KR20020089462A - 변경된 유전자 발현의 확인을 위한 세포 어레이 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전자의 기능 및(또는) 교란 작용 방식에 대한 세포 어레이의 생성 및 용도 또는 다른 게놈 등록 어레이와 조합된 세포 어레이 (어레이들의 어레이)에 관한 것이다. 각각의 세포 어레이는 다수의 미생물 균주로 구성된다. 각각의 균주는 유전자 또는 리포터 유전자와 작동가능하게 연결된 유전자 단편으로 구성된 하나의 리포터 유전자 융합체를 포함한다. 각각의 유전자 또는 유전자 단편은 유기체 게놈의 특정 위치에 "등록" 또는 맵핑되었다. 본 발명의 게놈 등록 집합체를 사용하여 다양한 조건하에서 유전자 발현의 변경을 측정할 수 있다. 상기 집합체는 신속한 분석법에 이용가능하고 DNA 마이크로어레이 기술에서 얻은 데이타를 확인, 정정 또는 발전시키는데 사용될 수 있다.

Description

변경된 유전자 발현의 확인을 위한 세포 어레이 {Cellular Arrays for the Identification of Altered Gene Expression}
DNA 어레이 분석은 유전자 발현에 대해 포괄적으로 게놈 분석을 하기 위한 강력한 방법이다. 현재, 이런 접근법은 박테리아 게놈 유전자 각각의 발현을 한번에 특성화할 수 있는 광범위하게 대등한 분석법으로 이용가능한 유일한 방법이다 [Richmond et al., (1999) Nucleic Acids Res. 27: 3821-3835., 17, 25], [Tao et al., (1999), J. Bacteriol. 181: 6425-6440], [Wilson et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 12833-12838].
최근의 리치몬드 (Richmond)등의 문헌 [(1999) Nucleic Acids Research, 27: 3821-3835]은 대장균을 단일 ORF 수준에 대해 분석하여 게놈 수준의 발현 프로파일에 대해 보고하였다. 열충격 또는 IPTG에 노출시킨 후 RNA 수준에서의 변화를 나일론 매질상에서 개별적 ORF의 포괄적인 저밀도 블롯 및 유리 슬라이드상에 스폿팅된 개별적인 ORF의 고밀도 어레이를 사용하여 분석하였다. 두 방법의 결과를 비교하였다. 리치몬드 등은 방사선 프로브/스폿 블롯이 형광 프로브/마이크로-어레이보다 열등하다고 진술한다. 게다가, 마이크로-어레이로 분석된 RNA는 규정된 배지에서 성장시킨 세포로부터 얻어지지만 스폿 블롯으로 분석된 RNA는 브로스 성장 배양물로부터 얻어지기 때문에 두 방법 사이에서 열충격 처리를 비교하는 것은 근본적으로 결함이 있다. 이런 새로운 방법론의 능력에도 불구하고, 결과의 신뢰성을 제한하는 몇가지 문제가 있다. 예를 들어, 결함은 미생물 RNA를 단리하는 동안 [Tao et al., (1999) J. Bacteriol. 181: 6425-6440] 또는 파라로거스 유전자로의 교차 혼성화로 인해 [Richmond et al., (1999) Nucleic Acids Res. 27: 3821-3835, 17, 25] 할 수 있다.
DNA 어레이 방법론의 다른 한계는 RNA를 단리해서 역전사효소에 의해 DNA로 전환시키면서 동시에 형광 표지를 혼입시켜야 한다는 것이다. 이런 단계가 DNA 어레이 기술을 기초로 간편한 고처리량 스크리닝의 개발을 쉽지 않게 한다. 따라서, DNA 어레이 기술의 결과를 고처리량 스크리닝에 적용하는 방법이 필요하다. 상기 언급된 이유 및 다른 이유로, 별법의 게놈 수준의 발현 프로파일 방법 뿐만 아니라 DNA 어레이 실험의 결과를 독립적으로 신속하게 확인하는 방법이 필요하다.
유전자 융합 기술은 유전자 발현을 모니터링하기 위해 생겨난 방법이다. 예를 들어, 대장균의 SOS (DNA 손상 반응) 레귤론은 케년 (Kenyon) 및 월커 (Walker)[(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 2819-2823]가 이중 가닥 DNA에 삽입되고 공유결합을 형성하는 DNA 손상제인 미토마이신 C (MMC)에 대한 대장균 (Escherichia coli)의 전사 반응을 비교함으로써 최초로 발견되었다. 이들 초기 실험은 lacZYA 오페론이 많은 프로모터 영역의 조절을 받게하는 트랜스포존을 사용하여 대장균 게놈 덩어리를 스캐닝하기 위해 시도되었지만, 전위의 무작위한 특성 및 대부분의 전위 사건의 위치가 알려져 있지 않기 때문에 전체 게놈을 조사한 것인지를 알 수 없었다. 따라서, 추가의 SOS 레귤론 유전자는 이들 초기 실험 이후에 확인되었다 [Lomba et al., (1997) Microbiol Lett 156: 119-122], [Walker, (1996) InEscherichia coliandSalmonella: Cellular and Molecular Biology. ASM Press, pp 1400 1416].
라로사 (LaRossa) (미국 제5,683,868호) 등은 다양한 스트레스 프로모터와 작동가능하게 연결된 luxCDABE로 구성된 구조물을 사용하여 대장균을 형질전환시켰다. 이들은 미생물을 사용하여에탄올, CdCl2및 톨루엔과 같은 다양한 환경 손상제를 검출했다. 손상제가 치사량에 가까운 농도로 존재하는 것은 생물발광 (bioluminescence)의 증가에 의해 지시된다. 그러나, 형질전환된 숙주를 만들기 위해, 스트레스 프로모터를 확인하고 특성화해야 한다. 추가로, 이 방법은 스트레스 반응에 대한 것으로만 제한된다.
애쉬비 (Ashby) 및 라인 (Rine) (미국 제5,569,588호)은 게놈 수준의 염기에서 표적 유기체의 별도의 단리된 세포로부터 리포터 유전자 생성 신호를 검출하여후보 약물에 대한 유기체의 전사 반응을 측정하는 방법을 보고했다. 각 세포는 표적 유기체의 상이한 내인성 전사 조절 성분과 작동가능하게 연결된 리포터 유전자와의 재조합 구조물을 함유한다. 세포에 후보 약물을 처리한 경우, 각 세포로부터의 리포터 신호를 검출함으로써 후보 약물에 대한 유기체의 전사 반응을 측정한다. 그러나, 이런 방법은 표적 유기체의 전사 조절 성분의 대부분이 공지되고 맵핑되어 있는 유기체의 경우에만 유용하다. 추가로, 리포터 신호는 약물 존재하에 세포가 항상성을 유지한 후에만 측정된다. 화학물질에 대한 초기 전사 반응은 고려하지 않는다.
luxCDABE에 융합된 무작위 대장균 게놈 DNA의 Lux-A 집합체를 사용하여 제초제 술포메투론 메틸 처리에 의해 발현이 유도되는 유전자 융합체를 스크리닝했다. 술포메투론 메틸로 유도가능한 유전자 융합체 (smi-lux) 중 19 개의 DNA 서열이 결정되었고, 이를 사용하여 luxCDABE 리포터의 발현을 조절하는 프로모터를 확인하였으며 [Van Dyk et al., (1998) J Bacteriol. 180: 785-792], 나머지 8047 개의 유전자 융합체는 아직 확인되지 않았다.
라로사 (LaRossa) 및 반 디크(Van Dyk) (미국 제6,025,131호)는 조절 영역을박테리아 발광 유전자 복합체에 무작위로 융합시키고, 상기 융합체를 적합한 숙주에서 세포 스트레스를 유발하는 세포 손상제와 접촉시켜 세포 발광의 증가를 통해 세포 스트레스를 검출하는, 제초제 또는 수확 보호 화학물질 등에 의해 유발되는 특정 세포 스트레스에 반응하는 조절 영역의 확인 방법을 개발하였다. 그러나, 이 방법은 액체 배지에서의 교란 (perturbations)으로 제한되었는데, 발광 반응은 화학적 스트레스의 존재하에 밤새 성장시킨 후의 고체 배지에서는 검출할 수 없었기 때문이다. 추가로, 게놈 수준에서는 조절 영역 활성을 분석할 수 없었다.
그러므로 해결해야 할 문제는 초기 전사 반응을 검출할 수 있게 하는 방식으로 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 사용하여 유전자 발현의 변화를 추적하여 측정하는 방법을 제공하고, 다른 방법 (즉, 마이크로어레이)의 결과를 교차확인 할 뿐만 아니라 유전자의 프로모터 및 오페론 구조를 결정하는 방법을 제공하고, 다양한 환경적 및 유전적 변화에 대한 세포 반응을 고처리량 방식으로 시험하는 방법을 추가로 제공하는 것이다.
발명의 요약
리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 사용하기 위한 신규 방법이 개시된다. 숙주 유기체의 게놈 DNA 단편을 프로모터 없는 리포터 유전자와 융합하였다. 제한 효소를 이용한 소화, 게놈 DNA의 물리적인 전단, PCR 및 전위 기술을 사용하여 리포터 유전자 융합체를 생성하였다. 리포터 유전자 복합체는 상동성을 기초로 숙주 게놈에 대해 등록된 게놈이다. 각각의 리포터 유전자 복합체의 유전자 발현을 리포터 유전자 활성으로 측정한다. 본 발명은 다양한 조건하에서의 유전자 발현 프로파일을 게놈 수준에서 고처리량 방식으로 측정하는 방법을 제공한다. 독립형 (stnad-alone)의 고처리량 방법 외에, 본 발명은 또한 DNA 마이크로어레이와 같은 다른 게놈 수준의 분석결과를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 특정 손상제 (관심 조건 또는 화학물질)에 대한 여러가지 프로모터들의 반응을 확인할 뿐만 아니라 상기 손상제에 반응하는, 아직 공지되지 않은 오페론을 확인하는방법을 제공한다. 이러한 방법을 사용하면, 어떤 한가지 변수에 대해 상이한 2 가지 샘플의 유전자 발현 패턴을 비교할 수도 있다. 본 발명은 또한 유전자 기능 및 화학적 작용 방식에 대한 이해와 관련된 정보를 제공하는 유전자 발현 프로파일을 생성하여 어레이들의 어레이를 사용하는 방법을 제공한다. 이런 정보는 기능의 손실, 유전자 생성물의 수준 감소 또는 유전자 생성물의 과다발현을 초래하는 유전자 변경을 분석함으로써 수득될 수 있다. 따라서, 어레이들의 어레이를 사용하여 작용 방식의 연구 및 기능적인 게놈학 모두를 진전시킬 수 있다.
본 발명을 통해, Lux-A 집합체 구성원 대부분의 서열 분석 및 게놈 등록이 완결되었다. Lux-A 집합체 중의 Lux 융합체는 프로모터 없는 luxCDABE 유전자에 융합된 대장균 게놈 DNA의 단편이었다. lux 융합체의 게놈 등록 집합체를 생물발광에서의 변화를 통해 측정되는 생물학적 반응에 대해 조사하였다. 본 발명은 다양한 조건하에서 유전자 발현 프로파일의 변화를 측정하는 수단을 제공한다.
본 발명은 독립형의 고처리량 방법 외에도 마이크로어레이와 같은 다른 게놈 수준의 분석으로부터 발생하는 가양성을 확인하거나 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 특정 손상제에 대한 여러가지 프로모터의 반응을 확인할 뿐만 아니라 상기 손상제에 반응하는, 아직 공지되지 않은 수많은 오페론을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 어떤 한가지 변수에 대해 상이한 2 가지 샘플의 유전자 발현 패턴을 비교하는 방법을 제공한다. 이러한 변수로는 유전자형, 배지, 온도, 영양성분의 고갈 또는 첨가, 억제제의 첨가, 물리적인 공격, 생물학적 공격, 조사(照射),가열, 냉각, 승압 또는 감압, 건조, 낮거나 높은 이온 강도 및 성장기 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 유전자 기능 및 화학적 작용 방식에 대한 이해와 관련된 정보를 제공하는 유전자 발현 프로파일을 생성시킴으로써 "어레이들의 어레이"를 사용하는 방법을 제공한다. 이런 정보는 기능의 상실, 유전자 생성물의 감소 또는 유전자 생성물의 과다발현을 초래하는 유전자 변경을 분석함으로써 수득될 수 있다. 따라서, 어레이들의 어레이를 사용하여 작용 방식의 연구 및 기능적인 게놈학 모두를 진전시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은
(a) 게놈 수준의 게놈 등록 집합체 둘 이상을 조립하는 단계,
(b) 하나 이상의 교란물로 상기 (a)의 각 집합체를 교란시키는 단계,
(c) 각 집합체에서 상기 (b)의 각 교란에 대한 반응을 측정하는 단계,
(d) 상기 하나 이상의 교란 결과를 분석하여 둘 이상의 게놈 등록 집합체 사이의 유전적 차이를 확인하는 단계
를 포함하는, 둘 이상의 게놈 등록 집합체 사이에서 변경된 유전자 발현을 확인하는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은
(a) 1) 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 게놈 단편 및 2) 상기 1)에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 포함하는 유전자 융합체 세트를 생성하는 단계,
(b) 단계 (a)에서의 리포터 유전자 융합체를 숙주 유기체에 시험관내 도입하는 단계,
(c) 상기 유기체의 게놈 서열에 대한 서열 상동성을 기초로 리포터 유전자 융합체를 등록하는 단계, 및
(d) 상기 리포터 유전자 융합체가 상기 유기체의 공지된 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 될 때까지 단계 (a), (b) 및(또는) (c)를 반복하는 단계
를 포함하는, 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 생성하는 방법을 제공한다.
유사하게, 본 발명은
(a) 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 DNA로부터 핵산 단편을 무작위로 생성시키는 단계,
(b) 상기 (a)에서 생성된 무작위 핵산 단편을 프로모터 없는 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 함유하는 벡터에 작동가능하게 연결시키는 단계,
(c) 상기 유전자 융합체를 함유하는 벡터 (b)를 숙주 유기체에 도입하는 단계,
(d) 상기 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체와 관련된 무작위 핵산 단편의 원위 말단 및 근위 말단의 핵산 서열을 결정하는 단계,
(e) 상기 숙주 유기체의 게놈 서열에 대한 서열 상동성을 기초로 단계 (d)에서 서열 결정된 융합체를 등록하는 단계, 및
(f) 상기 리포터 유전자 융합체가 상기 유기체의 공지된 게놈 뉴클레오티드서열의 15％ 이상이 될 때까지 단계 (a), (b) 및(또는) (c)를 반복하는 단계
를 포함하는, 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 생성하는 방법을 제공한다. 무작위 핵산 단편의 생성 단계에는 제한 효소 소화, 게놈의 물리적인 전단 및 중합효소 연쇄 반응을 도입할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) 각각이 프로모터 없는 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 함유하는 트랜스포존 하나 이상을 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 게놈에 도입하는 단계,
(b) 게놈 DNA의 근위 말단과 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 함유하는 트랜스포존 사이에 있는 접합부의 핵산 서열을 결정하고, 상기 리포터 유전자 융합체를 상기 유기체의 게놈 서열에 대해 등록하는 단계, 및
(c) 상기 리포터 유전자 융합체가 상기 유기체의 공지된 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 될 때까지 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계
를 포함하는, 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 생성하는 방법을 제공한다.
별법으로, 본 발명은
(a) 유도 조건 및 비유도 조건하에서 유기체의 유전자 발현 프로파일을 수득하여, 유도된 유전자를 확인하는 단계,
(b) 상기 (a)의 유기체의 게놈에 등록되어 있는 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 제공하는 단계,
(c) 상기 (b)의 리포터 유전자 융합체 중 상기 (a)에서 유도된 유전자에 상응하는 융합체를 선택하여 게놈 등록 집합체의 서브세트를 형성하는 단계,
(d) 상기 (c)의 게놈 등록 집합체의 서브세트를 상기 (a)의 유도 조건에 접촉시켜, 상기 (a)에서와 유사한 방식으로 발현이 변경된 대표적인 리포터 유전자 융합체 하나 이상을 확인하는 단계, 및
(e) 상기 (d)의 대표적인 리포터 유전자 융합체 하나 이상을 다수의 상이한 유도 조건에 고처리량 방식으로 접촉시켜 상기 리포터 유전자 융합체에 대한 유도 조건의 프로파일을 확인하는 단계
를 포함하는, 리포터 유전자 융합체의 유도 조건 프로파일을 확인하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 게놈을 제공하는 단계,
(b) 상기 (a)의 게놈 중 특정한 공지 영역에 대해 상동성을 갖는 일련의 증폭 프라이머를 제공하는 단계,
(c) 상기 (b)의 프라이머를 사용하여 상기 (a)의 게놈의 일부를 증폭시켜 핵산 증폭 생성물의 집합체를 형성하는 단계,
(d) 상기 (c)의 증폭 생성물을 프로모터 없는 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 함유하는 벡터에 작동가능하게 연결하는 단계,
(e) 상기 리포터 유전자 융합체를 상기 유기체에 도입하는 단계, 및
(f) 리포터 유전자 융합체가 상기 유기체의 공지된 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 될 때까지 단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 단계
를 포함하는, 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 생성하는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) 유사유전형 균주의 유전자형과 관련된 관심 유전자형을 사용하여 미생물 배양물의 게놈 수준 유전자 발현 분석결과를 분석하여 대립유전자에 따라 발현이 상이해지는 유전자를 확인하는 단계,
(b) 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체로부터 상기 (a)에서 발현이 변경된 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 영역을 함유하는 상응하는 리포터 유전자 융합체를 선택하거나 또는 상기 (a)에서 발현이 변경된 것으로 나타난 유전자와 동시 조절되는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 영역을 함유하는 동시 조절되는 리포터 유전자 융합체를 선택하는 단계,
(c) 상기 리포터 유전자 융합체를 유사유전형 균주에 도입하여, 상기 (b)로부터 선택된 리포터 유전자 융합체의 발현을 시험하는 단계,
(d) 상기 (c)에서 시험한 2 개의 균주에서 상이하게 발현되는 대표적인 리포터 유전자 융합체 하나 이상을 선택하는 단계, 및
(e) 고처리량 스크리닝으로 상기 리포터 유전자 융합체를 사용하여 융합체의 발현을 변경시키는 다른 화학물질 또는 유전자를 찾는 단계
를 포함하는, 고처리량 분석결과를 기초로 유전자 발현을 분석하는 방법을제공한다.
