, mit den cDNA-Sonden hybridisiert wird, die aus der zu analysierenden Probe hergestellt werden. Die Technologie des DNA-Mikroarrays oder -"chips" erlaubt die Untersuchung der Genexpression auf einer Genomskala und erlaubt die gleichzeitige Messung der Transkriptionsmengen vieler Gene. Verkürzt gesagt, umfasst die Technologie des DNA-Mikroarray oder -chips die Gruppenanordnung mikroskopischer Mengen von DNA, die komplementär zu den Genen von Interesse sind oder offene Leserahmen auf einer festen Oberfläche an festgelegten Positionen. Diese feste Oberfläche ist in der Regel ein Objektträger aus Glas oder eine Membran (wie beispielsweise eine Nylonmembran). Die DNA-Sequenzen lassen sich durch ein Spotting oder mit Hilfe der Photolithographie zu Arrays zusammenfügen (siehe http://www.affymetrix.com/). Es werden zwei separate fluoreszenzmarkierte Sondenmischungen, die aus zwei Proben zu vergleichenden Proben hergestellt werden, hybridisiert mit dem Mikroarray und das Vorhandensein und die Menge der gebundenen Sonden mit Hilfe der Fluoreszenz nach Lasererregung unter Verwendung eines konfokalen Rastermikroskops detektiert und unter Verwendung eines Laserscanners und entsprechender Software-Pakete für die Arrayanalyse quantifiziert. Auf dem Fachgebiet werden routinemäßig Cy3 (grün)- und Cy5 (rot)-Fluoreszenzmarkierungen verwendet, wobei jedoch auch andere ähnliche Fluoreszenzmarkierungen zum Einsatz gelangen können. Um ein Genexpressionsprofil oder -muster zwischen den zwei verglichenen Proben zu erhalten und zu quantifizieren, wird das Verhältnis zwischen den Signalen in den zwei Kanälen (rot:grün) mit der relativen Intensität von Cy5/Cy3-Sonden als zuverlässiges Maß für die relative Abundanz spezieller mRNAs in jeder Probe berechnet. Materialien für den Aufbau von DNA-Mikroarrays sind kommerziell verfügbar (Affymetrix (Santa Clara CA) Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) Genosys (The Woodlands, TX) Clontech (Palo Alto CA) und Corning (Corning NY). Außerdem lassen sich von kommerziellen Zulieferern, wie beispielsweise Affymetrix, Clontech und Corning DNA-Mikroarrays anwendungsspezifisch bestellen.
Die Grundlage der Genexpressions-Profilbestimmung mit Hilfe der Technologie des Mikroarrays beruht auf dem Vergleich eines Organismus unter verschiedenen Bedingungen, die eine Änderung der exprimierten Gene zur Folge haben. Es kann eine einzelne Population von Zellen an einer Reihe von Stressfaktoren exponiert werden, die zu der Veränderung der Genexpression fürt. Alternativ lässt sich die Zellumgebung konstant halten und es kann der Gentyp verändert werden. Typische Stressfaktoren, die zu einer Veränderung im Genexpressionsprofil führen, schließen die folgenden ein, ohne auf Bedingungen der Veränderung des Wachstums einer Zelle oder eines Stammes beschränkt zu sein: Exponierung an Mutagenen, Antibiotika, UV-Licht, Gammastrahlen, Röntgenstrahlen, Phagen, Makrophagen, organische Chemikalien, anorganische Chemikalien, umweltschädliche Schadstoffe, Schwermetalle, Temperaturänderungen, Änderungen des pH-Werts, Bedingungen, die eine oxidative Schädigung herbeiführen, DNA-Schädigung, Anaerobiose, Abreicherung oder Zugabe von Nährstoffen, Zugabe eines Wachstumsinhibitors und Austrocknung. Nichtgestresste Zellen werden zur Erzeugung von "Kontrollarrays" verwendet, während gestresste Zellen zur Erzeugung von "Versuchsarrays", "Stressarrays" oder "induzierten Arrays" verwendet werden. Induzierte Arrays sind solche, die eine "veränderte Genexpression" zeigen.
"Veränderte Genexpression" bezeichnet die Änderung der Menge von Transkriptions- oder Translationsprodukten. Wenn das Gen "aufwärts reguliert" ist, ist die Menge von Transkription- oder Translationsprodukten erhöht. Wenn das Gen "abwärtsreguliert" ist, ist die Menge an Transkriptions- oder Translationsprodukten verringert. Bedingungen, unter denen die Genexpression verändert wird, sind auch bekannt als eine "induzierende Bedingung. In einigen Fällen kann an einem einzigen Gen eine Reihe unterschiedlicher Bedingungen zu dem gleichen transkriptionellen Effekt (ihren. Damit wird eine Reihe induzierender Bedingungen das gleiche Gen entweder aufwärtsregulieren oder abwärtsregulieren. Diese Sammlung von ähnlich induzierenden Bedingungen ist bekannt als "profilinduzierende Bedingungen". In ähnlicher Weise ist der hierin im Zusammenhang mit einem zellulären Array oder einem DNA-Mikroarray verwendete Begriff "Perturbation" jede beliebige Veränderung der Umgebung oder des Genotyps, die zu einer veränderten Genexpression führen.
Die Begriffe "hohe Dichte" oder "umfassendes" Mikroarray bezeichnen DNA-Mikroarray hoher Dichte, das mindestens 75% der offenen Leserahmen des Organismus enthält.
Der Begriff "veränderte Genexpression" bezeichnet die Änderung in der Menge von Transkriptions- oder Translationsprodukten. Wenn das Gen "aufwärtsreguliert" ist, ist die Menge an Transkriptions- oder Translationsprodukten erhöht. Wenn das Gen "abwärtsreguliert" ist, ist die Menge von Transkriptions- oder Translationsprodukten verringert.
Der Begriff "Expressionsporofil" bezeichnet die Expression von Gruppen von Genen.
Der Begriff "Genexpressionsprofil" bezeichnet die Expression eines einzelnen Gens und einer Reihe einzelner Gene.
Das "umfassende Expressionsprofil" bezieht sich auf das Genexpressionsprofil von mehr als 75% der Gene in dem Genom. In der "umfassenden Genexpressionsanalyse" werden mindestens mehr als 75% der Genexpression des Organismus analysiert.
Der Begriff "entsprechend" wird hierin zur Bezeichnung ähnlicher oder homologer Sequenzen verwendet unabhängig davon, ob die exakte Position identisch oder von der des Moleküls verschieden ist, mit dem die Ähnlichkeit oder Homologie gemessen wird. Eine Nucleinsäure- oder Aminosäure-Sequenzanordnung kann Zwischenräume einschließen. Damit bezieht sich der Begriff "entsprechend" auf die Sequenzähnlichkeit und nicht auf die Nummerierung der Aminosäure-Reste oder Nucleotidbasen.
Die Begriffe "Abdruck" oder "Abdruck erzeugen" beziehen sich auf die Übertragung einer oder mehrerer Kulturen von einer Stelle und am häufigsten einer Multiwell-Kulturplatte auf ein Substrat oder eine feste Oberfläche durch physikalische Kontaktübertragung oder irgendeine beliebige einer Vielzahl von Technologien.
Der Begriff "Regulon" bezeichnet Gruppen von Operonen, die eine ähnliche Regulierung teilen.
Der Begriff "Operon" bezeichnet eine Einheit einer bakteriellen Genexpression und Regulierung und einschließlich Strukturgene und Kontrollelemente in DNA, die durch Regulatorgenprodukt(e) erkannt werden, die in Kombination die Erzeugung einer mRNA unterstützen.
Der Begriff "Sonde" bezieht sich auf ein einsträngiges Nucleinsäure-Molekül, bei dem es sich um ein Basenpaar handeln kann mit einer komplementären, einsträngigen Target-Nucleinsäure, um ein doppelsträngiges Molekül zu erzeugen.
Der Begriff "Genotyp" bezieht sich auf den genetischen Aufbau eines Organismus im Unterschied zu seinem physikalischen Aussehen.
Der Begriff "genomische DNA" bezieht sich auf eine einzelne komplette Reihe von Geninformationen, die in den Chromosomen eines Organismus gehalten werden.
Der Begriff "Gesamt-RNA" bezieht sich auf nichtfraktionierte RNA von einem Organismus.
Die Begriffe "RNA spezifizierendes Protein" oder "Transkript spezifizierendes Protein" beziehen sich auf die von einem ORF abgeleitete RNA.
Der Begriff "Transposition" bedeutet eine biochemische Reaktion, die die Bewegung eines transponierbaren Elementes von der einen Stelle zu einer anderen Stelle innerhalb eines DNA-Moleküls katalysiert. Die Transposition kann in vivo oder in vitro ausgeführt werden.
Ein Nucleinsäure-Molekül ist mit einem anderen Nucleinsäure-Molekül, wie beispielsweise einer cDNA, genomischen DNA oder RNA, dann "hybridisierbar", wenn eine einsträngige Form des Nucleinsäure-Moleküls mit dem anderen Nucleinsäure-Molekül unter geeigneten Bedingungen von Temperatur und Innenkonzentration der Lösung reassoziiert werden kann. Die Bedingungen der Hybridisierung und des Waschens sind gut bekannt und exemplifiziert in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor (1989), speziell Kapitel 11 und Tabelle 12.1. Die Bedingungen von Temperatur und Ionenstärke bestimmen, wie weit die Hybridisierung unter "stringenten Bedingungen" abläuft. Eine Hybridisierung macht erforderlich, dass die zwei Nucleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, wobei Fehlanpassungen zwischen Basen möglich sind, obgleich sie von stringenten Bedingungen der Hybridisierung abhängen. Die entsprechenden stringenten Bedingungen für die Hybridisierung von Nucleinsäuren hängen von der Länge der Nucleinsäuren und dem Grad der Komplementation ab, bei denen es sich um auf dem Fachgebiet gut bekannte Variablen handelt. Je größer der Grad der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen zwei Nucleotidsequenzen ist, umso größer ist der Wert Tm für Hybride von Nucleinsäuren mit derartigen Sequenzen. Die relative Stabilität (entsprechend dem höheren Tm) von Nucleinsäure-Hybridisierungen nimmt in der folgenden Reihenfolge ab: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Bei Hybriden mit einer Länge größer als 100 Nucleotide wurden Gleichungen zum Berechnen von Tm entwickelt (siehe Sambrook et al., supra 9.50-9,51). Bei Hybridisierungen mit kürzeren Nucleinsäuren, d.h. Oligonucleotiden, wird die Position der Fehlanpassungen bedeutsamer, und die Länge des Oligonucleotids bestimmt dessen Spezifität (siehe Sambrook et al., supra 11.7-11.8). Darüber hinaus wird der Fachmann auf dem Gebiet erkennen, dass die Temperatur und die Konzentration des Salzes der Waschlösung nach Erfordernis entsprechend den Faktoren eingestellt werden können, wie beispielsweise Länge der Sonde.
Der Begriff "komplementär" wird zur Beschreibung der Beziehung zwischen Nucleotidbasen verwendet, die zum Hybridisieren untereinander in der Lage sind. Beispielsweise ist im Zusammenhang mit der DNA Adenosin zu Thymin komplementär, während Cytosin zu Guanin komplementär ist. Dem entsprechend schließt die vorliegende Erfindung auch isolierte Nucleinsäure-Fragmente, die zu den kompletten Sequenzen komplementär sind, wie in den beigefügten Sequenzlisten angegeben ist, sowie zu solchen, die weitgehend ähnliche Nucleinsäure-Sequenzen sind.
"Gen" bezeichnet ein Nucleinsäure-Fragment, das ein spezielles Protein exprimiert, einschließlich regulatorische Sequenzen, die der codierenden Sequenz vorangehen (5'-nichtcodierende Sequenzen) und folgen (3'-nichtcodierende Sequenzen), sofern nicht anders angegeben wird. Sofern nicht anders angegeben, schließen beispielsweise "Reportergene", die in der Genfusion verwendet werden, keine regulatorische (Promotor)-Sequenzen ein. "Natives Gen" bezeichnet ein Gen, das in der Natur mit seinen eigenen regulatorischen Sequenzen angetroffen wird.
Die Begriffe "chimäres Gen", "Genfusion" oder "Fusion" bezeichnen jedes beliebige nichtnative Gen oder Gene, die zwei oder mehr genomische oder artifizelle DNA-Fragmente aufweisen und die nicht in der Natur angetroffen werden. Dementsprechend umfassen ein chimäres Gen, Genfusion oder Fusion regulatorische Sequenzen und codierende Sequenzen, die von unterschiedlichen Quellen abgeleitet sind, oder regulatorische Sequenzen und codierende Sequenzen, die von der gleichen Quelle abgeleitet sind und jedoch in einer Weise angeordnet sind, die sie von denen unterscheidet, die in der Natur angetroffen wird. "Endogenes Gen" bezeichnet ein natives Gen in seiner natürlichen Lokation in dem Genom eines Organismus. Ein "fremdes" Gen bezeichnet ein Gen, das normalerweise in dem Wirtsorganismus nicht angetroffen wird, das jedoch in dem Wirtsorganismus durch Gentransfer eingeführt wird. Ein "Transgen" ist ein Gen, das in das Genom mit Hilfe einer Transformationsprozedur eingeführt worden ist.
Der Begriff "codierende Sequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die auf eine spezielle Aminosäure-Sequenz codiert. "Geeignete regulatorische Sequenzen" bezeichnen Nucleotidsequenzen, die sich stromaufwärts (5'-nichtcodierende Sequenzen), im Inneren oder stromabwärts (3'-nichtcodierende Sequenzen) einer codierenden Sequenz befinden und die die Transkription, die RNA-Verarbeitung oder -Stabilität oder Translation der assoziierten codierenden Sequenz beeinflussen. In regulatorische Sequenzen können Promotoren einbezogen sein, Translation-Leadersequenzen, Introne und Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen.
Der Begriff "Promotor" bezeichnet eine DNA-Sequenz, an der eine RNA-Polymerase binden kann, um die Transkription einzuleiten. Im Allgemeinen befindet sich eine codierende Sequenz zu einer Promotorsequenz in 3'-Stellung. Promotoren können in ihrer Gesamtheit von einem nativen Gen abgeleitet werden oder können aus unterschiedlichen Elementen aufgebaut sein, die von unterschiedlichen Promotoren abgeleitet sind, die in der Natur angetroffen werden, oder können sogar synthetische DNA-Segmente aufweisen. Für den Fachmann auf dem Gebiet gilt als selbstverständlich, dass unterschiedliche Promotoren die Expression eines Gens in verschiedenen Geweben oder Zelltypen oder in verschiedenen Stufen der Entwicklung oder in Reaktion auf unterschiedliche Außenbedingungen steuern können. Promotoren, die fast zu jedem Zeitpunkt die Expression eines Gens in den meisten Zelltypen hervorbringen können, werden üblicherweise bezeichnet als "konstitutive Promotoren". Es gilt ferner als anerkannt, dass, da in den meisten Fällen die exakten Grenzen von regulatorischen Sequenzen nicht vollständig definiert worden sind, DNA-Fragmente unterschiedlicher Längen eine identische Promotoraktivität haben können. "Promotorregion" ist ein Promotor und die angrenzenden Bereiche, deren Funktion eine modulierte Promotoraktivität sein können.
Die "3'-nichtcodierenden Sequenzen" beziehen sich auf DNA-Sequenzen, die sich stromabwärts einer codierenden Sequenz befinden und Polyadenylierungs-Erkennungssequenzen sowie andere Sequenzen einschließen, die regulatorische Signale codieren, die in der Lage sind, die mRNA-Bearbeitung oder Genexpression zu beeinflussen. Das Polyadenolierungssignal ist gewöhnlich dadurch ausgezeichnet, dass es die Addition von Polyadenylsäure-Trakten an dem 3'-Ende des mRNA-Präkursors beeinflusst.
"RNA-Transkript" bezieht sich auf das Produkt, das sich aus der RNA-Polymerase-katalysierten Transkription einer DNA-Sequenz ergibt. Wenn das RNA-Transkript eine perfekte komplementäre Kopie der DNA-Sequenz ist, bezieht sie sich auf das primäre Transkript oder kann eine RNA-Sequenz sein, die von einer posttranskiptionellen Bearbeitung des primären Transkripts abgeleitet ist und bezeichnet wird als die reife RNA. "Messenger-RNA (mRNA)" bezieht sich auf die RNA; die keine Introne hat und die in ein Protein mit Hilfe der Zelle translatiert werden kann. "cDNA" bezieht sich auf eine doppelsträngige DNA, die zur mRNA komplementär ist und von dieser deriviert ist. "Sense"-RNA bezieht sich auf ein RNA-Transkript, in das die mRNA einbezogen ist und so in ein Protein mit Hilfe der Zelle translatiert werden kann. "Antisense RNA" bezieht sich auf ein RNA-Transkript, das zu allen oder einem Teil eines primären Targettranskripts oder mRNA komplementär ist und das die Expression eines Targetgens blockiert ( US-P-5107065 ). Der komplementäre Charakter einer Antisense-RNA kann sich auf jeden Teil des speziellen Gentranskriptes beziehen, d.h. an der 5'-nichtcodierenden Sequenz, 3'-nichtcodierenden Sequenz, Intronen oder der codierenden Sequenz. "Funktionelle RNA" bezieht sich auf Antisense-RNA, Ribozym-RNA oder auf eine andere RNA, die nichttranslatiert ist, die dennoch einen Einfluss auf zelluläre Prozesse hat.
Der Begriff "funktionsfähig verknüpft" bezeichnet die Assoziation von Nucleinsäure-Sequenzen an einem einzelnen Nucleinsäure-Fragment derart, dass die Funktion der einen durch die andere beeinflusst wird. Beispielsweise ist ein Promotor funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz dann verknüpft, wenn er in der Lage ist, die Expression dieser codierenden Sequenz zu beeinflussen (d.h., dass sich die codierende Sequenz unter der transkriptionellen Kontrolle des Promotors befindet). Codierende Sequenzen können funktionsfähig mit regulatorischen Sequenzen in Sense- oder Antisense-Orientierung verknüpft sein.
Der hierin verwendete Begriff "Expression" bezieht sich auf die Transkription und stabile Akkumulation von Sense (mRNA) oder Antisense-RNA, die von dem Nucleinsäure-Fragment der Erfindung deriviert sind. Expression kann sich auch auf Translation von mRNA in ein Polypeptid beziehen.
Der Begriff "Transformation" bezieht sich auf die Akquisition neuer Gene in einer Zelle nach der Inkorporation von Nucleinsäure.
Die Begriffe "Plasmid", "Vektor" und "Kassette" beziehen sich auf ein extrachromosomales Element, das oftmals Gene führt, die nicht Bestandteil des zentralen Metabolismus der Zelle sind und gewöhnlich die Form kreisrunder, doppelsträngiger DNA-Moleküle haben. Derartige Elemente können autonom replizierende Sequenzen sein, Genom-integrierende Sequenzen, Phagen- oder Nucleotidsequenzen, lineare oder kreisrunde einsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA, die von irgendeiner Quelle deriviert sind, in denen eine Zahl von Nucleotidsequenzen zu einer einzigartigen Konstruktion vereint oder rekombiniert sind, die in der Lage ist, eine Promotorfragment und DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt zusammen mit einer geeigneten 3'-nichttranslatierten Sequenz in eine Zelle einzuführen. "Transformationskassette" bezieht sich auf einen speziellen Vektor, der ein Fremdgehen enthält und zusätzlich zu dem Fremdgehen Elemente enthält, die eine verstärkte Expression dieses Gens in einem Fremdwirt ermöglichen.
Der Begriff "Restriktionsendonuclease" oder "Restriktionsenzym" bezieht sich auf Enzym, das in Inneren einer speziellen Nucleotidsequenz in einer doppelsträngigen DNA bindet und diese trennt.
Der Begriff "Biolumineszenz" bezieht sich auf das Phänomen der Lichtemission von irgendeinem lebenden Organismus.
Der Begriff "relative Lichteinheit" wird abgekürzt mit "RLU" und bezeichnet elf Maß der Lichtemmission, gemessen mit Hilfe eines Luminometers, kalibriert gegen einen inneren Standard, der für das zu verwendende Luminometer eindeutig ist.
Der Begriff "Stress" oder "Umgebungsstress" bezieht sich auf den in einer Zeller als Ergebnis einer Exponierung an einem Umgebungsinsult erzeugten Zustand
Der Begriff "Insult" oder "Umgebungsinsult" bezieht sich auf eine beliebige Substanz oder Umgebungsänderung, die zu einer Veränderung des normalen Zellenmetabolismus in einer Bakterienzelle oder einer Population von Zellen führt. In Umgebungsinsulte können die folgenden einbezogen sein, ohne auf diese beschränkt zu sein: chemische Substanzen, umweltschädliche Schmutzstoffe, Schwermetalle, Temperaturänderungen, Änderungen des pH-Wertes sowie Mittel zum Erzeugen einer oxidativen Schädigung, DNA-Schädigung, Anaerobiose, Änderungen der Nitrat-Verfügbarkeit oder Pathogenese.
Der Begriff "Stressreaktion" bezieht sich auf die zelluläre Reaktion, die zu der Erzeugung entweder detektierbarer Mengen von Stressproteinen führt oder zu einem gegenüber Exponierung an einem anderen Insult oder einer erhöhten Dosis des Umgebungsinsult toleranteren Zustand.
Der Begriff "Stressgen" bezieht auf jedes beliebige Gen, dessen Transkription als Ergebnis von Umgebungsstress oder durch das Vorhandensein von Umgebungsinsulten induziert ist.
Die Begriffe "log-Phase", "log-Phasenwachstum", "exponentielle Phase" oder "exponenzielles Phasenwachstum" beziehen sich auf Zellkulturen von Organismen, die unter Bedingungen wachsen, die eine exponentielle Vermehrung der Zellenzahl ermöglichen.
Die hierin zur Anwendung gelangenden Standardmethoden des rekombinanten DNA- und Molekularklonens sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und wurden beschrieben von Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); und von Silhavy, T.J., Bennan, M.L. und Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laborstory Cold Press Spring Harbor, NY (1984); und von Ausubel, F.M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, veröffentlicht von der Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).
In der vorliegenden Erfindung wurde eine regellose Reihe von Fragmenten von E. coli-Genom erzeugt durch teilweises Digerieren von E. coli-Genom mit Restriktionsenzym Sau3A1 und Trennen der Fragmente mit Hilfe der Größenfraktionierung. Die Fraktion mit einer mittleren Größe von 1,8 kb wurde isoliert und ligiert mit dem Plasmid pDEW201, das den Ursprung der Replikation enthält, und bla von pBR322, vier Transkriptionsterminatoren stromaufwärts des promotorlosen luxCDABE-Gens. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli XL2Blue-Zellen transformiert. Näherungsweise wurden 24.000 resultierende Transformanten gepoolt und als die Quelle der heterologen Plasmid-DNA verwendet. Dieser Plasmid-DNA-Pool wurde zur Transformation von E. coli-DPD1675-Zellen verwendet. Insgesamt wurden 8.066 einzelne Transformanten isoliert und als Lux-A-Sammlung codiert. Es wurde eine Homologie-Suche für die Sequenz von Beginn und Ende von Klonen von Lux-A-Sammlung im Vergleich zur kompletten E. coli-Sequenz ausgeführt. Der Ort und die Orientierung jeder chimären Genfusion in Bezug auf das E. coli-Genom wurde auf der Grundlage einer errechneten Homologie bestimmt. Zusätzliche Sequenzen für die Sammlung können durch mehr regellose Fusionen hinzugefügt werden oder durch Umkehren der Orientierung von DNA in der Fusion, um die Promotorregionen in die richtige Orientierung für die insertierte DNA zu bringen, indem die Methode zur Anwendung gelangt, die auf dem Fachgebiet routinemäßig ausgeführt wird.
Da E. coli gut charakterisiert ist und dessen Genom sequenziert worden ist, ist es der am Meisten bevorzugte prokaryotische Organismus für die vorliegende Erfindung. Andere bevorzugte Organismen sind solche, deren Genome sequenziert wurden oder die vollständig sequenzierte Genome haben und für die Einführung von Genfusionen durch Transduktion, Transformation oder Konjugation zugänglich sind. Diese schließen die 113 Organismen ein, ohne auf diese beschränkt zu sein, die auf der Webseite zusammengestellt sind: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/bact.html as of 2/15/00. Zusätzlich zu den vorgenannten Organismen können in der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung von Reportergen-Fusionen die vorgenannten Organismen verwendet werden, beliebige mikrobielle Organismen mit mindestens 15% und bevorzugt 20% und am Meisten bevorzugt 50% ihrer Genomsequenz, von der bekannt ist, die für die Einführung von Genfusionen durch Transduktion, Transformation oder Konjugation zugänglich ist.
Wie bei dem Reportergen oder Reportergenkomplex ist luxCDABE wegen seiner Empfindlichkeit und Einfachheit für Assay-Bedingungen am Meisten bevorzugt. Andere Reportergene, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, lassen sich ebenfalls in der vorliegenden Erfindung benutzen. Die bevorzugten Reportergene schließen ein: lacZ, gfp, cat, galK, inaZ, luc, luxAB, bgaB, nptII, phoA, uidA und xylE, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Die Methoden zur Einführung von Fusionen in derartige Stämme sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Fusionen lassen sich einführen durch Transduktion, Transformation oder Konjugation, wie sie für den jeweiligen speziellen Organismus am Besten geeignet sind. Sie lassen sich in vitro mit Hilfe von Methoden aufbauen, in die Transposon (z.B. Tn7) vermittelte Transposition, Ligieren von regellosen Fragmenten mit einem Reportergenkonstrukt, das einen Vektor enthält, oder Ligieren von PCR-Produkten mit dem selben Vektor einbeziehen, ohne auf diese beschränkt zu sein. Sie können durch in vivo-Transposition aufgebaut werden, wo das Transposon in die Zelle mit Hilfe von Transduktion, Transformation oder Konjugation eingeführt wird.
Die bevorzugten Methoden zum Erzeugen einer Reihe von Fragmenten des Genoms schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: partielle Digestion mit einem Restriktionsenzym, physikalisches Scheren, Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifikation, die Kombination von Restriktionsenzym-Digestion und PCR, die Kombination von Restriktionsenzym-Digestion und physikalischem Scheren, die Kombination von physikalischem Scheren und PCR und die Kombination aller Drei. Die vorgenannten Methoden zum Erzeugen von Fragmenten sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise ist die PCR gut beschrieben in den US-P-4683202 (1987, Mullis, et al.) und 4683195 (1986, Mullis, et al.), während die Restriktionsenzym-Digestion und das physikalische Scheren gut beschrieben wurden in Sambrook et al., supra.
Darüber hinaus lassen sich chimäre Reportergen-Fusionen auch unter Anwendung von Transposition auf der Genomhöhe erzeugen. Die vorstehend beschriebenen Methoden zum Erzeugen von Transpositionen sind in dem Fachgebiet gut bekannt.
Nachdem Sequenzieren und Genomregistrieren der Mehrheit der Vertreter der Lux-A-Sammlung beendet war, wurden die biologischen Reaktionen der Stammsammlung, die luxCDABE-Fusionen enthielten, auf Vertreter gut charakterisierter regulatorischer Kreise untersucht. Damit wurden die Genfusionen mit dem lac-Operon und Vertreter der Hitzeschock-Gruppen, SOS-, SoxRS- und OxyR-Regulonen aus der Lux-A-Sammlung ausgewählt und die Reaktionen auf bekannte Induktoren jedes dieser globalen regulatorischen Kreise bestimmt.
Bei jedem der vorgenannten Regulone wurden entsprechende biologische Reaktionen demonstriert. Die Lux-A-Sammlung enthielt 3 Vertreter, bei denen es sich um Fusionen von luxCDABE mit dem lac-Operon (1) handelte. Diese Kulturen wurden in Gegenwart von Glukose aufgezogen und die Biolumineszenz gemessen und mit Kulturen verglichen, die in Abwesenheit von Glukose aufgezogen wurden. In Abwesenheit von Glukose aufgezogene Kulturen zeigten eine sehr viel stärkere Biolumineszenz als diejenigen in Gegenwart von Glukose.
Als lux-Fusionen wurden 4 von 12 Hitzeschock-Promotoren ermittelt. Insgesamt wurden 6 Fusionen, die Stämme enthielten, isoliert und auf Stressreaktion in Gegenwart unterschiedlicher Konzentration von Ethanol getestet. Die Hitzeschock-Regulongenfusionen von der Lux-A-Sammlung bestätigten die Induktion einer Hilzeschockreaktion durch Ethanol.
Bei dem SOS-Regulon wurden in der Lux-A-Sammlung 7 lux-Fusionen festgestellt. Wenn diese Stämme mit DNA-schädigender chemischer Nalidixinsäure getestet wurden, wurde ein erhöhtes Maß an Biolumineszenz beobachtet. In der gleichen Kultur induzierte die Behandlung mit Ethanol jedoch keine Biolumineszenz.
In einer ähnlichen Weise wurde, obgleich die SoxR/S- und OxyR-Regulonen nicht vollständig in der Lux-A-Sammlung repräsentiert waren, die biologisch entsprechende Reaktion beobachtet.
Obgleich daher die Lux-A-Sammlung insofern nicht umfassend war, dass sie eine durch jeden Promotor in E. coli kontrollierte Fusion enthielt, gewährt sie nichtsdestoweniger eine genomweite Übersicht der transkriptionellen Reaktionen auf aufgeprägte Stressfaktoren und kann angepasst werden, um die Reaktionen zu optimieren.
Der Einfluss von Mitomycin C (MMC), einem bekannten DNA-schädigenden Mittel, wurde mit einem DNA-Mikroarray getestet und das resultierende Genexpressionsmuster mit den Genexpressionsdaten von den behandelten Zellen der Lux-A-Sammlung verglichen. Erwartungsgemäß war in den Daten des Mikroarrays die Expression der bekannten SOS-Gene erhöht. Allerdings war die Expression von mehreren SOS-Regulongenen weniger stark als zweifach (Tabelle 12) erhöht und lag als solche innerhalb einer großen Gruppe von 792 Genen, deren Expression um 20% oder mehr erhöht war. Da die Meisten von ihnen wahrscheinlich auf Artefakte in den Arraydaten anstatt auf tatsächliche biologisch relevante Reaktionen zuruckzuführen sind, wurde die Gruppe von Genen mit weniger als zweifacher Erhöhung in der Expression als MMC-nichtinduzierbare Gene betrachtet. Hätte man diese Versuche unter Verwendung einer Verbindung mit einer ansonsten unbekannten Wirkungsart ausgeführt, hätten einige biologisch relevante Genexpressionsereignisse bei der Vorgehensweise mit dem DNA-Mikroarray gefehlt. Um zu testen, ob Stämme, die luxCDABE-Genfusionen führen, das erwartete positive Ergebnis liefern, wurden die drei Genfusionen, die in der Lux-A-Sammlung von Reportergen-Fusionen verfügbar waren, auf Mitomycin C-Reaktionen getestet. In allen drei Fallen induzierte Mitomycin C eine erhöhte Biolumineszenz. Dieses demonstriert damit, dass negative Ergebnisse aus DNA-Mikroarrays durch widersprüchige positive Ergebnisse mit entsprechenden Genfusionen in Frage gestellt werden können.
Die Gene, von denen bisher nicht bekannt ist, dass sie mit Mitomycin C aufwärtsreguliert werden, liefern eine Gelegenheit zur weiteren Untersuchung der Korrelation von DNA-Array und experimentellen Genfusionsdaten. Bei dieser Klasse von Genen sind vier Fusionen in der Lux-A-Sammlung von Reportergen-Fusionen verfügbar. Die entsprechenden luxCDABE-Fusionen dieser vier Gene lieferten keine Bestätigung für eine durch MMC induzierte erhöhte Genexpression. Daher wurden die positiven Ergebnisse von dem Array als falsch-positiv klassifiziert.
Von einer der Genfusionen in der Lux-A-Sammlung von Genfusionen wurde festgestellt, dass sie ein Genomfragment hat, das, wenn es invertiert wird, zu einer Fusion mit yebF führen würde, einem Gen, von dem beobachtet wurde, dass es durch Mitomycin C in Versuchen des DNA-Mikroarrays aufwärts reguliert wird. Wenn das genomische DNA-Fragment freigesetzt und wieder zurück in den Vektor insertiert wurde, wurde festgestellt, das die Biolumineszenz von einigen der transformierten Kolonien durch ein anderes DNA-schädigendes Mittel stark induzierbar ist, nämlich Nalidixinsäure, was mit Nachdruck nahelegt, dass die Inversion von DNA aufgetreten sein könnte. Ferner wurde die Induktion von Biolumineszenz durch MMC demonstriert, wie in 2 gezeigt wird.
Die Induktion einer erhöhten Genexpression von der yebF-lux-Fusion validiert nicht nur die Daten von der DNA-Arrayuntersuchung, sondern ermöglicht darüber hinaus eine erleichterte Dosisreaktion und kinetische Analysen und stellt einen Biosensorstamm für ein Screening mit hohem Durchsatz bereit. Es ist möglich, dass die DNA-Schädigungsreaktion, die von der yebF-lux-Fusion aufgenommen wird, durch die gut charakterisierte SOS-Reaktion vermittelt werden könnte, da es einen LexA-Box-Aufwärtsstrom von yebG (Lomba et al., (1997) FEMS Microbiol Lett 156:119-122), gibt, der sich ummittelbar stromaufwärts von yebF befindet. Allerdings wird ebenfalls vorgeschlagen, dass es einen Promotor gibt, der die Transkription des yebF-Gens (Blattner et al., (1997) Science 277:1453-1462) antreibt, weshalb die Induktion von yebF-Expression durch MMC unerwartet war. Somit demonstrieren diese Ergebnisse des Konzepts, dass mit einem DNA-Mikroarray ein bisher unbekanntes Genexpressionsereignis entdeckt werden kann und dann eine entsprechende lux-Genfusion zur Validierung und Erweiterung der Ergebnisse verwendet werden kann. Außerdem kann ein solcher lux-Fusionsstamm die Grundlage für ein Screening mit hohem Durchsatz auf der Basis von Änderungen der Genexpression bilden.
Die in dem Beispiel 3 erwähnte yebF-luxCDABE-Genfusion lässt sich für ein Screening mit hohem Durchsatz für andere Verbindungen als MMC und Nalidixinsäure verwenden, das zu einer DNA-Schädigung führt. Die Verwendung der luxCDABE-Biolumineszenz-Reporterfusion ermöglicht die leichte Detektion einer Reportergenaktivität in einer Weise, bei der keine Zelllyse oder Zugabe von Enzymsubstraten erforderlich sind. Damit erfordert die Entwicklung eines Screening mit hohem Durchsatz lediglich ein Instrument zur quantitativen Erfassung der Lichterzeugung (von denen es zahlreiche kommerziell verfügbar gibt) und eine Quelle für bakterielle Zellkulturen, die die Genfusion der Wahl enthalten. Derartige bakterielle Zellkulturen lassen sich mit Hilfe einer von mehreren Methoden zuführen. Ein grundsätzlicher Weg zur Verwendung von bakteriellen Stämmen, die Genfusionen enthalten, erfolgt einfach über frisch aufgezogene bakterielle Zellkulturen. Eine Alternative zu dem täglichen Kultivieren ist die Verwendung tiefgefrorener Kulturaliquots, wie sie beispielsweise erfolgreich mit einem E. coli-Biolumineszenzsensor demonstriert worden sind, der für Genexpressionsassays unmittelbar nach dem Auftauen kompetent ist, die zuvor unter Verwendung eines Gefrierschutzmittels, wie beispielsweise Glyzerin (Sticher et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:4053-4060) bei –80°C gelagert worden ist. Zwei andere übliche Methoden zur Handhabung von Bakterien, der Lyophilisierung und kontinuierlichen Kultur haben sich ebenfalls als nützliche Quellen für lux-Fusionsstämmen für Testzwecke erwiesen. Die Lyophilisierung ist erfolgreich auf Metall-ansprechbare und Hitzeschock-ansprechbare zellulare Biosensorstämme angewendet worden (Corbisier et al., (1996) Environ. Toxicol. Water Qual. 11:171-177; Tauriainen et al., (1998) Biosensors & Bielectronics 13:931-938; Tauriainen et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:4456-4461; Van Dyk und Wagner (1998) U.S. 5731163 ; Wagner und Van Dyk (1998), Methods in Molecular Biology: Bioluminescence Methods und Protocols, Bd. 102. Humana Press Inc, S. 123-127). Es hat sich gezeigt, dass das kontinuierliche Kultivieren von E. coli-Biolumineszenz-Biosensoren in Minibioreaktoren eine reproduzierbare Detektion von Stressreaktionen liefert (Gu et al., (1996), Biotechnol. Prog. 12:393-397; Gu et al., (1999) Biosens. Biolectron. 14:355-361).
Andere mögliche Methoden für die Bereitstellung zellulärer Biosensoren für Screenings mit hohem Durchsatz sind die Immobilisation durch Einschluss in einem Trägermaterial oder die Verwendung eines Biolumineszenz-Bioreporter-Integrierten Schaltkreises (BBIC). Für die Verwendung als eine Sonde für Abproduktströme ist die Strontiumalginat-Immobilisation eines lux-Fusion enthaltenden bakteriellen Stammes demonstriert worden (Heitzer et al., (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:1487-1494; Matrubutham et al., (1997) Appl. Microbiol. Biotechnol. 47:604-609; Webb et al., (1997) Bitechnol. Bioeng. 54:491-502). In einem anderen Beispiel der Immobilisation ist festgestellt worden, dass Kügelchen aus Calciumaliginat, die einen auf SOS ansprechenden lux-Fusionsstamm beherbergen, aufbewahrt in einer Lösung von CaCl₂ bei 4°C, für bis zu einem Monat nach der Erzeugung brauchbare DNA-Schädigungsinduktionsantworten gibt (Davidov et al., im Druck). In ähnlicher Weise ergibt eine Calciumalginat-Immobilisation eines auf Kupfer ansprechenden Biosensors eine überlegene Stabilität des Biosensors im Vergleich zu der Immobilisation des gleichen Biosensors in Agarose (de Lorenzo et al., (1999) Anal. Chim. Acta 387:235-255). Ferner ist eine Kombination immobilisierter Zellen und einer Lichtmessanlage bei Sensoren möglich, die als Signal sichtbares Licht erzeugen. In einem solchen Fall ist ein E. coli-lac-Fusionsstamm an dem einen Ende der faseroptischen Kontrollvorrichtung immobilisiert (Ikariyama et al., (1997) Anal. Chem. 69:2600-2605). Schließlich wird in dem BBIC-Vorgehen, bei dem der Vorteil eines zellulären Signals genutzt wird, das mit Hilfe von fünf Gen-luxCDABE-Reportern erzeugt wird, ein biolumineszenter Biosensorstamm auf einem Mikroluminometer abgeschieden, der im Inneren eines Integrierten Schaltkreises erzeugt ist; das durch den Biosensor erzeugte Licht wird mit Hilfe des Integrierten Schaltkreises detektiert, wonach die Ergebnisse bearbeitet und übertragen werden (Simpson et al., (1998) Soc. Opt, Eng. 3328 (Smart Electronics und MEMS):202-212; Simpson et al., (1998) TIBTECH 16:332-338.

Daher wird die Entwicklung eines auf DNA-Schaden ansprechbaren Screening mit hohem Durchsatz auf der Basis der neu entdeckten yebF-luxCDABE-Fusion mühelos ausgeführt, indem eine der vorgenannten bekannten Methoden gewählt wird, um einen aktiven zellulären Biosensor bereitzustellen und diesen nach Erfordernis mit einem Instrument zu kombinieren, welches die Erzeugung von sichtbarem Licht misst. Andere Promotoren aus einem auf Stress ansprechbaren Gen können verwendet werden, um Screenings mit hohem Durchsatz unter Verwendung einer lux-Fusion zu erzeugen. Es können auf Stress ansprechbare Genpromotoren sowohl von prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen verwendet werden, wobei jedoch Promotoren von Bakterien bevorzugt sind und Promotoren von E. coli am Meisten bevorzugt sind. Geeignete, auf Stress ansprechende Genpromotoren können ausgewählt werden aus der Liste der Gene unter der Überschrift "ansprechende Gene", die in der nachfolgenden Tabelle 1 gegeben ist, sowie aus anderen neu entdeckten regulatorischen Kreisen, ohne auf diese beschränkt zu sein. TABELLE

Stimulus	Regulatorisches Gen/regulatorische Gene	Regulatorischer Kreis	Ansprechende Gene^*
Proteinschädigung^a	rpoH	Hitzeschock	grpE, dnaK, lon, rpoD, groESL, lysU, htpE, htpG, htpI, htpK, clpP, clpB, htpN, htpO, htpX, etc.
DNA-Schädigung^b	lexA, recA	SOS	recA, uvrA, lexA, umuDC, uvrA, uvrB, uvrC, sulA, recN, uvrD, ruv, dinA, dinB, dinD, dinF, etc.
Oxidative Schädigung^c	oxyR	Wasserstoffperoxid	katG, ahp, etc.
Oxidative Schädigung^d	soxRS	Superoxid	micF, sodA, nfo, zwf, soi, etc.
Membranschädigung^e	fadR	Fettsäure-Aushungerung	fabA
Beliebige^f	?	Universalstress	uspA
Stationäre Phase^g	rpoS	Ruhezustand	xthA, katE, appA, mcc, bolA, osmB, treA, otsAB, cyxAB, glgS, dps, csg, etc.
Aminosäure-Aushungerung^h	relA, spoT	Stringent	his, ilvBN, ilvGMEDA, thrABC, etc.
Kohlenstoff-Aushungerungⁱ	cya. crp	Katabolische Aktivierung	lac, mal, gal, ara, tna, dsd, hut, etc.
Phosphat-Aushungerung^j	phoB, phoM, phoR, phoU	P-Nutzung	phoA, phoBR, phoE, phoS, aphA, himA, pepN, ugpAB, psiD, psiE, PsiF, psiK, psiG psiI, psiJ, psiN,psiR,psiH, phiL, phiO, etc.
Stickstoff-Aushungerung^k	glnB, glnD, glnG, glnL	N-Nutzung	glnA, hut, etc.

* Gene, deren Expression durch den entsprechenden Stimulus erhöht ist und deren Expression durch entsprechendes regulatorisches Gen(e) kontrolliert wird.
a Neidhardt et ran Sogelen dans E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et coll. Ed., p.1334 1345, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))
b Walker dans E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et coll. Ed., p.1346 à 1357, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))
c Christman et coll. Cell 41: 753 à 762 (1985); Storz et coll. Science 248: 189 à 194 (1990); Demple, Ann. Rev. Genet. 25: 315 337 (1991)
d Demple, Ann. Rev. Genet. 25: 31 337 (1991)
e Magnuson et coll. Microbiol. Rev 57: 522 à 542 (1993)
f Nystrom et Neidhardt, J. Bacterial, 175: 2949 à 2956 (1993); Nystrom et Neidhardt Mol. Microbiol. 6: 3187 3198 (1992)
g Kolter et coll. Ann. Rev. Microbiol. 47: 855 à 874 (1993)
h Cashel et Rudd dans E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et coll. Ed., p. 1410-1438, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)); Winkler dans E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et coll. Ed., p. 395 à 411, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))
i Neidhardt, Ingraham et Schaecter. Physiology of the Bacterial Cell: A Molecular Approach, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1990), p 351 à 388; Magasanik et Neidhardt dans E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et coll. Ed., p. 1318 à 1325, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))
j Wanner dans E. coli and Salmonella lyphimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et coll. Ed., E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et coll. Ed., p. 1326 à 1333, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987))
k Rietzer et Magasanik dans E. coli and Salmonella typhimurium; Cellular and Molecular Biology (Neidhardt, F. C., et coll. Ed., p. 1302 à 1320, American Society of Microbiology, Washington, DC (1987)); Neidhardt, Ingraham et Schaecter. Physiology of the Bacterial Cell: A Molecular Approach, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1990), p. 351 à 388.