유사하게, 본 발명의 목적은
(a) 관심 조건 또는 관심 화학물질로 처리한 유기체의 게놈 수준의 유전자 발현 분석결과를 분석하여, 발현이 변경된 유전자를 확인하는 단계,
(b) 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체로부터 상기 (a)의 변경된 유전자에 상응하는 유전자 또는 상기 (a)의 변경된 유전자에 상응하는 유전자와 동시 조절되는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 영역을 함유하는 리포터 유전자 융합체를 선택하는 단계,
(c) 상기 (b)에서 선택된 리포터 유전자 융합체의 발현을 상기 (a)에서 사용한 관심 조건 또는 관심 화학물질로 시험하는 단계, 및
(d) (c)의 유전자 발현 결과를 (a)의 유전자 발현 결과와 비교하는 단계
를 포함하는, 포괄적인 게놈 분석 결과를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
추가로, 본 발명은
(a) 가능한 오페론 영역에 맵핑되어 있는 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체로부터 리포터 유전자 융합체의 서브세트를 선택하는 단계,
(b) 상기 서브세트를 리포터 유전자 기능에 대해 분석하는 단계, 및
(c) 리포터 유전자의 기능에 대한 정량 결과를 기초로, 추정되는 오페론 구조를 결정하는 단계
를 포함하는, 오페론 구조를 결정하는 방법을 제공한다.
별법으로, 본 발명은
(a) 1) 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 게놈 단편 및 2) 상기 1)에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 포함하는 유전자 융합체 세트를 생성하는 단계,
(b) 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체로부터 공지되거나 짐작되는 프로모터 영역을 15％ 이상 대표하는 상기 (a) 세트로부터 각각이 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체에 작동가능하게 연결된 공지되거나 짐작되는 프로모터 영역을 함유하는, 리포터 유전자 융합체의 중복되지 않는 서브세트를 선택하는 단계, 및
(c) 상기 (b)의 리포터 유전자 융합체의 중복되지 않는 서브세트를 어레이 포맷으로 고정시키는 단계
를 포함하는, 리포터 유전자 융합체를 함유하는 세포 어레이를 제조하는 방법을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 각각이 1) 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 게놈 단편 및 2) 상기 1)에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 포함하는 리포터 유전자 융합체를 포함하며, 하나 이상의 세포 어레이가 대조군 어레이이고 하나 이상의 세포 어레이가 실험 어레이인 2 개 이상의 동일한 세포 어레이를 제조하는 단계,
(b) 상기 (a)의 실험 어레이를 교란 조건과 접촉시키는 단계, 및
(c) 대조군 어레이와 실험 어레이의 유전자 발현 활성의 차이를 비교하여,상기 교란 조건에 대한 유전자 발현 반응을 측정하는 단계
를 포함하는, 교란에 대한 유전자 발현 반응을 측정하는 방법을 제공한다.
본 방법에 사용할 수 있는 유기체로는 원핵생물 및 진균 및 특정 장내 박테리아 등이 있다.
본 방법에 유용한 리포터로는 luxCDABE, lacZ, gfp, cat, galK, inaZ, luc, luxAB, bgaB, nptII, phoA, uidA 및 xylE 등이 있다.
본 출원은 2000년 4월 14일 출원된 미국 가출원 제60/197,348호의 잇점을 청구한다.
본 발명은 박테리아 유전자 발현 분야에서의 발명이다. 더 구체적으로, 본 발명은 게놈 등록 유전자 융합 집합체를 사용하여 게놈 수준 (scale)에서 전사 변화를 모니터링하는 방법을 기재한다.
도 1은 Lux-A 집합체에서 lac 오페론에 대한 융합체의 도표이다. 화살표가 있는 경우, 화살표 머리의 방향은 클로닝된 염색체 절편의 DNA가 직접 (화살표 머리가 우측으로 향함) 유전자를 발현시키거나 또는 상보적인 (화살표 머리가 좌측으로 향함) 가닥의 유전자를 발현시키는 프로모터로 배열되어 있는지를 지시한다.
도 2는 다양한 농도의 MMC로 처리된 yebF-luxCDABE 융합체를 함유하는 대장균 균주 DPD3232에서 증가된 생물발광 유도의 동역학을 나타낸 것이다.
도 3 (A 내지 C)은 고상 성장 동안의 Luxarray 0.5 발광을 나타낸 것이다. 도 3A는 마이크로플레이트 발광 측정기를 맞추기 위한, 96 웰 공간 중 복제된 세포의 위치를 나타낸 것이다. 좌측의 백색 광은 12 개 스폿 각각의 복제물을 나타낸다. 같은 플레이트에서의 생물발광 화상은 우측에 나타냈다. 도 3B는 각 클론에서 수집된 신호를 시간의 함수로 나타낸 것이다. 각각의 사이클은 약 20 분이었다. 도 3C는 동일한 클론의 8 개 복제물로부터 수집된 신호를 나타낸 것이다.
도 4 (A 내지 D)는 날리딕스산 (NA)을 사용한 Luxarray 0.5 교란을 일반적으로 나타낸 것이다. 도 4A는 모(母) 플라스미드 및 2 개의 비-반응 리포터, osmY 및 lacZYA를 함유하는 균주로부터의 결과를 나타내고, 도 4B는 3 개의 DNA 손상 반응 리포터, uvrS, recA, dinG로부터의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 날리딕스산을 사용한 고밀도 Luxarray 0.5 교란을 나타낸 것이다. 정사각형은 날리딕스산을 처리한 배양물에서의 리포터 유전자 반응을 나타내고, 원은 처리하지 않은 배양물에서의 리포터 유전자 활성을 나타낸다.
도 6은 Luxarray 1.0 클론을 선택하기 위해 제공된 선택 기준을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 7은 LB 배지에서 14 시간 성장시킨 후에 냉각 CCD 어레이 카메라 (플루오르켐 (FluorChem) 8000, 알파이노테크 (AlphaInnotech))에 의해 Luxarray 1.0 리포터에서 포착된 생물발광을 나타낸 것이다.
도 8은 대장균의 형질 I 세포외 다당류에 대한 20 개 유전자의 유전자 클러스터에서 예견된 프로모터 및 형질 I 세포외 다당류의 생성을 코딩하는 영역의 luxCDABE 유전자 융합체의 프로모터 활성을 나타낸 것이다. 상기 영역의 대장균 유전자는 화살표의 상단 세트로 나타냈다. 위쪽의 행은 토대가 되는 2 개의 문헌 [P, Blattner et al., (1997) Science 277: 1453-1462], [P, Thieffry et al. (1998) Bioinformatics 14: 391-400]에 기재된 바와 같이 예견된 프로모터 영역이다. 본원에 나타낸 DNA 어레이 및 유전자 융합 데이타에 의해 지지된 2 개의 프로모터는 볼드체로 나타냈다. 각각의 유전자의 b 명칭 및 학명을 나타낸다. 마이크로어레이 방법으로 측정한 rpoC 돌연변이 균주에서 감소된 mRNA 농도와 rpoC+ 균주에서 감소된 mRNA 농도의 비를 다음 행에 나타냈다. 영역에서 선택된 luxCDABE 유전자 융합체의 염색체 삽입의 맵핑된 위치는 두꺼운 화살표의 두번째 세트로 나타냈다. 하기는 rpoC+ 대장균 숙주 균주 및 rpoC 돌연변이를 보유하는 숙주 균주에서 각각의 플라스미드에 대한 lux 클론 확인 개수 및 생물발광 데이타 (RLU/109 cfu)이다. 유전자 융합체가 중복되는 경우, 더 짧은 융합체를 먼저 표시했다.
도 9 (A 내지 D)는 lexA+ 숙주 (도 9A)에서 날리딕스산 (NA)에 의한 프로모터 b1728의 유도와 lexind 숙주 (도 9C)의 프로모터와의 비교 및 lexA+ 숙주 (도 9B)에서 미토마이신 C (MC)에 의한 프로모터 b1728의 유도와 lexind 숙주 (도 9D)의 프로모터와의 비교를 일반적으로 나타낸 것이다.
도 10은 리모넨에 의해 상향조절된 uhpT-lux를 나타낸 것이다.
본 발명은 본 출원의 일부를 구성하는 하기의 상세한 설명 및 이후의 설명으로 더 완전히 이해할 수 있다.
본 발명은 유전자 기능 및(또는) 교란의 작용 방법을 결정하기 위한 세포 어레이 또는 다른 게놈 등록 어레이 (어레이들의 어레이)와의 조합의 세포 어레이의 생성 및 용도에 관한 것이다. 각각의 세포 어레이는 다수의 미생물 균주로 구성된다. 각 균주는 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 유전자 또는 유전자 단편으로 구성된 하나의 리포터 유전자 융합체를 포함한다. 각각의 유전자 또는 유전자 단편은 유기체의 게놈에서 특정 위치로 "등록" 또는 맵핑되었다. 본 발명의 세포 어레이는 유기체의 게놈이 15％ 이상 분석된 리포터 유전자 융합체를 함유하는 것이다. 상기 리포터 유전자 융합체를 함유하는 세포 어레이를 본원에서 "등록 집합체"라 부른다.
본 발명의 게놈 등록 집합체는 다양한 조건하에서 유전자 발현의 변경을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 집합체는 빠른 분석법에 쓰일 수 있고 DNA 마이크로어레이 기술에 의해 생성된 데이타를 확인하고, 정정하고 증대시키는데 사용될 수 있다.
본 명세서에는, 다수의 용어 및 약어가 사용된다. 하기 정의가 제공된다.
"오픈리딩프레임"은 ORF라는 약어를 사용한다. 용어 "ORF"는 단백질을 구체화하는 유전자를 나타낸다.
"중합효소 연쇄 반응"은 PCR이라는 약어를 사용한다.
본원에 사용된 바와 같이, "단리된 핵산 단편"은 합성된, 인공적인 또는 변경된 핵산 염기를 임의로 함유하는 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 DNA의 중합체이다. DNA의 중합체 형태에서 단리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 절편을 포함할 수 있다.
"세포 어레이"는 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체와 융합된 염색체단편에서 서로 상이한 균주의 세트를 의미한다.
용어 "어레이들의 어레이"는 세포 어레이의 집합을 나타내는데, 이 때 각각의 개별적인 세포 어레이는 특정 유도 조건 또는 조건의 세트에 반응하는 리포터 유전자 융합체를 함유한다.
용어 "전반적인 수준" 또는 "게놈 수준"은, 리포터 유전자 융합체에 적용하는 경우 유기체의 전사 단위의 최소 15％ 표현을 나타낸다. 예를 들어, 대장균 (레귤론 DB 데이타베이스 v. 3.0, http://www.cifn.unam.mx/Computational_Biology /E.coli-predictions/)에서 2328 개 전사 단위 (t.u.s)가 있음이 예상된다. 따라서, 329 개 t.u.s (2328 개의 15％)를 표현하는 유일한 융합체의 세트가 "전반적인 수준"에 있다. 용어 "전반적인 수준" 또는 "게놈 수준"은, 돌연변이 또는 과다발현하는 경우 유기체의 오픈리딩프레임의 최소 15％ 표현을 나타낸다.
용어 "게놈 등록"은 게놈 내에 정의된 핵산 서열을 정확하게 위치를 정하거나 맵핑하는 방법을 나타낸다.
용어 "게놈 등록 집합체"는 리포터 유전자 융합체, 유전자 기능 상실 돌연변이, 유전자 기능 변경 돌연변이 또는 유기체의 게놈 핵산 서열의 상동성에 의해 "등록" 또는 맵핑된 과다발현 유전자를 함유하는 균주의 세트를 나타낸다. 이 게놈 등록 집합체는 모든 공지된 또는 예상된 프로모터 영역의 15％ 이상, 더 바람직하게는 20％ 이상, 가장 바람직하게는 50％ 이상의 리포터 유전자 융합체; 모든 공지된 또는 예상된 ORF의 15％ 이상, 더 바람직하게는 20％ 이상, 가장 바람직하게는 50％ 이상의 유전자 기능 상실 돌연변이; 모든 공지된 또는 예상된 ORF의 15％ 이상, 더 바람직하게는 20％ 이상, 가장 바람직하게는 50％ 이상의 유전자 기능 변경 돌연변이 또는 모든 공지된 또는 예상된 ORF의 15％ 이상, 더 바람직하게는 20％ 이상, 가장 바람직하게는 50％ 이상의 과다발현을 포함한다.
게놈의 문맥내에서 유전자 또는 ORG에 적용된 본원에 사용된 용어 "공지된"은 유전자 또는 ORF의 서열이 공지되고 유전자 또는 ORF 기능에 대한 지식에 제한이 없음을 의미한다.
용어 "리포터 유전자 융합체"는 다른 부분에서 개시된 전사 및(또는) 번역을 검출하는데 유용한 유전자 또는 유전자들의 일부분으로 구성된 키메라 유전자를 나타낸다.
용어 "리포터 유전자 복합체"는 함께 있는 것이 측정가능한 신호를 발생시키는데 유용한 2 개 이상의 임의의 세트를 나타낸다.
용어 "리포터 유전자 활성" 또는 "리포터 구조물 활성"은 리포터 시스템과 관련된 측정가능한 신호를 초래하는 용도에서 리포터 시스템 제한 성분(들)의 축적을 나타낸다. 측정된 활성은 드 노보 생성, 분해 또는 비활성을 진행 및(또는) 제한 성분의 활성의 합계 결과이다.
용어 "Lux-A 집합체"는 플라스미드-생성 luxCDABE 융합체를 함유하는 대장균 균주의 특정 세트를 나타낸다.
용어 "lux 융합체" 또는 "luxCDABE 융합체"는 luxCDABE 유전자와 접합된 게놈 서열로 구성된 키메라 유전자를 나타낸다.
용어 "유사유전형 균주"는 단일 돌연변이에 의해 서로 상이한 둘 이상의 균주 또는 오직 한 유전자만이 달라 대립유전자의 작용에 따라 발현이 상이해지는 유전자를 함유하는 균주를 나타낸다.
용어 "DNA 마이크로어레이" 또는 "DNA 칩"은 고밀도 포맷 또는 어레이의 고체 표면상의 게놈 내에서 유전자 군 또는 모든 유전자의 PCR 생성물을 조립하는 것을 의미한다. 어레이 구조물의 일반적인 방법 및 용도는 이용가능하다 ([SchenaM, Shalon D, Davis RW, Brown PO., Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 1995 Oct 20; 270(5235): 467-70] 및 http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html 참조). DNA 마이크로어레이는 상기 유전자 또는 이들의 PCR 생성물을 포함하는 DNA 마이크로어레이와 분석할 샘플에서 제조한 cDNA 프로브와의 혼성화를 동시에 수행하여 많은 유전자들의 유전자 발현 패턴 또는 프로파일을 분석할 수 있게 한다. DNA 마이크로어레이 또는 "칩" 기술은 다수의 유전자의 전사 수준을 동시에 측정가능하게 하여, 게놈 수준에서의 유전자 발현을 조사할 수 있게 한다. 간략히, DNA 마이크로어레이 또는 칩 기술은 규정된 위치에서 고체 표면상의 관심 유전자 또는 오픈리딩프레임에 대한 상보적 DNA의 극미량을 어레이 하는 것을 포함한다. 상기 고체 표면은 일반적으로 유리 슬라이드 또는 막 (나일론 막)이다. DNA 서열은 스폿팅 또는 사진평판술 (http://www. affymetrix.com/ 참조)에 의해 어레이될 수 있다. 비교할 2 개의 샘플로부터 제조된 2 개의 별개의 형광 표지된 프로브 혼합물을 마이크로어레이와 혼성화하고, 이것에 주사 공초점 현미경을 사용한 레이저로 여기시킨 후의 형광을 통해 결합된 프로브의 존재 및 양을 검출하고 레이저 스캐너 및 적절한 여레이 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 정량한다. Cy3 (녹색) 및 Cy5 (적색) 형광 표지는 당업계에서 일상적으로 사용되지만, 다른 유사한 형광 표지가 또한 사용될 수 있다. 2 개의 비교 샘플 사이의 유전자 발현 프로파일 또는 패턴을 수득하고 정량하기 위해, 2 개의 채널 (적색:녹색)에서 신호 사이의 비를 각각의 샘플에서 특정 mRNA의 상대적인 양의 신뢰성 있는 측정에 의해 주어진 Cy5/Cy3 프로브의 상대적인 세기로 계산한다. DNA 마이크로어레이 구조물의 재료는 상업적으로 시판된다 (Affymetrix (Santa Clara CA) Sigma Chemical Company (St. Louis,MO) Genosys (The Woodlands, TX) Clontech (Palo Alto CA) and Corning (Corning NY)). 추가로, 주문한 DNA 마이크로어레이는 어피메트릭스 (Affymetrix), 클론텍 (Clontech) 및 코닝 (Corning)과 같은 상업적인 판매자에 의해 제조될 수 있다.
마이크로어레이 기술을 통해 프로파일된 유전자 발현의 기초는 유전자 발현을 변경시키는 다양한 조건 하에서 유기체를 비교하는 것이다. 단일 집단의 세포는 유전자 발현을 변경시키는 다양한 스트레스에 노출될 수 있다. 별법으로, 세포 환경은 일정하게 유지될 수 있고 유전자형은 변경될 수 있다. 유전자 발현 프로파일의 변경을 초래하는 전형적인 스트레스는 세포 또는 균주의 성장을 변경하는 조건, 돌연변이원에 노출, 항생제, UV 광, 감마선, x-선, 파지, 대식세포, 유기 화학물질, 무기 화학물질, 환경 오염원, 중금속, 온도 변화, pH 변화, 산화 손상을 일으키는 조건, DNA 손상, 혐기 환경, 영양분의 고갈 또는 첨가, 성장 억제제의 첨가 및 건조를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 스트레스를 받지 않은 세포를 사용하여 "대조군" 어레이를 생성하고, 스트레스 받은 세포를 사용하여 "실험", "스트레스성" 또는 "유도" 어레이를 생성한다. 유도 어레이는 "변경 유전자 발현"을 입증하는 어레이이다.
"변경 유전자 발현"은 전사물 또는 번역물의 농도에서 변화를 나타낸다. 유전자가 "상향조절"된 경우, 전사물 또는 번역물의 농도가 증가된다. 유전자가 "하향조절"된 경우, 전사물 또는 번역물의 수준이 감소된다. 유전자 발현이 변경된 조건은 "유도 조건"으로 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 다수의 상이한 조건은 단일 유전자에 동일한 전사 효과를 초래할 수 있다. 따라서, 다수의 유도 조건은 동일한 유전자를 상향조절하거나 하향조절할 것이다. 유사 유도 조건의 이런 수집은 "유도 조건 프로파일"로 공지되어 있다. 유사하게, 세포 어레이 또는 DNA 마이크로 어레이에 대한 참조에서 본원에 사용된 용어 "교란"은 유전자 발현을 변경시키는 환경 또는 유전자형의 임의의 변경이다.
용어 "고밀도" 또는 "포괄적인" 마이크로어레이는 유기체의 개방 해독특의 75％ 이상을 함유하는 고밀도 DNA 마이크로어레이를 나타낸다.
용어 "변경 유전자 발현"은 전사물 또는 번역물 농도에서 변화를 나타낸다. 유전자가 "상향조절"된 경우, 전사물 또는 번역물의 농도는 증가된다. 유전자가 "하향조절"된 경우, 전사물 또는 번역물의 농도가 감소된다.
용어 "발현 프로파일"은 유전자 군의 발현을 나타낸다.
용어 "유전자 발현 프로파일"은 개별 유전자 및 개별 유전자 한 벌의 발현을 나타낸다.
"포괄적인 발현 프로파일"은 게놈에서 유전자의 75％ 이상의 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. "포괄적인 유전자 발현 분석"에서 75％ 초과의 유기체 유전자 발현이 분석되었다.
용어 "-에 상응하는"은 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정된 분자로부터 동일하던지 또는 상이하던지, 유사 또는 상동 서열을 나타내기 위해 본원에서사용한다. 핵산 또는 아미노산 배열은 공간을 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "-에 상응하는"은 서열 유사성을 나타내고, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 염기의 번호를 나타내는 것은 아니다.
용어 "프린트" 또는 "프린팅"은 물리적 접촉 전이 또는 임의의 대부분 기술에 의해 한 장소, 대부분 멀티웰 배양 플레이트로부터 기질 또는 고체 표면으로 하나 이상의 배양물을 전이하는 것을 나타낸다.
용어 "레귤론"은 유사한 조절을 공유하는 오페론의 군을 나타낸다.
용어 "오페론"은 함께 mRNA 생성을 지속시키는 조절자 유전자 생성물에 의해 인식되는 DNA에서 구조 유전자 및 조절 성분을 포함하는 박테리아 유전자 발현 및 조절의 단위를 나타낸다.
용어 "프로브"는 상보적인 단일 가닥 목표 핵산과 염기쌍을 이루어 이중 가닥 분자를 형성할 수 있는 단일 가닥 핵산 분자를 나타낸다.
용어 "유전자형"은 물리적인 외관에서 구별되는 유기체의 유전자 구조를 나타낸다.
용어 "게놈 DNA"는 유기체의 염색체가 보유하는 유전 정보의 단일 완전 세트를 나타낸다.
용어 "전체 RNA"는 유기체로부터 분별되지 않은 RNA를 나타낸다.
용어 "단백질을 특정화하는 RNA" 또는 "단백질을 특정화하는 전사물"은 ORF로부터 유래된 RNA를 나타낸다.
용어 "전위"는 DNA 분자내의 한 부위에서 다른 부위로 전위 인자의 이동을촉매하는 생화학적 반응을 의미한다. 전위는 생체내 또는 시험관내에서 수행할 수 있다.
핵산 분자의 단일 가닥 형태가 적절한 온도 및 용액의 이온 강도 조건 하에서 다른 핵산 분자와 어닐링할 수 있는 경우, 핵산 분자는 다른 핵산 분자, 예를 들어 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA와 "혼성화가능"하다. 혼성화 및 세척 조건은 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)], 특히 그의 11 장 및 표 12.1 (전문이 본원에 참고문헌으로 도입됨)에 잘 공지되어 있고 예시되어 있다. 온도 및 이온 강도 조건은 혼성화의 "엄격함"을 결정한다. 혼성화의 엄격함에 따라 염기 사이에 불일치가 가능할 수 있지만, 혼성화는 2 개의 핵산이 상보 서열을 함유하는 것을 필요로한다. 핵산에 적절한 혼성화 엄격함은 당업계에 공지된 변수인 핵산의 길이 및 상보성 정도에 의존한다. 2 개의 핵산 서열 사이의 유사성 또는 상동성 정도가 커질수록, 이 서열을 갖는 핵산의 혼성화를 위한 Tm 값이 더 커진다. 핵산 혼성화의 상대적인 안정성 (높은 Tm에 상응함)은 하기 순서에 따라 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 100 뉴클레오티드 초과의 길이의 혼성화를 위해, Tm을 계산하는 방정식을 유도하였다 (문헌 [Sambrook et al., supra, 9. 50-9. 51]을 참조). 더 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드와 혼성화하기 위해서는, 불일치되는 위치가 더 중요해지고, 올리고뉴클레오티드의 길이가 그의 특이성을 결정한다 (문헌 [Sambrook et al., supra, 11.7-11.8]을 참조). 게다가, 숙련된 당업자는 프로브의 길이와 같은 인자에 따라온도 및 세척액 염 농도를 조정할 필요가 있음을 알 것이다.
용어 "상보적인"은 서로 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들어, DNA의 경우, 아데노신은 티민과 상보적이고 시토신은 구아닌과 상보적이다. 그러므로, 본 발명은 수반하는 서열 목록뿐만 아니라 유사 핵산 서열에 보고된 바와 같이 완전한 서열에 대해 상보적인 단리된 핵산 단편을 또한 포함한다.
"유전자"는 다른 언급이 없는 한, 선행 조절 서열 (5' 비코딩 서열) 및 후속 코딩 서열 (3' 비코딩 서열)을 포함하는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 나타낸다. 예를 들어, 유전자 융합체에 사용된 "리포터 유전자"는 다른 언급이 없는 한, 조절 (프로모터) 서열을 포함하지 않는다. "천연 유전자"는 자신의 조절 서열과 함께 천연에서 발견되는 유전자를 나타낸다.
용어 "키메라 유전자", "유전자 융합체" 또는 "융합체"는 임의의 비-천연 유전자 또는 2 개 이상의 게놈 또는 천연에서 발견되지 않는 인공 DNA 단편을 포함하는 유전자들을 나타낸다. 그러므로, 키메라 유전자, 유전자 융합체 또는 융합체는 다른 공급원으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열 또는 같은 공급원으로부터 유래되었지만 천연에서 발견되는 것과는 다른 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈에서 그의 본래 위치의 천연 유전자를 나타낸다. "이종" 유전자는 숙주 유기체에서 정상적으로 발견되지 않지만 유전자 전이에 의해 숙주 유기체로 도입된 유전자를 나타낸다. 이종 유전자는 비-천연 유기체에 도입된 천연 유전자 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다."이식유전자"는 형질전환 방법에 의해 게놈으로 도입된 유전자이다.
용어 "코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 나타낸다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류 (5' 비코딩 서열), 내부 또는 하류 (3' 비코딩 서열)에 위치한 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 이는 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성 또는 관련된 코딩 서열의 번역에 영향을 준다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론 및 폴리아데닐화 인식 서열을 포함할 수 있다.
용어 "프로모터"는 RNA 중합효소가 전사를 개시하기 위해 결합할 수 있는 DNA 서열을 나타낸다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 완전히 천연 유전자로부터 얻을 수 있거나 또는 천연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 얻어진 상이한 성분으로 구성될 수 있거나 합성 DNA 절편까지도 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포형에서 또는 발달의 상이한 단계에서, 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자 발현을 지시할 수 있다는 것이 당업계 숙련자에게 공지되어 있다. 대부분의 시기에 대부분의 세포형에서 유전자의 발현을 야기하는 프로모터를 흔히 "구성 프로모터"라 부른다. 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 한정되지 않았기 때문에 다른 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 추가로 인식된다. "프로모터 영역"은 이의 기능이 프로모터 활성을 조절할 수 있는 프로모터 및 인접 영역이다.
"3' 비코딩 서열"은 코딩 서열의 하류에 위치하고 폴리아데닐화 인식 서열 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 조절 신호를 코딩하는 다른 서열을 포함하는 DNA 서열을 나타낸다. 폴리아데닐화 신호는 통상적으로 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙트 (tract)의 첨가에 영향을 주는 것을 특징으로 한다.
"RNA 전사물"은 DNA 서열의 RNA 중합효소-촉매화 전사의 결과인 생성물을 나타낸다. RNA 전사물이 DNA 서열의 완전히 상보적인 카피인 경우, 이를 일차 전사물이라 부르거나 일차 전사물의 후-전사 프로세싱으로부터 유래된 RNA 서열일 수 있고 성숙 RNA로 부른다. "전령 RNA (mRNA)"는 인트론이 없고 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 나타낸다. "cDNA"는 mRNA와 상보적이고 mRNA로부터 유래된 이중 가닥 DNA를 나타낸다. "센스" RNA는 mRNA를 포함하고 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA 전사물을 나타낸다. "안티센스 RNA"는 목표 일차 전사물 또는 mRNA의 전체 또는 일부분에 상보적이고 목표 유전자의 발현을 저해하는 RNA 전사물을 나타낸다 (미국 특허 제5,107,065호). 안티센스 RNA의 상보성은 특이성 유전자 전사물, 즉 5' 비코딩 서열, 3' 비코딩 서열, 인트론 또는 코딩 서열의 임의의 부분으로 있을 수 있다. "기능성 RNA"는 세포 프로세스에 영항을 주지만 번역되지는 않는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA 또는 다른 RNA를 나타낸다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 기능에 영행을 주는 단일 핵산 단편에서 핵산 서열의 회합을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 경우 (즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절하에 있음) 프로모터는 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배열에서 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 본 발명의 핵산 단편으로부터 유래된 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 나타낸다. 발현은 또한 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 나타낼 수 있다.
용어 "형질전환"은 핵산의 도입 후 세포에서 신규 유전자의 획득을 나타낸다.
용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 통상적으로 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태로, 세포의 중심 대사의 일부분이 아닌 유전자를 보유하는 외부 염색체 성분을 나타낸다. 상기 성분은 임의의 공급원으로부터 유래된 자발적인 복제 서열, 게놈 통합된 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형 또는 원형의 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA일 수 있는데, 이 때 다수의 뉴클레오티드 서열은 적절한 3' 비번역 서열과 함께 선택된 유전자 생성물에 대한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 세포로 도입가능한 단일 구조물로 접합되거나 재조합되어 있다. "형질전환 카세트"는 이종 유전자를 함유하고 특정 숙주 세포의 형질전환을 촉진하는 이종 유전자 외의 성분을 갖는 특정 벡터를 나타낸다. "발현 카세트"는 이종 숙주에서 유전자의 발현을 증가시키는 이종 유전자 외의 성분을 갖는 이종 유전자를 함유하는 특정 벡터를 나타낸다.
용어 "제한 엔도뉴클레아제" 또는 "제한 효소"는 이중 가닥 DNA 내의 특정 뉴클레오티드 서열내에서 결합하고 절단하는 효소를 나타낸다.
용어 "생물발광"은 임의의 생유기체로부터 광 방출 현상을 나타낸다.
용어 "상대적인 광 단위"는 "RLU"라는 약어를 사용하고 발광 측정기로 측정되고, 사용된 발광 측정기로 내부 표준 단위에 대해 보정되는 광 방출의 측정을 나타낸다.
용어 "스트레스" 또는 "환경 스트레스"는 환경 손상제에 대한 노출의 결과로서 세포에서 생성되는 조건을 나타낸다.
용어 "손상제" 또는 "환경 손상제"은 박테리아 세포 또는 세포 집단에서 정상적인 세포 대사의 변경을 초래하는 임의의 물질 또는 환경 변화를 나타낸다. 환경 손상제는 화학물질, 환경 오염원, 중금속, 온도 변화, pH 변화 뿐만 아니라 산화 손상을 일으키는 조건, DNA 손상, 혐기 환경, 질산염 이용가능성의 변화 또는 병인을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "스트레스 반응"은 스트레스 단백질의 측정가능한 수준의 유도 또는 다른 손상제에 대한 노출에 더 내성있는 상태를 초래하거나 환경 손상제의 투여량을 증가시키는 세포 반응을 나타낸다.
용어 "스트레스 유전자"는 전사가 환경 스트레스의 결과로서 또는 환경 손상제 존재에 의해 유도된 임의의 유전자를 나타낸다.
용어 "대수 증식기", "대수상 성장", "지수 증식기", 또는 "지수상 성장"은 세포 수의 지수적 증식을 허용하는 조건하에서 유기체 성장의 세포 배양물을 나타낸다.
본원에서 사용한 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 공지되어 있고 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY (1989)], [Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor, NY (1984)] 및 [Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)]에 기재되어 있다.
본 발명에서, 대장균 게놈 단편의 무작위 세트는 대장균 게놈을 제한 효소 Sau3Al로 부분적으로 소화시키고, 크기 분별에 의해 단편으로 분리하여 제조하였다. 평균 크기가 1.8 KB인 분율을 단리시키고 pBR322, 프로모터 없는 luxCDABE 유전자의 상류에 있는 4 개의 전사 터미네이터로부터의 복제 기점 및 bla를 함유하는 플라스미드 pDEW201로 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물을 대장균 XL2Blue 세포로 형질전환시켰다. 생성된 약 24000 개의 형질전환주를 풀링하고 이종 플라스미드 DNA의 공급원 AS를 사용하였다. 상기 플라스미드 DNA 풀을 대장균 DPD 1675 세포를 형질전환하기 위해 사용하였다. 전체 8066 개의 각각의 형질전환주를 단리하고 Lux-A 집합체로 표지하였다. Lux-A 집합체로부터 클론의 시작부 및 말단 서열에 대한 상동성 조사를 완전한 대장균 서열에 대해 수행하였다. 대장균 게놈에 대한 각각의 키메라 유전자 융합체의 위치 및 배열은 계산된 상동성을 기초로 측정되었다. 집합체에 대한 추가의 서열을 더 무작위의 융합체에 의해 또는 융합체 DNA의 배열을 전환시킴으로써 첨가하여 당업계에서 일상적인 방법을 사용하여 도입된 DNA에 대해 정확히 배열된 프로모터 영역을 놓을 수 있다.
대장균이 잘 특성화되어 있고 그의 게놈이 서열 분석되었기 때문에, 본 발명에서는 원핵 유기체가 가장 바람직하다. 다른 바람직한 유기체는 게놈이 서열 분석되었거나 완천히 서열 분석된 게놈을 갖는 유기체이고 이는 형질도입, 형질전환 또는 접합에 의한 유전자 융합체를 도입시킬 수 있다. 이는 2000년 2월 15일 현재 WEB 페이지, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ PMGifs/Genoms/bact.html에 열거된 113 개 유기체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 언급된 유기체 외에, 형질도입, 형질전환 또는 접합에 의해 유전자 융합체의 도입이 가능한 공지된 게놈 서열의 15％ 이상, 바람직하게는 20％ 이상, 가장 바람직하게는 50％ 이상인 임의의 미생물 유기체를 본 발명에서 리포터 유전자 융합체를 제조하기 위해 사용할 수 있다.
리포터 유전자 또는 유전자 복합체에서, luxCDABE가 분석 조건의 민감성 및 단순성에서 가장 바람직하다. 당업계에 잘 공지된 다른 리포터 유전자가 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직한 리포터 유전자는 lacZ, gfp, cat, galK, inaZ, luc, luxAB, bgaB, nptII, phoA, uidA 및 xylE를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
상기 균주로 융합체를 도입하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 융합체는 각각의 특정 유기체에 적절하게 형질도입, 형질전환 또는 접합에 의해 도입될 수 있다. 이는 트랜스포존 (예를 들어, Tn7) 매개 전위를 포함하나 이에 제한되지 않고, 무작위 단편을 벡터 함유 리포터 유전자 구조물과 라이게이션하거나 PCR 생성물을 동일한 벡터와 라이게이션하는 기술에 의해 시험관 내에서 구성될 수 있다. 이는 생체내 전위에 의해 구성될 수 있는데, 이 때 트랜스포존은 형질도입, 형질전환 또는 접합에 의해 도입된다.