Fusionen mit lux-Reportergenen können ebenfalls zur Unterstützung der Identifikation der Operonstrukturen verwendet werden, die neuerlich entdeckten regulatorischen Kreise, und Promotor-Stellen. Da die beliebige Datenbank von E. coli-Genom-DNA mit dem promotorlosen lux-Gen fusioniert wurde, sollte die Stärke der Biolumineszenz in den resultierenden Fusionen von dem Promotor von dem E. coli abhängen. Wenn die Fusion beispielsweise den kompletten Promotor enthält, würde die lux-Genexpression stärker sein als die Fusion, die eine partielle Region des gleichen Promotors enthält. Wenn der Promotor bis zu der Stelle abgestumpft ist, die nichtfunktionell ist, würde die lux-Genexpression fehlen. Ein solches Ergebnis könnte die postulierten Operonstrukturen stützen sowie die Abhängigkeit der Promotorfunktion im Wirt (Beispiel 4).
Die Konstruktion und das Sequenzieren einer Random-Bank von E. coli-Genomfragmenten in Plasmid pDEW201 hat eine genomregistrierte Reihe von Promotoraktivitäts-Reporterkonstrukten erzeugt. Ein in hohem Maße paralleles Festphasen-Zellularassay ist unter Nutzung einer Unterreihe dieser Reporter durch Kombinieren einer Bioinformationsanalyse und Rototerherstellung von Arrays mit einer Hochleistungskulturproduktion entwickelt worden. Dieses Assay verfügt über die Kapazität unter Nutzung von Standard-Roboterinstrumenten zur Überwachung der Promotoraktivität der gesamten mikrobiellen Genome in doppelter Ausführung oder alternativ ganzer Genome unterschiedlicher Mikroben auf dem gleichen Array. Das Ergebnis des Assays ist ein Graustufenbild und ist kompatibel mit kommerziellen Produkten der Bildanalyse und Datenanalyse, die speziell für Technologien des DNA-Mikroarrays entwickelt wurden.
Verkürzt umfasst der Assay das Erzeugen einer nichtredundanten Sammlung von Klonen, die Reporterkonstrukte enthalten. Diese Zellen werden zu einer stationären Phase aufgezogen und robotergestützt mit hoher Dichte auf eine poröse Membran ausgedruckt (z.B. Biodyne B Nunc). Zum Ausdrucken kann jeder beliebige Kontakt-Druckroboter oder kontraktlose Druckroboter (z.B. Biomek 2000, Beckman) verwendet werden. Die Membran befindet sich im engen Kontakt mit dem festen Medium. Ein entscheidender Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, die Membran von einer Oberfläche zur anderen Oberfläche zu bewegen, die ein unterschiedliches Medium enthält. Die Fähigkeit zur Messung der Lumineszenz als eine Funktion der regulatorischen Regionaktivität aus den Zellen, die in der festen Oberfläche aufgezogen wurden, war überraschend und unerwartet. LaRossa und Van Dyk ( US-P-6025131 ) haben bereits berichtet, dass die Methode zum Detektieren der Aktivität von regulatorischen Regionen als Reportergenaktivität in geeigneten Wirten auf die Zellen beschränkt war, die in den flüssigen Medien aufgezogen wurden. Das Aufziehen in einem festen Medium macht es möglich, dass man die Zellen bis zu einer gewünschten Dichte vor der Perturbation aufziehen und dann der Kinetik der Reaktion folgen kann. Versuchsprotokolle umfassen oftmals Perturbationen, die wegen des Zelltods oder anderer irreversibler Effekte eine Langzeitexponierung verbieten. Die Möglichkeit, das gesamte Array zu den neuen Wachstumsbedingungen zu verschieben, ermöglicht eine große Vielzahl von Versuchsschemen, einschließlich pulsierende oder Pulse-Chase-Exponierungen, Reversibilität und kurzzeitige Kinetikuntersuchungen. Einflüsse von Perturbanten können durch Vergleich der mit Hilfe der behandelten und kontrollierten Kulturen erzeugten Lumineszenz bestimmt werden.
Es müssen mehrere wichtige Merkmale des Assaysystems evaluiert werden. Speziell sind Wachstumsdichte und -bedingungen, Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und die Fähigkeit zur Perturbation der Reporter und Nachweisänderungen wichtige Brennpunkte.
Unter Verwendung der DNA-Schädigung in E. coli als ein Modellsystem wurde zuerst der Assay mit einer kleinen Reihe von gut charakterisierten Klonen entwickelt, um die Robustheit der Vorgehensweise zu bewerten. Die Reihe von 10 Klonen wurde für die Reaktion auf DNA-schädigendes Mittel getestet, nämlich Nalidixinsäure. Die erwartete Nalidixin-induzierte Heraufregulierung von Genen in dem SOS-Regulon wurde als erhöhte Biolumineszenz detektiert. (4B). Die Stärke der Biolumineszenz von den Stämmen, die Fusionen mit Genen enthielten, die auf eine DNA-Schädigung nicht reagierten, wurde durch die Behandlung mit Nalidixinsäure nicht beeinflusst (4A).
Es wurde die Klon-Reihe von Luxarray 0.5 verwendet, um einen in hohem Maße parallelen Festphasenassay durch Ausdrucken der Klone mit hoher Dichte zu entwickeln. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Erfassung eines Bilds des von Reporterkonstrukten erzeugten Signals, so dass die Signalintensität anschließend quantifiziert werden kann. Dieses macht es nicht nur erforderlich, dass die Erfassungsparameter (Brennebene, Vergrößerung, Integrationszeit und Algorithmus) konstant sind, sondern auch, dass die Software für die nachgeschaltete Bildanalyse über die Fähigkeit zur Verarbeitung der erzeugten Bilder verfügt. Die chemische Perturbation, eine der Nutzanwendungen der vorliegenden Erfindung, erfordert ein physikalisches Umsetzen einer Membran von der einen Kulturplatte zur anderen. Dieses führt zu Bildern mit minimaler X-Y-Positionsregistrierung. Diese Bilder können mehrere kommerziell verfügbare Produkte wirksam bearbeiten. Zwei für die entsprechenden Softwarepakete geeignete Beispiele sind die ArrayVision^TM (Imaging Research, Toronto, Kanada) und ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Zur Aufnahme der Daten wird eine gekühlte CCD-Kamera bevorzugt verwendet.
Für die genomregistrierte Klonsammlung wurden Rechenfilter angewendet, um eine nichtredundante Reihe von Reporterkonstrukten zu erzeugen, die näherungsweise 28% der Promotoren in dem Genom repräsentieren. Selbst bei diesem Bedeckungsgrad ist es wahrscheinlich, dass mindestens ein repräsentativer Promotor aller Regulone in E. coli in der Sammlung vorhanden ist. Diese große Reihe wurde in Versuchen der DNA-Schädigungsperturbation verwendet, um die Reaktion mehrerer Promotoren zu bestätigen. Wie mit den Experimenten geringer Dichte, die mit dem Luminometer quantifiziert wurden, festgestellt wurde, waren die erwarteten Reaktionen für den jeweiligen Klon gut demonstriert. Die fünf dokumentierten DNA-schadenansprechenden Reporterkonstrukte zeigten eindeutig eine Aufwärtsregulierung der Expression. Im Gegensatz dazu war die Lichterzeugung aus dem Stamm, der die lac-Promotorfusion trug sowie von mehreren Stämmen, die andere Promotorfusionen trugen, vermindert.
Ein Zellulararray (Luxarray 1.0) hoher Dichte in der vorliegenden Erfindung wurde ebenfalls zur Identifikation einer Reihe vermutlich zuvor unbekannter DNA-schadenreaktiver Operonen angewendet. Bei Behandlung mit der DNA-schädigenden chemischen Substanz, Nalidixinsäure, demonstrierten mehrere zuvor nichtbeschriebene Promotoren zusätzlich zu der erwarteten Promotoraktivität (d.h. SOS-Regulon) ein ähnliches Verhalten. Die vorliegende Erfindung lässt sich zur Überwachung transkriptioneller Änderungen in Hochleistungsform anwenden.
Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls ein Verfahren zum Identifizieren der Fusionen, die mit der Ausnahme nützlich sein könnten, dass die Orientierung der chromosomalen DNA relativ zu den Reportergenen invertiert ist, so dass die Promotorregionen, die von Interesse sind, nichtfunktionsfähig mit den Reportergenen verknüpft sind. Das Auswählen derartiger Fusionen und das Invertieren der Orientierung der insertierten DNA können die Nutzanwendung einer sequenzierte Sammlung deutlich verbessern, indem den Sammlungen sehr viel mehr funktionsfähig verknüpfte Fusionen hinzugefügt werden. Eine einfache Möglichkeit dieses vorzunehmen besteht darin, die Plasmid-DNA mit einem einzelnen Restriktionsenzym zu digerieren, welches unmittelbar außerhalb der klonierten Region trennt und die Stücke religiert. Obgleich sich aus dieser Prozedur eine Mischung von Plasmiden ergibt, kann in vielen Fällen das korrekt orientierte Plasmid ermittelt werden, da Zellen, die dieses enthalten, jedoch keine anderen möglichen Produkte, Licht erzeugen werden. Diese Methode des Invertierens wurde auch zur Anwendung gebracht, um Genfusionen der Lux-A-Sammlung hinzuzufügen. Abgesehen von der Lichterzeugung lassen sich andere Methoden anwenden (besonders PCR), um die Orientierung oder Größe des Inserts zu identifizieren.
Darüber hinaus können spezielle PCR-Primer für jede beliebige Region von Interesse an dem Chromosom bemessen werden, für das Sequenzdaten verfügbar sind. Für E. coli ist das gesamte Genom verfügbar. Durch Nutzung von Positions- und Richtungskoordinaten für bekannte und vorhergesagte Promotoren wurden daher spezielle Primer für die Aufgabe der Erzeugung eines PCR-Produktes konstruiert, das den jeweiligen Promotor enthält. Es wurde angenommen, dass der eigentliche Promotor in einem Genomfragment von 400 Basenpaaren liegt, das an der Verschiebungsstelle des Startcodons des ersten offenen Leserahmens in dem Operon endet. Aus dieser Region wurden für jedes Operon Primerpaare ausgewählt, so dass der "rechte" Primer gezwungen wurde, das Startcodon des ersten offenen Leserahmens des Operons einzubeziehen (Primer3, Rozen und Skaletsky (1996, 1997, 1998)). Der Code ist verfügbar bei http://www-genome.wiemit.edu/genome_software/other/primer3.html. Akzeptable PCR-Primerpaare wurden für 80% der Operone unter Anwendung der Standard-Primer3-Parameter mit einer optimalen Schmelztemperatur, Tm, von 68°C identifiziert. Primerpaare für die verbleibenden Operone lassen sich entweder identifizieren, das ein oder mehrere Parameter relaxiert werden, indem der Suchbereich ausgewählt wird, oder unter Anwendung eines anderen Algorithmus. Die endgültige Version der Primer schließt außerdem die Hinzufügung entsprechender EcoRI- und SacI-Endonuclease-Spaltstellen ein (linke bzw. rechte Primer), so dass die PCR-Produkte gerichtet in pDEW201 geklont werden können.
Noch andere Methoden zur Erzeugung von Genfusionen für eine genomregistrierte Sammlung führen eher zu chromosomalen Genfusionen als zu solchen auf Plasmidbasis. Transponierbare genetische Elemente, die Reportergene tragen, können verwendet werden, um Genfusionen zu erzeugen. Wenn dieses durch Random-Transposition in das Chromosom des Wirtsorganismus erfolgt, können die nachfolgenden Genfusionen in Bezug auf die chromosomale DNA-Sequenz genomregistriert sein, indem die Sequenz der Verbindung zwischen dem transponierbaren Element und dem Chromosom bestimmt wird (Nichols et al., (1998) J. Bacteriaol. 180:6408-6411). Alternativ können Transpositionen, die unter Verwendung eines definierten (und damit genomregistrierten) Segments chromosomaler DNA vorgenommen werden, mit Hilfe einer homologen Rekombination in das Wirtschromosom rekombiniert werden. Darüber hinaus können mit Hilfe einer homologen Rekombination Genfusionen, die mit Hilfe anderer Methoden, wie beispielsweise Klone in Plasmid-DNA, in vitro erzeugt wurden, in das Chromosom des Wirts rekombiniert werden (Balbas et al., (1996) Gene 172:65-69; Loyd und Low (1996) In Escherichia coli und Salmonella; Cellular und Molecular Biology. ASM-Press, S. 2236-2255), ortspezifische Rekombination (Nash H. (1996) In Escherichia coli und Salmonella; Cellular und Molecular Biology. ASM Press, S. 2363-2376) oder mit Hilfe beider (Boyd et al., (2000) J. Bacteriol. 182:842-847).
Die bevorzugten Methoden zur Erzeugung von Genfusionen schließen die Verwendung von Plasmid-DNA von Klonen ein, die eine Reorientierung als Template für die PCR erfordern, um eine Inversion zu erzeugen, die Verwendung spezifischer PCR-Primer, sofern Sequenzdaten verfügbar sind, oder die Anwendung einer Transposition zur Erzeugung von Genfusionen im Chromosom (Konyon und Walker (1980) Proc. Natl. Acad Sci. USA, 77:2819-2823), ohne auf diese beschränkt zu sein. Die am Meisten bevorzugte Methode zur Erzeugung von Genomfragmenten ist die Anwendung eines Restiktionsenzyms oder das physikalische Scheren. Die Genomfragmente werden sodann zu promotorlosen Reportergenen ligiert, um eine Genfusion zu erzeugen. Die vorgenannten Methoden zur Erzeugung von Fusionen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls ein Verfahren zur Verwendung der genomregistrierten Sammlung von Genfusionen in einem flüssigen Format, um Genfusionen zu finden, die als Biosensoren verwendbar sind. Beispielsweise wurde von 39 Genfusionen festgestellt, dass sie aufwärtsreguliert sind, wenn sie an Limonen für 135 Minuten (Beispiel 7) exponiert werden. Mit Hilfe der Verwendung dieser Genfusion in einem Stamm, der als der Produktionsorganismus für Limonen verwendet werden soll, lässt sich das Vorhandensein von Limonen oder lassen sich die optimalen Bedingungen für die Limonen-Erzeugung mit Hilfe der Aufwärtsregulierung der Biolumineszenz messen.
Genexpressionsprofile liefern Information, die für das Verständnis der Genfunktion und die chemischen Wirkungsweisen relevant ist. In ähnlicher Weise kann man zu einer solchen Information mit Hilfe der Analyse genetischer Veränderungen gelangen, die zu einem Funktionsverlust führen, zu verringerten Mengen oder einer Überexpression von Genprodukten. Damit lässt sich ein solcher "Array von Arrays" sowohl verwenden, um Untersuchungen der Wirkungsweise zu verbessern als auch der funktionellen Genomik. Die Ablaufdiagramme I und II zeigen zwei Wege derartiger Arrays von Arrays, die zur Anwendung gelangen können.
Das Ablaufdiagramm I stellt mehrere Tests dar, die an einer vorgegebenen Perturbation ausgeführt werden können, mit der die Umgebung der Zelle verändert wird. Ablaufdiagramm I
Mit dem Ablaufdiagramm II wird beschrieben, dass, wenn Daten von Arrays von Arrays analysiert werden, mit Hilfe ausgewählter Hilfsmittel in dem Array von Arrays veränderte Reaktionen weiter analysiert werden können, die von Interesse sind. Ablaufdiagramm II
Diese Arrays von Arrays können aufgebaut werden, indem große Sammlungen von genomregistrierten Mutationen in Genen eines Organismus erzeugt werden. Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung und einschließlich die Folgenden, ohne auf diese beschränkt zu sein: klassische Bestrahlung und chemisch induzierte Mutagenese sowie modernere Methoden auf Genombasis und einschließlich in vivo-Random-Transposition gefolgt von einem Sequenzieren von Verbindungen, um das Gen zu ermitteln, das zu einzelnen Genen in in vitro-Transposition zerteilt, gerichtet wurde, gefolgt von einer homologen Rekombination in vivo, um Aufteilungen zu erzeugen, und Primer-Oligonucleotid-erzeugte Deletion und Insertion-Allele, die in vitro durch PCR erzeugt werden und nachfolgend zu dem Genom rekombiniert werden. Mit Hilfe einer Vielzahl von Methoden lassen auch spontane Mutanten auswählen (LaRossa, R. A. (1996) In Escherichia coli und Salmonella: Cellular and Molecular Biology. ASM Press, S. 2527-2587). In ähnlicher Weise lässt sich eine große Sammlung von genomregistrierten genetischen Veränderungen erzeugen, die zu einer Überexpression führen. Dieses kann in mehrfacher Weise erreicht werden und einschließlich durch genetische Auswahl (LaRossa, R.A. (1996) In Escherichia coli und Salmonella: Cellular and Molecular Biology. ASM Press, S. 2527-2587), Klonen von Multicopy-Plasmiden, Einsetzen des Gens, das überexpremiert werden soll, hinter einem starken Promotor, sowie Einsetzen des Gens, das überexpremiert werden soll, hinter einem regulierten Promotor, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Perturbationen sind eine beliebige Veränderung der Umgebung oder des Genotyps. Perturbationen, die die Umgebung verändern, schließen die folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: physikalische Eigenschaften, wie beispielsweise Strahlungsfluss, Strahlungsspektrum, Feuchte, Substrat oder Temperatur; Nähreigenschaften, wie beispielsweise Kohlenstoffquelle, Energiequelle, Stickstoffquelle, Phosphorquelle, Schwefelquelle oder Quellen von Spurenelementen; biologische Eigenschaften, wie beispielsweise das Vorhandensein von Konkurrenten, Prälatoren, Kommensale, Pathogene, wie beispielsweise Phagen und sonstige Vieren, das Vorhandensein von Toxinen oder Bakterocinen; und chemische Eigenschaften, wie beispielsweise das Vorhandensein von Komplexbildnern, Inhibitoren, Giftstoffen oder anormalen Mengen an normalen Metaboliten.
Auf eine vorgegebene Perturbation können verschiedene Tests ausgeführt werden, die die Umgebung der Zelle verändern (Diagramm I). Reaktionen schließen Muster von Genexpression (z.B. Reportergenexpression, Vorhandensein oder Fehlen von speziellem Protein oder Intermediaten) und phänotypische Effekte genetischer Veränderungen ein; diese Reaktionen lassen sich gleichzeitig analysieren. Beispiele für Phänotypen, die einem Screening unterzogen werden können, schließen in der vorliegenden Erfindung die Folgenden ein, ohne auf diese beschränkt zu sein: metabolische Fähigkeiten (z.B. Kohlenstoffquelle-Bedarf, Auxotopher-Bedarf, Aminosäure-Bedarf, Stickstoffquelle-Bedarf und Purin-Bedarf); Beständigkeit gegenüber anorganischen Chemikalien (z.B. Säure, Arsenat, Azid, Schwermetalle und Peroxid); Beständigkeit gegenüber organischen und biologischen Chemikalien (z.B. Antikörper, Acridin, Actinomycin, Aminopurin, Aminophenylalanin, Colicin, Ethanol, Fluoracetat, Mitomycin C und Nalidixinsäure); Beständigkeit gegenüber biologischen Erregern (z.B. Phagen); Beständigkeit gegenüber physikalischen Extrembedingungen (z.B. Temperatur, pH-Wert, Osmotoleranz und Strahlung). Die Phänotypen, die einer Detektion mit Hilfe der vorliegenden Erfindung zugänglich sind, sind zahlreich, und eine vollständige Übersicht findet sich in Robert LaRossa: Escherichia coli und Salmonella: Cellular and Molecular Biology (1996) ASM press S. 2527-2587). Dieses wird ein verstärktes empirisches Anpassen einer der Perturbationen an der anderen ergeben. Wenn beispielsweise eine der Chemikalien ein sehr ähnliches Muster von Effekten in allen Tests wie eine andere Chemikalie liefert, ist die Wahrscheinlichkeit für eine ähnliche Wirkungsart der zwei Chemikalien hoch. Zweitens, wird eine derartige gleichzeitige Analyse mehrerer Muster das Verständnis der Genfunktion verbessern. Wenn beispielsweise eine Gruppe von Genen in ähnlicher Weise durch Umgebungsperturbation reguliert wird und eine genetische Perturbation (d.h. Mutation) in dieser Gruppe von Genen ähnliche phänotypische Wirkungen hat, kann hypothetisch von einer ähnlichen Funktion ausgegangen werden.
Das Ablaufdiagramm II zeigt, dass, wenn Daten von Arrays von Arrays analysiert werden, veränderte Reaktionen, die von Interesse sind, weiter durch Auswahl von Hilfsmitteln in dem Array von Arrays analysiert werden können. Beispielsweise kann man jede beliebige Perturbation auswerten, indem danach gefragt wird, welche Mutanten gegenüber der Umgebungsänderung hypersensitiv oder hyperresistent sind. Man betrachte das Genexpressionsprofil vom Wild-Typ und den veränderten Mutanten in der Reaktion auf die Umgebungsschädigung und in deren Abwesenheit. Eine andere Vorgehensweise zur Untersuchung genetischer Veränderungen besteht in einem Vergleich der genomregistrierten Sammlung von Mutanten mit dem Wild-Typ, indem untersucht wird, wie die Wachstumscharakteristik zwischen den Mutanten und dem Wild-Typ bei Änderungen in einem großen Bereich von Umgebungsparametern variiert. Die interessierenden Unterschiede werden sodann mit der Genexpressions-Profilbestimmung weiter verfolgt.
Wenn Arrays von Arrays genutzt werden, wird die umfangreiche Datenmenge von Phänotypen, die sich aus den Wechselwirkungen zwischen Gentypen und der Umgebung ergibt und entweder durch Änderung der genetischen Zusammensetzung ermittelt wird oder durch Änderung der Kulturbedingungen, eine Interpretation des Wechselspiels zwischen Mutanten und Genexpressionsprofilen ermöglichen. Die Analyse derartiger Wechselwirkungen wird ebenfalls bei der Entdeckung einer Genfunktion und beim Bestimmen der Arten einer chemischen Wirkung nützlich sein. Darüber hinaus können diese Analysen zur Identifikation verwendbarer Targets für Pharmazeutika, antimikrobieller Substanzen oder Agrochemikalien, zur Entwicklung von Tests der Umweltdiagnostik oder Entwicklung eines Hochleistungs-Screenings auf der Grundlage der Arten oder der Stellen der chemischen Wirkung führen.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele festgelegt. Es gilt als selbstverständlich, dass diese Beispiele, obgleich sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zeigen, lediglich zur Veranschaulichung gegeben werden. Aus der vorstehenden Diskussion und aus diesen Beispielen kann der Fachmann auf dem Gebiet die wesentlichen Merkmale der vorliegenden Erfindung erkennen und kann, ohne vom Grundgedanken des Schutzumfanges abzuweichen, zahlreiche Änderungen und Modifikationen an der Erfindung vornehmen, um sie einer unterschiedlichen Nutzung und unterschiedlichen Bedingungen anzupassen.
ALLGEMEINE METHODEN
Die in den Beispielen zur Anwendung gelangenden Standardmethoden der rekombinanten DNA und des molekularen Klonens sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und wurden beschrieben von: Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989)(Maniatis) und von T.J. Silhavy, M.L. Bennan, und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) und von Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, veröffentlicht von Greene Publishing Assoc. und Wiley-Interscience (1987).
Die Bedeutung der Abkürzungen ist die Folgende: "KB" bedeutet Kilobase(n), "hr" bedeutet Stunde(n), "Min" bedeutet Minute(n), "Sec" bedeutet Sekunde(n), "d" bedeutet Tag(en), "ml" bedeutet Milliliter, "μl" bedeutet Mikroliter, "nl" bedeutet Nanoliter, "μg" bedeutet Mikrogramm, "ng" bedeutet Nanogramm, "mM" bedeutet millimolar, "μM" bedeutet mikromolar.
MEDIEN UND KULTURBEDINGEN
Die für die Aufrechterhaltung und das Wachstum bakterieller Kulturen geeigneten Materialien und Methoden wurden entnommen aus "Experiments in Molecular Genetics" (Jeffrey H. Miller), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972), "Manual of Methods for General Bacteriology" (Phillip Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg und G. Briggs Phillips, eds), S. 210-213, American Society for Microbiology, Washington, DC. Oder Thomas D. Brock in "Biotechnology; A Textbook of Industrial Microbiology", 2. Ausg., (1989) Sinauer Associates, Inc. Sunderland MA. Alle Regenzien und Materialien, die für das Wachstum und die Aufrechterhaltung bakterieller Zellen verwendet wurden, wurden erhalten von Aldrich Chemicals (Milkaukee, WI), DIFCO Laboraoties (Detroit, MI), Gobco/BRL (Gaithersburg, MD) oder Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), sofern nicht anders angegeben.
Das LB-Medium enthält das folgende Medium bezogen auf einen Liter: Bacto-Trypton (10 g), Bacto-Hefeextrakt (5 g) und NaCl (10 g).
Das Vogel-Bonner-Medium enthält die folgenden Bestandteile bezogen auf einen Liter: 0,2 g MgSO₄·7H₂O, 2 g Citronensäure·1 H₂O, 10 g K₂HPO₄ und 3,5 g NaHNH₄PO₄·4H₂O.
Ein M9-Minimalmedium enthält die folgenden Bestandteile des Mediums pro Liter: Na₂HPO4 (6 g), KH₂PO₄ (3 g), NaCl (0,5 g) und NH₄Cl(1 g).
Die vorgenannten Medien wurden zur Sterilisation autoklaviert und anschließend 10 ml 0,01 Mol CaCl₂ und 1 ml 1 Mol MgSO₄·7H₂O zu den M9-Medien zugegeben. Die Kohlenstoffquelle und andere Nährstoffe wurden zugegeben, wie in den Beispielen ausgeführt wurde. Die Zugaben wurden vorsterilisiert, bevor sie den Medien zugesetzt wurden.
METHODEN DER MOLEKULARBIOLOGIE:
Restriktionsenzymdigestionen, Ligationen, Transformationen und Methoden der Agarose-Gelelektrophorese, wurden ausgeführt entsprechend der Beschreibung in Sambrook, J., et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Die Methoden der Polymerasekettenreaktionen (PCR) finden sich in White, B., "PCR Protocols: Current Methods and Applications", Bd. 15 (1993) Hamana Press Inc.
BEISPIEL 1
KONSTRUKTION, SEQUENZIEREN UND REGISTRIEREN EINER RANDOM-BANK VON E. COLI-GENOMFRAGMENTEN FUSIONIERT MIT EINEM LUXCDABE-REPORTER
Die Random-Bank von E. coli-Genomfragmenten im Plasmid pDEW201, die den Ursprung der Replikation und bla von pBR322 enthält, vier Transkriptionsterminatoren stromaufwärts der promotorlosen P. luminescens-luxCDABE-Gene und eine mehrfache Klonierungsstelle, die zwischen den Terminatoren und luxCDABE liegt, wurde aufgebaut, wie bereits beschrieben wurde von Van Dyk et al., (1998), J. Bacteriol. 180:785-792; Van Dyk und LaRossa, (1998), Methods in Molecular Biology: Bioluminescence, Methods and Protocols, Humana Press Inc., Bd. 102:85-95).
Verkürzt gesagt, wurde chromosomale DNA isoliert aus E. coli-Stamm W3110 (Ernsting et al., (1992), J. Bacteriol. 174:1109-1118), teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3A1 digeriert, größenfraktioniert mit Hilfe von Agarose-Gelelektrophoresen und eine Fraktion mit einer mittleren Größe von näherungsweise 1,8 kb isoliert. Diese Fraktion wurde ligiert mit pDEW201, die zuvor digeriert wurde mit BamHI und behandelt wurde mit Kälberdarm-Alkaliphosphatase. Die Ligierungsprodukte wurden verwendet, um ultrakompetente E. coli XL2Blue-Zellen zu transformieren (Stratagene) unter Anwendung der von Stratagenen gelieferten Vorschrift zu Ampicillin-Resistenz zu transformieren. Die in eine vorläufige Charakterisierung einzelner XL2Blue-Transformanten, die willkürlich genommen wurden, zeigte, dass ein großer Prozentanteil (16 von 16) insertierte DNA mit einem Größenbereich von 0,9 bis 3,0 kb enthielt. Näherungsweise 24.000 von diesen Transformanten wurden gepoolt und als eine Quelle für heterogene Plasmid-DNA verwendet, die unter Verwendung von Qiagen-tip20-Säulen (Qiagen Corp) isoliert wurde. Dieser Plamid-DNA-Pool wurde verwendet, um E. coli DPD1675 (Nishimura et al. (1990) zu transformieren (Acids Res. 18:6169; Van Dyk und LaRossa (1998) Methods in Molecular Biology: Bioluminescence Methods and Protocols, Humana Press Inc., Bd. 102:85-95), durch Selektieren auf Ampicillin-Resistenz und Anwendung einer 30-minütigen phänotypischen Expressionszeit, um das Vorhandensein von Geschwistern auf ein Minimum herabzusetzen. Insgesamt wurden 8.066 einzelne Transformanten verwendet, um 96 Mulden steriler Microtest III^TM Tissue Culture Plates (Falcon^®)-Kulturplatten zu beimpfen, die jeweils 190 μl Vogel-Bonner-Medium (Davis et al., (1980) Advanced bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY) mit Glukose als eine Kohlenstoffquelle enthielten und ergänzt wurden mit Thiamin, Uracil, Prolin und 25 μg/ml Ampicillin. Diese Platten wurden abgedeckt und über Nacht ohne Schütteln bei 37°C inkubiert. Die Übernacht-Kulturen in den 96-Mulden-Platten wurden zur dauerhaften kryogenen Lagerung in doppelter Ausführung bei –80°C verwendet (Menzel, R., (1989), Anal. Biochem. 181:40-50). Diese 8.066 einzelnen Kulturen wurden bezeichnet als die Lux-A-Sammlung.
Für die DNA-Sequenzanalyse wurde die eine der doppelten Reihen der Lux-A-Sammlung aufgetaut und als Inokulum für Kulturen verwendet, die bis zur Sättigung in Terrific Broth (Gibco-BRL, Inc) aufgezogen wurden und 100 μg/ml Ampicillin in 96 Mulden-Platten mit tiefen Mulden enthielten. Die Plasmid-DNA wurde aus den Kulturen unter Anwendung der Qiagen R.E.A.L.^TM-Präparationsmethode mit der folgenden Modifikation extrahiert: Nach der Lyse von Zellen wurden die Platten in ein Bad mit siedendem Wasser für 5 Minuten gegeben und anschließend in einem Eisbad vor der Ausfällung mit Puffer 3 rasch abgeschreckt. Diese Modefikation verhinderte einen Abbau der Plasmid-DNA durch die in dem non-endA-Wirtsstamm, DPD1675, vorhandenen Nucleasen. Die DNA-Sequenzierungsreaktionen wurden ausgeführt mit näherungsweise 1 mg Plasmid-DNA unter dem Standard ABI Prism^TM Dye Terminator Reaction Ready-Bedingungen mit den Primern pDEW201.forward (SEQ ID Nr.: 1, 5'GGATCGGAATTCCCGGGGAT-3') und pDEW201.reverse (SEQ ID Nr.: 2, 5'CTGGCCGTTAATAATGAATG-3'), um eine Sequenzinformation von jedem Ende des Insertes zu erhalten. Die DNA-Sequenzen wurden auf verbesserten ABI377^TM-XL 96-Spur-Sequenzen unter 4 Durchlaufbedingungen auf 5% PAG (Polyacrylamid-Gel), Long Ranger^TM (FMC, Inc.)-Gelen bestimmt und mit ABI-Software analysiert. Die DNA-Sequenzen wurden zur weiteren Analyse auf ein auf UNIX basierendes Gerät übertragen. Eine Homologiesuche für die Sequenz wurde von Beginn bis Ende jedes Lux-A-Klons (in beiden Orientierungen) gegen die komplette E. coli-Sequenz (Gen-Bank-Zugriffnr. U00096) unter Anwendung von Pearson's FASTA-Programm (fasta3, Version 3.1t13) ausgeführt. Die entscheidenden Fasta-Optionen waren nQH-m 10-z0.
Die entscheidenden Daten über jede besonders signifikante Ausrichtung (FASTA score>1000, Mindesüberlappungslänge >200 und Minimumidentität >70%) wurden in einer rationalen Datenbank gespeichert (Sybase System 11, Sybase Inc.).
Sodann wurde die Stelle des Lux-A-Klons auf dem E. coli-Genom auf die vorstehend berechneten Homologien sowohl für den Beginn als auch für das Ende des Insertes unter Anwendung der folgenden Regeln bezogen:

i) Sowohl die distalen als auch die proximalen Enden des Insertes müssen über eine eindeutige hohe Sequenzhomologie mit E. coli verfügen,
ii) die relative Stelle und Orientierung der Anpassungen der Sequenz, die von dem Beginn und dem Ende des Klons ermittelt wurden, ergeben eine angemessene Länge für den Klon, von der bekannt ist, dass sie in einer verhältnismäßig schmalen Verteilung liegt.