게놈 단편의 세트를 생성하는 바람직한 방법은 제한 효소로의 부분 소화, 물리적 전단, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 제한 효소 소화 및 PCR의 조합, 제한 효소 소화 및 물리적 전단의 조합, 물리적 전단 및 PCR의 조합, 및 세가지 모두의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 단편을 생성하는 상기 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어 PCR은 미국 특허 제 4,683,202호 (1987, Mullis, et al.) 및 미국 특허 제4,683,195호 (1986,Mullis, et al.)에 잘 기재되어 있고 제한 효소 소화 및 물리적 전단은 샘브루크 (Sambrook) 등의 상기 문헌에 기재되어 있다.
게다가, 키메라 리포터 유전자 융합체는 또한 게놈 수준에서 전위를 사용하여 제조할 수 있다. 전위를 일으키는 상기 기재된 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
서열 분석 및 게놈 등록한 후에 Lux-A 집합체 구성원의 대다수는 잘 특성화된 조절 회로의 구성원에 대한 luxCDABE 융합체를 함유하는 균주 집합체의 생물학적 반응이 완결되었다. 따라서, lac 오페론에 대한 유전자 융합체 및 열충격, SOS, SoxRS 및 OxyR 레귤론의 구성원은 Lux-A 집합체로부터 선택되었고 전반적인 조절 회로의 각각의 공지된 유도인자에 대한 반응이 측정되었다.
적절한 생물학적 반응은 상기 언급된 각 레귤론을 증명하였다. Lux-A 집합체는 lac 오페론에 대한 luxCDABE의 융합체인 3 개의 구성원을 함유하였다 (도 1). 이 배양물을 글루코스 존재하에 성장시켰고 생물발광을 측정하고 글루코스 부재하에서 성장시킨 배양물과 비교하였다. 글루코스 부재하에 성장시킨 배양물이 글루코스 존재하의 배양물보다 훨씬 더 높은 생물발광을 나타냈다.
12 개 열충격 프로모터 중에서 4 개가 lux 융합체로 발견되었다. 총 6 개의 균주를 함유하는 융합체가 단리되었고 다양한 에탄올 농도에서 스트레스 반응에 대해 시험하였다. Lux-A 집합체의 열충격 레귤론 유전자 융합체는 에탄올에 의한 열충격 반응의 유도로 확인하였다.
SOS 레귤론에서, 7 개 lux 융합체는 Lux-A 집합체로 발견되었다. 이 균주가 DNA 손상 화학물질 날리딕스산으로 시험된 경우, 생물발광 수준의 증가가 관측되었다. 그러나, 에탄올로의 처리는 동일한 배양물에서 생물발광을 유도하지 않았다.
유사한 경향으로, SoxR/S 및 OxyR 레귤론이 Lux-A 집합체에서 완전히 나타나는 것은 아니지만, 생물학적으로 적절한 반응이 관측되었다.
따라서, Lux-A 집합체가 대장균의 각 프로모터에 의해 조절되는 융합체를 포괄적으로 함유하지는 않지만, 그럼에도 불구하고 Lux-A 집합체는 스트레스에 대한 전사 반응의 게놈 수준의 개요를 제공하고 반응을 최적화하는데 적용될 수 있다.
공지된 DNA 손상제인 미토마이신 C (MMC)의 효과는 DNA 마이크로어레이로 시험하였고 생성된 유전자 발현 패턴을 Lux-A 집합체의 처리된 세포로부터 유전자 발현 데이타와 비교하였다. 예상된 바와 같이, 공지된 SOS 유전자의 발현이 마이크로 어레이 데이타에서 증가되었다. 그러나 몇가지 SOS 레귤론 유전자의 발현은 2-배 미만 (표 12)으로 증가되었고 발현이 20％ 이상으로 증가된 792 개 유전자의 큰 군내에 존재하였다. 이들 중 대부분은 실제 생물학적 명백한 반응에 대한 것이기 보다는 어레이 데이타에서의 결함에 의한 것이기 때문에, 발현이 2 배 미만으로 증가하는 군은 MMC 비유도 유전자라 생각되었다. 상기 실험이 다른 공지되지 않은 활성 모드와 함께 화합물을 사용하여 수행되기 때문에, 몇가지 생물학적으로 명백한 유전자 발현 사건은 DNA 마이크로어레이 접근으로 놓칠 수 있다. luxCDABE 유전자 융합체를 보유하는 균주가 예상된 양성의 결과를 산출하는지를 시험하기 위해, 리포터 유전자 융합체의 Lux-A 집합체에 이용가능한 3 개의 유전자 융합체를 미토마이신 C 반응에 대해 시험하였다. 모든 3 가지 경우에, 미토마이신 C는 생물발광의 증가를 유도하였다. 따라서, 이는 DNA 마이크로어레이로부터의 음성의 결과가 상응하는 유전자 융합체의 양성의 결과와 모순됨으로써 제기될 수 있는 의문을 설명한다.
미토마이신 C로 상향조절되는 것으로 사전에 공지되지 않은 유전자는 DNA 어레이 및 유전자 융합체 실험 데이타의 상관성을 추가로 조사하기 위한 기회를 제공한다. 이 유전자의 클래스에서, 4 개의 융합체는 리포터 유전자 융합체의 Lux-A 집합체에서 이용가능하였다. 상기 4 개의 유전자에 상응하는 luxCDABE 융합체는 MMC에 의해 유도된 유전자 발현이 증가되었다는 증거를 제공하지 않는다. 따라서, 어레이로부터 양성의 결과는 가양성으로 분류된다.
유전자 융합체의 Lux-A 집합체 중 하나의 유전자 융합체는 반전되는 경우 DNA 마이크로어레이 실험에서 미토마이신 C에 의해 상향조절되는 것으로 관측된 유전자 yebF에 대한 융합체를 형성하는 게놈 단편을 갖는 것으로 밝혀졌다. 게놈 DNA 단편이 방출되고 벡터로 도입되는 경우, DNA의 반전이 발생되는 것을 강하게 제안하는, 몇 개의 형질전환된 콜로니로부터 생물발광이 다른 DNA 손상제인 날리딕스산에 의해 강하게 유도되는 것으로 밝혀졌다. 추가로, MMC에 의한 생물발광의 유도는 도 2에 나타낸바와 같이 입증되었다.
yebF-lux 융합체로부터의 증가된 유전자 발현 유도가 DNA 어레이 연구의 데이타를 확인할 뿐 아니라, 추가로 손쉬운 투여 반응 및 동역학 분석을 가능하게하고 고처리량 스크리닝의 바이오센서 균주를 제공한다. yebF-lux 융합체에 의해 보고된 DNA 손상 반응은 yebF의 상류인, yebG의 LexA 박스 상류가 존재하기 때문에 [Lomba et al., (1997) FEMS Microbiol Lett 156: 119-122] 잘 특성화된 SOS 반응에 의해 매개될 수 있다. 그러나, yebF 유전자의 전사를 유도하는 프로모터가 존재함 [Blattner et al., (1997) Science 277: 1453-1462]을 또한 제안할 수 있고, 그러므로 MMC에 의한 yebF 발현의 유도는 예상되지 않았다. 따라서, 이 결과는 사전에 공지되지 않은 유전자 발현 사건이 DNA 마이크로어레이로 발견될 수 있다는 개념을 입증하였고, 상응하는 lux 유전자 융합체가 결과를 확인하고 확장하는데 사용될 수 있다는 것을 입증하였다. 게다가, 상기 lux 융합체 균주는 유전자 발현 변화에 기초한 고처리량 스크리닝의 기초를 형성할 수 있다.
실시예 3에 언급된 yebF-luxCDABE 유전자 융합체는 DNA 손상을 일으키는 MMC 및 날리딕스산 이외의 화합물에 대해 고처리량 스크리닝으로 사용될 수 있다. luxCDABE 생물발광 리포터 융합체의 사용은 세포 용해 또는 효소 기질의 첨가를 필요로하지 않는 방법으로 손쉽게 리포터 유전자 활성을 검출할 수 있게 한다. 따라서, 고처리량 스크리닝의 개발은 광 생성을 정량하는 장치 (상업적으로 시판되는 것이 다수 있음) 및 선택의 유전자 융합체를 함유하는 박테리아 세포 배양물의 공급원만을 필요로한다. 상기 박테리아 세포 배양물은 몇가지 방법에 의해 공급될 수 있다. 유전자 융합체를 함유하는 박테리아 균주를 사용하는 기본적인 방법은 새로 성장시킨 박테리아 세포 배양물을 사용하는 것이 간단하다. 매일 배양하는 것의 대안은 동결 배양 분액, 예를 들어 글리세롤 (Sticher et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 4053-4060)과 같은 동결방지제를 사용하여 -80℃에서 이미 저장되어 있는 것을 녹인 후 즉시 유전자 발현 분석에 대해 수용능력있는 대장균 생물발광 센서를 사용하여 성공적으로 입증되었다. 박테리아를 다루는 다른 두가지 통상적인 방법, 동결건조 및 연속적인 배양은 또한 용도를 시험하기 위한 lux 융합체 균주의 유용한 공급원을 제공한다. 동결 건조는 문헌[Corbisier et al., (1996) Environ. Toxicol. Water Qual. 11: 171-177], [Tauriainen et al., (1998) Biosensors ＆ Bioelectronics 13: 931-938], [Tauriainen et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 4456-4461]; [Van Dyk and Wagner (1998) U.S. 5,731,163], [Wagner and Van Dyk (1998), Methods in Molecular Biology: Bioluminescence Methods and Protocols, vol. 102. Humana Press Inc p. 123-127]에 기재된 바와 같이 금속 반응 및 열충격 반응 세포 바이오센서 균주에 성공적으로 적용되었다. 작은 생물 반응기에서 대장균 생물발광 바이오센서의 연속적인 배양은 문헌 [Gu et al., (1996), Biotechnol. Prog. 12: 393-397], [Gu et al., (1999) Biosens. Bioelectron. 14: 355-361]에 기재된 바와 같이 스트레스 반응의 재현가능한 검출을 수득하는 것으로 나타났다.
고처리량 스크리닝을 위한 세포 바이오센서를 공급하기 위한 다른 가능한 방법은 담체 물질의 포착 및 생물발광 바이오리포터 통합 회로 (BBIC)의 사용에 의해 고정된다. 박테리아 균주를 함유하는 lux 융합체의 알긴산 스트론튬 고정은 폐기물 흐름에 대한 프로브 [Heitzer et al., (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 1487-1494], [Matrubutham et al., (1997) Appl. Microbiol. Biotechnol. 47: 604-609], [Webb et al, (1997) Biotechnol. Bioeng. 54: 491-502]를 사용하여 입증하였다. 고정의 다른 예는, SOS 반응 lux 융합체 균주를 번식하고, 4℃의 CaC12용액중에서 저장되는 알긴산 칼슘 비드가 형성 후 한달 이하 동안 유용한 DNA 손상 유도 반응을 제공하는 것으로 알려져있다 [Davidov et al., in press]. 마찬가지로, 구리-반응 바이오센서의 알긴산 칼슘 고정은 아가로스의 동일한 바이오센서의 고정에 비해 우수한 바이오센서 안정성을 나타낸다 [de Lorenzo et al., (1999) Anal. Chim. Acta 387: 235-244]. 게다가, 고정된 세포의 조합 및 광 검출 장비는 신호로서 가시광선을 생성하는 센서로 가능하다. 이런 경우, 대장균 luc 융합체 균주는 광학 섬유 모니터링 장치 [Ikariyama et al., (1997) Anal. Chem. 69: 2600-2605]의 말단에 고정된다. 마지막으로, 5 개 유전자 luxCDABE 리포터에 의해 생성된 세포 신호의 이점을 갖는 BBIC 접근에서, 생물발광 바이오센서 균주는 통합 회로 내에 제작된 마이크로-발광 측정기에 침착되고; 바이오센서에 의해 생성된 광은 통합 회로에 의해 검출되고, 이 때 결과를 프로세싱하고 전달한다 [Simpson et al., (1998) Soc. Opt. Eng. 3328 (Smart Electronics and MEMS): 202-212]; [Simpson et al., (1998) TIBTECH 16: 332-338].
그러므로, 신규 개발된 yebF-luxCDABE 융합체에 기초한 DNA 손상 반응 고처리량 스크리닝의 개발을 상기 공지된 방법 중 하나를 선택하여 쉽게 달성하여 활성 세포 바이오센서 및 필요한 경우 가시광선 생성을 측정하는 장치와의 조합을 제공한다. 스트레스 반응 유전자의 다른 프로모터는 lux 융합체를 사용하는 고처리량 스크리닝을 생성하는데 사용될 수 있다. 원핵 세포 및 진핵 세포 둘다의 스트레스 반응 유전자 프로모터가 사용될 수 있지만, 박테리아의 프로모터가 바람직하고 대장균의 프로모터가 가장 바람직하다. 적합한 스트레스 반응 유전자 프로모터는 하기 표 1에 주어진 표제 "반응 유전자"의 유전자 목록 및 신규 발견된 조절 회로로부터 선택되나 이에 제한되지 않는다.
lux 리포터 유전자에 대한 융합체는 또한 오페론 구조, 신규 개발된 조절 회로 및 프로모터 부위의 확인을 입증하기 위해 사용될 수 있다. 대장균 게놈 DNA의 무작위 라이브러리가 프로모터 없는 lux 유전자와 융합되었기 때문에, 융합체를 생성할 때 생물발광의 세기는 대장균의 프로모터에 의존해야 한다. 예를 들어, 융합체가 완전한 프로모터를 함유한 경우, lux 유전자 발현은 동일 프로모터의 일부 영역을 함유하는 융합체보다 강하다. 프로모터가 비-기능성인 위치에서 말단이 절단 (truncate)된 경우, lux 유전자 발현이 없었다. 이런 결과는 숙주에서 예상된 오페론 구조 및 프로모터 기능의 의존성을 입증할 수 있다 (실시예 4).
플라스미드 pDEW201에서 대장균 게놈 단편의 무작위 라이브러리의 구조 및 서열은 프로모터 활성 리포터 구조물의 게놈 등록 세트를 생성하였다. 매우 병렬인 고상 세포 분석법은 생물정보학 분석 및 어레이 및 고처리량 배양 생성물의 로봇 제조를 조합함으로써 상기 리포터의 서브세트를 사용하여 개발되었다. 상기 분석법은 표준 로봇 도구를 사용할 용량을 가지고 있어서, 복제물에서 전체 미생물 게놈 또는 별법으로 동일 어레이상의 다른 미생물의 전체 게놈의 프로모터 활성을 모니터링한다. 상기 분석법의 결과는 그레이스케일 화상이고 화상 분석을 위한 상업적인 제품 및 DNA 마이크로어레이 기술의 구체적으로 개발된 데이타 분석과 비교할 수 있다.
간단히, 상기 분석법은 리포터 구조물을 함유하는 클론의 중복되지 않는 집합체를 생성하는 것과 관련이있다. 이 세포는 정지기로 성장시키고 로봇으로 다공성 막 상에 고밀도로 출력한다 (예를 들어, 바이오딘 B 넌크 (Biodyne B Nunc)). 임의의 접촉 또는 비접촉 프린트 로봇 (예를 들어, 바이오메크 (Biomek) 2000, 베크만 (Beckman))은 프린팅에 사용될 수 있다. 상기 막은 고체 배지와 가깝게 접촉한다. 본 발명의 중요한 양태는 하나의 표면에서 상이한 배지를 함유하는 다른 표면으로 막을 이동시킬 수 있는 능력이다. 고체 표면에서 세포 성장으로부터 조절 영역 활성의 기능으로 발광을 측정하는 능력은 놀랍고 예상치 못한 것이었다. 이미, 라로사 (LaRossa) 및 반디크 (Van Dyk) (미국 제6,025,131호)는 적합한 숙주에서 리포터 유전자 활성으로 조절 영역의 활성을 검출하는 방법이 액체 배지에서의 세포 성장을 제한한다는 것을 보고했다. 고체 배지에서의 성장은 교란시키기 전에원하는 밀도로 세포를 성장시킨 후, 반응 동역학을 따른다. 실험 프로토콜은 종종 세포사멸 또는 다른 비가역적 효과 때문에 장기간 노출을 금지하는 교란과 관련된다. 전체 어레이를 신규 성장 조건으로 이동할 수 있는 능력은 매우 다양한 실험 계획을 가능하게 하는데, 실험 계획은 펄스 또는 펄스/체이스 노출, 가역성 및 단기간 동역학 연구를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 교란물의 효과는 처리한 배양물 및 대조군 배양물에 의해 발생된 발광의 비교에 의해 결정될 수 있다.
분석 시스템의 몇가지 중요한 특성을 평가하는 것이 필요하였다. 특히, 성장 밀도 및 조건, 민감도, 재생산성 및 리포터를 교란하고 변화를 측절할 수 있는 능력이 주요한 초점이었다.