In vielen Fällen ergab die vorgenannte Prozedur eine einzige wahrscheinliche Stelle, in anderen Stellen gab es jedoch mehrfache mögliche Stellen. Die Ergebnisse wurden in der relationalen Datenbank gespeichert.
Eine Tabelle der Annotationen der offenen Leserahmen für E. coli wurde unter Anwendung einer Entrez-Einrichtung von NCBI heruntergeladen und diese Daten in der relationalen Datenbank gespeichert.
Es wurde eine Web-basierende tabellarische Interface der Daten erzeugt. Dadurch ist man in der Lage, die Lux-A-Klone in Beziehung zu der funktionellen Annotation zu sehen. Ebenfalls wurde eine auf Java basierende graphische Interface erzeugt, damit man positionelle und richtungsbezogene Verhältnisse leicht visualisieren kann. Damit wurde die Lux-A-Sammlung auf das E. coli-Genom registriert.
BEISPIEL 2
VALDIERUNG DER LUX-A-SAMMLUNG DURCH VERIFIKATION AUSGEWÄHLTER GLOBALER REGULATORISCHER REAKTIONEN
Mit dem Sequenzieren von Lux-A-Sammlungen und dem Registrieren der Mehrzahl der Lux-A-Vertreter war es möglich, die biologischen Reaktionen auf Stämme weiter zu untersuchen, die luxCDABE-Fusionen oder andere Vertreter mit gut charakterisierten regulatorischen Kreisen enthalten. Aus der Lux-A-Sammlung wurden Genfusionen mit lac-Operon und Vertreter der Hitzeschock-, SOS-, SoxRS- und OxyR-Regulonen ausgewählt und die Reaktionen auf bekannte Induktoren jeder dieser globalen regulatorischen Kreise getestet.
WACHSTUMSMEDIEN UND CHEMIKALIEN
Verwendet wurde ein reiches flüssiges Medium, nämlich LB (Miller, J.H., (1972), Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY). Sofern vorgegeben, wurde Ampicillin (Amp) mit 150 μg/ml zugegeben. Ethanol (200 proof, Quantum Chemicals) wurde verdünnt direkt in das LB-Medium gegeben. Eine Stammlösung von 20 mg/ml Nalidixinsäure (Sigma Chemical Co.) in 1 molarem NaOH wurde ebenfalls in LB-Medium verdünnt. In ähnlicher Weise wurde eine Stammlösung von 100 ml/ml Methylviologen (Sigma Chemical Co.) in Wasser weiter verdünnt in LB-Medium. Bis zu den gewünschten Konzentrationen wurde eine 30%ige Lösung von Wasserstoffperoxid (EM Science) in LB-Medium verdünnt.
RE-ISOLIERUNG VON MIKROPLATTEN, WACHSTUMSKULTUREN UND TESTEN VON STRESSREAKTIONEN
Es wurden ausgewählte Stämme aus der Lux-A-Sammlung von Mikroplatten, die bei –80°C gelagert wurden, re-isoliert, indem einzelne Kolonien auf den LB-Amp-Platten ausgezogen wurden. Die Reinheit der Kulturen in den Mulden wurde getestet, indem vier einzelne Kolonien in 100 μl LB-Medium in einer 96-Mulden-Luminometerplatte (Microlite, Dynex Technologies) beimpft wurden. Eine reproduzierbare Biolumineszenz jeder Reihen von vier Isolaten gewährte eine Bestätigung für die klonale Reinheit.
Um die Testreaktionen zu testen, wurden eine oder zwei einzelnen Kolonien jedes ausgewählten Stammes zur Beimpfung von 5,0 ml LB-Medium mit einem Gehalt von 150 μg/ml Ampicillin verwendet. Diese Kulturen wurden über Nacht bei 37°C aufgezogen und anschließend durch Zugabe von 50 μl oder 100 μl der über Nacht aufgezogenen Kultur zu 10,0 ml frischem LB-Medium (ohne Ampicillin) verdünnt und unter Bewegung bei 37°C aufgezogen, bis die Kultur sich in einer exponentiellen Phase mit Ablesungen auf einem Klett-Summerson-Colorimeter befand, das ein Rotfilter zwischen 10 und 40 enthielt. Diese aktiv aufgezogenen Kulturen wurden sofort zur Auslösung einer Stressreaktion in einem Versuch durch Zugabe von 50μl-Kulturen zu 50μl LB-Medium verwendet, das verschiedene Konzentrationen der chemischen Substanz in den Mulden einer 96-Mulden-Luminometerplatte enthielt. Diese Aufteilung der aktiv aufgezogenen Kultur zum Zeitpunkt der Zugabe der chemischen Substanz gewährleistete das Vorhandensein identischer Populationen, wenn der Stress ausgelöst wurde. Es wurde die Lichterzeugung in einem Dynex ML3000-Luminometer bei 37°C gemessen. Die dimensionslosen Einheiten der Lichterzeugung, relative Lichteinheiten (RLU), wurden durch Vergleich mit der Lichtablesung von einer internen lichtemittierenden Diode erhalten. Es wurde der Zyklusmodus des ML3000-Luminometers ähnlich den früheren Beschreibungen (Van Dyk et al., Appl. Environ. Microbiol. 60:1414-1420) angewendet.
GENFUSIONEN MIT DEM LACZYA-OPERON

Die Transkription des sehr gut charakterisierten lac-Operons wird sowohl mit spezifischen als auch mit globalen regulatorischen Kreisen reguliert. Eine spezifische negative Regulierung wird durch den lacI-codierten Repressor vermittelt (Choy und Adhya, (1996) In Escherichia coli und Salmonella: Cellular and Molecular Biology. ASM Press, S. 1287-1299). Die globale Regulierung wird in Reaktion auf Glukose-Verfügbarkeit durch positive transkriptionelle Aktivierung von cAMP-CRP vermittelt (Botsford und Harman (1992) Cyclie AMP in Prokaryotes. Microbiol. Rev. 56:100-122). Die Lux-A-Sammlung enthält drei Vertreter, bei denen es sich um Fusionen von luxCDABE mit dem lac-Operon handelt, wie in 1 gezeigt wird. Um die entsprechende Reaktion auf diese Genfusionen mit Glukose zu testen, wurde jedes reisoliert und auf Biolumineszenz getestet, wenn diese in Gegenwart oder bei Abwesenheit von Glukose in LB-Medium aufgezogen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 Fusionen mit dem lac-Operon in der Lux-A-Sammlung RLU von 100 μl Übemacht-Kulturen

Lux-Klon	LBAmp¹⁵⁰ + 0,4% Glukose	LBAmp¹⁵⁰
lux-a.pk034.a6 (a)	0,002	23,0
lux-a.pk034.a6 (b)	0,001	18,8
lux-a.pk050.b9 (a)	0,001	26,0
lux-a.pk050.b9 (b)	0,001	0,007
lux-a.pk065.d4 (a)	0,001	19,1
lux-a.pk065.d4 (a)	0,001	19,6

Es wurden zwei isolierte Einzelkolonien jeder Kultur getestet, indem sie über Nacht in dem vorgegebenen Medium aufgezogen und anschließend die Biolumineszenz von 100 μl in einem ML3000-Luminometer gemessen wurde. Bei dem LBAmp-Medium handelte es um LB-Medium mit einem Gehalt von Ampicillin einer Konzentration von 150 mg/ml.
Mit nur einer Ausnahme zeigte jede der aus den Kulturen in der Lux-A-Sammlung isolierten Kolonien in Abwesenheit von Glukose eine sehr viel stärkere Biolumineszenz als in ihrer Gegenwart. Eine der Kolonien aus dem lux-a.pk050.b9, die keine starke Biolumineszenz zeigte, könnte auf Kontamination der Kultur in dieser Mulde zurückzuführen sein. Andere Ereignisse einer vermutlichen Querkontamination sind nicht beobachtet worden. Jeder der lacZ-luxCDABE-Fusionsstämme hatte mindestens eine re-isolierte Kolonie, die die erwartete Reaktion auf Glukose lieferte. Somit wurde die entsprechende biologische Reaktion dieser Vertreter der Lux-A-Sammlung verifiziert.
HITZESCHOCK-REGULON-GENFUSIONEN

Die Lux-A-Sammlung wurde untersucht, um Fusionen mit Genen in dem σ³²-kontrollierten Hitzeschock-Regulon (Gross, C.A., (1996) In Escherichia coli und Salmonella: Cellular und Molecular Biology, 2. Ausg., ASM Press, S. 1382-1399) zu ermitteln. Tabelle 3 zeigt die Gene oder Operonen, für die die Lux-A-Sammlung durchsucht wurde, und zeigt die Zahl der Genfusionen, die für jedes Gen ermittelt wurde. TABELLE 3 Genfusionen der Lux-A-Sammlung mit Vertretern des Hitzeschock-Regulons

Hitzeschock-Gen oder Operon	Zahl der Fusionen in der Lux-A-Sammlung
grpE	0
lon	1
clpPX	0
dnaKJ	0
groESL (mopAB)	0
rpoD	3
htpG	0
clpB	I
htpX	0
htgA (htpY)	0
hslT (ibpA)	0
rfaDFCL (htrM)	1

Obgleich es keine vollständige Repräsentation des jeweiligen Vertreters des Hitzeschock-Regulons gab, wurden lux-Fusionen mit vier von zwölf Hitzeschock-Promotoren (33%) ermittelt. Damit enthält die Lux-A-Sammlung Vertreter, die eine Aktivierung dieser Stressreaktion zeigen müssten. Darüber hinaus sind Stämme mit zuvor konstruierter grpE-luxCDABE-Genfusion in elterlichem Plasmid pDEW201 (Van Dyk et al., (1998) J. Bacteriol. 180:785-792) in ausgewählte Mulden der Platten der Lux-A-Sammlung gegeben worden. Eine von diesen wurde auch zum Testen ausgewählt. In Tabelle 4 sind die Informationen über die sechs Stämme zusammengestellt, die aus den Mulden der tiefgefrorenen Lux-A-Sammlung reisoliert wurden. TABELLE 4 Hitzeschock-Regulon-Genfusionen

Lux-Klon	Stamm-Name	Insert- Größe	Fusion mit	Gene in geklonter DNA	Basal- RLU*	3% Ethanol- Reaktionsverhältnis
lux-a.pk057.h1	DPD2241	581	grpE	yfjB' grpE'	61,1	5,2
lux-a.pk021.g 11	DPD2242	2154	lon	'clpP clpX lon'¹	6,71	5,6
lux-a.pk089.e7	DPD2246	1989	rpoD	'dnaG rod'2	9,49	2,4
lux-a.pk054.c3	DPD2243	2319	clpB	'sfhB yfiH clpB'³	38,5	4,7
lux-a.p k040.e4	DPD2244	2650	rfaDFCL	yibB' rfaD rfaF'	33,1	1,4

* Vom Zeitpunkt Null der Kontrolle (unbehandelt) aktiv aufgezogener Kulturen in Vogel-Bonner-Minimalmedium, die während des Screenings auf Sulfometuronmethyl-Reaktionen erhalten wurden (Van Dyk et al., J. Bacteriol. 180:785-792).
# Das Verhältnis der Biolumineszenz von der mit 3% Ethanol für 40 Minuten nach Ethanol-Zugabe behandelten Kultur zu LB dividiert durch die Biolumineszenz der unbehandelten Kontrolle in LB zum gleichen Zeitpunkt.
1 clpP und clpX sind cotranskribiert; damit ist kein Promotor stromaufwärts des clpX zu erwarten.
2 Dieses Fragment sollte lediglich den rpoD-spezifischen Promotor enthalten (Tylor et al., (1984) Cell. 38:371-381).
3 Es gibt keinen intergenen Abstand zwischen sfhB und yfiH, so dass es unwahrscheinlich ist, dass es stromaufwärts von yfiH einen Promotor gibt.

Die Bezeichnung ("oder") wird benutzt, um anzugeben, dass das E. coli-Gen in der chimären Reportergen-Fusion abgestumpft ist. Wenn sich das Zeichen' am Anfang des Gen-Namens befindet (z.B. 'lacZ), bedeutet dieses, dass das 5'-Ende fehlt. Wenn sich das Zeichen ' am Ende des Gens befindet (z.B. lacZ') bedeutet dieses, dass das 3'-Ende des Gens nicht vorhanden ist.
Die Lichterzeugung aus jedem dieser Stämme bei Fehlen von Stress steht in Übereinstimmung mit jedem dieser chromosomalen DNA-Fragmente, die einen aktiven Promotor enthalten, da diese Werte sehr viel größer sind als die von einer Kultur, welche das elterliche Plasmid pDEW201 trägt, das unter den gleichen Bedingungen 0,002 RLU hatte (Van Dyk et al., (1998) J. Bacteriol. 180:785-792). Diese Stämme wurden auf ihre Fähigkeit getestet, bei der Hitzeschock-Stressreaktion unter Verwendung von 5%, 4%, 3% und 2% (Volumen/Volumen) einen bekannten, potenten chemischen Induktur nachzuweisen. Im Vergleich zur Kontrolle, der unbehandelten Kultur, führte jeder dieser sechs Stämme bei mindestens zwei Konzentrationen von Ethanol zu einer erhöhten Biolumineszenz. Tabelle 4 enthält das Reaktionsverhältnis für jeden Stamm zu 3% Ethanol bei einer Behandlung von 40 Minuten. Diese Daten demonstrieren, dass diese Hitzeschock-Regulon-Genfusionen von der Lux-A-Sammlung die Induktion der Hitzeschockreaktion nachweisbar machen.
SOS-REGULON-GENFUSIONEN

In einer ähnlichen Weise, wie sie vorstehend beschrieben wurde, wurde die Lux-A-Sammlung untersucht, um Fusionen mit Genen in dem SOS-DNA-Schädigungsreaktionsregulon zu finden (Kim et al., (1997) Proc Natl Acad Ssci USA 94(25):13792-7; Walker, G.C. (1996) In Escherichia coli und Salmonella: Cellular and Molecuklar Biology. ASM Press, S. 1400-1416). Tabelle 5 zeigt die Gene oder Operonen, für die die regellos erzeugte Lux-A-Sammlung untersucht wurde, sowie die Zahl der bei jedem Gen vorhandenen Genfusionen. TABELLE 5 Mengen der Lux-A-Sammlung-Genfusionen mit Vertretern des SOS-Regulons

SOS-Gen oder -Operon	Zahl der Fusionen in der Lux-A-Sammlung
umuDC	0
recA	2
uvrA	1
uvrB	0
sulA (sfiA)	0
uvrD	1
recN	0
polB (dinA)	0
dinP (dinB)	1
dinD	0
dinF	1
dinG	1
dinI	0
ruvAB	1

Von den untersuchten vierzehn SOS-Regulongenen oder -operonen wurde von sieben (50%) festgestellt, dass sie mit Hilfe von verwendbaren Fusionen in der Lux-A-Sammlung repräsentiert werden.

Damit enthält diese Sammlung Vertreter, die bei Aktivierung der SOS-Stressreaktion nachweisbar sind. In Tabelle 6 ist die Information über die acht Stämme zusammengestellt, die aus Mulden der tiefgefrorenen Lux-A-Sammlung re-isoliert wurden. TABELLE 6 SOS-Regulon-Genfusionen

Lux-Klon	Stamm-Name	Insert-Größe	Fusion mit:	Gene in der Insert-DNA	Basal RLU*	Nalidixinsäure-Reaktionsverhältnis#
lux-a. k085.a5	DPD2247	2840	dinF	plsB(-)'dgkA(+) lexA(+)dinF(+)'	0,224	2,2
lux-a. pk0024.f5	DPD2248	2022	dinG	'rh1E(+)ybiA(-) dinG(+)'	32,8	2,0
lux-a. pk055.a3	DPD2249	2125	dinP	fhiA(-)'mbhA(+) dinP(+)'	4,41	5,0
Lux-a. pk022.d4	DPD2250	1789	recA	'mtlB(-)ygaD(-) recA(-)'	97,5	1,8
lux-a. pk085.b5	DPD2251	1782	recA	'mtlB(-)ygaD(-) recA(-)'	99,5	2,8
lux-a. pk01.b6	DPD2253	2105	uvrA	yjcC(+)'yjcB(-) ssb(+)uvrA(-)'	Nicht durchgeführt	1,4
lux-a. pk052.b6	DPD2254	1632	uvrD	'xerC(+) yigB(+) uvrD(+)'	15,7	1,2
lux-a. pk058.f2	DPD2293	1890	ruvA(-)	'yebC(-)ruvC(-) yebB(+)ruvA(-)'	14,3	4,6

* Vom Zeitpunkt Null der Kontrolle (unbehandelt) aktiv aufgezogener Kulturen in Vogel-Bonner-Minimalmedium, die während des Screenings auf Sulfometuronmethyl-Reaktionen erhalten wurden (Van Dyk et al., J. Bacteriol. 180:785-792).
# Das Verhältnis der Biolumineszenz von der mit 5 μg/ml Nalidixinsäure für 110 Minuten nach Nalidixinsäure-Zugabe behandelten Kultur zu LB dividiert durch die Biolumineszenz der unbehandelten Kontrolle in LB zum gleichen Zeitpunkt.

Die Bezeichnung ("oder') wird benutzt, um anzugeben, dass das E. coli-Gen in der chimären Reportergen-Fusion abgestumpft ist. Wenn sich das Zeichen' am Anfang des Gen-Namens befindet (z.B. 'lacZ), bedeutet dieses, dass das 5'-Ende fehlt. Wenn sich das Zeichen ' am Ende des Gens befindet (z.B. lacZ') bedeutet dieses, dass das 3'-Ende des Gens nicht vorhanden ist.
Jeder dieser Stämme, der auf Basal-Biolumineszenz in dem definierten Medium getestet wurde, hatte einen größeren Wert der Lichterzeugung als ein Stamm, der das elterliche Plasmid enthielt, was auf das Vorhandensein eines Promotors hinweist, der die Expression des luxCDABE-Reporters antreibt. Die Fähigkeit dieser Promotor-luxCDABE-Fusionen zum Nachweis der Aktivierung der SOS-Stressreaktion wurde unter Verwendung von Nalidixinsäure, bei der es sich um einen bekannten, potenten chemischen Induktur handelt, getestet. Die Endkonzentrationen von Nalidixinsäure betrugen 1, 5, 25 und 125 μg/ml für alle Stämme mit Ausnahme von DPD2293, die getestet wurden bei 80, 40, 20, 10, 5, 2,5 und 1,25 μg/ml. Bei jedem dieser acht Stämme führten mindestens drei Konzentrationen von Nalidixinsäure zu einer erhöhten Biolumineszenz. In Tabelle 6 ist das Reaktionsverhältnis auf 5 μg/ml Nalidixinsäure bei 110 Minuten nach Zugabe angegeben. Diese Daten demonstrieren, dass die Induktion der SOS-Reaktion durch erhöhte Biolumineszenz für diese SOS-Regulon-Genfusion in der Lux-A-Sammlung nachweisbar ist.
Die Spezifität von Reaktionen wurde getestet, indem der Einfluss von Ethanol auf diese SOS-Regulon-Genfusionen gemessen wurde. In jedem Fall gab es eine nur geringe bis keine erhöhte Biolumineszenz, die durch eine Behandlung mit 5%, 4% oder 3% (Volumen/Volumen) Ethanol induziert wurde. Die Behandlung mit 3% Ethanol bei 40 Minuten nach Zugabe, eine Bedingung, die zu einer erhöhten Lichterzeugung von allen Hitzeschock-Regulon-Genfusionen führt (Tabelle 4) lieferte beispielsweise Stamm-DPD2249, der eine dinP-luxCDABE-Genfusion enthält, ein Reaktionsverhältnis von 0,80. In ähnlicher Weise wurde, wenn der Stamm DPD2243, der eine Hitzeschock-Genregulon-clpB-luxCDABE-Fusion enthält, bei Test mit Nalidixinsäure keine erhöhte Biolumineszenz beobachtet, während bei 110 Minuten nach Zugabe von 5 μg/ml Nalidixinsäure das Reaktionsverhältnis 0,40 betrug. Auf diese Weise wurde die Spezifität der Hitzeschockreaktion auf Ethanol und die SOS-Reaktion auf Nalidixinsäure gezeigt.
SOXS-REGULIERTE, OXIDATIVE SCHADENSREGULON-GENFUSIONEN
Die Lux-A-Sammlung wurde auch auf das Vorhandensein von Fusionen mit Genen in dem SoxR- und SoxS-reguliertem, oxidativen Streckreaktionsregulon untersucht (Koh et al., (1999) Mol. Gen. Genet. 261:374-380; Rosner und Storz (1997) Curr. Top. Cell. Regul. 35:163-177); Van Dyk et al., (1998) J. Bacteriol. 180:785-792). Die nachfolgende Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse. TABELLE 7 Menge von Lux-A-Sammlung-Genfusionen mit Vertretern des SoxR/S-Regulons

SoxR/S-Regulongen oder -operon Zahl der Fusionen in der Lux-A-Sammlung

sodA 0

nfo 0

fumC 0

achA 0

fpr 0

zwf 3

micF 0

acrAB 0

inaA 1

pqiAB 0

ribA 1

poxB 1

In ähnlicher Weise wie bei den Hitzeschock- und SOS-Regulonen war das SoxR/S-Regulon in der Lux-A-Sammlung nicht vollständig repräsentiert. Nichtsdestoweniger enthielt die Sammlung Genfusionen mit 33% des SoxR/S-Regulongens oder -operonen, von denen zu erwarten war, dass sie die Aktivierung dieser Stressreaktion nachweisen. In Tabelle 8 ist die Information über die sechs Stämme zusammengefasst, die von Mulden der tiefgefrorenen Lux-A-Sammlung re-isoliert wurden. TABELLE 8 SoxR/S-Gegulon-Genfusionen

Lux-Klon	Stamm-Name	Insert-Größe	Fusion mit:	Gene in Insert-DNA	Basal-RLU*	Methylviologen-Reaktionsverhältnis
lux-a. pk053.b1	DPD2278	1708	zwf	pykA(+)' yebK(+)zwf' (-)'	5,0	Nicht getestet
lux-a. pk082.g7	DPD2272	1708	zwf	pykA(+)' yebK(+)zwf(-)'	16,9	3,6
lux-a. pk088.e1	DPD2279	1709	zwf	pykA(+)' yebK(+)zwf' (-)	4,2	Nicht getestet
lux-a. pk078.d2	DPD2286	2308	ribA	yciM(+)' o102(+) pgpB(+)nib(A)'	5,8	4,7
lux-a. pk014.a9	DPD2087	1583	inaA	'glpQ yhaH inaA'	9,8	9,0
lux-a. pk071.a11	DPD3509	1131	poxB	'b0872poxB'	1,5	15,0

* Vom Zeitpunkt Null der Kontrolle (unbehandelt) aktiv aufgezogener Kulturen in Vogel-Bonner-Minimalmedium, die während des Screenings auf Sulfometuronmethyl-Reaktionen erhalten wurden (Van Dyk et al., J. Bacteriol. 180:785-792).
# Das Verhältnis der Biolumineszenz von der mit 250 μg/ml Methylviologen für 120 Minuten nach Methylviologen-Zugabe behandelten Kultur zu LB dividiert durch die Biolumineszenz der unbehandelten Kontrolle in LB zum gleichen Zeitpunkt.