모델 시스템으로서 대장균에서 DNA 손상을 사용할 때, 상기 분석법은 접근의 어려움을 평가하기 위해 잘 특성화된 클론의 작은 세트로 먼저 개발되었다. 10 개 클론의 세트를 DNA 손상제인 날리딕스산에 대한 반응으로 시험하였다. SOS 레귤론에서 예상된 유전자의 날리딕스산 유도 상향조절은 증가된 생물발광으로 측정되었다 (도 4B). DNA 손상에 반응하지 않는 유전자에 대한 융합체를 함유하는 균주로부터의 생물발광 수준은 날리딕스산 처리에 의해 영향을 받지 않았다 (도 4A).
Luxarray 0.5의 클론 세트는 고밀도 클론을 프린팅하기 위한 매우 병렬인 고상 분석법을 개발하는데 사용되었다. 본 발명은 신호 세기가 후속적으로 정량되는 리포터 구조물의 화상의 수집을 허용한다. 이는 일정한 수집 파라미터 (초점면, 배율, 누적 시간 및 연산) 뿐만 아니라 발생된 화상을 프로세싱할 수 있는 하류 화상 분석을 필요로한다. 본 발명에서 유용한 것 중의 하나인 화학적 교란은 하나의배양 플레이트에서 다른 플레이트로 막을 물리적으로 재배열하는 것이 필요하다. 이는 최소 X-Y 위치 등록을 갖는 화상을 초래한다. 몇가지 상업적으로 시판되는 제품은 상기 화상을 효과적으로 프로세싱할 수 있다. 어레이비전 (ArrayVision) (등록상표) (Imaging Research, Toronto, Canada) 및 이미지퀀트 (ImageQuant) (Molecular Dynamics, Sunnyvale,CA)는 적절한 소프트웨어 패키지의 두가지 예시이다. 냉각 CCD 카메라를 데이타를 포착하기 위해 사용하는 것이 바람직하다.
컴퓨터 필터를 게놈 등록 클론 집합체에 적용하여 게놈 프로모터의 약 28％를 나타내는 리포터 구조물의 중복되지 않는 세트를 생성하였다. 이런 적용범위에서도, 대장균에서 모든 레귤론의 하나 이상의 대표적인 프로모터가 집합체에 존재할 수 있다. 이 큰 세트는 몇가지 프로모터의 반응을 확인하기 위한 DNA 손상 교란 실험에 사용되었다. 발광 측정기로 정량된 저밀도 실험으로 밝혀짐에 따라, 각각의 클론의 예상된 반응이 잘 입증되었다. 5 개의 증명된 DNA 손상 반응 리포터 구조물은 발현의 상향조절을 명확히 나타낸다. 이와는 반대로, lac 프로모터 융합체를 보유하는 균주 뿐만 아니라 다른 프로모터 융합체를 보유하는 몇가지 균주로부터 광 생성이 감소되었다.
본 발명에서 고밀도 세포 어레이 (Lux 어레이 1.0)를 또한 다수의 추정되지만 사전에 공지되지 않은 DNA 손상 반응 오페론을 확인하기 위해 사용하였다. DNA 손상 화학물질인 날리딕스산으로 처리한 경우, 예상되는 프로모터 활성 (즉, SOS 레귤론)외에, 사전에 기재되지 않은 몇가지 프로모터가 유사한 습성을 나타냈다. 본 발명은 고처리량 방법에서 전사 변화를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다 .
본 발명은 또한 염색체 DNA의 배열이 리포터 유전자에 대해 반전되어 관심 프로모터 영역이 리포터 유전자에 작동가능하게 연결되지 않은 것을 제외하고는 유용한 융합체를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 상기 융합체를 선택하고 인서트 DNA의 배열을 반전하는 것은 집합체에 대한 더 작동가능하게 연결된 다수의 융합체를 첨가함으로써 연속적인 집합체의 이용을 충분히 증가시킬 수 있다. 이를 수행하는 간단한 방법은 클론 영역의 외부 및 재라이게이션한 조각을 절단하는 단일 제한 효소로 플라스미드 DNA를 소화시키는 것이다. 상기 방법을 수행하여 플라스미드 혼합물을 얻었지만, 많은 경우에 플라스미드를 함유하지만 다른 가능한 생성물은 없는 세포가 광을 생성하기 때문에 정확히 배열된 플라스미드를 찾을 수 있다. 상기 반전 방법은 또한 Lux-A 집합체에 유전자 융합체를 첨가하기 위해 사용될 수 있다. 광 생성 외의 다른 방법은 인서트의 배열 또는 크기를 확인하기 위해 사용될 수 있다 (특히 PCR).
추가로, 특정 PCR 프라이머는 이용가능한 서열 데이타의 염색체 상의 관심 임의의 영역에 대해 디자인할 수 있다. 대장균에서는 전체 게놈을 이용할 수 있다. 그러므로 공지되고 예견된 프로모터의 위치상 및 방향상 좌표를 이용함으로써, 각 프로모터를 함유하는 PCR 생성물을 생성하기 위해 특정 프라이머를 디자인하였다. 실제 프로모터는 오페론의 첫번째 오픈리딩프레임의 번역 개시 코돈 위치에서 400 개 염기쌍 게놈 단편 말단에 위치하는 것으로 추정되었다. 프라이머 쌍은 "우측" 프라이머가 오페론의 첫번째 오픈리딩프레임의 개시 코돈을 포함하게 되는 각 오페론의 상기 영역으로부터 선택되었다 [Primer3, Rozen and Skaletsky(1996, 1997, 1998]. 코드는 (http://www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/ primer3.html)에서 이용가능하다. 수용가능한 PCR 프라이머 쌍은 최적 융점, Tm이 68℃인 기본 프라이머 3 파라미터를 사용하여 오페론의 80％로 확인되었다. 잔류 오페론의 프라이머 쌍은 하나 이상의 파라미터를 완화하거나 조사 영역을 확장함으로써 또는 상이한 알고리즘을 사용함으로써 확인할 수 있다. 프라이머의 최종 버전은 또한 PCR 생성물이 pDEW201로 직접 클로닝될 수 있는 적절한 EcoRI 및 SacI 엔도뉴클레아제 절단 부위 (각각의 좌측 및 우측 프라이머)의 첨가를 포함한다 .
게놈 등록 집합체의 유전자 융합체를 생성하는 다른 방법은 플라스미드 생성 유전자 융합체보다는 염색체를 초래한다. 리포터 유전자를 보유하는 전위 유전 인자는 유전자 융합체를 생성하는데 사용될 수 있다. 유전자 융합체 생성이 무작위 전위에 의해 숙주 유기체의 염색체로 수행되는 경우, 후속적인 유전자 융합체는 전위 인자와 염색체 사이의 접합부위의 서열을 결정하기 위한 염색체 DNA 서열에 관한 게놈 등록일 수 있다 [Nichols et al., (1998) R Bacteriol. 180: 6408-6411]. 별법으로, 염색체 DNA의 정의된 (및 이어서 게놈 등록된) 단편을 사용하여 시험관내에서 수행된 전위는 숙주 염색체로 상동성 재조합에 의해 재조합될 수 있다. 추가로, 플라스미드 DNA의 클론과 같이 다른 방법에 의해 형성된 유전자 융합체는, 상동성 재조합 ([Balbas et al., (1996) Gene 172: 65-69]; [Lloyd and Low (1996) InEscherichia coliandSalmonella, Cellular and Molecular Biology. ASM Press, pp 2236-2255]), 부위 특이성 재조합 [Nash H. (1996) InEscherichia coliandSalmonella: Cellular and Molecular Biology. ASM Press, pp 2363-2376] 또는 둘다 [Boyd et al., (2000) J. Bacteriol. 182: 842-847]에 의해 숙주의 염색체로 재조합될 수 있다
유전자 융합체를 생성하는 바람직한 방법은 PCR 주형으로서 재배열을 필요로하는 클론의 플라스미드 DNA를 사용하여 반전을 생성시키는 것, 서열 데이타가 이용가능한 경우 특정 PCR 프라이머를 사용하는 것, 또는 전위를 사용하여 염색체의 유전자 융합체를 생성시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다 [Kenyon and Walker (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77: 2819-2823]. 게놈 단편을 생성하는 가장 바람직한 방법은 제한 효소 또는 물리적인 전단을 사용하는 것이다. 그 다음, 게놈 단편을 프로모터 없는 리포터 유전자를 라이게이션하여 유전자 융합체를 생성시킨다. 융합체를 생성하는 상기 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명은 또한 바이오센서로서 유용한 유전자 융합체를 발견하기 위해 액체포맷에서 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 39 개 유전자 융합체는 135 분 동안 리모넨에 노출시키는 경우 상향조절되는 것이 밝혀졌다 (실시예 7). 리모넨 생성 유기체로서 사용된 균주에 상기 유전자 융합체를 사용함으로써, 리모넨의 존재 또는 리모넨 생성의 최적 조건을 생물발광의 상향조절에 의해 측정할 수 있다.
유전자 발현 프로파일은 유전자 기능 및 화학물질 작용의 모드를 이해하는데 관련된 정보를 제공한다. 유사하게, 이런 정보는 유전자 생성물의 기능 상실, 농도 감소 또는 과다발현을 초래하는 유전자 변경의 분석에 의해 수득될 수 있다.따라서, "어레이들의 어레이"는 작용 방법 연구 및 기능적 게놈학 둘 다를 발전시키기 위해 사용할 수 있다. 흐름도 I 및 II는 사용할 수 있는 어레이들의 어레이의 두가지 방법을 서술한다.
흐름도 I은 몇가지 시험을 세포의 환경을 변화시키는 교란으로 수행할 수 있음을 나타낸다.
<흐름도 I>
흐름도 II는 어레이들의 어레이로부터 데이타가 분석됨에 따라, 관심있는 변경된 반응을 어레이들의 어레이에서 선택된 도구에 의해 추가로 분석할 수 있다는 것을 기술한다.
<흐름도 II>
이 어레이들의 어레이는 유기체의 유전자에서 게놈 등록 돌연변이의 큰 집합체를 생성함으로써 제조될 수 있다. 몇가지 방법은 전통적인 방사선 및 돌연변이를 유도하는 화학물질 뿐만 아니라 더 현대적인 게놈-기초 기술 (생체내 무작위 전위 후 접합 부위의 서열분석하여 교란된 유전자를 결정, 시험관내에서 각각의 유전자로 목표한 전위 후 분열제를 생성하는 생체내 상동성 재조합 및 시험관내에서 PCR에 의해 생성되는 결손 도입 대립유전자로 프라이머 올리고뉴클레오티드를 생성 및 후속적으로 게놈으로 재조합하는 것을 포함)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 자발적인 돌연변이는 또한 다양한 방법으로 선택될 수 있다 [LaRossa, R. A. (1996) InEscherichia coliandSalmonella: Cellular and Molecular Biology.ASM Press, p. 2527-2587]. 유사하게, 과다발현을 초래하는 게놈 등록 유전자 변경의 큰 집합체를 생성할 수 있다. 이는 유전자 선택 [LaRossa, R. A. (1996) InEscherichia coliandSalmonella: Cellular and Molecular Biology. ASM Press, p. 2527-2587], 다중복제 플라스미드의 클로닝, 강한 프로모터에 의해 과다발현된 유전자의 배치 및 조절 프로모터에 의해 과다발현되는 유전자의 배치를 포함하나 이에 제한되지 않는 몇가지 방법에 의해 달성될 수 있다.
교란은 환경 또는 유전자형의 임의의 변경이다. 환경을 변화시키는 교란은 물리적 특성, 예를 들어 방사선의 영향, 방사선 스펙트럼, 습도, 기저 또는 온도; 영양 특성, 예를 들어 탄소원, 에너지원, 질소원, 인원 (phosphorus source), 황원 (sulfur source) 또는 미량 원소원; 생물학적 특성, 예를 들어 경쟁자, 약탈자, 공생자, 파지 및 바이러스와 같은 병원균의 존재, 독소의 존재 또는 박테리옥신; 및 화학물질 특성, 예를 들어 킬레이터, 억제제, 독물 또는 정상 대사물의 비정상 수준의 존재를 포함한다.
세포의 환경을 변화시키는 주어진 교란에 대해 여러가지 시험을 할 수 있다 (흐름도 1). 이의 반응은 유전자 발현 (예를 들어, 리포터 유전자 발현, 특이적인 단백질 또는 중간체의 존재 또는 부재) 및 유전적 변경이 표현형에 미치는 영향의 패턴을 포함한다: 이들 반응들은 동시에 분석할 수 있다. 본 발명의 방법에서 스크리닝할 수 있는 표현형의 예로는 대사량 (예를 들면, 탄소원에 대한 요구, 영양분에 대한 요구, 아미노산에 대한 요구, 질소원에 대한 요구 및 퓨린에 대한 요구): 무기 화학물질 (예를 들면, 산, 비산염, 아지드, 중금속 및 과산화물)에 대한 내성: 유기 및 생물학적 화학물질 (예를 들면, 항생제, 아크리딘, 악티노마이신, 아미노 퓨린, 아미노 페닐알라닌, 콜리신, 에탄올, 플루오로아세테이트, 미토마이신 C 및 날리딕스산)에 대한 내성: 생물학적 작용제 (예를 들면, 파지)에 대한 내성: 물리적 극단 (예를 들면, 온도, pH, 삼투압 및 방사선)에 대한 내성 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따라 검출할 수 있는 표현형은 매우 다양하며, 이에 관한 완전한 검토를 위해서는 문헌 [Robert LaRossa:Escherichia coliandSalmonella: Cellular and Molecular Biologv (1996) ASM press p.2527-2587]을 참고할 수 있다. 이는 어떠한 교란과 다른 교란의 실험적 매치를 향상시킬 것이다. 예를 들어, 어떠한 화학물질이 모든 시험에서 다른 화학물질과 매우 유사한 작용 패턴을 나타내는 경우라면, 이들 2 가지 화학물질들의 작용 방식이 매우 유사할 가능성이 매우 높다. 두번째로, 여러가지 패턴에 대한 이러한 부수적인 분석은 유전자 기능에 대한 이해를 증진시킬 것이다. 예를 들어, 어떠한 군의 유전자가 이 군의 유전자에 대한 환경적 교란 및 유전적 교란 (즉, 돌연변이)에 의해 유사하게 조절되어 표현형에 대한 효과가 유사하다면, 유사한 기능을 한다는 것을 유추할 수 있다.
흐름도 II는 어레이들의 어레이로부터의 데이타를 분석하기 때문에, 관심 반응의 변경을 어레이들의 어레이에서 선택한 도구를 사용하여 추가로 분석할 수 있음을 도시한다. 예를 들어, 어떤 돌연변이체가 환경적 변화에 대해 과도로 민감한지 또는 과도한 내성이 있는지에 관하여 임의의 교란을 평가할 수 있다. 환경적 변화에 대한 반응에서 및 이러한 변화가 없을 때, 야생형 및 변경된 돌연변이체의유전자 발현 프로파일을 살핀다. 유전적 변화를 시험하기 위한 다른 접근법은 광범위한 범위의 환경적 파라미터에서의 변화에 따라 돌연변이체와 야생형 사이에 성장 특성이 어떻게 달라지는 가를 시험함으로써 돌연변이체의 게놈 등록 집합체를 야생형과 비교하는 것이다. 이어서, 관심을 갖는 차이에 대해 유전자 발현을 프로파일한다.
어레이들의 어레이를 이용하기 때문에, 유전자형과 환경 사이의 상호작용에 의하며 유전적 조성 또는 배양 조건의 변화에 의해 관측되는, 표현형에 대한 대량의 데이타로 인해, 돌연변이체와 유전자 발현 프로파일 사이의 상호작용을 해석할 수 있을 것이다. 또한, 이러한 상호작용의 분석은 유전자 기능의 발견 및 화학물질 작용 방식의 측정에도 유용할 것이다.
또한, 이러한 분석을 통해 의약품, 항균제 또는 농약을 위한 유용한 표적의 식별, 환경적 진단 시험의 개발, 또는 화학적 작용 방식 또는 화학적 작용 부위를 기초로 하는 고처리량 스크리닝의 개발이 가능할 수 있다.
본 발명을 하기의 실시예를 통해 추가로 설명한다. 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내는 이들 실시예는 단지 설명하기 위해서임을 이해해야 한다. 당업자라면 상기 기재 및 이들 실시예를 통해 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있을 것이며, 본 발명의 사상과 범위에서 벗어나지 않고도 여러가지 용도 및 조건에 맞춰 본 발명을 여러가지로 변화 및 변형시킬 수 있다.
일반적인 방법
하기 실시예에서 사용한 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis)], [T.J. Silhavy, M. L. Bennan, and L. W. Enquist, Experiments with Gene 융합체, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984)] 및 [Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)]에 기재되어 있다.
약자들의 의미는 다음과 같다: "KB"는 킬로베이스(들)을 의미하고, "hr"는 시간(들)을 의미하고, "min"은 분(들)을 의미하고, "sec"는 초(들)을 의미하고, "d"는 일(들)을 의미하고, "ml"은 밀리리터(들)을 의미하고, "㎕"는 마이크로리터(들)을 의미하고, "nl"는 나노리터(들)을 의미하고, "㎍"은 마이크로그램(들)을 의미하고, "ng"은 나노그램(들)을 의미하며, "mM"은 밀리몰을 의미하고, "μM"은 마이크로몰을 의미한다.