Die Bezeichnung ("oder") wird benutzt, um anzugeben, dass das E. coli-Gen in der chimären Reportergen-Fusion abgestumpft ist. Wenn sich das Zeichen' am Anfang des Gen-Namens befindet (z.B. 'lacZ), bedeutet dieses, dass das 5'-Ende fehlt. Wenn sich das Zeichen ' am Ende des Gens befindet (z.B. lacZ') bedeutet dieses, dass das 3'-Ende des Gens nicht vorhanden ist.
Ähnlich wie bei den SOS-Hitzeschock-Regulonfusionen zeigten diese eine Basal-Lichterzeugung, die größer als die des promotorlosen elterlichen Plasmids waren, was auf das Vorhandensein eines Promotors hinweist. Die Reaktionsfähigkeit von vier dieser Stämme auf einen bekannten Induktur des SoxR/S-Regulons, Methylviologen, wurde getestet bei 1000, 500, 250, 125, 62, 31 und 16 μg/ml. Jede dieser sieben Konzentrationen von Methylviologen induzierte eine erhöhte Biolumineszenz von jedem der vier Stämme. In Tabelle 8 ist das Reaktionsverhältnis für 250 μg/ml bei 120 Minuten Behandlung für die vier getesteten Stämme angegeben. Hier wurde wiederum die biologisch entsprechende Reaktion beobachtet.
OXYR-REGULIERTE, OXIDATIVE SCHADENSREGULON-GENFUSIONEN
Es wurden Fusionen mit OxyR-regulierten Genen (Rosner und Storz (1997) Curr. Top. Cell. Regul. 35:163-177) in der Lux-A-Sammlung festgestellt, die in Tabelle 9 zusammengefasst sind. TABELLE 9 Mengen von Genfusionen der Lux-A-Sammlung mit den Vertretern des Oxy-R-Regulons

OxyR-Regulongen oder -operon Zahl der Fusionen in der Lux-A-Sammlung

katG 0

gorA 0

dps 0

ahpCF 3

Von diesen vier Genen oder Operonen, die durch OxyR kontrolliert werden, waren Fusionen mit einem (25%) in der Lux-A-Sammlung verfügbar. In Tabelle 10 ist die Information über die drei Stämme zusammengestellt, von denen jeder eine Fusion der ahpCF-Operon-regulatorischen Region mit dem luxCDABE-Reporter enthält, die aus Mulden der tiefgefrorenen Lux-A-Sammlung re-isoliert wurden. TABELLE 10 OxyR-Regulon-Genfusionen

Lux-Klon	Stamm- Name	Insert- Größe	Fusion mit:	Gene in der InsertDNA	RLU- Anfangs- screen*	H₂O₂- Reaktions- verhältnis#	H₂O₂- Reaktions- verhältnis im pcnB-Wirt‡
lux-a. pk051.d5	DPD2283	1184	ahpC	dsbG 'ahpC(+)'	92,2	1,3	16,5
lux-a. pk051.e3	DPD2284	1184	ahpC	dsbG' ahpC(+)'	68,3	1,6	15,3
Lux-a. pk03.d6	DPD2285	1182	ahpC	dsbG' ahpC(+)'	47,2	1,2	Nicht durchgeführt

* Vom Zeitpunkt Null der Kontrolle (unbehandelt) aktiv aufgezogener Kulturen in Vogel-Bonner-Minimalmedium, die während des Screenings auf Sulfometuronmethyl-Reaktionen erhalten wurden (Van Dyk et al., J. Bacteriol. 180:785-792).
# Das Verhältnis der Biolumineszenz von der mit 0,002% Wasserstoffperoxid für 30 Minuten nach Wasserstoffperoxid-Zugabe behandelten Kultur zu LB dividiert durch die Biolumineszenz der unbehandelten Kontrolle in LB zum gleichen Zeitpunkt.
‡ Das Verhältnis der Biolumineszenz von der Kultur des E. coli-Wirtsstammes DPD2228 [F-lac4169 rpsL pcnB80 zad-2084:;Tn10], der die Plasmid-DNA von der ursprünglichen Lux-A-Sammlung des Stammes enthält, der aufgeführt ist und mit 0,002% Wasserstoffperoxid bei 30 Minuten in LB nach der Wasserstoffperoxid-Zugabe behandelt worden ist, dividiert durch die Biolumineszenz der unbehandelten Kontrolle in LB zum gleichen Zeitpunkt.

Die Bezeichnung ("oder") wird benutzt, um anzugeben, dass das E. coli-Gen in der chimären Reportergen-Fusion abgestumpft ist. Wenn sich das Zeichen' am Anfang des Gen-Namens befindet (z.B. 'lacZ), bedeutet dieses, dass das 5'-Ende fehlt. Wenn sich das Zeichen ' am Ende des Gens befindet (z.B. lacZ') bedeutet dieses, dass das 3'-Ende des Gens nicht vorhanden ist.
Der hohe Wert der Lichterzeugung aus diesen drei Stämmen, die ahpC-luxCDABE-Genfusionen enthalten, zeigt, dass sie jeweils einen sehr aktiven Promotor enthalten. Um zu testen, ob diese Stämme bei Aktivierung der OxyR-kontrollierten oxidativen Stressreaktion nachweisbar sind, wurde jeder mit Wasserstoffperoxid bei 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001, 0,0005, 0,00025% behandelt. Im besten Fall war die Biolumineszenz minimal induziert. Tabelle 10 zeigt das Reaktionsverhältnis zur Behandlung mit 0,002% Wasserstoffperoxid bei 30 Minuten nach der Behandlung.
Zuvor hatte bei einer anderen lux-CDABE-Fusion in Plasmid pDEW201 mit einem Gen in dem OxyR-Regulon katG gezeigt, dass es größere Reaktionsverhältnisse zu Wasserstoffperoxid liefert, wenn das Plasmid zu einem E. coli-Wirtsstamm gebracht wurde, der eine pcnB-Mutation enthält (Van Dyk et al., (2000) im Druck In A. Mulchandani und O.A. Sadik (Herausg.), Recent Advances in Environmental Chemical Sensors und Biosensors. ACS Symposium-Reihen). Mutationen in diesem Gen führen zu einer verringerten Plasmid-Kopiezahl bei Plasmiden mit Ursprüngen der Replikation wie der in pBR322 (Lopilato et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 205:285-290), so dass sich eine verringerte Basal-Expression der Genfusionen ergibt, die auf derartigen Plasmiden geführt werden. Um dementsprechend zu testen, ob die Verringerung der Kopiezahl der ahpC-luxCDABE-Fusionen ebenfalls eine zuverlässigere Detektion der OxyR-vermittelten Stressreaktion liefern würde, wurden von zwei dieser Stämme der Lux-A-Sammlung entnommene Plasmid-DNA durch Transformation in einen pcnB^–-mutanten Wirtsstamm gebracht. Die zwei resultierenden Stämme wurden auf Reaktionen auf Wasserstoffperoxid bei 0,004, 0,002, 0,001, 0,0005, 0,00025, 0,00012, 0,00006% getestet. Jede von diesen sieben Konzentrationen erzeugte eine drastisch erhöhte Biolumineszenz von beiden ahpC-luxCDABE-Fusionsstämmen in dem pcnB^–-Wirt. Die letzte Spalte von Tabelle 10 gibt das Reaktionsverhältnis zur Behandlung mit 0,002% Wasserstoffperoxid bei 30 Minuten an. Damit wurde die entsprechende biologische Reaktion von diesen Fusionen auf ein Gen, das stark exprimiert war, erhalten, wenn man die Kopiezahl der Genfusionen verringerte.
In einem der Fälle, in denen die Reaktion von der Genfusion auf Plasmidbasis in Bezug auf ein stark exprimiertes Gen schwach war, wurde demonstriert, dass die Verringerung der Plasmid-Kopiezahl mit einer pcnB-Mutation zu einer potenteren Induktion führte. Andere Fusionen mit stark exprimierten Genen lassen sich ebenfalls in einen Wirtsstamm mit verringerter Kopiezahl bringen, wie beispielsweise ein pcnB-Mutant, oder in das Chromosom bei einer Gendosierung von eins integrieren (Elsemore, D.A. (1998) Methods in Molecular Biology: Bioluminescencent Protocols., Bd. 102, S. 97-104, Humana Press, Inc.).
BEISPIEL 3
VERWENDUNG EINER GENOMREGISTRIERTEN SAMMLUNG VON REPORTERGEN-FUSIONEN, UM DIE ERGEBNISSE VON EINER DNA-ARRAYANALYSE ZU BESTÄTIGEN ODER ZU ERFRAGEN UND HOCHLEISTUNGSSCREENINGS AUF DER BASIS DER GENEXPRESSION ZU ENTWICKELN
DNA-MIKROARRAY-VERSUCH MIT MITOMYCIN C (MMC)
Verwendet wurde der E. coli-Stamm MG 1655 (rph-1). Über Nacht bei 37°C aufgezogene Kulturen in LB wurden mit 1 bis 250 in frischem LB verdünnt und unter Belüftung bei 37°C aufgezogen. Jede Subkultur wurde in zwei 100ml-Kulturen aufgeteilt, sobald die Ablesung auf dem Klett-Sammerson-Colorimeter mit dem Rotfilter 20 Klett-Einheiten ergab. Der einen der aufgeteilten Kulturen wurde mit einer Endkonzentration von 250 ng/ml, eine subletale Dosis, MMC (Sigma, aufgelöst in ddH₂O) zugegeben. Bei der anderen Kultur handelte es sich um eine solche ohne Kontrollzugabe. Die Bebrütung wurde bei 37°C für weitere 40 Minuten fortgesetzt und die Zellen sodann für die Präparierung der Gesamt-RNA aufgenommen. Die mit MMC behandelte Kultur und ihre Kontrolle erreichten 60 bzw. 55 Klett-Einheiten nach einer Behandlung von 40 Minuten.
Die Reinigung der Gesamt-RNA, die Markierung der ersten Strang-cDNA, die Herstellung des E.
coli-Gesamtgenoms mit Mikroarraychips hoher Dichte, Hybridisierung und Datenanalyse wurden wie vorstehend beschrieben ausgeführt (Wie et al., (2001) J. Bacteriol. 183: 545-556). In der Sondenmarkierung wurden sowohl xy3 als auch cy5 verwendet und die Hybridisierungsversuche wiederholt, indem die Fluoreszenz-cy-Farbstoffe zwischen jedem Paar von MMC-behandelter Probe und ihrer Blindkontrolle ausgetauscht wurden.
Für alle Gene in dem DNA-Array wurde die Verhältnisse der Expression in den mit Mitomycin C behandelten Proben im Vergleich zu den Kontrollen berechnet. Verhältnisse, die größer oder gleich zwei waren, wurden als induzierte Gene betrachtet, währen solche mit Verhältnissen kleiner als zweifach nichtinduziert angesehen wurden. Die bekannten SOS-Gene (Kim et al., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 1997 Dec 9; 94(25):13792-7; Lomba et al., (1997) FEMS Microbiol Lett 156:119-122; Walker, G.C. (1996). In Escherichia coli und Salmonella: Cellular and Molecular Biology. ASM Press, S. 1400-1416) fielen sowohl in die induzierten Klassen (Tabelle 11) als auch in die nichtinduzierten Klassen (Tabelle 12).

Darüber hinaus wurde festgestellt, dass 20 Gene, von denen zuvor nicht bekannt war, dass sie durch MMC induziert wurden, in dem Array-Versuch induziert sind (Tabelle 13). TABELLE 11 Bekannte SOS-Gene, die durch MMC-Array-Versuch induziert wurden

Gen	Faltungsinduktion/Array-Versuch	Verfügbare lux-Fusion	Induktion der Fusion
recN	8,3	NEIN
recA	3,0	JA	JA
lexA	3,6	NEIN
dinI	6,7	NEIN
dinD	2,2	NEIN
uvrA	2,3	JA	JA
uvrB	2,1	NEIN
ruvA	2,0	JA	JA
sulA	5,8	NEIN
umuC	2,1	NEIN
dinB (dinP)	2,0	JA	JA
b1848 (yebG)	5,8	NEIN

TABELLE 12 Bekannte SOS-Gene, die in dem Array-Versuch NICHT durch MMC induziert wurden

Gen	Faltungsinduktion/Array-Versuch	Verfügbare lux-Fusion	Induktion der Fusion
uvrD	1,4	JA	JA
polB (dinA)	1,2	NEIN
dinG	1,4	JA	JA
dinF	1,8	JA	JA
himA	1,3	NEIN
ruvB	1,5	NEIN
umuD	1,2	NEIN

TABELLE 13 Gene, von denen zuvor nicht bekannt war, dass sie DNA-schadeninduzierbar sind und von denen in dem Array-Versuch festgestellt wurde, dass sie durch MMC induziert werden.

Gen	Faltungsinduktion/Array-Versuch	Verfügbare lux-Fusion	Induktion der Fusion
mioC	2,1	NEIN
xseA	2,0	NEIN
insB_2	2,2	NEIN
insB_1	2,1	NEIN
insA_4	2,1	NEIN
secG	2,2	NEIN
exbD	2,2	JA	NEIN
trkH	2,1	JA	NEIN
infA	2,3	NEIN
hslS	6,7	NEIN
hslT	4,0	NEIN
cspA	2,9	NEIN
dniR	2,1	JA	NEIN
b0531	3,3	NEIN
b1847 (yebF)	3,3	JA (wenn invertiert)	JA
b1228	2,5	NEIN
b2940	2,3	NEIN
b0571 (ylcA)	2,2	JA	NEIN
b2559	2,0	NEIN
b3199	2,0	NEIN

VERIFIZIERUNG ERWARTETER REAKTIONEN DER MMC-INDUKTION VON BEKANNTEN SOS-GENEN
Es wurde die Lux-A-Sammlung von Reportergen-Fusionen auf Vorhandensein von Fusionen mit den Genen in Tabelle 11 untersucht. Es wurde festgestellt, dass in der Sammlung vier vorhanden waren.
Jede von diesen wurde auf Induktion durch MMC bei mehreren Dosismengen im Ablauf einer Zeit von 100 Minuten getestet. In allen vier Fällen wurde bei mehreren Dosismengen von MMC die erwartete Induktionsreaktion über eine Zeitdauer ohne Änderung in der Genexpression, gefolgt von einer Induktion einer erhöhten Biolumineszenz beobachtet. Damit wird demonstriert, dass die Ergebnisse von DNA-Array-Versuchen unter Verwendung entsprechender Genfusionen verifiziert werden können.
ABFRAGEN DES NEGATIVEN ERGEBNISSES VON NON-INDUKTION BEKANNTER SOS-GENE
Wie erwartet, war die Expression der bekannten SOS-Gene erhöht. Allerdings war die Expression von mehreren um weniger als zweifach (Tabelle 12) erhöht und lag damit innerhalb einer großen Gruppe von 792 Genen, deren Expression um 20% oder mehr erhöht war. Die meisten von diesen waren wahrscheinlich eher auf Artefakte in den Array-Daten anstatt auf tatsächlich biologisch relevante Reaktionen zurückzuführen. Um festzustellen, ob Stämme, die luxCDABE-Genfusionen führen, das erwartete positive Ergebnis erbringen würden, wurden die drei Genfusionen, die in der Lux-A-Sammlung von Reportergen-Fusionen verfügbar sind, auf Mitomycin C-Reaktionen getestet. In allen drei Fällen induzierte Mitomycin C eine erhöhte Biolumineszenz. Damit wird demonstriert, dass negative Ergebnisse von DNA-Arrays durch widersprüchliche positive Ergebnisse mit entsprechenden Genfusionen abgefragt werden können.
ABFRAGEN ODER BESTÄTIGUNG DER INDUKTION VON ZUVOR UNBEKANNTEN MMC-INDUZIERBAREN GENEN
Die Gene, von denen zuvor nicht bekannt war, dass sie mit Mitomycin C induziert werden, wurden weiter untersucht auf Korrelation des DNA-Arrays und experimentelle Daten der Genfusion. Für diese Klasse von Genen waren vier Fusionen in der Lux-A-Sammlung der Reportergen-Fusionen verfügbar.
Die entsprechenden luxCDABE-Fusionen mit diesen vier Genen lieferten keine Bestätigung für eine durch MMC induzierte erhöhte Genexpression.
Von einer zusätzlichen Genfusion in der Lux-A-Sammlung von Genfusionen wurde festgestellt, dass sie ein Genomfragment hat, das, wenn es invertiert ist, zu einer Fusion mit yebF führen würde. In diesem Fall lag ein divergenter Promotor zu dem turT-Gen in dem chromosomalen Fragment vor, und Stamme, die die Rückwärts yebF-Fusion enthielten, erzeugten Licht. Nach der Isolation von Plasmid-DNA, X-Mal-Digestion, die die Insert-DNA von dem Vektor freisetzt, Religierung und Transformation, erzeugten 10% der Transformanten Licht. Von diesen wurde festgestellt, dass 20% (oder 2% der Anfangstransformanten) von Nalidixinsäure, einem anderen DNA-Schädigungsmittel, stark induziert wurden. Dieses Ergebnis lässt stark vermuten, dass die Inversion der Insert-DNA in diesen mit Nalidixinsäure induzierbaren Genfusionen stattgefunden hat. Die Orientierung des insertierten Segmentes, um eine Fusion von yebF mit dem luxCDABE-Operon zu erhalten, wurde mit Hilfe der DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Darüber hinaus wurde eine Induktion durch Mitomycin C nachgewiesen, wie in 2 gezeigt wird.
BEISPIEL 4
FUNKTIONELLE DEFINITION VON POSTULIERTEN PROMOTORREGIONEN
Die Gene, die die Erzeugung eines Typ I-extrazellulären Polysaccharids in E. coli codieren, befinden sich in einem Cluster von 20 Genen (Stevenson et al. (1996) J. Bacteriol. 178:4885-4893). Es wurde stromaufwärts ein Promotor für diese Gene identifiziert (Stout, V. (1996) J. Bacteriol. 178:4273-4280) und dessen Regulierung charakterisiert (Gottesman, S. (1995) Two-component Signal Transduction. American Society of Microbiology, S. 253-262; Wehland und Bernhard (2000) J. Biol. Chem. 275: 7013-7020). Nichtsdestoweniger ist die transkriptionelle Organisation dieser Region nicht vollständig definiert gewesen. Die annotierte Sequenz für diese Gene (Blattner et al., (1997) Science 277: 1453-1462), die von einem Strang des Genoms transkribiert sind, legt das Vorhandensein mehrerer vermutlicher Promotoren und Aktivator-Bindungsstellen nahe. Darüber hinaus legt eine Vorhersage der Operon-Struktur in dieser Region nahe, wonach diese Gene zu mehreren transkriptionellen Einheiten organisiert sein können (Thieffry et al., (1998) Bioinformatics 14:391-400). 8 ist eine Zusammenfassung der vorhergesagten Promotoren in dieser Region. Was unerwartet ist, legen ein E. coli-DNA-Mikroarray basierendes Experiment mit Stämmen von 397C, die eine abgestumpfte Untereinheit von RNA-Polymerase und P90 enthalten, eine isogene rpoC⁺-Kontrolle, das RNA-Transkripte in dieser Region durch die rpoC-Mutation beeinflusst waren. Die Expression von Genen b2043 bis b2062 war in dem rpoC-Mutanten coordinativ hochreguliert (8). Die erhöhte Expression erklärt sich am Leichtesten dann, wenn ein einzelnes Transkript vor b2062 beginnt und zwischen b2043 und b2042 (gelF) endet. Wenn dieses der Fall ist, sollte die Region stromaufwärts von b2062 einen Promotor enthalten. Diese Region war mit dem luxCDABE-Operon in lux-a.pk033.g2 fusioniert. Es wurden Transformanten von P90 und 397C in LB-Medium bei 30°C aufgezogen, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Die Biolumineszenz und Trübung, die mit einem Klett-Summerson-Kolorimeter (Van Dyk et al., (1995) J. Bacteriol. 177:6001-6004) von aktiv aufgezogenen Kulturen aufgezeichnet wurde, wurde zur Berechnung der Lichterzeugung pro 10⁹-Zellen verwendet. Es wurde der ungepaarte t-Test angewendet, um vierfache Biolumineszenz-Messungen von Stämmen zu vergleichen, die Genfusionen mit dem das elterliche Plasmid-tragenden Kontrollstamm führen. Die Biolumineszenz, die erzeugt wurde, wenn die lux-a.pk033.g2-Genfusion in den Stamm P90 gesetzt wurde, war schwach (0,56 +/– 0,06 RLU/109 CFU), war jedoch deutlich größer (P<0,0001) als die Biolumineszenz, die durch das elterliche Plasmid in dem gleichen Wirtsstamm erzeugt wurde (0,028 +/– 0,010 RLU/10⁹ CFU). Diese Daten stehen in Übereinstimmung mit einem Promotor in der Region stromaufwärts von b2062, der in dem Stamm P90, der in dem LB-Medium wachst, nicht sehr aktiv ist. Die Biolumineszenz dieser Genfusion war um das 1500fache erhöht, wenn sie in den Stamm 397C eingesetzt wurde (8). Diese starke Promotoraktivität, die die luxCDABE-Genexpression antreibt, ist daher von der rpoC-Mutation abhängig. Im Gegensatz dazu hatten mehrere andere Genfusionen mit chromosomalen DNA-Segmenten in dieser Region unabhängig davon, ob sie vorhergesagte Promotorregionen enthielten oder nicht, sehr geringe Aktivitätswerte sowohl in dem Wild-Typ als auch in dem rpoC-Mutanten (8). Damit stehen die Daten sowohl von den DNA-Mikroarray-Versuchen als auch von den Genfusionen in Übereinstimmung mit der Cotranskription der zwanzig Gene in dieser Region. Das Ende des Operons wurde mit Hilfe einer Genfusion mit galF-Stromaufwärtsregion (in lux-a.pk07.d12) definiert, die die lux-CDABE-Transkription stark antrieb. Die Aktivität dieser Promotorregion war durch die rpoC-Mutation nicht dramatisch beeinflusst (8), was in Übereinstimmung mit den DNA-Array-Daten stand.
BEISPIEL 5
STARK PARALLELE TRANSKRIPTIONSANALYSE UNTER VERWENDUNG EINES ARRAYS HOHER DICHTE VON ZELLULÄREN REPORTERN
BESTÄTIGUNG DES PRINZIPS MIT LUXARRAY 0.5
Es wurde ein Festphasen-Assaysystem, das aus Reporterklonen bestand, die in Gegenwart oder bei Abwesenheit einer Perturbation, biologisch, umgebungsbedingt oder chemisch, aufgezogen wurden, entwickelt. Dieses wurde dadurch erreicht, dass die Reporter auf einer porösen Membran aufgezogen wurden (Biodyne B, Nunc), die auf der Oberseite des festen Wachstumsmediums in einer Kulturschale aufsaß (OmniTray, Nunc). Die Lumineszenz wurde entweder mit Hilfe eines Luminometers gemessen oder indem ein Bild der gesamten Kultur erzeugt wurde und die Pixeldichte quantitativ erfasst wurde. Die Wirkungen von Perturbaten lassen sich durch Vergleich der Lumineszenz ermitteln, die durch behandelte Kulturen und Kontrollkulturen erzeugt wurde. Das Wachstum auf der Oberfläche der Membran macht es möglich, dass der Reporterassay zwischen den Bedingungen nach Erfordernis verändert werden kann. Versuchsprotokolle umfassen oftmals Perturbationen, die eine lang anhaltende Exponierung verbieten, was auf Zellentod oder auf andere irreversible Wirkungen zurückzuführen ist. Die Fähigkeit, den gesamten Array zu neuen Wachstumsbedingungen zu verschieben, ermöglicht eine große Vielzahl von Versuchsschemen, wie beispielsweise gepulste oder Pulse/Chase-Exponierungen, Reversibilität und kurzfristige kinetische Untersuchungen.

Es müssen mehrere wichtige Merkmale des Assaysystems bewertet werden. Insbesondere waren die Wachstumsdichte und die Bedingungen, die Empfindlichkeit, die Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit zur Perturbation der Reporter und der Nachweis der Änderungen Hauptgesichtspunkte. Die Entwicklung dieses Assaysystems wurde unter Verwendung einer Sammlung von mit 10 Mulden charakterisierten Klonen, dem elterlichen Plasmid-Klon und dem Medium allein (Tabelle 14) initiiert. Die Reihe von 10 Klonen repräsentierte eine Verteilung der Signalstärke sowie die Reaktion auf die Perturbation mit DNA-Schädigungsmitteln und insbesondere Nalidixinsäure. Die ersten Versuche wurden so konzipiert, dass man aus der Empfindlichkeit und der Einfachheit der Messung der Lumineszenz mit einem 96-Mulden-Luminometer (Dynex ML3000) Nutzen zog. Das Ausdrucken erfolgte unter Verwendung eines BioMek 2000 (Beckman Coulter), das mit einem Hochdichte-Replikationsgerät (HDRT) ausgestattet war. Die Sterilisation zwischen den Transfers wurde ausgeführt, indem die Stifte nacheinander in 0,2% SDS in Wasser, sterilem Wasser und 70% Ethanol eingetaucht wurden. Nach der Sterilisation wurden die Stifte vor dem nächsten Transfer luftgetrocknet. TABELLE 14 Luxarray 0.5-Klonbeschreibung

Stamm	Klon-Nr.	Fusion mit:	Biolumineszenz*	Bemerkung
DPD2083	N.A.	N.A.	kein	Elterliches Plasmid ohne Insert
DPD2282	65.d4	lacZ	mäßig	"konstitutive" Expression in LB/geringe Expression in LB + Glukose
DPD2247	85.a5	dinf	gering	SOS-Regulon/Nalidixinsäure und Mitomycin C-induzierbar
DPD2248	24.f5	dinG	mäßig	SOS-Regulon/Nalidixinsäure und Mitomycin C-induzierbar
DPD2249	55.a3	dinP	mäßig	SOS-Regulon/Nalidixinsäure und Mitomycin C-induzierbar
DPD2250	22.d4	recA	hoch	SOS-Regulon/Nalidixinsaure und Mitomycin C-induzierbar
DPD2253	01.b6	uvrA	mäßig	SOS-Regulon/Nalidixinsäure und Mitomycin C-induzierbar
DPD2242	21.g11	lon	mäßig	Hitzeschock-Regulon
DPD2243	54.c3	clpB	mäßig	Hitzeschock-Regulon
DPD2245	42.c8	rpoD	gering	Hitzeschock-Regulon
DPD2084	06.b4	yciG	gering	SigmaS-abhängige Stressreaktion
DPD2090	23.c7	osmY	gering	SigmaS-abhängige Stressreaktion

* Biolumineszenz wurde in der flüssigen Kultur mit Hilfe eines Luminometers gemessen.

Es wurden über Nacht bei 37°C in 40 ml LB in 96-Muldenschalen Stämme aufgezogen. Diese Kulturen wurden bezeichnet als "Druckplatten" und wurden als Zellenquelle zur Herstellung der Arrays verwendet.
Es wurden Membranen mit UV-Bestrahlung für 10 Minuten sterilisiert und anschließend mit vorgewärmtem Medium in einer Kulturschale in Kontakt gebracht. Die Klone und Kontrollen wurden auf eine Membran mit ungefähr 8 × 12 cm aufgedruckt, die das Muster einer 96-Muldenplatte nachahmte (
3A). Die Stämme wurden gedruckt, um 8 repetierende Sektionen der 10 Stämme zu erzeugen sowie 2 Kontrollen und wurden in ein auf 37°C vorgewärmtes Luminometer Dynex ML3000 gegeben. Die Lumineszenzdaten wurden für jeden Spot für 40 Zyklen für eine Dauer von 20 Minuten (über Nacht) aufgenommen. 3B zeigt, dass für das jeweilige Klon als Funktion der Zeit aufgenommene Signal. 3C zeigt das von den Replikat-Spots des gleichen Klons aufgenommene Signal (recA-luxCDABE). Die Daten zeigen eindeutig, dass die Stämme sich in dem neuen Festphasensystem gut verhielten. Die gemessene Signalstärke bestätigte die in flüssiger Kultur erhaltenen Daten. Außerdem variierten Replikate nur minimal, was wiederum ähnlich den Messungen in flüssiger Kultur war.
Als nächstes wurde das System auf seine Fähigkeit zur Bestimmung der Reaktionen auf Perturbation, in diesem Fall DNA-Schädigung, die durch Nalidixinsäure hervorgerufen wurden, ausgewertet. Es wurden ein elterliches Klon und zwei nichtreagierende Reporter, osmY und lacZYA, und drei auf DNA-Schädigung ansprechende Reporter, uvrA, recA, dinG, ausgewählt. Es wurden Stämme auf Duplikatmembranen über LB Agar aus frischen Übernacht-Kulturen entsprechend der Beschreibung aufgedruckt und für 6 Stunden bei 37°C inkubiert, um den Zellen zu ermöglichen, in die exponentielle Wachstumsphase einzutreten. Die Membranen wurden zu neuen, vorgewärmten Platten bewegt, die unterschiedliche Mengen an Nalidixinsäure enthielten, und Licht-Ablesungen mit einem ML3000-Luminometer aufgenommen. Die Luxarray 0,5-Klone (4A und B) wurden auf Membranen aufgedruckt und zu Beginn auf LB aufgezogen und anschließend zu Platten gegeben, die 0 μg/ml (Rauten), 1 μg/ml (Quadrate) oder 5 μg/ml Nalidixinsäure (Dreiecke) enthielten. Die Lumineszenz wurde mit einem Luminometer Dynex ML3000 alle 30 Minuten für 2 Stunden gemessen. Wie in 4B gezeigt ist, wurde die durch Nalidixinsäure vermittelte Aufwärtsregulierung von Genen in dem SOS-Regulon als erhöhte Biolumineszenz detektiert. Im Gegensatz dazu blieben Stämme, die Fusionen mit nicht auf DNA-Schädigung ansprechende Gene, osmY und lacZYA, enthielten, durch eine Behandlung mit Nalidixinsäure unbeeinflusst (4A). Der Stamm, der das elterliche Plasmid, pDEW201, enthielt, und zwar ohne eine durch Promotor getriebene luxCDABE-Expression, erzeugte sehr geringe Stärken der Biolumineszenz, die sehr nahe dem auf einem ML3000-Luminometer gemessenen Hintergrund für Stämme war, die in 96-Mulden-Mikroplatten aufgezogen waren. Die offensichtliche Basal-Biolumineszenz und Aufwärtsregulierung dieses Stammes (4A) ist wahrscheinlich eine Folge der Überkreuzung von einem angrenzenden Stanzen, der eine auf DNA-Schädigung ansprechende Genfusion enthielt.
HOCHDICHTE-LUXARRAY 0.5
Es wurde die Klon-Reihe von Luxarray 0.5 zur Entwicklung eines hochparallelen Festphasenassays durch Ausdrucken der Klone bei hoher Dichte auf eine Membran von näherungsweise 8 × 12 cm verwendet. Diese Arrays wurden verwendet, um das System weite zu entwickeln.
DICHTE DES DRUCKENS
In dem Bemühen, sich dem endgültigen Assaysystem stärker anzunähern, wurden die Klone von Luxarray 0.5 zur Bestimmung der maximalen Dichte verwendet, mit der man die Zellen ausdrucken konnte und für nützliche Analysen ausführen konnte. Die Arrays wurden wie vorstehend mit erhöhter Dichte gedruckt und für 8 Stunden bei 37°C aufgezogen. Die Lumineszenz wurde unter Verwendung eines EagleEye II (Stratagene, La Jolla, CA) abgebildet. Aus der visuellen Untersuchung konnten einzelne klonale Wachstumsbereiche mit Dichten bis zu 6.144 einzelnen Spots pro Membran aufgelöst werden. Aus einem Größenvergleich der Wachstumsbereiche unterschiedlicher Dichten ging hervor, dass es in der Wachstumsdauer von 8 Stunden einen nährstoffbegrenzten Einfluss gab, der zu einer umgekehrt proportionalen Wachstumsgröße mit zunehmender Dichte führte. Bei dieser Dichte ist dieses mehr als zweifach größer als die geschätzte Zahl der Transkriptionseinheiten in dem gesamten E. coli-Genom. Damit könnte ein einzelner 8 × 12cm-Array das gesamte E. coli-Genom zweifach repräsentieren, wobei noch Kapazität für Kontrollen übrig bleibt. Alternativ ließe sich auf dem gleichen Array eine volle Genomabdeckung zweier verschiedener Stämme oder verschiedener Spezies drucken.
HOCHDICHTE ARRAY-BILDSAMMLUNG
Das Wesentliche dieses Assays besteht darin, ein Bild des von Reporterkonstrukten erzeugten Signals zu sammeln, so dass die Signalintensität anschließen quantitativ ausgewertet werden kann. Dieses erfordert nicht nur, dass die Sammlungsparameter (Brennebene, Vergrößerung, Integrationszeit und Algorithmus) konstant sind, sondern dass die nachgeschaltete Software der Bildanalyse die Fähigkeit besitzt, die erzeugten Bilder zu verarbeiten. Die häufigste Anwendung dieses Assays, die chemische Perturbation, erfordert eine physikalische Verschiebung einer Membran von der einen Kulturplatte zu einer anderen. Dieses ergibt Bilder mit minimaler X-Y-Positionsregistrierung. Diese Bilder lassen sich mit mehreren kommerziell verfügbaren Erzeugnissen wirksam bearbeiten. Zwei Beispiele für geeignete Softwarepakete sind ArrayVision^TM (Imaging Research, Toronto, Kanada) und ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
HOCHDICHTE-LUXARRAY 0,5-NALIDIXINSÄURE-PERTURBATION
Die Klone von Luxarray 0.5 wurden verwendet, um Arrays entsprechend der vorstehenden Beschreibung mit einer Dichte von 4 × 4 zu drucken. Das soll heißen, dass jeder einzelne Spot wie in 3 sechzehnmal in einem 4 × 4-Subarray repliziert wurde. Das Ergebnis war, dass jeder Klon 128-mal auf verschiedenen Bereichen des Arrays gedruckt wurde. Die Arrays wurden dreifach aus frischen Übernacht-Kulturen auf Membranen auf Platten gedruckt, die LB-Medium enthielten. Nach Aufzucht bei 37°C für 6 Stunden wurden die Membranen auf vorgewärmte Platten gegeben, die entweder LB-Medium oder LB-Medium enthielten, das mit 5 μg/ml Nalidixinsäure (NA) ergänzt wurde, die, wie bereits demonstriert, eine detektierbare Induktion von reaktionsfähigen Promotoren für einen bereiten Bereich von Promoterstärke (4) bewirkte. Die Kulturen wurden bei 37°C ersetzt, um das Aufziehen fortzusetzen. Es wurden Bilder für jeden Array alle 2 Stunden von 0 Stunden bis 8 Stunden nach der Verschiebung unter Verwendung einer gekühlten CCD-Kamera aufgenommen (FluorChem 8000:f0.85-Linse, 2 Minuten Exponierung. AlphaInnotech). Die Spot-Intensität wurde unter Verwendung eines ArrayVision^TM (Imaging Research, Toronto, Kanada) bestimmt. 5 zeigt die Ergebnisse für ausgewählte Stämme, die Reportergen-Fusionen enthalten.
Wie bei den Versuchen mit geringer Dichte festgestellt wurde, die mit dem Luminometer quantitativ ausgewertet wurden, waren die erwarteten Reaktionen für jeden Klon gut nachgewiesen. Die fünf dokumentierten auf DNA-Schaden ansprechbaren Reporterkonstrukte zeigen eindeutig eine Hinaufregulierung der Expression. Im Gegensatz dazu war die Lichterzeugung von dem Stamm, der die lac-Promotoerfusion trug sowie von mehreren Stämmen, die andere Promoterfusionen trugen, vermindert. Diese verminderte Biolumineszenz spiegelte in ähnlicher Weise das verminderte Wachstum und den Metabolismus der mit Nalidixinsäure behandelten Stämme wider und demonstriert die Spezifität der Hinaufregulierung der SOS-Regulon-Genfusionen. Darüber hinaus ist das Signal von dem Stamm, der das elterliche Plasmid enthält, von dramatisch geringerer Größenordnung als dasjenige von Stämmen mit Promotor-lux-Fusionen, womit der Vorteil der gekühlten CCD-Kamera für die Datenaufnahme demonstriert wird.
LUXARRAY 1.0, EIN HOCHPARALLELER PROMOTOR-AKTIVITÄTSASSAY
AUSWAHL EINER MAXIMALEN NICHTREDUNDANTEN REIHE VON LUX-GENFUSIONEN
Die genomregistrierte Lux-A-luxCDABE-Genfusionssammlung (beschrieben in Beispiel 1) lieferte eine Liste von 4.988 Genfusionen auf Plasmid-Basis, jede mit Grenzinformation in Bezug auf das E. coli-Genom und die Orientierung in Bezug auf das lux-Operon. Ein funktionsfähiges verknüpftes oder funktionelles Konstrukt wurde als ein solches definiert, das aus einem Genomfragment besteht, welches einen Promotor angrenzend an den promotorlosen lux-Operon in einer Orientierung umfasst, die eine Transkription bewirkt, die an dem Promotor ausgelöst wird, um in das lux-Operon hinaus und durch es hindurch fortgesetzt zu werden. Um daher die funktionelle Unterreihe der Sammlung zu identifizieren, wurden computergestützt Kriterien angewendet, um die Liste von Klonen erstens auf Funktionalität und zweitens auf Redundanz zu filtern. Es wurde eine Liste von Definitionen von dokumentierten und vorhergesagten Operonen (Thieffry et al., (1998) Bioinformatics 14:391400) verwendet, um genomische Koordinaten der Operonen als die translationelle Startcodon-Position des ersten offenen Leserahmens (ORF) in dem Operon festzulegen sowie die translationelle Stoppcodon-Position des letzten ORF in dem Operon. Weitere Informationen, die einbezogen waren, waren der Strang, auf dem das Operon codiert ist (die Richtung der Transkription) und die Gen-Namen (gewöhnliche Zahl oder "b"-Zahl). Die lux-Genfusionen wurden computergestützt unter Anwendung der folgenden Annahmen gefiltert: (i) eine funktionelle, transkriptionelle Funktion würde sich aus einem beliebigen Genomfragment ergeben, beginnend mit mehr als 50 Basenpaaren stromaufwärts des Startcodons des ersten ORF und endend irgendwo zwischen dem Startcodon des ersten ORF und in dem Operon und dem Stoppcodon des letzten ORF in dem Operon, wodurch das Auftreten eines transkriptionellen Stoppsignals in dem Konstrukt zwischen dem Promotor und dem lux-Operon eliminiert wird; und (ii) der in dem Genomfragment enthaltene Promotor muss in der korrekten Orientierung in Bezug auf das lux-Operon gerichtet sein (bildlich dargestellt in 6). Schließlich wurde in Fällen, wo mehr als ein Klon den Kriterien für ein einzelnes Operon genügte, lediglich das eine Konstrukt, welches das Genomfragment enthielt, das den größten Betracht der vorgeschalteten Sequenz repräsentiert, erhalten, wodurch Redundanz eliminiert wird. Der verwendete PERL-Code und die resultierende Liste von 689 ausgewählten Genfusionen finden sich in Schema 1 und Tabelle 18 (nach Beispiel 7). Diese Fusionen repräsentieren 27% der 2.584 bekannten und vorhergesagten transkriptionellen Einheiten in dem E. coli-Genom. Einzelne Kulturen von Stämmen, welche die identifizierten Genfusionen enthielten, wurden von den 90 ursprünglichen Kulturplatten neu zum Array angeordnet, um eine Reihe von 16 96-Mulden-Mikroplatten zu erzeugen, die alle die identifizierten Fusionen enthielten, zweifach mit einer Seite-an-Seite-Symmetrie und einschließlich entsprechend angeordnete Kontrollen. Diese repräsentierten 16 Platten wurden zur Erzeugung der zellulären Arrays zur Verwendung in den nachfolgenden Analysen benutzt.
HERSTELLUNG VON REPORTERARRAY
Die E. coli-Stämme wurden bei 37°C über Nacht in 40 μl LB-Medium ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin in einer Reihe von 16 96-Muldenschalen aufgezogen. Diese Kulturen wurden als "Druckplatten" bezeichnet und als die Zellenquelle zur Herstellung der Arrays verwendet. Es wurden poröse Membranen (Biodyne B, Nunc) mit UV-Beleuchtung für 10 Minuten sterilisiert und sodann mit vorgewärmtem festem LB-Wachstumsmedium in einer Kulturschale (OmniTry, Nunc) in Kontakt gebracht. Das Drucken von 4 × 4-Subarrays erfolgte unter Verwendung eines MioMek 2000 (Beckman Coulter), ausgestattet mit einem Hochdichte-Replikationsgerät (HDRT). Die Sterilisation zwischen den Transfers erfolgte durch Einweichen der Stifte nacheinander in 0,2% SDS in Wasser, in sterilem Wasser und 70% Ethanol. Nach der Sterilisation wurden die Stifte vor dem nächsten Transfer luftgetrocknet. Die E. coli-Stämme in dem LuxArray wurden auf eine Membran mit ungefähr 8 × 12 cm in zwei Reihen dreifach ausgedruckt.
WACHSTUM IN DEM ARRAY
Wachstumsgeschwindigkeit einzelner Kolonien wurde ausgewertet, da anfängliche Versuche eindeutig eine große Verteilung von Wachstumsgeschwindigkeiten für die Reporterstämme in dem System demonstrierten. Um zwischen klonabhängigen oder systemabhängigen Quellen dieser Variabilität zu unterscheiden, wurden in dreifacher Ausführung an unterschiedlichen Tagen unter Verwendung von LB-Agar-Medium mit einem Gehalt von 10 μg/ml Tetrazolium-Blue zelluläre Arrays für die Biolumineszenz erzeugt. Das erzeugte Produkt, wenn Lebendzellen Tetrazolium-Blue reduzieren, ist ein unlösliches blaues Präzipitat. Dieses erhöhte stark den Kontrast zwischen den Zellen und dem Medium, was eine direkte Bilderzeugung der Zellen durch normales Licht vereinfacht. Bei jedem der dreifach ausgeführten Versuche wurde jeder Klon visuell bewertet, um die Wachstumsgröße zu bestimmen, die im Verlaufe von 8 Stunden Inkubation bei 37°C (Daten nicht gezeigt) erzeugt wird. Die Variabilität war eindeutig klonspezifisch und von Tag zu Tag ausgesprochen konstant. Das es sich bei der Mehrzahl der vorgeschlagenen Analysen um relative Messungen handelt und Vergleiche zwischen den Klonen unwahrscheinlich sind, beeinflusst dieser Typ der Wachstumsvariabilität nicht die Anwendbarkeit oder Robustheit des Assay-Gesamtsystems. Es wurden keine weiteren Versuche unternommen, die Quelle der Variabilität zu bestimmen, jedoch kann man davon ausgehen, dass sie eine Folge der von den Klonen geführten Plasmid-Konstrukte ist.
BIOLUMINESZENZ VON LUXARRAY 1.0
Bei den Biolumineszenz-Bildern wurde eine gekühlte CCD-Kamera (FluorChem 8000:f0.85 Optik, 2 Minuten Exponierung, alphaInnotech) ohne zusätzliche Lichtquelle angewendet. Die Biolumineszenz von einem solchen Array, das für 16 Stunden auf reichem Medium aufgezogen wurde, ist in 7 gezeigt. Das Array in 7 zeigt replizierte Seite-an-Seite-Subarrays, in die Kontrollstämme einbezogen sind, ein Stamm mit lacZYA Promotorfusion und ein Stamm, der das elterliche Plasmid (pDEW201) enthält.
IDENTIFIKATION VON AUF NALIDIXINSÄURE ANSPRECHENDE GENFUSIONEN UNTER VERWENDUNG DES LUXARRAYS 1.0
Die antibiotische Nalidixinsäure als ein Inhibitor für DNA-Gyrase bekannt, dass sie ein wirksamer Induktor der SOS-DNA-Schädigungsstressreaktion ist, wurde verwendet, um die Nutzanwendung dieses Arrays zu demonstrieren. Die Arrays wurden am frischen Übernacht-Kulturen auf Membranen auf Platten gedruckt, die LB-Medien enthielten. Nach einer Aufzucht bei 37°C für 6 Stunden wurden Membranen auf vorgewärmte Platten gegeben, die entweder LB-Medium oder LB-Medium enthielten, das mit 5 mg/ml Nalidixinsäure ergänzt war, wonach sie bei 37°C ersetzt wurden, um das Aufziehen fortzusetzen. Alle zwei Stunden von 0 Stunden bis 8 Stunden nach dem Verschieben wurden unter Verwendung einer gekühlten CCD-Kamera (FluorChem 8000: f0.85 Optik, 2 Minuten Exponierung, AlphaInnotech) Bilder für jedes Array aufgenommen.
Die Spot-Intensität jedes Bildes wurde unter Verwendung von ArrayVision^TM (Imaging Research, Toronto, Kanada) bestimmt und die resultierenden Messungen der Pixeldichte mit Identifikatoren für jeden Spot in ein Template importiert. Das durchschnittliche Signal für jeden dieser dreifachen Spots wurde errechnet. Das Hintergrundsignal, das von einer Kreuzbelichtung benachbarter Spots resultiert, wurde berechnet, indem das Medium der 24 Spots ermittelt wurde, das einen Stamm mit dem elterlichen Plasmid auf jedem der dreifachen Arrays enthielt, und der Durchschnitt der drei Mittelwerte berechnet wurde. Dieses Hintergrundsignal wurde zu jedem der Zeitpunkte berechnet und von jeder Messung zu dem entsprechenden Zeit subtrahiert. Alle negativen Zahlen wurden auf 0 gerundet.
Die Datennormierung zur Berücksichtigung der Wachstumshemmung durch Nalidixinsäure wurde ausgeführt, indem die Summe der gemittelten Signale jedes Spots in dem Array für jede Behandlung zu jedem Zeitpunkt ermittelt wurde. Ein Normierungsfaktor (NF) wurde wie folgt berechnet:
NF = Array-Gesamtsignal (Zeitpunkt 0, LB-Kontrolle)/Array-Gesamtsignal (Zeit x, Zustand y)
Jede Messung wurde mit NF multipliziert, um ein normiertes Signal zu ergeben. Die Verhältnisse des mit Nalidixinsäure behandelten Spots zu dem entsprechenden Kontrollspot wurden unter Verwendung der normalisierten Daten berechnet.
Die Verhältnisse der normalisierten Daten wurden mit jedem der zweifachen Spots verglichen, die von unabhängigen Kulturen in dem Array resultierten. Vermutliche Nalidixinsäure-aufwärtsregulierte Genfusionen wurden als solche ausgewählt, für die das Verhältnis in beiden zweifachen Spots mindestens zwei sowohl zu den Zeitpunkten 2 Stunden als auch 4 Stunden betrug. Mit Hilfe dieser Kriterien wurden zwölf Genfusionen ausgewählt (Tabelle 15).
Diese zwölf Genfusionen schließen drei gut charakterisierte Vertreter des SOS-Regulon sowie mehrere Fusionen mit Promotoren ein, von denen zuvor nicht bekannt war, dass sie durch eine Behandlung mit Nalidixinsäure reguliert werden. Die DNA-Sequenz von Plasmid-DNA, die von jeder dieser zwölf Kulturen isoliert wurde, bestätigte erneut die Identität jeder insertierten DNA. Das LuxArray enthält eine Summe von sechs Genfusionen mit SOS-Regulon-Operonen, von denen allen zu erwarten war, dass sie durch Nalidixinsäure aufwärtsreguliert werden. Drei wurden damit fälschlich als Negative bewertet. Eine Untersuchung der Daten zeigte, dass zwei dieser Falschnetagive reproduzierbar aufwärtsreguliert wurden, jedoch nicht bei einem Wert des Auswahlkriteriums; eine Fusion mit uvrD wurde aufwärtsreguliert durch 1,6- und 1,9-fach bei vier Stunden Behandlung mit Nalidixinsäure, während eine mit ruvA aufwärtsreguliert wurde mit 1,7-fach und 2,1-fach zu diesem Zeitpunkt. Die dritte hatte keine übereinstimmende Reaktionen; das Verhältnis von mit Nalidixinsäure behandelten und unbehandelten Spots für die dinF-lux-Fusion wurde mit 4,2 in einem der zweifachen Spots und 0,7 in dem anderen ermittelt.
VALIDIERUNG VON MIT NALIDIXINSÄURE AUFWÄRTSREGULIERTEN GENFUSIONEN DURCH ERNEUTES TESTEN IN FLÜSSIGEM MEDIUM
Jede der erneut identifizierten, vermutlich Nalidixinsäure-aufwärtsregulierten Genfusionen und zwei der bekannten SOS-Genfusionen wurden erneut unter Verwendung von exponentiell aufgezogenen Kulturen in flüssigem Medium mit sieben Konzentrationen von Nalidixinsäure (80 μg/ml in zweifachen Verdünnungen auf 1,2 μg/ml) getestet. Es wurden mehrere Konzentrationen von Nalidixinsäure verwendet, da sie Differenzen in den Reaktionen zwischen flüssigem und festem Wachstum nicht bekannt waren. Die Lichterzeugung von 100 μl Duplikat-Kulturen bei 37°C wurde quantitativ ermittelt unter Verwendung eines 96-Mulden-Plattenluminometers (Luminoskan Ascent, Labsystems). Die Tabelle 15 zeigt die als Verhältnisse des Signals von den mit Nalidixinsäure behandelten Kulturen zu der unbekannten Kontrolle bei 2 Stunden mit der Konzentration ausgedrückten Ergebnisse, die maximale Reaktion lieferte. Ebenfalls ist die Zahl der Konzentrationen von Nalidixinsäure, die getestet wurden, gezeigt, die aus den Reaktionsverhältnissen von 1,5 oder größer resultierten. Es ist zu beachten, dass die Tests in flüssigem Medium nicht auf Wachstumshemmung durch Nalidixinsäure korrigiert wurden. Unter Anwendung eines Standards eines maximalen Reaktionsverhältnisses von mindestens 1,8 und Reaktionsverhältnissen, die >1,5-fach bei 3 oder mehr Konzentrationen waren, zeigte sich bei 7 der 9 vermutlich neuartigen durch Nalidixinsäure aufwärtsregulierten Genfusionen, dass sie in flüssigem Medium reproduziert werden.
MITOMYCIN C-REAKTIONEN UND EINFLUSS VON LEXAIND-MUTATION
Es wurde Mitomycin C, eine DNA-schädigende Verbindung mit einem anderen Wirkungsmechanismus von der Nalidixinsäure, verwendet, um zu bestimmen, ob diese neuen entdeckten, mit Nalidixinsäure aufwärtsregulierten Genfusionen generell auf DNA-Schädigung ansprechbar sind. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer lexAind-Mutation getestet, um zu ermitteln, ob irgendeine von diesen, Bestandteil des SOS-Regulon war. Die Erwartung bestand darin, dass ein SOS-Regulon-Vertreter sowohl durch Nalidixinsäure als auch Mitomycin C in einer Weise induziert wird, die von der lexA-Funktion abhängig ist (Walker, G.C., (1996) Escherichia coli und Salmonella: Cellular and Molecular Biology ASM Press). Wie in 9 gezeigt, wurde eindeutig eine Fusion der Promotorregion von b1728 mit luxCDABE sowohl durch Nalidixinsäure als auch Mitomycin C in dem lexA⁺-Wirt induziert, wurde jedoch nicht in den lexAind-Wirtsstamm durch diese Chemikalien induziert. Damit demonstrieren diese Ergebnisse, dass die Aufwärtsregulierung durch Nalidixinsäure sowie Mitomycin C durch lexA kontrolliert ist. Dieses steht in Übereinstimmung mit der Beobachtung der Aufwärtsregulierung des b1728 mRNA-Transkripts bei einer Mitomycin C-Behandlung in einer von LexA abhängigen Form (Fernandez de Henestropa et al., (2000) Mol. Microbiol. 35: 1560-1572). In ähnlicher Weise wurden zwei Genfusionen, solche mit oraA und yigN, als neue Vertreter des SOS-Regulon identifiziert (Tabelle 16). Interessanter Weise waren vier der auf Nalidixinsäure ansprechenden Genfusionen nicht durch Mitomycin C in den lexA⁺-Wirt aufwärtsreguliert, was nahelegt, dass sie nicht generell auf DNA-Schädigung ansprechbar sind, sondern vielmehr spezieller ansprechbar sind auf Nalidixinsäure. Was was netativ war, auf non-DNA-Schädigung ansprechbare Genfusionen waren ebenfalls einbezogen (Tabelle 16).