배지 및 배양 조건
박테리아 배양물의 유지 및 성장에 적합한 물질 및 방법은 문헌 [Experiments in Molecular Genetics (Jeffrey H. Miller), Cold spring Harbor Laboratory Press (1972), Manual of Methods for General Bacteriology (Phillip Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds), pp. 210-213, AmericanSociety for Microbiology, Washington, DC. or Thomas D. Brock in Biotechnology], [A Textbook of Industrial Microbiology. Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland MA]에 기재되어 있다. 달리 언급하지 않는다면, 박테리아 세포의 유지 및 성장에 사용한 모든 시약 및 물질은 알드리치 케미칼스 (Aldrich Chemicals) (미국 위스콘신주 밀워키 소재), 디프코 레보레이토이즈 (DIFCO Laboraoties) (미국 미시건주 디트로이트 소재), 깁코/BRL (Gibco/BRL) (미국 메릴랜드주 가이터스버그 소재) 또는 시그마 케미칼 컴파니 (Sigma Chemical Company) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다.
LB 배지는 배지 1 리터 당 하기의 물질을 함유한다: 박토-트립톤 (10 g), 박토이스트 추출물 (5 g) 및 NaCl (10 g).
보겔-보너 (Vogel-Bonner) 배지는 1 리터 당 하기의 물질을 함유한다: MgS04.7H2O 0.2 g, 시트르산.1H20 2 g, K2HP0410 g 및 NaHNH4PO4.4H2O 3.5 g.
최소 M9 배지는 배지 1 리터 당 하기의 물질을 함유한다: Na2HP04(6 g), KH2PO4(3 g), NaCl (0.5 g) 및 NH4Cl (1 g).
상기 배지를 오토클레이브시켜 멸균한 후에 M9 배지에 0.01 M CaCl 10 ml 및 1 M MgS04.7H2O 1 ml을 첨가했다. 탄소 공급원 및 다른 영양분을 실시예에서 언급한 바와 같이 첨가했다. 모든 첨가물은 배지에 첨가하기 전에 미리 멸균해 둔 것들이었다.
분자 생물학 기술
제한 효소 소화, 라이게이션, 형질전환 및 아가로스 겔 전기영동 방법은 문헌 [Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기재된 바와 같이 수행했다.
중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술은 문헌 [White, B., PCR Protocols: Current Methods and Applications, Volume 15 (1993) Humana Press Inc.]에 기재되어 있다.
실시예 1
luxCDABE 리포터에 융합된 대장균 게놈 단편의 무작위 라이브러리의 제작, 서열 분석 및 등록
pBR322의 복제 기점 및 bla, 프로모터 없는 P. luminescens luxCDABE 유전자 상류의 4 개의 전사 터미네이터 및 터미네이터와 luxCDABE 사이의 다중 클로닝 부위를 함유하는, 플라스미드 pDEW201에서 대장균 게놈 단편의 무작위 라이브러리를 문헌 [Van Dyk et al., (1998) J Bacteriol. 180 : 785-792; Van Dyk and LaRossa (1998) Methods in Molecular Biology : Bio발광, Methods and Protocols, Humana Press Inc. vol. 102 : 85-95]에 미리 기재되어 있는 바와 같이 제작했다.
간단하게 말하자면, 제한 효소 Sau3Al을 사용하여 대장균 균주 W3110에서 단리한 염색체 DNA [Ernsting et al., (1992) J. Bacteriol. 174: 1109-1118]를 부분적으로 소화시켜 아가로스 겔 전기영동을 통해 크기별로 분획화하고, 평균 크기가 대략 1.8 KB인 분획물을 단리했다. 이 분획물을 BamHI으로 미리 소화시켜 둔pDEW201에 융합시키고, 소 소장 알칼리성 포스파타제로 처리했다. 스트라타진이 제공한 프로토콜에 따라, 라이게이션 생성물을 사용하여 초감응성 대장균 XL2Blue 세포 (스트라타진 (Stratagene) 제품)를 암피실린 내성이 되도록 형질전환시켰다. 무작위로 골라낸 개별 XL2Blue 형질전환체의 예비 특성화는 대부분 (16개 중 16개)이 크기가 0.9 내지 3.0 KB인 인서트 DNA를 함유한다는 것을 지시했다. 이들 형질전환체를 대략 24,000개 풀링 (pool)하여 퀴아젠 (Qiagen) tip20 컬럼 (퀴아젠 코포레이션 (Qiagen Corp) 제품)을 사용하여 단리한 이종 LuxZ 라이브러리 플라스미드 DNA의 공급원으로서 사용했다. 상기 플라스미드 DNA 풀을 사용하여, 암피실린 내성에 대해 선택하고 30 분 동안의 표현형 발현 시간을 주어 sibling의 존재를 최소화하면서 대장균 DPD1675를 형질전환시켰다 [Ni-shimura et al. (1990). Arucleic Scids Res. 18: 6169; Van Dyk and LaRossa (1998) Methods in Molecular Biology: Bioluminescence Methods and Protocols, Humana Press inc. vol. 102:85-95]. 총 8066개의 개별 형질전환체를 사용하여 탄소 공급원으로서의 글루코스를 함유하고 티아민, 우라실, 프롤린 및 25 ㎍/ml 암피실린을 보충한 보겔-보너 배지 [Davis et al., (1980) Advanced bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY]를 190 ㎕씩 함유하는 멸균 마이크로테스트 티슈 컬쳐 플레이트 (Microtest Tissue Culture Plates) (팔콘 (Falcon) (등록상표) 제품))의 96-웰에 접종했다. 이들 플레이트를 덮고 37℃에서 진탕 없이 밤새 인큐베이션했다. 96-웰 플레이트 중의 상기 철야 배양물을 2벌씩 -80℃에서 영구 극저온 저장했다 [Menzel, R., (1989) Anal. Biochem. 181: 40-50]. 이들 8066개의 개별 배양물을 Lux-A 집합체라고 부른다.
DNA 서열 분석을 위해서, Lux-A 집합체의 상기 2벌 세트 중 하나를 해동시켜 접종물로서 이용하여, 96 웰의 깊은 웰 플레이트 중 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 테러픽 브로쓰 (Terrific Broth) (깁코 BRL, 인크 (Gibco BRL, Inc) 제품)에서 포화될 때까지 성장시켰다. 퀴아젠 R.E.A.L.TM프렙 방법을 다음과 같이 변형시켜 사용하여, 상기 배양물로부터 플라스미드 DNA를 추출했다: 세포 용균 후에, 상기 플레이트를 물이 끓고 있는 수조에 5 분 동안 넣었다가 빙수조에서 신속하게 냉각시킨 다음, 완충액 3을 사용하여 침전시켰다. 이러한 변형법은 비-endA 숙주 균주인 DPD1675에 존재하는 뉴클레아제에 의해 플라스미드 DNA가 절단되는 것을 방지한다. 프라이머 pDEW201 전방향 (서열 1, 5'-GGATCGGAATTCCCGGGGAT-3') 및 pDEW201. 역방향 (서열 2, 5'-CTGGCCGTTAATAATGAATG-3')를 사용하여 표준 ABI 프리즘TM다이터미네이터 리액션 레디 (ABI PrismTMDyeTerminator Reaction Ready) 조건하에 플라스미드 DNA 대략 1 ㎍으로 DNA 서열 분석 반응을 수행하여, 상기 인서트의 각 말단의 서열 정보를 얻었다. ABI377TM-XL 96-레인 업그레이드형 시퀀서(Sequencer)를 이용하여 4회의 운행 조건으로 5％ PAG (폴리아크릴아미드 겔) 롱레인저TM(LongRangerTM) (FMC, 인크 (FMC, Inc.)) 겔 상에서 DNA 서열을 결정하고 ABI 소프트웨어로 분석했다. DNA 서열을 추가의 분석을 위해 UNIX를 기초로 하는 유틸리티로 옮겼다. 각각의 Lux-A 클론 (양쪽 방향)의 시작부 및 말단부 서열의 상동성 조사를 파슨 (Parson)의 FASTA 프로그램 (fasta3, Version 3. ltl3)을 사용하여 완전한 대장균 서열 (젠뱅크 (Genbank) 제공 U00096)에 대해 수행하였다. 필수적인 Fasta 옵션은 -nQH-m 10-z 0이었다.
각각의 매우 중요한 배열 (FASTA 스코어 > 1000, 최소 중복 길이 > 200 및 최소 동일성 > 70％)에 대한 필수적인 데이타는 관련된 데이타베이스 (시베이스 시스템 (Sybase System) 11, 시베이스 인크 (Sybase Inc.))에 저장하였다.
이어서, 대장균 게놈상에서 Lux-A 클론의 위치는 인서트의 시작부 및 말단 모두에 대해 상기에서 컴퓨터로 계산한 상동성을 기초로 다음의 규칙에 따라 평가했다;
i) 인서트의 말초 및 근위 말단 둘 다는 대장균과 높은 서열 상동성을 분명하게 가져야하고,
ii) 클론의 시작부 및 말단에서 결정된 서열 매치의 상대적인 위치 및 방향은 클론의 적절한 길이를 의미하는데, 이 때 클론은 상당히 좁은 분포를 갖는 것으로 공지되었다.
많은 경우에 상기 방법은 하나의 가능한 위치를 제공하나, 다른 경우에 다수의 가능한 위치가 있다. 상기 결과는 관련된 데이타베이스에 저장하였다.
대장균의 오픈리딩프레임에 대한 주석표를 NCBI의 엔트레즈 (Entrez) 시설을 사용하여 다운로드 하였고, 이 데이타는 관련된 데이타베이스에 저장하였다.
웹을 기초로, 데이타에 대한 표 인터페이스를 만들었다. 이는 기능적인 주석에 관하여 Lux-A 클론을 참조하는 것을 허용한다. 자바 (Java)를 기초로 하는 도표 인터페이스를 또한 쉽게 시각화 하기 위해 위치 및 방향 관계를 갖도록 만들었다. 따라서, Lux-A 집합체를 대장균 게놈에 대해 등록하였다.
실시예 2
선택된 전체 조절 반응의 입증을 위한 Lux-A 집합체의 확인
Lux-A 집합체의 서열 분석 및 대다수 LuxA 구성원의 등록을 사용하여, 잘 특성화된 조절 회로의 다른 구성원에 대한 luxCDABE 융합체를 함유하는 균주의 생물학적 반응을 추가로 조사하는 것이 가능하다. lac 오페론에 대한 유전자 융합체 및 열충격, SOS, SoxRS 및 OxyR 레귤론의 구성원을 Lux-A 집합체로부터 선택하고 이들 전반적인 조절 회로의 각각의 공지된 유도인자에 대한 반응을 시험하였다.
성장 배지 및 화학 물질
풍부한 액체 배지, LB [Miller, J. H., (1972) Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]를 사용하였다. 언급된 경우, 암피실린 (Amp)을 150 ㎍/ml로 첨가하였다. 에탄올 (200회 시험, 퀀텀 케미칼 (Quantum Chemicals))을 LB 배지로 직접 희석하였다. 1 M NaOH 중 20 mg/ml 날리딕스산 (시그마 케미칼 컴파니)의 스톡 용액을 LB 배지로 추가로 희석하였다. 유사하게, 물 중 100 mg/ml 메틸 비올로겐 (시그마 케미칼 컴파니)의 스톡 용액을 LB 배지로 추가로 희석하였다. 과산화 수소 (EM Science) 30％ 용액을 원하는 농도로 LB 배지로 희석하였다.
마이크로플레이트로부터 재단리, 배양물의 성장 및 스트레스 반응으로부터 시험
선택된 균주를 LB-Amp 플레이트 상에 단일 콜로니를 스트리킹하여 80℃에 저장시킨 Lux-A 집합체 마이크로플레이트로부터 재단리하였다. 웰에서 배양물의 순도를 96 웰 발광 측정기 플레이트 (마이크로라이트 (Microlite), 다이넥스 테크놀로지 (Dynex Technologies))에 LB 배지 100 ㎕에 4 개의 단일 콜로니를 접종하여 시험하였다. 4 개 단리물의 각각의 세트의 일정한 생물발광은 클론 순도의 증거를 제공하였다.
스트레스 반응을 시험하기 위해, 각각의 선택된 균주의 1 개 또는 2 개의 단일 콜로니를 암피실린 150 ㎍/ml을 함유한 LB 배지 5.0 ml의 접종에 사용하였다. 이 배양물을 37℃에서 밤새 성장시킨 후 새로운 LB 배지 (암피실린 부재) 10.0 ml 중의 철야 배양물 50 ㎕ 또는 100 ㎕을 첨가하여 희석하고 37℃에서 교반하면서 성장시켜 10과 40 사이의 적색 필터를 함유하는 클레트-서머슨 (Klett-Summerson) 비색계로 기록하였을때 배양물이 지수 증식기가 되게 하였다. 이런 활발하게 성장시킨 배양물을 96 웰 발광 측정기 플레이트에서 다양한 농도의 화학물질을 함유하는 LB 배지 50 지프 (zip)에 배양물 50 pl을 첨가하여 스트레스 반응 실험을 개시하는데 즉시 사용하였다. 스트레스가 부여되는 경우 동일한 집단으로 확인된 화학물질을 첨가할 때 활발하게 성장하는 배양물의 분열이 존재하였다. 광 생성은 37℃에서 다이넥스 ML3000 발광 측정기로 측정하였다. 광 생성의 크기없는 단위, 상대적인 광 단위 (RLU)는 내부 광-방출 다이오드로부터의 광 기록과 비교하여 수득된다. 선술된 문헌 [Van Dyk et al., Appl. Environ. Microbiol. 60: 1414-1420]과 유사한, ML3000 발광 측정기의 사이클 모드를 사용하였다.
lacZYA 오페론으로의 유전자 융합
매우 잘 특성화되어 있는 lac 오페론의 전사는 특이적 및 전반적 조절 회로 둘다에 의해 조절된다. 특이적, 음성 조절은 lacl-코딩된 리프레서에 의해 매개된다 [Choy and Adhya, (1996) InEscherichia coliandSalmonella: Cellular and Molecular Biology. ASM Press pp 1287-1299]. 글루코스 이용가능성에 대한 반응의 전반적 조절은 양성 cAMP-CRP의 전사 활성화에 의해 매개된다 [Botsford and Harman (1992) CyclicAMP inprokaryotes. 마이크로biol. Rev. 56: 100-122]. 도 1에 나타낸 바와 같이, Lux-A 집합체는 lac 오페론에 대한 luxCDABE 의 융합체인 3개의 구성원을 함유한다. 글루코스에 대한 이들 유전자 융합체의 적당한 반응을 시험하기 위해서, 각각을 재단리하여 LB 배지 중에서 글루코스의 존재 또는 부재하에 성장시키는 경우의 생물발광에 대해 시험했다. 이 결과를 표 2에 나타냈다.
각 배양물에서 2개씩 단리한 단일 콜로니들을 상기 명시한 배지 중에서 밤새 성장시킨 후에 ML3000 발광 측정기 중 100 ㎕의 생물발광을 측정하여 시험하였다.LBAmp 배지는 150 ㎍/ml 농도의 암피실린을 함유하는 LB 배지이다.
하나의 예외만 제외하고, Lux-A 집합체의 상기 배양물로부터 단리한 콜로니 각각은 글루코스가 존재할 때보다 글루코스가 없을 때에 생물발광성이 훨씬 더욱 높았다. 크게 생물발광하지 않았던 lux-a.pkO50.b9로부터의 한 콜로니는 그 웰에서 배양물의 오염에 의한 것일 수 있다. 달리 추정되는 교차 오염 사건은 관찰되지 않았다. lacZ-luxCDABE 융합체 균주 각각은 글루코스에 대한 예측된 반응을 나타내는 재단리한 콜로니를 1개 이상 보유했다. 따라서, 이들 Lux-A 집합체 구성원의 적당한 생물학적 반응이 입증되었다.
열충격 레귤론 유전자 융합체
Lux-A 집합체를 시험하여 δ32-조절된 열충격 레귤론의 유전자에 대한 융합체를 발견했다 [Gross, C. A., (1996) InEscherichia coliandSalmonella: Cellular and Molecular Biology, Second ed. ASM Press, pp. 1382-1399]. 표 3은 Lux-A 집합체에서 조사한 유전자 또는 오페론 및 각 유전자에서 발견된 유전자 융합체의 수를 나타낸다.
열충격 레귤론의 각 구성원을 완전하게 대표하는 것은 아니지만, 12 개의 열충격 프로모터 중 4 개에 대한 lux 융합체를 발견했다 (33％). 따라서, Lux-A 집합체는 이러한 스트레스 반응의 활성화를 보고해야 하는 구성원을 함유한다.
또한, 모 플라스미드 pDEW201에서 미리 제작된 grpE-luxCDABE 유전자 융합체를 보유하는 균주 [Van Dyk et al., (1998) J. Bacteriol. 180: 785-792]를 Lux-A 집합체 플레이트의 선택된 웰에 대조군으로서 넣었다. 또한, 이들 중 하나를 선택하여 시험했다. 표 4는 냉동시킨 Lux-A 집합체의 웰로부터 재단리한 6개의 균주에 대한 정보를 요약한 것이다.
*대조군(미처리)를 보겔-보너 최소 배지 중에서 배양물을 활발하게 성장시키면서 술포메투론 메틸 반응에 대한 스크리닝을 하면서, 제0시간부터 얻었다 [Van Dyk et al., J. Bacteriol. 180: 785-792].
＃LB에 에탄올을 첨가하고 40분 후에 3％ 에탄올을 처리한 배양물로부터의 생물발광을 동일 시점에서 LB 중 미처리 대조군의 생물발광으로 나누어서 얻은 비율.
1clpP 및 clpX가 동시전사되었기 때문에, clpX의 프로모터 상류라고 예측되지 않음.
2상기 단편은 rpoD 특이적 프로모터만을 함유해야 함 [Tylor et al., (1984) Cell 38: 371-381].
3sfhB와 yfiH 사이에 유전자 간격이 없기 때문에, yfiH의 프로모터 상류인것 같지는 않음.
표시 (' 또는 ')는 키메라 리포터 유전자 융합체 중의 대장균 유전자가 말단이 절단되었음을 나타내기 위해 사용한 것이다. '가 유전자 명칭의 시작부에서 사용된 경우 (예를 들어, 'lacZ), 이는 5' 말단이 손실되었음을 의미한다. '가 유전자 명칭의 말단부에서 사용된 경우 (예를 들어, lacZ'), 이는 그 유전자의 3' 말단이 존재하지 않음을 의미한다.
스트레스가 없을 때, 이들 균주 각각으로부터의 광 생성률은 활성 프로모터를 함유하는 이들 염색체 DNA 단편 각각의 경우와 일치하는데, 이는 상기 값이 동일 조건하에서 0.002 RLU인 모 플라스미드 pDEW201를 보유하는 배양물로부터의 값보다 훨씬 크기 때문이다 [Van Dyk et al., (1998) J Bacteriol. 180: 785-792]. 이들 균주들을 이용하여, 공지된 강력한 화학적 유도자인 에탄올을 5, 4, 3 및 2 (v/v)％로 사용한 열충격 스트레스 반응에 대한 보고능력에 대해 시험했다. 적어도 에탄올의 2가지 농도에서는 6개의 균주 각각이 미처리된 배양물인 대조군과 비교될 만큼 생물발광을 증가시켰다. 표 4는 처리 후 제40 분에 3％ 에탄올에 대한 각 균주의 반응 비율을 포함한다. 이러한 데이타는 Lux-A 집합체로부터의 이들 열충격 레귤론 유전자 융합체가 열충격 반응의 유도를 보고할 수 있음을 증명한다.
SOS 레귤론 유전자 융합체
상기 기재한 바와 유사한 방식으로, Lux-A 집합체를 시험하여 SOS DNA 손상 반응 레귤론의 유전자에 대한 융합체를 발견했다 [Kim et al., (1997) Proc NatlAcad Sci USA 94 (25): 13792-7; Walker, G. C.-(1996) InEscherichia coliandSalmonella: Cellular and Molecular Biology. ASM Press pp. 1400-1416]. 표 5는 Lux-A 집합체에서 무작위로 생성한 유전자 또는 오페론 및 각 유전자에 존재하는 유전자 융합체의 수를 나타낸다.
시험했던 14 개의 SOS 레귤론 유전자 또는 오페론 중에서, 7 개 (50％)가 Lux-A 집합체에서 유용한 융합체로 대표된다는 것을 발견했다. 따라서, 이러한 집합체는 SOS 스트레스 반응의 활성화를 보고해야 하는 구성원을 함유한다. 표 6은 냉동시킨 Lux-A 집합체의 웰로부터 재단리한 8개의 균주에 대한 정보를 요약한 것이다.
*대조군(미처리)를 보겔-보너 최소 배지 중에서 배양물을 활발하게 성장시키면서 술포메투론 메틸 반응에 대한 스크리닝을 하면서, 제0시간부터 얻었다 [Van Dyk et al., J. Bacteriol. 180: 785-792].
＃LB에 날리딕스산을 첨가하고 110분 후에 5 ㎍/ml의 날리딕스산을 처리한 배양물로부터의 생물발광을 동일 시점에서 LB 중 미처리 대조군의 생물발광으로 나누어서 얻은 비율.
표시 (' 또는 ')는 키메라 리포터 유전자 융합체 중의 대장균 유전자가 말단이 절단되었음을 나타내기 위해 사용한 것이다. '가 유전자 명칭의 시작부에서 사용된 경우 (예를 들어, 'lacZ), 이는 5' 말단이 손실되었음을 의미한다. '가 유전자 명칭의 말단부에서 사용된 경우 (예를 들어, lacZ'), 이는 그 유전자의 3' 말단이 존재하지 않음을 의미한다.
규정된 배지 중 기본 생물발광에 대해 시험한 이들 각각의 균주는 모 플라스미드를 함유하는 균주보다 더 높은 수준의 광 생성을 갖고, luxCDABE 리포터의 발현을 유도하는 프로모터 존재를 나타낸다. SOS 스트레스 반응의 활성을 보고하는 이들 프로모터-luxCDABE 융합체의 능력은 공지된 능력있는 화학적 유도인자인 날리딕스산을 사용하여 시험하였다. 날리딕스산의 최종 농도는 대부분의 균주 DPD2293에 대해 1, 5, 25 및 125 ㎍/ml이었고, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 및 1.25 ㎍/ml에서 시험하였다. 각각의 8 개의 균주에서, 날리딕스산의 3 개 이상의 농도에서 생물발광이 증가되는 결과를 보였다. 표 6은 첨가 후 제 110 분에 날리딕스산 5 ㎍/ml에서 반응비를 제공한다. 이들 데이타는 SOS 반응의 유도가 Lux-A 집합체에서 SOS 레귤론 유전자 융합체에 대한 생물발광의 증가로 보고되는 것을 설명한다.
반응의 특이성을 이들 SOS 레귤론 유전자 융합체에서 에탄올의 효과를 측정하여 시험하였다. 각각의 경우에 5, 4 또는 3％ (v/v) 에탄올을 처리하여 유도된 생물발광의 증가가 거의 없었다. 예를 들어, 첨가 후 제40 분에 3％ 에탄올로 처리하는 모든 열충격 레귤론 유전자 융합체에서 광 생성을 증가시키는 조건 (표 4)에서, dinPluxCDABE 유전자 융합체를 함유하는 균주 DPD2249에 대한 수득된 반응비는 0.80이었다. 유사하게, 열충격 레귤론 clpB-luxCDABE 융합체를 함유하는 균주 DPD2243을 날리딕스산로 시험하는 경우, 생물발광의 증가는 관측되지 않았다; 날리딕스산 5 ㎍/ml의 첨가 후 110 분에, 반응비는 0.40이었다. 따라서, 에탄올에 대한 열충격 반응 및 날리딕스산에 대한 SOS 반응의 특이성이 나타났다.
SoxS-조절되는 산화 손상 레귤론 유전자 융합체
Lux-A 집합체를 또한 SoxR 및 SoxS 조절되는 산화 스트레스 반응 레귤론에서 유전자에 대한 융합체 존재에 대해 조사하였다 [Koh et al., (1999) Mol. Gen. Genet. 261: 374-380; Rosner and Storz (1997) Curr. Top. Cell. Regul. 35: 163-177; Van Dyk et al., (1998) J Bacteriol. 180: 785-792]. 하기 표 7에 결과를 나타냈다.
열충격 및 SOS 레귤론에 대해 유사한 방법에서, SoxR/S 레귤론은 Lux-A 집합체에서 완전히 나타나지 않았다. 그럼에도 불구하고, 집합체는 이런 스트레스 반응의 활성을 보고할 것으로 예상되는 33％의 SoxR/S 레귤론 유전자 또는 오페론에대한 유전자 융합체를 함유하였다. 표 8은 동결 Lux-A 집합체의 웰로부터 재단리된 6 개의 균주에서 정보를 요약한다.
*대조군(미처리)를 보겔-보너 최소 배지 중에서 배양물을 활발하게 성장시키면서 술포메투론 메틸 반응에 대한 스크리닝을 하면서, 제0시간부터 얻었다 [Van Dyk et al., J. Bacteriol. 180: 785-792].
＃LB에 메틸 비올로겐을 첨가하고 120분 후에 250 ㎍/ml의 메틸 비올로겐을 처리한 배양물로부터의 생물발광을 동일 시점에서 LB 중 미처리 대조군의 생물발광으로 나누어서 얻은 비율.
표시 (' 또는 ')는 키메라 리포터 유전자 융합체 중의 대장균 유전자가 말단이 절단되었음을 나타내기 위해 사용한 것이다. '가 유전자 명칭의 시작부에서 사용된 경우 (예를 들어, 'lacZ), 이는 5' 말단이 손실되었음을 의미한다. '가 유전자 명칭의 말단부에서 사용된 경우 (예를 들어, lacZ'), 이는 그 유전자의 3' 말단이 존재하지 않음을 의미한다.
SOS 및 열충격 레귤론 융합체와 유사하게, 이들은 프로모터 없는 모 플라스미드보다 큰 기준 광 생성을 갖고 이는 프로모터가 존재함을 지시한다. SoxR/S 레귤론의 공지된 유도인자, 메틸 비올로겐에 대한 4 개의 균주의 반응은 1000, 500, 250, 125, 62, 31 및 16 ㎍/ml에서 시험하였다. 각각의 7 개의 메틸 비올로겐 농도는 각각의 4 개의 균주에서 생물발광의 증가를 유도하였다. 표 8은 4 개의 시험 균주에 대해 처리 후 제120 분에 250 ㎍/ml에서 반응비를 제공한다. 본원에서 또한, 생물학적으로 적절한 반응이 관측되었다.
OxyR-조절 산화 손상 레귤론 유전자 융합체
OxyR 조절 유전자에 대한 융합체 [Rosner and Storz. (1997) Curr. Top. Cell. Regul. 35: 163-177]가 표 9에 요약한 바와 같이 Lux-A 집합체에서 밝혀졌다.
OxyR에 의해 조절되는 4 개의 유전자 또는 오페론 중, 하나 (25％) 에 대한융합체가 Lux-A 집합체에서 이용가능하다. 표 10은 ahpCF 오페론 조절 영역의 luxCDABE 리포터에 대한 융합체를 각각 함유하는 3 개의 균주에서 정보를 요약하는데, luxCDABE 리포터는 동결 Lux-A 집합체의 웰에서 재단리되었다.
*대조군(미처리)를 보겔-보너 최소 배지 중에서 배양물을 활발하게 성장시키면서 술포메투론 메틸 반응에 대한 스크리닝을 하면서, 제0시간부터 얻었다 [Van Dyk et al., J. Bacteriol. 180: 785-792].
＃LB에 과산화 수소를 첨가하고 제30분 후에 0.002％의 과산화 수소를 처리한 배양물로부터의 생물발광을 동일 시점에서 LB 중 미처리 대조군의 생물발광으로 나누어서 얻은 비율.
‡LB에 과산화 수소를 첨가하고 제30분 후에 0.002％의 과산화 수소를 처리한 열거된 기점 Lux-A 집합체 균주의 플라스미드 DNA를 함유하는 대장균 숙주 균주 DPD2228 [F-lac4169 rpsL pcnB80 zad-2084:: Tn10]의 배양물로부터의 생물발광을 동일 시점에서 LB 중 미처리 대조군의 생물발광으로 나누어서 얻은 비율.
표시 (' 또는 ')는 키메라 리포터 유전자 융합체 중의 대장균 유전자가 말단이 절단되었음을 나타내기 위해 사용한 것이다. '가 유전자 명칭의 시작부에서 사용된 경우 (예를 들어, 'lacZ), 이는 5' 말단이 손실되었음을 의미한다. '가 유전자 명칭의 말단부에서 사용된 경우 (예를 들어, lacZ'), 이는 그 유전자의 3' 말단이 존재하지 않음을 의미한다.
ahpCluxCDABE 유전자 융합체를 함유하는 3 개의 균주로부터 높은 수준의 광 생성은 이들 각각이 높은 활성의 프로모터를 함유하고 있음을 지시한다. 균주가 OxyR-조절 산화 스트레스 반응의 활성을 나타내는지를 시험하기 위해, 각각을 0.016, 0.008, 0.004, 0.002, 0.001, 0.0005 및 0.00025％의 과산화 수소로 처리하였다. 기껏해야, 생물발광이 최소로 유도되었다. 표 10은 처리 후 제30 분에 0.002％ 과산화 수소로 처리한 반응비를 나타낸다.
이전에, 플라스미드 pDEW201에서 OxyR 레귤론의 유전자에 대한 다른 luxCDABE 융합체, katG는 플라스미드가 pcnB 돌연변이를 함유하는 대장균 숙주 균주로 이동된 경우 과산화 수소에 대한 더 큰 반응비를 수득함을 나타냈다 [Van Dyk et al., (2000) in press. In A. Mulchandani and O. A. Sadik (ed.), Recent Advances in Environmental Chemical Sensors and Biosensors. ACS Symposium Series]. 이런 유전자에서 돌연변이는 pBR322 [Lopilato et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 205: 285-290]에서의 복제 유사체의 기점과 함께 플라스미드에 대한 플라스미드 복제 수를 감소시키므로, 상기 플라스미드를 보유하는 유전자 융합체의기본 발현을 감소시킨다. 따라서, ahpC-luxCDABE 융합체의 복제수가 감소하는지를 시험하는 것은 또한 OxyR-매개 스트레스 반응의 더 신뢰성 있는 검출을 수득할 수 있고, 2 개의 Lux-A 집합체 균주로부터 주어진 플라스미드 DNA는 pcnB-돌연변이 숙주 균주로 형질전환에 의해 이동될 것이다. 2 개의 생성된 균주를 0.004, 0.002, 0.001, 0.0005, 0.00025, 0.00012 및 0.00006％의 과산화 수소에 대한 반응에 대해 시험하였다. 각각의 7 개의 농도는 극적으로 pcnB- 숙주에서 ahpC-lllxCDABE 융합체 균주 둘 다로부터 생물발광의 증가를 유도하였다. 표 10의 마지막 컬럼은 30 분에서 0.002％ 과산화 수소로 처리한 반응비를 제공한다. 따라서, 유전자 융합체의 복제수가 감소되는 경우 고발현 유전자에 대한 이들 융합체의 적절한 생물학적 반응을 수득하였다.
플라스미드-생성된 고발현 유전자에 대한 융합체의 반응이 약한 한 예에서, pcnB 돌연변이와 함께 플라스미드 복제 수의 감소가 더 능력있는 유도를 초래한다는 것을 입증하였다. 고발현 유전자에 대한 다른 융합체는 또한 감소된 복제수, pcnB 돌연변이 또는 하나의 유전자 투여량에서 염색체로 통합된 숙주 균주로 이동할 수 있다 [Elsemore, D. A. (1998) Methods in Molecular Biology: Bioluminescencent Protocols., vol. 102, p: 97-104, Humana Press, Inc].
실시예 3
DNA 어레이 분석으로부터의 결과를 확인하거나 조사하고 유전자 발현에
기초한 고처리량 스크리닝을 개발하기 위한 리포터 유전자 융합체의
게놈 등록 집합체의 용도
미토마이신 C (MMC)로 DNA 마이크로어레이 실험
대장균 균주 MG1655 (rph-1)를 사용하였다. LB 37℃에서 밤새 성장시킨 배양물을 새로운 LB로 1 내지 250으로 희석하고 37℃에서 통기하면서 성장시켰다. 적색 필터를 갖는 클레트-서머슨 비색계에서 기록이 20 클레트 단위를 기록하는 경우 각각의 부배양물을 2 개의 100 ml 배양물로 분리하였다. 거의 치사량인, 최종 농도 250 ng/ml의 MMC (시그마, ddH2O에 용해)를 분리한 배양물 중 하나에 첨가하였다. 다른 배양물은 추가의 대조군이 없었다. 37℃에서 인큐베이션을 추가의 40 분 동안 지속한 후, 세포를 수집하여 전체 RNA를 제조하였다. MMC 처리된 배양물 및 그의 대조군은 각각 처리 제40분 후에 60 및 55 클레트 단위에 도달하였다, .
전체 RNA 정제, 첫번째-가닥 cDNA 표지, 대장균 온전한 게놈 고밀도 마이크로어레이 칩의 제조, 혼성화 및 데이타 분석을 선술한 바와 같이 수행하였다 [Wei et al. (2001) J: Bacteriol. 183: 545-556]. cy3 및 cy5 둘 다를 프로브 표지에 사용하였고, 혼성화 실험을 MMC 처리된 샘플과 블랭크 (blank) 대조군의 각각의 벌 사이에서 형광 cy 염료를 교환하여 반복하였다.
미토마이신 C를 처리한 샘플에서의 발현 대 대조군에서의 발현 비율을 DNA 어레이에 있는 모든 유전자에 대해 계산했다. 2 이상의 비율은 유도된 유전자로 간주하지만, 2 배 미만의 비율은 유도되지 않은 것으로 간주하였다. 공지된 SOS 유전자 [Kim et al., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 1997 Dec 9; 94 (25): 13792-7], [Lomba et al., (1997) FEMS Microbiol Lett 156: 119-122], [Walker, G. C.(1996). InEscherichia coliandSalmonella: Cellular and Molecular Biology. ASM Press pp. 1400-1416])는 유도 (표 11) 및 유도되지 않은 클래스 (표 12) 둘 다에 된다. 추가로, MMC에 의해 유도되는 것으로 사전에 공지되지 않은 20 개의 유전자가 어레이 실험에서 유도되는 것으로 관측되었다 (표 13).
공지된 SOS 유전자의 예상되는 MMC 유도 반응의 입증
표 11에서 리포터 유전자 융합체의 Lux-A 집합체를 유전자에 대한 융합체의 존재에 대해 조사하였다. 4 개가 집합체에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이들 각각을 100 분의 시간 코스에 걸쳐 몇가지 투여량에서 MMC에 의한 유도에 대해 시험하였다. 유전자 발현의 변화가 없는 지연기의 예상되는 유도 반응 후의 증가된 생물발광의 유도는 몇가지 투여량의 MMC에서 4 가지 경우 모두에서 관측되었다. 따라서, 이는 DNA 어레이 실험의 결과가 상응하는 유전자 융합체를 사용하여 입증될 수 있음을 설명한다.