Damit war der LuxArray-Assay zur Indentifizierung neuartiger, durch Nalidixinsäure aufwärtsregulierter Gene in E. coli verwendbar. In ähnlicher Weise kann dieser robuste Assay allgemein in einer parallelen Form auf die Hybridisierungsassays zur Überwachung transkriptioneller Änderungen angewendet werden. Die vielfache Kapazität der Gesamtgenomskale und die relative Einfachheit der Herstellung ermöglichen einen signifikanten Durchsatz. Dieser Assay ist eine bedeutende Zugabe für Bemühungen, um eine funktionelle Zuordnung der Promotoraktivität vorzunehmen. TABELLE 15 Nalidixinsäure-Reaktionen auf festem und in flüssigem Medium

Fusion mit Gen oder Operon:	Lux ID	Fluss. Vers. NA/LB, t=2h	Fester Vers. NA/LB, t=4h	Fester Vers. NA/LB, t=6h	Fester Vers. NA/LB, t=8h	Nal-Konz. d. max.Induktion in Flüssigk.	Fluss. Vers. NA/LB, t=2h	# d. Konz. mit >1,5-fach aufwärts
Bekannte SOS-Regulonvertreter:
dinG ybiB	lux-a.pk0024.f5	3,4	4,2	3,1	2,6	5 μg/ml	4,18	6
dinG ybiB	lux-a.pk0024.f5	2,5	3,7	3,5	2,9
dinP	lux-a.pk055.a3	3,1	5,1	4,2	3,1	5 μg/ml	7,60	7
dinP	lux-a.pk055.a3	5,5	11,0	8,1	6,3
uvrA	lux-a.pk0001.b6	2,5	2,3	1,6	1,0	nf	nf	nf
uvrA	lux-a.pk0001.b6	2,9	2,4	1,1	0,6
Nalidixinsäure aufwärtsreguliert sowohl auf der festen LuxArray-Kultur als auch in flüssiger Kultur
b1169	lux-a.pk0015.d6	2,3	6,4	2,7	0,6	20 μg/ml	2,71	6
b1169	lux-a.pk0015.d6	2,2	4,1	1,9	0,8
b1728	lux-a.pk033.c5	3,7	4,3	3,2	2,6	5 μg/ml	3,67	7
b1728	lux-a.pk033.c5	2,1	3,1	3,3	2,5
b1936	lux-a.pk0019.g1	2,5	7,7	9,7	7,1	10 μg/ml	2,34	6
b1936	lux-a.pk0019.g1	4,4	8,2	15,5	10,2
lpxA lpxB rnhB dnaE	lux-a.pk061.c3	3,5	3,1	2,8	1,7	2,5 μg/ml	1,82	3
lpxA lpxB rnhB dnaE	lux-a.pk061.c3	2,7	3,5	3,0	1,9
oraA	lux-a.pk058.f5	5,1	7,9	5,9	3,9	10 μg/ml	7,19	7
oraA	lux-a.pk058.f5	4,7	7,7	5,6	3,8
yaaF	lux-a.pk031.e7	2,1	2,0	1,3	1,0	2,5 μg/ml	1,85	3
yaaF	lux-a.pk031.e7	2,0	2,1	1,8	1,5
yigN	lux-a.pk046.fl1	2,1	2,5	0,3	0,1	1,2 μg/ml	2,54	5
yigN	lux-a.pk046.fl1	7,1	4,3	2,5	2,2
Nalidixinsäure-Aufwärtsregulierung nichtproduziert in flüssiger Kultur
frvR frvX frvB frvRA	lux-a.pk046.e6	2,8	2,3	0,8	0,5	20 μg/ml	1,46	0
frvR frvX frvB frvRA	lux-a.pk046.e6	2,1	2,3	2,0	1,7
yfhJ fdx hscA ythE	lux-a.pk0019.g2	2,1	2,0	1,7	1,4	1,2 μg/ml	1,02	0
yfhJ fdx hscA ythE	lux-a.pk0019.g2	2,1	2,2	1,5	1,3

TABELLE 16: Mitomycin C- und Nalidixinsäure-Reaktionen in lexA⁺- und lexAind-Wirten

Fusion mit Gen oder Operon	Lux ID	Wirtsstamm	NA- Verhältnis, 2 h, 10 μg/ml	Mit C- Verhältnis, 2 h, 250ng/ml
Bekannte SOS-Regulonvertreter
dinG ybiB	lux-a.pk0024.f5	lexA⁺	4,03	5,01
		lexA^ind	0,97	1,15
Nalidixinsäure aufwärtsreguliert sowohl auf dem festen LuxArray als auch in flüssiger Kultur
Neue SOS-Regulonvertreter
b1728	lux-a.pk033.c5	lexA⁺	5,17	8,97
	lux-a.pk033.c5	lexA^ind	0,40	0,90
oraA	lux-a.pk058.f5	lexA⁺	11,06	15,27
	lux-a.pk058.f5	lexA^ind	1,06	1,21
yigN	lux-a.pk046.fl 1	lexA⁺	5,74	9,84
	lux-a.pk046.fl 1	lexA^ind	0,59	0,93
Nalidixinsäure aufwärtqsreguliert, DNA-Schädigung nicht allgemein induzierbar
b1169	lux-a.pk0015.d6	lexA⁺	3,22	1,12
	lux-a.pk0015.d6	lexA^ind	2,29	1,73
b1936	lux-a.pk0019.g1	lexA⁺	3,25	1,22
	lux-a.pk0019.g1	lexA^ind	1,55	2,46
lpxA lpxB rnhB dnaE	lux-a.pk061.c3	lexA⁺	2,87	1,06
	lux-a.pk061.c3	lexA^ind	2,39	1,29
yaaF	lux-a.pk031.e7	lexA⁺	1,53	1,02
	lux-a.pk031.e7	lexA^ind	1,19	0,99
Negativ-Kontrollen
yciG	lux-a.pk006.b4	lexA⁺	0,32	0,56
		lexA^ind	0,67	0,61
lacZ	65.d4	lexA⁺	0,81	0,80
		lexA^ind	1,05	1,24

BEISPIEL 6
HINZUFÜGUNGEN ZU SAMMLUNGEN UND ALTERNATIVE METHODEN DES ERZEUGENS VON SAMMLUNGEN VON BAKTERIELLEN GENOMFRAGMENTEN, DIE MIT EINEM REPORTER FUSIONIERT SIND
Es gibt mehrere Methoden zum Herstellen von Fusionen bakterieller Promotorregionen mit Reportergenen zum Hinzufügen zu einer genomregistrierten Sammlung von regellos erzeugten Genfusionen. Einige dieser Methoden sind auch alternative Methoden zum Aufbauen einer großen Sammlung von Genfusionen.
Erstens, werden DNA-Sequenzdaten von mehr Random-Genfusionen zur Identifikation zusätzlicher nützlicher Vertreter zu einer Sammlung führen, die nicht vollständig gesättigt ist. Diese zusätzlichen Sequenzen können von Vertretern der gleichen ursprünglichen sequenzierten Genbank von genetischen Fusionen, z.B. LuxA, oder einer unabhängig erzeugten Genbank erzeugt werden. Die in den vorangegangenen Beispielen ausgeführten Schritte ermöglichen die Genomregistrierung der neu sequenzierten Fusionen.
Das DNA-Sequenzieren von regellos erzeugten Fusionen wird zur Identifikation von Fusionen führen, die mit der Ausnahme anwendbar sind, dass die Orientierung der chromosomalen DNA invertiert ist, so dass die Promotorregionen, die von Interesse sind, nicht funktionsfähig mit den Reportergenen verknüpft sind. Das Auswählen derartiger Fusionen und Invertieren der Orientierung der Insert-DNA kann die Nützlichkeit einer sequenzierten Sammlung deutlich erhöhen, indem sehr viel mehr funktionsfähig verknüpfte Fusionen den Sammlungen hinzugefügt werden. Ein einfacher Weg, dieses auszuführen, besteht im Degerieren der Plasmid-DNA mit einem Restriktionsenzym, das unmittelbar außerhalb der klonierten Region schneidet und die Stücke wieder zusammenfügt. Obgleich eine Mischung von Plasmiden aus dieser Prozedur resultiert, kann in vielen Fällen das korrekt orientierte Plasmid gefunden werden, da Zellen, die dieses enthalten, nicht jedoch andere mögliche Produkte, Licht erzeugen werden. Diese Methode hat den Vorteil, dass die Anwendung der Polymerasekettenreaktion vermieden wird und damit mögliche Änderungen in der DNA-Sequenz aus einer Amplifikation vermieden wird.

Diese Vorgehensweise wurde demonstriert, indem eine nichtfunktionsfähig verknüpfte clpB-Fusion in der Lux-A-Sammlung identifiziert, das chromosomale DNA-Segment im Bezug zu dem Vektor invertiert und ein E. coli-Stamm, der das resultierende Plasmid trägt, mit einem in der Sammlung mit einer richtigen Orientierung der clpB-Promotorregion verglichen wurde. Eines der Isolate aus der Lux-A-Sammlung, lux-a.pk043.d3, enthält die Region des E. coli-Chromosoms mit dem clpB-Promotor, ist jedoch in entgegengesetzter Richtung orientiert, als erforderlich wäre, um den Promotor und die Reportergene funktionsfähig zu verknüpfen. Es wurden sehr geringe Mengen einer Lichterzeugung dieses Stammes gemessen. Im Gegensatz dazu hatte der Stamm, lux-a.pk054.c3, der das Plasmid mit der clpB-Promotorregion in der richtigen Orientierung trägt, um dieses funktionsfähig mit luxCDABE-Reportergenen zu verknüpfen, ein hohes Maß der Lichterzeugung. Aus lux-a.pk043.d3 wurde Plasmid-DNA isoliert, mit Restriktionsenzym Xmal digeriert und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Die Ligierungsreaktion wurde angewendet, um E. coli-Stamm DPD1675 mit Hilfe einer Elektroporation zu transformieren. Die Transformanten wurden anhand der Ampicillin-Widerstandsfähigkeit ausgewählt. Wie mit Hilfe einer Exponierung eines Röntgenfilmes nachgewiesen wurde, erzeugten 3% der resultierenden, transformierten Kolonien Biolumineszenz. Die Reaktion auf Ethanol-Behandlung von zwei dieser lichterzeugenden Transformanten, die vermutlich invertierte chromosomale Insertionen enthalten, und zwar von lux-a.pk054.c3 (DPD2243), die ein Plasmid mit dem clpB-Promotor enthält, der funktionsfähig mit dem luxCDABE-Reporter verknüpft ist, und das ursprüngliche lux-a.pk043.d3 wurden verglichen. Aktiv aufgezogene Kulturen bei 37°C in LB-Medium wurden mit 4% Ethanol behandelt und die Lichterzeugung bei 37°C unter Anwendung eines Mikroplatten-Luminometers (Dynex ML3000) quantitativ bestimmt. In Tabelle 17 ist die durchschnittliche Biolumineszenz von doppelt ausgeführten Proben bei 38 Minuten nach Behandlung zusammengestellt. TABELLE 17 Lichterzeugung durch Stämme, die eine clpB-luxCDABE-Genfusion enthalten und aus der Inversion der chromosomalen Insertion resultieren, sowie Kontrollen

Stamm	Kulturtrübung¹	Lichterzeugung in LB²	Lichterzeugung in LB + 4% Ethanol2	Reaktionsverhältnis
lux-a.pk043.d3	11	0,0015	0,0025	N/A
lux-a.pk043.d3 invertiert	14	1,25	8,17	6,5
lux-a.pk043.d3 invertiert	18	5,34	29,63	5,5
lux-a.pk054.c3 (DPD2243)	12	1,37	13,00	9,4

1 zum Zeitpunkt 0; Klett-Einheiten
2 RLU

Damit wurde mit Hilfe der Lichterzeugung in LB-Medium das Vorhandensein eines Promotors, der die Transkription des luxCDABE-Operon in den invertierten Isolaten antreibt, gezeigt. Darüber hinaus wurde auch die erwartete biologische Reaktion der Induktion einer Aufwärtsregulierung durch Ethanol-Behandlung für diesen Vertreter des Hitzeschock-Regulon demonstriert.
Diese Methode des Invertieren wurde parallel in einer solchen Weise ausgeführt, dass Gegenfusionen der Lux-A-Sammlung hinzugefügt werden. Erstens, wurde eine Liste von etwa 400 Genfusionen aus der Lux-A-Sammlung abgeleitet, die das korrekte Genomfragment enthielten, jedoch relativ zu dem lux-Operon in falscher Orientierung, und die in der gegenwärtigen Sammlung nicht vorhanden sind. Jeder dieser Stämme, der diese Fusionen enthielt, wurde aus der ursprünglichen Sammlung von 8.000 Fusionen herausgenommen und erneut aufgezogen. Die Biolumineszenz von jedem wurde quantitativ bestimmt, da in einigen Fällen das Vorhandensein eines divergenten Promotors in dem klonierten DNA-Fragment zur Lichterzeugung selbst dann führte, wenn die DNA im Bezug auf den Promotor invertiert war, der von Interesse ist. Etwa die Hälfte der ausgewählten Stämme erzeugte >0,1 RLU-Licht nach 3 Stunden Inkubation bei 37°C nach Beimpfung von 100 μl LB-Medium mit 10 μl Kultur von einer Arbeitsplatte. Dieses legt nahe, dass die Reihe von Stämmen mit Lichterzeugung von <0,1 RLU anfangs leichter fortzusetzen sei. Daher wurden nach der Isolation von Plasmid-DNA in einem 96-Mulden-Format, Xmal-Digestion, und Religierung, die aus Stämmen mit Lichterzeugung von weniger als 0,1 RLU hervorgehenden Ligierungsreaktionsmischungen in Platten sortiert, die von denen separat waren, die von Stämmen mit Lichterzeugung größer oder gleich 0,1 RLU kamen. E. coli-DPD1675 wurde kompetent gemacht durch Calciumchlorid-Behandlung und transmormiert mit der religierten Plasmid-DNA, die auf Ampicillin-Widerstandsfähigkeit selektiert. Indem die Petrischale mit den Transformantenkolonien auf einen Röntgenfilm gegeben wurde und der exponierte Film zu verschiedenen Kontaktzeitpunkten entwickelt wurde, wurden lichterzeugende Transformanten identifiziert. Die lichterzeugenden Kolonien wurden gereinigt, indem einzelne Kolonien in erstarrtem LB-Medium isoliert wurden, das Ampicillin enthielt, und indem die Lichterzeugung mit Hilfe der Luminometrie verifiziert wurde. Dieser Prozess wurde für 36 Plasmide vervollständigt, die aus Stämmen mit einer Lichterzeugung kleiner als 0,1 RLU isoliert waren. Die Plasmid-DNA aus jedem der Stämme, die vermutliche invertierte chromosomale Segmente enthielten, wurde isoliert und die DNA-Sequenz ermittelt, um einzuschätzen, ob das invertierte Produkt erhalten worden war. Im Vergleich mit der E. coli-Genom-DNA-Sequenz unter Verwendung von BLASTN (Standardeinstellung) lieferten 13 der 36 Plasmide eine DNA-Sequenzinformation, die eine hohe Trefferzahl hatte. Von diesen hatten fünf eine DNA in der invertierten Orientierung aus dem ursprünglichen Klon.
Für diese relativ geringe Erfolgsrate gab es mehrere mögliche Ursachen. Beispielsweise können einige Promotoren, die annotiert sind, in den zur Anwendung gelangenden Bedingungen unter Umständen nicht funktionsfähig sein oder können unter Umständen keine biologisch relevanten Promotoren sein. Damit würde eine Auswahl durch Lichterzeugung des invertierten Klons nicht erfolgreich sein. Im Gegensatz dazu könnten divergente Promotoren, die in dem Test mit der flüssigen Kultur auf Biolumineszenz, die zum Aussortieren angewendet wurde, nicht auf dem mm Screening auf lichterzeugende Klone verwendeten erstarrten Medium nicht aktiv gewesen sein. Dieses kann zu einer Selektion einer Kolonie geführt haben, die das Anfangsplasmid enthielt. Darüber hinaus kann es eine geringe Plasmid-DNA-Ausbeute gegeben haben, ein schlechtes Schneiden und/oder geringe Religierungen bei paralleler Ausführung in Mikroplatten. Dieses kann zu DNA-Konzentrationen in den Ligierungen geführt haben, so dass die intermolekularen Ligierungen auf ein Minimum herabgesetzt waren, oder so dass eine geringe Zahl von Transformantenkolonien resultierte sowie seltene Transformanten mit der invertierten Insert-DNA nicht repräsentiert waren. Damit hat diese Vorgehensweise der Restriktiondigestion, Religierung, Transformation und Selektion von lichterzeugenden Transformanten demonstriert, dass sie funktionieren. Allerdings ist eine weitere Optimierung auf eine effiziente, parallele Implementierung erforderlich.
Um das Invertieren eines chromosomalen Segmentes in ein Plasmid, das divergente Promotoren enthält, zu testen, wurde eine Rückwärsfusion mit yebF gewählt. Von besonderem Interesse war das Erhalten einer funktionsfähig verknüpften Reportergen-Fusion mit yebF, da das yebF-Gen ansonsten ein unbekannter offener Leserahmen ist, der in einem DNA-Mikroarray-Versuch gefunden wurde und stark durch Mitomycin C, einem DNA-Schädigungsmittel, induziert zu sein schienen. In diesem Fall war ein zu dem purT-Gen divergenter Promotor in dem chromosomalen Fragment vorhanden, und Stämme, die die Rückwärts-yebF-Fusion enthielten, erzeugten Licht. Nach der Xmal-Digestion, Religierung und Transformation erzeugten 10% der Transformanten Licht. Von diesen zeigten sich 20% (oder 2% der Anfangstransformanten) durch Nalidixinsäure, einem anderen DNA-Schädigungsmittel, stark induziert. Dieses Ergebnis legt mit Nachdruck nahe, dass die gewünschte Inversion des chromosomalen Segmentes aufgetreten war. Dieses wurde mit Hilfe der DNA-Sequenzanalyse verifiziert. Damit ist das Invertieren chromosomaler Segmente, die divergente Promotoren enthalten, möglich und wird dann erleichtert, wenn die zwei Promotoren anhand ihrer biologischen Aktivität unterschieden werden können.
Eine alternative Prozedur des Invertieren verwendet Plasmid-DNA von Klonen, die eine Neuorientierung als Templates für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfordern. Es wurden Universal-PCR-Primer konzipiert, die speziell mit dem pDEW201-Plasmid hybridisieren, welches das die Klonierungsstelle flankierende Genomfragment (Bam HI) flankiert. Die Verwendung des ersten Primers, pDEWE2S (SEQ ID Nr.; 3, 5'-GGAATTGGGGATCGGAGCTCCCGGG-3'), eine EcoRI-Stelle (GAATTC) wird zu einer SacI-Stelle (GAGCTC) über eine interne AT-zu-GC-Fehlanpassung konvertiert. Die Verwendung des zweiten Primers, pDEWS2E (SEQ ID Nr.:4, 5'GAATGGCGCGAATTCGGTACCCGGG-3'), führt zu der Umwandlung der SacI-Stelle zu einer EcoRI-Stelle über eine interne GC-zu-AT-Umwandlung. Damit lassen sich die von irgendeinem pDEW201-Klon resultierenden PCR-Produkte mit EcoRI und SacI digerieren und zu EcoRI- und SacI-digerierten pDEW201 ligieren. Das resultierende Plasmid enthält das ursprüngliche chromosomale Segment in der entgegengesetzten Orientierung des ursprünglichen Klons relativ zu dem lux-Operon. Da die Primer im Bezug auf den Vektor spezifisch sind, können sie für alle Klone verwendet werden und eignen sich für Hochleistungsmethoden (96-Muldenplatte).
KONSTRUKTION, SEQUENZIEREN UND REGISTRIEREN EINER ZUSÄTZLICHEN RANDOM-GENBANK VON E. COLI-GENOMFRAGMENTEN, DIE MIT EINEM LUXCDABE-REPORTER FUSIONIERT SIND
Es wurde eine unabhängige Random-Genbank von E. coli-Genomfragmenten im Plasmid pDEW201 aufgebaut und als die LuxZ-Bank bezeichnet. Die aus dem E. coli-Stamm W3110 (Ernsting et al., (1992) J. Bacteriol. 174: 1109-1118) isolierte chromosomale DNA wurde teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3A1 digeriert, mit Hilfe von Agarose-Gelelektrophoresen größenfraktioniert und eine Fraktion mit einer mittleren Größe von näherungsweise 0,7 kb isoliert. Diese Fraktion wurde mit pDEW201 ligiert, das zuvor mit BamHI digeriert worden war und mit Kälberdarm-Alkaliphosphatase behandelt worden war. Die Produkte der Ligierung wurden verwendet, um ultrakompetente E. coli-XL2Blue-Zellen (Stratagene) auf Ampicillin-Widerstandsfähigkeit zu transformieren, indem das Protokoll zur Anwendung gelangte, das von Stratagene bereitgestellt wurde. Eine erste Charakterisierung einzelner XL2Blue-Transformanten, die regellos aufgenommen wurden, zeigte, dass ein großer Prozentanteil (16 von 16) insertierte DNA mit Größen im Bereich von 0,1 bis 1,5 kb enthielt. Näherungsweise 150.000 dieser Transformanten wurden gepoolt und als Quelle für heterogene LuxZ-Bank-Plamid-DNA verwendet, die unter Anwendung von Qiagen-tip20-Säulen (Qiagen Corp.) isoliert wurden. Dieser Plasmid-DNA-Pool wurde 100-fach verdünnt und anschließend zur Transformation von E. coli-DPD1675 (Van Dyk und LaRossa (1998) Methods in Molecular Biology: Bioluminescence Methods and Protocols, Humana Press Inc., Bd. 102, S. 85-95) durch Elektroporation zu transformieren. Beginnend mit 1 Liter LB-Kultur mit näherungsweise 2,4 × 10⁸-Zellen/ml wurden elektrokompetente DPD1675-Zellen hergestellt. Nach dem Abschrecken auf Eis wurden die Zellen aus dieser Kultur durch Zentrifugation mit einer mittleren relativen Zentrifugalkraft von 6,555 für 5 Minuten aufgenommen. Die Zellen wurden zweimal in eiskaltem, sterilisierten destillierten Wasser gewaschen (1 Liter für die erste Wäsche und 500 ml für die zweite Wäsche) und zentrifugiert. Sodann wurden die Zellen mit 10 ml eiskaltem, sterilen 10%igem Glyzerin in destilliertem Wasser gewaschen und zentrifugiert. Die abschließende erneute Suspension von Zellenpellets erfolgte mit eiskaltem, sterilen 10%igem Glyzerin in destilliertem Wasser, um ein abschließendes Volumen von 2,1 ml zu ergeben. Es wurden 55μl-Aliquots hergestellt, in Trockeneis und Ethanol schockgefroren und anschließend bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Eines dieser Aliquots wurde auf Eis aufgetaut, 1,0 μl der verdünnten LuxZ-Bank-Plasmid-DNA zugegeben und die Zellen und die Plasmid-DNA in eine Cuvette zur Elektroporation auf Eis gegeben (Biorad, Gene Pulser^®/E. coli Pulser^TM). Die verschlossene Cuvette wurde elektroporiert mit 1,85 Volt bei einer Kapazität von 25 μF und anschließend 0,5 ml SOC-Medium (pro Liter: 20 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl, 2,5 mMol KCl, 2,5 mMol MgCl₂, 20 mMol Glukose, pH 7,0) gegeben. Um das Vorhandensein von Geschwistern auf ein Minimum herabzusetzen, wurde eine phänotypische Expressionszeit bei 37°C von 30 Minuten angewendet. Nach dieser Inkubation wurden 500 μl 24%igem sterilen Glyzerin in Wasser zugegeben und 100μl-Aliquots hergestellt, auf Trockeneis tiefgefroren und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Diese Aliqots wurden sodann aufgetaut, auf LB-Medium, das Ampicillin enthielt, auf Platten gezogen und 4.608 Einzelkolonien zur Verwendung als Impfgut für Kulturen ausgewählt, die auf 80 μl 1x Gefriermedium (LB mit 100 μg/ml Ampicillin, 5,54% Glyzerin, 36 mMol K₂HPO₄, 13,2 mMol KH₂PO₄, 1,7 mMol NaC₆H₅O₇·2H₂O, 40 mMol MgSO₄, 6,8 mMol NH₄SO₄) in den Mulden von 384 Mulden-Mikroplatten aufgezogen. Diese Platten wurden bei –80°C gelagert, bis sie zur Beimpfung verwendet wurden, und wurden bis zur Sättigung in Terrific Broth (Gibco-BRL, Inc.) aufgezogen, die 100 μg/ml Ampicillin in 96 Muldenplatten mit tiefen Mulden enthielt. Die Plasmid-DNA wurde aus den Kulturen unter Anwendung der Qiagen R.E.A.L.^TM-Präpariermethode mit der folgenden Modifikation extrahiert: Nach Lyse von Zellen, wurden die Platten in ein siedendes Wasserbad für 5 Minuten gegeben und anschließend vor der Ausfällung mit Puffer R3 in einem Eiswasserbad schockgekühlt. Diese Modifikation verhinderte einen Abbau der Plasmid-DNA durch die in dem non-endA-Wirtsstamm, DPD1675, vorhandenen Nucleasen. Die Reaktionen zur DNA-Sequenzierung wurden mit näherungsweise 1 μg Plasmid-DNA unter Standard-ABI-Prtsm^TMdRhodamine Dye Termintor Ready Reaction-Bedingungen mit den Primern pDEW201.forward (SEQ ID Nr.:1, 5'-GGATCGGAATTCCCGGGGAT-3') und pDEW201.reverse (SEQ ID Nr.:2, 5'-CTGGCCGTTAATAATGAATG-3') ausgeführt, um eine Sequenzinformation von jedem Ende des Inserts zu erhalten. Die DNA-Sequenzen wurden auf einem ABI377^TM-XL96-Spuren aufgerüsteten Sequenzer unter vier Durchlaufbedingungen auf 5% PAG (Polyarylamid-Gel) Long Ranger^TM (FMC, Inc.)-Gelen bestimmt und mit ABI-Software analysiert. Die DNA-Sequenzen wurden zur weiteren Analyse in ein auf UNIX basierendes Gerät gegeben. Die Homologiesuche für die Sequenz von Beginn und Ende jedes LuxZ-Klon (in beiden Orientierungen) und Registrierung zu dem E. coli-Genom erfolgten entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1 und resultierte zu 1.799 zusätzlichen genomregistrierten Genfusionen.
BEISPIEL 7
LUXARRAY 1.04, EIN GENOMWEITER PROMOTORAKTVITÄT-ASSAY IN FLÜSSIGEM MEDIUM UND DESSEN ANWENDUNG ZUR ENTDECKUNG EINES LIMONEN-SENSORS AUSWAHL ZUSÄTZLICHER, NICHTREDUNDANTER LUX-GENFUSIONEN ZUR ERWEITERUNG DES LUXARRAY 1.0
Es wurden funktionsfähig verknüpfte Genfusionen aus der in Beispiel 6 beschriebenen genomregistrierten LuxZ-Genfusion-Sammlung ausgewählt, indem die in Beispiel 5 beschriebenen computergestützten Filter angewendet wurden. Diese Liste wurde sodann mit der gegenwärtigen Liste von in dem LuxArrax 1.0 enthaltenen Promotoren verglichen, um eine Redundanz zu eliminieren. Dieser Prozess führte zur Identifikation von 149 Genfusionen, die zur Erweiterung des LuxArrays verwendbar sind.
Zusätzlich wurden die fünf Genfusionen, die durch Inversion der in Beispiel 6 beschriebenen zuvor sequenzierten Genfusionen erzeugt wurden, und sechs Genfusionen von anderen Quellen hinzugefügt. Tabelle 19 stellt diese zusätzlichen 160 Genfusionen zusammen, die zusammen mit den Genfusionen im LuxArray 1.0 dem LuxArray 1.04 ergeben. Die 849 Genfusionen im LuxArray 1.04 repräsentieren damit 33% der 2.584 bekannten und vorhergesagten transkriptionellen Einheiten in dem E. coli-Genom. Einzelne Kulturen von Stämmen, die neu identifizierte Genfusionen enthalten, wurden den leeren Mulden der vorhandenen Mikroplatte Nr. 15 hinzugefügt und neu Mikroplatten mit der Nummerierung 17 bis 19 mit zweifacher Seite-an-Seite-Symmetrie erzeugt. Die frühere Mikroplatte 16 wurde eliminiert, da sie lediglich Stämme mit dem elterlichen Plasmid und sterile Kontrollen enthielt. Damit ist der LuxArray 1.04 in 18 Mikroplatten enthalten, die den zellulären Array repräsentieren. Diese wurde in Gefriermedium bei –80°C aufbewahrt.
LIMONEN-STRESS DES REPORTER-ARRAYS IN FLÜSSIGER KULTUR
Es wurden Mikroplatten von –80°C, die den LuxArray 1.04 mit E. coli-Stämmen enthielten, aufgetaut und verwendet, um 100 μl LB-Medium ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin in Coster#3595-96-Mulden-Mikroplatten mit flachem Boden zu beimpfen. Nach einer Aufzucht über Nacht bei 37°C wurden die Platten visuell untersucht und alle Mulden mit geringer oder keiner Trübung aufgezeichnet. Sodann wurden diese Kulturen verdünnt, indem 15 μl zu 135 μl LB-Medium in Costar#3595 gegeben wurden, 96-Mulden-Mikroplatten mit flachem Boden, und wurden auf einer IKA-Schuttler MTS-4-Schüttelmaschine mit einer Einstellung von 400 für zwei Stunden bei 37°C in einer Feuchthaltebox mäßig durchgewirbelt. Es wurden 20 μl jeder dieser aktiv aufgezogenen Kulturen in die entsprechenden Mulden in Reihen von drei Mikroplatten gegeben, von denen eine 80 μl LB-Medium, eine andere 80 μl LB-Medium gesättigt mit Limonen bei Raumtemperatur und die dritte 40 μl LB-Medium gesättigt mit Limonen und 40 μl LB-Medium enthielt. Unter Verwendung eines auf 37°C vorgewärmten MLX-Mikroplatten-Luminometers (Dynex) wurde eine erste Ablesung (Zeitpunkt 0) vorgenommen. Sodann wurden die Platten ohne Schütteln auf 37°C gebracht. Nach 45, 90 und 135 Minuten wurden weitere Biolumineszenz-Messungen aufgenommen. Zur Begrenzung der Zahl der Mikroplatten, die täglich gehandhabt werden mussten, wurden an jedem von vier verschiedenen Tagen die LuxArray 1.04-Mikroplatten 1 bis 5, Mikroplatten 6 bis 10, Mikroplatten 11 bis 15 und Mikroplatten 17 bis 19 verwendet.
DATENANALYSE VON LIMONEN-INDUZIERTEN REAKTIONEN
Die Daten wurden auf der Grundlage jedes einzelnen Targets, an dem die Daten aufgenommen wurden, zur Korrektur auf Wachstumshemmung normiert, die durch Limonen hervorgerufen wird. Die Biolumineszenz (RLU) jeder einzelnen Kultur für jeden Tag der Versuchsreihe unter jeder der drei Bedingungen wurde zur Bestimmung der täglichen Array-Gesamt-RLU hinzugefügt. Diese wurden verwendet, um einen Normierungsfaktor (DNF) wie folgt zu ermitteln:
DNF = tägliches Array-Gesamtsignal (Zeitpunkt 0, LB-Kontrolle)/tägliches Array-Gesamtsignal (Zeit x, Bedingung y)
Jede Messung von dem entsprechenden Tag, Zeitpunkt und Bedingung wurde mit DNF multipliziert, um ein normiertes Signal zu ergeben. Die Daten von den Mulden, die auf geringes Wachstum oder kein Wachstum bewertet wurden, wurden in der weiteren Analyse nicht verwendet. Die normierten Daten wurden mit der Software GeneSpring (Silicon Genetics) analysiert, womit das Signal von jeder der zweifachen Kulturen für jede Reportergen-Fusion gemittelt wurde.
Insgesamt gab es eine geringe bis keine Aufwärtsregulierung der Genexpression unter der Bedingung von 40% gesättigtem Limonen in LB-Medium. Damit wurden Muster der Genexpression von 80 % gesättigtem Limonen in LB-Medium weiter untersucht. Es wurden Listen von Genfusionen angelegt, die zweifach oder mehr zum jeweiligen Zeitpunkt aufwärtsreguliert wurden. Diese Listen wurden untersucht und Genfusionen mit sehr geringen normierten RLU-Werten (<0,012 RLU) bei allen Bedingungen eliminiert. Die aufwärtsregulierten Genfusionen sind in Tabelle 20 zusammengestellt, bei der der Name des Gens im jeweiligen Operon mit der kleinsten b# verwendet wird, um die jeweilige Genfusion zu identifizieren. Die Bezeichnung ">2X" wird für eine Aufwärtsregulierung gegeben, während "*" dann angegeben wird, wenn die Expression kleiner war als zweifach erhöht. Bei 45 Minuten war die Expression von 14 Genfusionen erhöht; keine von diesen war um dreifach oder mehr erhöht. Bei 90 Minuten waren 37 Genfusionen induziert; darin eingeschlossen sind bis auf eine alle Genfusionen, die bei 45 Minuten beobachtet wurden. Allerdings sind die am höchsten aufwärtsregulierten Genfusionen bei 90 Minuten, zuvor als bei 45 Minuten aufwärtesreguliert beobachtet worden. Dieses waren Fusionen des luxCDABE-Reporters mit den Promotorregionen von uhpT (3.8X), nirB (3.7X) und narK (3.6X). Bei 135 Minuten waren 39 Genfusionen induziert, die 13 Fusionen einschlossen, die nicht bei 45 oder 90 Minuten beobachtet wurden. Bei diesem Zeitpunkt waren die am Höchsten aufwärtsregulierten Genfusionen solche mit den Promotorregionen von uhpT (7.7X), nirB (4.1X) und katG (4.1X). Damit war die Genfusioin mit der Promotorregion von uhpT die am Höchsten aufwärtsregulierte sowohl zu den Zeitpunkten von 90 als auch von 135 Minuten.
VERIFIZIERUNG VON UHPT-LUX-AUFWÄRTSREGULIERUNG DURCH LIMONEN
Der Stamm E. coli-DPD3228 ist identisch mit lux-a.pk034.b9, dem Stamm, der die uhpT-luxCDABE-Genfusion enthält. Dieser Stamm wurde über Nacht bei 37°C in LB-Medium aufgezogen, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, und wurde am folgenden Tag in LB-Medium verdünnt und zur Lock-Phase bei 37°C aufgezogen. 20μl-Aliquots dieser Kultur wurden zu 80 ml LB-Medium, gesättigt mit Limonen, zu 80 μl einer Reihe von Zweifachverdünnungen in LB-Medium von LB, gesättigt mit Limonen, und zu 80 μl LB-Medium gegeben. Die Lichterzeugung wurde in einem Luminoskan Ascent (Labsystems)-Mikroplatten-Luminometer bei 37°C gemessen. 10 zeigt das Ergebnis. Ähnlich den Anfangsbeobachtungen des LuxArrays wurde eine späte Reaktion auf das Vorhandensein von Limonen beobachtet. Diese Reaktion war bei der höchsten Konzentration des Limonens, die getestet wurde, maximal, wurde jedoch auch dann nachgewiesen, wenn Limonen mit 40% oder 20% der sättigenden Mengen im LB-Medium vorhanden war. Damit wurde die Aufwärtsregulierung von Biolumineszenz aus diesem Stamm durch Limonen bestätigt, womit seine Nutzanwendung als ein Sensor auf Limonen demonstriert wird. Schema 1: PERL-Skript, das zum Filtern der lux-Klonsammlung auf funktionelle Reporterkonstrukte verwendet wurde
TABELLE 18 Luxarray 1.0-Klonsammlung

The numbers in parenthesis represent each end of the nucleotide sequence designation in the E. coli genomic sequence. The sequence designation is based on Blattner et al. ((1997) Science 277:1453-1462) TABELLE 19

TABELLE 20 Erstes Gen des Operons 45 Minuten 90 Minuten 135 Minuten

b0116 (lpdA)	>2X	>2X	*
b0168 (map)	>2X	>2X	*
b0767 (ybhE)	>2X	>2X	>2X
b0842	>2X	>2X	>2X
b1186 (nhaB)	>2X	>2X	>2X
b1413 (hrpA)	>2X	>2X	>2X
b1676 (pykF)	>2X	>2X	>2X
b1993 (cobU)	>2X	>2X	>2X
b2081	>2X	>2X	*
b2999	>2X	*	*
b3012	>2X	>2X	>2X
b3904 (rhaB)	>2X	>2X	>2X
b4106 (phnC)	>2X	>2X	>2X
b4392 (slt)	>2X	>2X	*
b0314 (betT)	*	>2X	>2X
b0417	*	>2X	>2X
b0422 (xseB)		>2X	*
b0572	*	>2X	>2X
b0593 (entC)	*	>2X	>2X
b0839 (dacC)	*	>2X	>2X
b1188 (ycgB)	*	>2X	*
b1223 (narK)	*	>2X	>2X
b1872 (bisZ)	*	>2X	>2X
b2237 (inaA)	*	>2X	>2X
b2322	*	>2X	>2X
b2367 (emrY)	*	>2X	*
b2451	*	>2X	>2X
b2550	*	>2X	*
b2699 (recA)	*	>2X	>2X
b3245	*	>2X	>2X
b3267 (yhdV)	*	>2X	>2X
b3336 (bfr)	*	>2X	*
b3365 (nirB)	*	>2X	>2X
b3419 (yhgJ)	*	>2X	>2X
b3666 (uhpT)	*	>2X	>2X
b3942 (katG)	*	>2X	>2X
b4043 (lexA)	*	>2X	*
b4264 (yjgS)	*	>2X	*
b0005	*	*	>2X
b0123 (yacK)	*	*	>2X
b0386 (proC)	*	*	>2X
b0450 (glnK)	*	*	>2X
b0774 (bioA)	*	*	>2X
b1847 (yebF)	*	*	>2X
b1852 (zwf)	*	*	>2X
b2019 (hisG)	*	*	>2X
b2114 (metG)	*	*	>2X
b2428	*	*	>2X
b3573	*	*	>2X
b3779 (gppA)	*	*	>2X
b4226 (ppa)	*	*	>2X

AUFLISTUNG DER SEQUENZEN

Claims

Verfahren zum Bestimmen der Genfunktion zwischen zwei genomregistrierten Sammlungen, umfassend: (a) Zusammenfügen mindestens zweier genomweitskalige, genomregistrierter Sammlungen von der genomischen DNA eines Organismus, wobei eine der Sammlungen eine Sammlung von Reportergenfusionen aufweist, von denen jede Fusion ein Reportergen aufweist, das funktionsfähig mit einem genomischen DNA-Fragment verknüpft ist; (b) Perturbieren jeder Sammlung von (a) mit mindestens einer Perturbation; (c) Messen der Reaktion jeder Sammlung auf jede Perturbation von (b) und (d) Analysieren der Ergebnisse der mindestens einen Perturbation, um Muster von Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den mindestens zwei genomregistrierten Sammlungen zu identifizieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Perturbation ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Strahlung, Feuchtigkeit, Temperaturänderungen, Änderungen der Kohlenstoffquelle, Änderungen der Energiequelle, Änderungen der Stickstoffquelle, Änderungen der Phosphorquelle, Änderungen der Schwefelquelle, Änderungen der Quelle von Spurenelementen, Änderungen des ph-Wertes, des Vorhandenseins anderer Organismen, des Vorhandenseins von Chemikalien, des Vorhandenseins von Toxinen und anomalen Mengen normaler Metabolite.
Verfahren zum Erzeugen einer genomregistrierten Sammlung von Reportergenfusionen, welches Verfahren die Schritte umfasst: (a) Erzeugen einer Reihe von Genfusionen, welche aufweist: 1) ein Reportergen oder Reportergenkomplex, funktionsfähig verknüpft mit 2) einem Genomfragment von einem Organismus, von dem mindestens 15% der genomischen Nucleotidsequenz bekannt sind; (b) Einführen von Reportergenfusionen von Schritt (a) in einen Wirtsorganismus in vitro; (c) Registrieren der Reportergenfusionen auf der Grundlage der Sequenz-Homologie der Genomsequenz des Organismus; (d) Wiederholen von (a), (b) und/oder (c), bis Reportergenfusionen zu mindestens 15% der bekannten genomischen Nucleotidsequenzen des Organismus erzeugt worden sind.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Genfusionen von Schritt (a) entweder in vitro oder in vivo in einem mikrobiellen Organismus erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 3, worin: (a) das Erzeugen einer Reihe von Genfusionen umfasst: 1) Erzeugen von regellosen Nucleinsäurefragmenten, von der DNA eines Organismus, von dem mindestens 15% der Nucleotidsequenz bekannt sind, und 2) funktionsfähiges Verknüpfen der in Schritt (1) erzeugten, regellosen Nucleinsäurefragmenten mit einem promotorlosen Reportergen oder Reportergenkomplex in einem Vektor und (b) das Registrieren der Reportergenfusionen auf der Grundlage der Sequenz-Homologie zu der Genomsequenz des Organismus von Schritt (c) umfasst das Bestimmen der Nucleinsäuresequenz der distalen und proximalen Enden der regellosen Nucleinfragmente in Bezug auf das Reportergen oder den Reportergenkomplex.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die regellosen Nucleinsäurefragmente von Schritt (a) erzeugt werden mit Hilfe einer Methode, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Restriktionsenzymdigestion, physikalisches Scheren des Genoms und Polymerasenkettenreaktion.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Erzeugen einer Reihe von Genfusionen die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Genoms von einem Organismus, worin mindestens 15% der Nucleotidsequenz bekannt sind; (b) Bereitstellen einer Reihe von Amplifikationsprimern mit Homologie zu den speziellen bekannten Regionen des Genoms von (a); (c) Amplifizieren von Abschnitten des Genoms von (a) mit Primern (b), um eine Sammlung von Nucleinsäure-Amplifikationsprodukten zu erzeugen, und (d) funktionsfähiges Verknüpfen der Amplifikationsprodukte von (c) mit einem Vektor, der promotorloses Reportergen oder Reportergenkomplex enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei (a) das Erzeugen einer Reihe von Genfusionen das Einführen von einem oder mehreren Transposonen in das Genom eines Organismus umfasst, von dem mindestens 15% der Nucleotidsequenz bekannt sind, und jedes Transposon ein promotorloses Reportergen oder Reportergenkomplex enthält, und (b) das Registrieren der Reportergenfusionen auf der Grundlage der Sequenz-Homologie zu der Genomsequenz des Organismus von Schritt (c) umfasst das Bestimmen der Nucleinsäuresequenz der Verknüpfung zwischen dem proximalen Ende Genom-DNA und dem Transposon, das ein Reportergen oder Reportergenkomplex enthält.
Verfahren einem der vorgenannten Ansprüche 1, 3, 5, 7 oder 8, bei welchem der Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Prokarioten und Fungi.
Verfahren nach Anspruch 9, bei welchem der Prokariot ein Enterobakterium ist.
Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem das Enterobakterium ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Escherichia und Salmonella.
Verfahren einem der vorgenannten Ansprüche 1, 3, 5, 7 oder 8, bei welchem das Reportergen oder der Reportergenkomplex ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus luxCDABE, lacZ, gfp, cat, galK, inaZ, luc, luxAB, bgaB, nptII, phoA, uidA und xylE.
Verfahren einem der vorgenannten Ansprüche 1, 3, 5, 7 oder 8, bei welchem mindestens 50% der genomischen Nucleotidsequenz bekannt sind.
Verfahren nach Anspruch 2 zum Validieren der Ergebnisse einer umfangreichen Genomanalyse, umfassend die Schritte: (a) Analysieren eines genomweiten Expressionsassays eines mikrobiellen Organismus, behandelt unter einer Bedingung oder mit einer Chemikalie, die von Interesse sind, um Gene mit veränderter Expression zu identifizieren; (b) Auswählen aus einer genomregistrierten Sammlung von Reportergenfusionen solche Reportergenfusionen, die Promotorregionen funktionsfähig verknüpft mit Genen enthalten, die den veränderten Genen aus (a) entsprechen oder Genen, die coreguliert sind mit Genen, die den veränderten Genen aus (a) entsprechen; (c) Prüfen der Expression der Reportergenfusionen, die ausgewählt sind aus (b), unter den Bedingungen oder mit den Chemikalien, die von Interesse sind, die in (a) angewendet wurden, und (d) Vergleichen der Genexpressionsergebnisse von (c) mit dem Genexpressionsergebniss von (a).