공지된 SOS 유전자의 비유도의 음성 결과를 조사
예상한 바와 같이, 공지된 SOS 유전자의 발현이 증가되었다; 그러나 몇개의 발현은 2 배 미만으로 증가하였고 (표 12) 상기와 같이 큰 군의 792 개의 유전자 내에서 발현이 20％ 이상으로 증가되었다. 이들 중 대부분은 실제 생물학적으로 명백한 반응이라기 보다는 어레이 데이타의 결함 때문일 수 있다. luxCDABE 유전자 융합체를 보유하는 균주가 예상되는 양성의 결과를 수득하는 지를 시험하기 위해, 리포터 유전자 융합체의 Lux-A 집합체에서 이용가능한 3 개의 유전자 융합체를 미토마이신 C 반응에 대해 시험하였다. 3 개의 모든 경우에, 미토마이신 C는 증가된 생물발광을 유도하였다. 따라서, 이는 DNA 어레이의 음성의 결과가 상응하는 유전자 융합체와의 모순된 양성의 결과에 의해 조사될 수 있음을 설명한다.
사전에 공지되지 않은 MMC 유도가능한 유전자 유도의 조사 또는 확인
미토마이신 C로 유도되는 것으로 사전에 공지되지 않은 유전자를 DNA 어레이 및 유전자 융합 실험 데이타의 상호관계에 대해 추가로 조사하였다. 유전자의 상기 클래스에서, 4 개의 융합체는 리포터 유전자 융합체의 Lux-A 집합체에서 이용가능하였다.
이들 4 개의 유전자에 대한 상응하는 luxCDABE 융합체는 MMC에 의해 유도되는 유전자 발현의 증가의 증거가 제공되지 않았다.
유전자 융합체의 Lux-A 집합체 중 추가의 유전자 융합체는 반전되는 경우 yebF에 대한 융합체를 초래하는 게놈 단편을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이런 경우에, purT 유전자에 대해 전환된 프로모터가 염색체 단편에 존재하고 역방향 yebF 융합체를 함유하는 균주가 광을 생성하였다. 플라스미드 DNA의 단리, 벡터로부터 인서트 DNA를 방출하는 XmaI 소화, 재라이게이션 및 형질전환 후에, 형질전환체의 10％는 광을 생성하였다. 이들 중에서, 20％ (또는 초기 형질전환체 중 2％)는 날리딕스산, 다른 DNA 손상제에 의해 높게 유도되는 것으로 밝혀졌다. 이 결과는 인서트 DNA의 반전이 날리딕스산 유도가능한 유전자 융합체에서 발생한다는 것을 강하게 제안하였다. luxCDABE 오페론에 대한 yebF의 융합체를 수득하기 위한 도입된 절편의 방향을 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 게다가, 미토마이신 C에 의한 유도는 도 2에 나타낸 바와 같이 설명되었다.
실시예 4
가정된 프로모터 영역의 기능적 정의
대장균에서 형질 I 세포외 다당류의 생성을 코딩하는 유전자는 20 개 유전자의 클러스터에 위치한다 [Stevenson et al. (1996) J Bacteriol. 178: 4885-4893]. 이들 유전자의 상류 프로모터를 확인하였고 [Stout, V. (1996) J. Bacteriol. 178: 4273-4280] 그의 조절을 특징화하였다 [Gottesman, S. (1995) Two-component Signal Transduction. American Society of Microbiology pp253-262], [Wehland and Bernard (2000) J. Biol. C17em. 275: 7013-7020]. 그럼에도 불구하고, 이 영역의 전사 구성은 완전히 정의되지 않았다. 게놈의 한 가닥으로부터 전사된 이 유전자에 대한 주석 서열 [Blattner et al. (1997) Science 277: 1453-1462]은 몇개의 추정되는 프로모터 및 활성제 결합 부위를 제안한다. 게다가, 이 영역에서 오페론 구조의 예상은 이 유전자가 몇개의 전사 단위로 구성될 수 있다는 것을 제안한다 [Thieffry et al. (1998) Bioinformatics 14: 391-400]. 도 8은 이 영역에서 예상된 프로모터를 요약한다. 예상외로, 말단이 절단된 RNA 중합효소의 부단위 및 동질유전자 rpoC+ 대조군인 P90을 함유하는 균주 397C와의 대장균 DNA 마이크로어레이를 기초로 한 실험은 이 영역에서 RNA 전사물이 rpoC 돌연변이에 의해 영향을 받는다는 것을 제안하였다. b2062를 통한 유전자 b2043의 발현은 rpoC 돌연변이에서 공동작용으로 상향조절되었다 (도 8). 발현의 증가는 단일 전사물이 b2062의 이전 및 b2043과 b2042 (galF) 사이의 말단에서 개시되는 지를 가장 쉽게 설명한다. 이것이 사실인 경우, b2062의 상류 영역은 프로모터를 함유해야 한다. 이 영역은 lux-a.pk033.g2에서 luxCDABE 오페론에 대해 융합되었다. P90 및 397C의 형질전환체를 30℃의 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 성장시켰다. 활발하게 성장시킨 배양물의 클레트-서머슨 비색계로 기록된 생물발광 및 혼탁도 [Van Dyk et al. (1995) J Bacteriol. 177: 6001-6004]를 109 개의 세포 당 광 생성의 계산에 사용하였다. 짝지워지지 않은 t-시험을 모 플라스미드를 보유하는 대조군 균주에 대한 유전자 융합체를 보유하는 생물발광 측정에 4벌로 사용하였다. lux-a.po33.g2 유전자 융합체가 균주 P90에 위치하는 경우 생성되는 생물발광은 약하지만 (0.56 +/-0.06 RLU/109 CFU), 여전히 동일한 숙주 균주에서 모 플라스미드에 의해 생성되는 생물발광 (0.028 +/-0.010 RLU/109 CFU)보다는 충분히 컸다 (P <0.0001). 이 데이타는 LB 배지에서 성장시킨 균주에서 매우 활발하지는 않은 b2062의 상류 영역에서 프로모터와 일치한다. 이 유전자 융합체의 생물발광은 균주 397C에 위치한 경우 1500 배 증가되었다 (도 8). 그러므로, luxCDABE 유전자 발현을 유도하는 이런 강한 프로모터 활성은 rpoC 돌연변이에 의존한다. 이와는 반대로, 이들이 예상된 프로모터 영역을 함유하던지 아니던지, 이 영역에서 염색체 DNA 절편에 대한 몇가지 다른 유전자 융합체는 야생형 및 rpoC-돌연변이 둘 다에서 매우 낮은 정도의 활성을 갖는다 (도 8). 따라서, DNA 마이크로어레이 실험 및 유전자 융합체로부터의 데이타는 이 영역에서 20 개 유전자의 동시전사와 일치한다. 오페론의 말단을 luxCDABE 전사를 강하게 유도하는 galF 상류 영역 (lux-a.pk07.dl2에서)에 대한 유전자 융합체에 의해 정의하였다. 이 프로모터 영역의 활성은 DNA 어레이 데이타에 일치하는 바와 같이 rpoC 돌연변이에 의해 극적으로 달성되지 않았다 (도 8).
실시예 5
세포 리포터의 고밀도 어레이를 사용한 매우 병렬인 전사 분석
Luxarray 0.5의 원리의 증명
교란물, 생물제제, 환경물질 또는 화학물질 존재 또는 부재하에 성장시킨 리포터 클론으로 구성된 고상 분석 시스템을 개발하였다. 이를 배양 디시 (옴니트레이 (OmniTray), 넌크 (Nunc))에서 고체 성장 배지의 상단에 위치한 다공성 막 (바이오딘 (Biodyne) B, 넌크)에서 리포터를 성장시켜 달성하였다. 발광을 발광 측정기에 의해 또는 전체 배양물의 화상을 만들고 픽셀 밀도를 정량하여 측정하였다. 교란물의 효과는 처리 및 대조 배양물에 의해 생성된 발광을 비교하여 결정할 수 있다. 막 표면에서 성장은 필요한 경우 조건 사이에서 이동시키기 위한 리포터 분석을 허용한다. 실험 프로토콜은 세포 사멸 또는 다른 비가역적인 효과 때분에 장기간 노출을 금지하는 교란과 흔히 연관있다. 신규 성장 조건으로 전체 어레이를 이동하는 능력은 펄스 또는 펄스/체이스 노출, 가역성 및 단기간 동역학 연구와 같은 매우 다양한 실험 계획을 허용한다.
분석 시스템의 몇가지 중요한 특징이 평가에 필요하다. 특히, 성장 밀도 및 조건, 민감도, 재생산성 및 리포터를 교란하고 변화를 측정할 수 있는 능력이 주요 초점이었다. 이 분석 시스템의 개발은 10 개의 잘 특성화된 클론의 집합체, 모 플라스미드 클론 및 배지 단독을 사용하여 개시되었다 (표 14). 10 개 클론의 세트는 신호 세기의 분포 뿐만 아니라 DNA 손상제, 특히 날리딕스산으로의 교란에 대한 반응을 나타냈다. 초기 실험은 96-웰 발광 측정기 (다이넥스 ML3000)를 사용한 발광 측정의 민감도 및 단순성에 이익이 있도록 디자인 하였다. 프린팅은 고밀도 복제 장비 (HDRT)를 갖춘 바이오메크 (BioMek) 2000 (베크만 쿨터 (Beckman Coulter))을 사용하여 달성하였다. 이동 사이에서 멸균은 물 중 0.2％ SDS, 멸균수 및 70％ 에탄올에 연속적으로 핀을 적셔 달성하였다. 멸균 후에, 핀을 다음 이동에 앞서 공기-건조시켰다.
균주를 96-웰 디시에서 37℃의 40 ㎕ LB에서 밤새 성장시켰다. 이 배양물을 "프린팅 플레이트"로 디자인하였고 어레이를 제조하기 위한 세포원으로 사용하였다.
막을 UV 조명으로 10 분 동안 멸균한 후 배양 디시에서 예열시킨 배지와 접촉시켰다. 클론 및 대조군을 96-웰 플레이트의 패턴과 유사한 약 8x12 cm 막에 프린트하였다 (도 3A). 균주를 프린트하여 10 개의 균주 및 2 개의 대조군의 8 회 반복 부분을 생성하였고 37℃로 예열된 다이넥스 ML3000 발광 측정기에 두었다. 발광 데이타를 20 분 지속의 40 사이클 동안 (밤새) 각각의 스폿에 대해 수집하였다. 도 3B는 시간의 함수로서 각각의 클론에 대해 수집된 신호를 나타낸다. 도 3C는 동일한 클론 (recA-luxCDABEC)의 복제 스폿으로부터 수집된 신호를 나타낸다. 데이타는 균주가 신규 고상 시스템에서 잘 작동함을 명확히 나타낸다. 예외 없이, 측정된 신호 세기는 액체 배양물에서 수득된 데이타를 확증하였다. 추가로, 최소로 변경된 복제물은 액체 배양 측정과 유사하다.
그 다음에, 시스템을 교란물, 이 경우 날리딕스산에 의한 DNA 손상에 대한 반응을 결정하는 능력을 평가하였다. 모 클론 및 2 개의 비반응 리포터, osmY 및 lacZYA; 및 3 개의 DNA 손상 반응 리포터, uvrA, recA 및 dinG를 선택하였다. 균주를 기재한 바와 같은 새로운 철야 배양물로부터 LB 아가를 통해 이중막으로 프린트하였고 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 세포가 지수 증식기로 들어가게 하였다. 막을 다양한 양의 날리딕스산을 함유하는 신규의 예열된 플레이트로 이동시켰고 광 기록을 ML3000 발광 측정기로 수집하였다. Luxarray 0.5 클론 (도 4A 및 B)을 막에서 프린트하고 LB에서 초기에 성장시킨 후 0 ㎍/ml (다이아몬드), 1 ㎍/ml (정사각형) 또는 5 ㎍/ml 날리딕스산 (삼각형)을 함유하는 플레이트로 이동시켰다. 발광을 다이넥스 ML3000 발광 측정기로 2 시간 동안 30 분 마다 측정하였다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, SOS 레귤론에서 예상된 날리딕스산 매개 유전자의 상향조절을 생물발광의 증가에 따라 측정하였다. 이와는 반대로, 비-DNA 손상 반응 유전자, osmY 및 lacZYA에 대한 유전자를 함유하는 균주는 날리딕스산 처리에 영향을 받지 않았다 (도 4A). luxCDABE 발현을 유도하는 프로모터가 없는 모 플라스미드, pDEW201를 함유하는 균주는 96-웰 마이크로플레이트에서 성장시킨 균주에대해 ML3000 발광 측정기로 측정한 배경에 매우 근접한 매우 낮은 수준의 생물발광을 발생한다. 명백한 기준 생물발광 및 이 균주의 상향조절 (도 4A)은 DNA 손상 반응 유전자 융합체를 함유하는 인접 균주와의 크로스-토크 (cross-talk) 때문일 수 있다.
고밀도 Luxarray 0.5
Luxarray 0.5의 클론 세트를 약 8x12 cm 막에서 고밀도로 클론을 프린팅하여 매우 병렬인 고상 분석을 개발하는데 사용하였다. 이 어레이는 추가의 시스템을 개발하는데 사용하였다.
프린팅 밀도
최종 분석 시스템을 더 가까이 근접하게 하기 위한 노력으로, Luxarray 0.5의 클론을 세포를 프린팅하고 유용한 분석을 수행할 수 있는 최대 밀도를 결정하는데 사용하였다. 어레이를 상기와 같이 증가된 밀도에서 프린팅하고 37℃에서 8시간 동안 성장시켰다. 발광은 이글아이 (EagleEye) II (스트라타진, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 화상을 얻었다. 광학적 검사에서 성장의 개별 클론 영역은 막 당 6144 개의 개별 스폿 이하의 밀도에서 분석될 수 있다. 상이한 밀도에서 성장 영역 크기의 비교에서, 8 시간 성장 기간에 밀도 증가에 반비례하는 양의 성장을 초래하는 영양분-제한 효과가 있다는 것이 나타났다. 상기 밀도에서, 2 배 이상으로 증가된 후, 전체 대장균 게놈에서 전사 단위 수를 확정하였다. 따라서, 단일 8x12 cm 어레이는 대조군에 대해 남은 용량을 사용하여 반복하여 전체 대장균 게놈을 나타낼 수 있다. 별법으로, 2개의 상이한 균주 또는 2종 균주의 전체 게놈 수준을 동일 어레이 상에 인쇄할 수 있다.
고밀도 어레이 화상 집합체
상기 분석법의 정수는 신호 세기를 후속적으로 정량할 수 있는 리포터 구조물로부터 발생된 신호의 화상을 수집하는 것이다. 이는 일정한 수집 파라미터 (초점면, 배율, 누적 시간 및 연산) 뿐만 아니라 발생된 화상을 프로세싱할 수 있는 하류 화상 분석을 필요로한다. 본 발명에서 유용한 것 중의 하나인 화학적 교란은 하나의 배양 플레이트에서 다른 플레이트로 막을 물리적으로 재배열하는 것이 필요하다. 이는 최소 X-Y 위치 등록을 갖는 화상을 초래한다. 여러가지 상업적으로 시판되는 제품은 상기 화상을 효과적으로 프로세싱할 수 있다. 어레이비전 (ArrayVision) (등록상표) (이메이징 리서치 (Imaging Research), 캐나다 토론토 소재) 및 이미지퀀트 (ImageQuant) (몰레큘라 다이나믹스 (Molecular Dynamics), 미국 캘리포니아주 서니배일 소재)는 적절한 소프트웨어 패키지의 두가지 예시이다.
고밀도 Luxarray 0.5 날리딕스산 교란
0.5의 클론을 4x4 밀도에서 상기 언급한 바와 같이 어레이를 프린팅하는데 사용하였다. 도 3에서 각각의 단일 스폿은 4x4 서브어레이에서 16 회 복제되었다. 이는 어레이의 상이한 영역상에 128 회 프린팅되는 각각의 클론을 초래한다. 어레이는 새로운 철야 배양물로부터 LB 배지를 함유한 플레이트 상의 막에 3 회 프린팅되었다. 37℃에서 6 시간 동안 성장시킨 후 막을 LB 배지 또는 프로모터 세기의 범위 영역에서 반응하는 프로모터의 검출가능한 유도를 야기하는것으로 선술된 5㎍/ml 날리딕스산 (NA)으로 보충한 LB 배지를 함유하는 예열된 플레이트로 이동시켰다 (도 4). 배양물을 교체하여 37℃에서 연속 성장시켰다. 냉각 CCD 카메라 (플루오로켐 8000: fO.85 렌즈, 2 분 노출. 알파이노테크)를 사용하여 재배치한 후화상을 0 내지 8 시간 동안 2 시간 마다 각각의 어레이에서 수집하였다. 스폿 세기를 어레이비전TM(이메이징 리서치, 캐나다 토론토 소재)을 사용하여 결정하였다. 도 5는 리포터 유전자 융합체를 함유하는 선택된 균주에 대한 결과를 나타낸다.
발광 측정기로 정량된 저 밀도 실험에서 밝혀진 바와 같이, 각각의 클론에서 예상되는 반응은 잘 입증되었다. 5 개 입증된 DNA 손상-반응 리포터 구조물은 발현의 상향조절을 분명하게 보인다. 이와는 반대로, lac 프로모터 융합체를 보유하는 균주 뿐만아니라 다른 프로모터 융합체를 보유하는 여러가지 균주로부터의 광 생성이 감소되었다. 이는 날리딕스산 처리된 균주의 성장 및 대사의 감소를 반영하는 생물발광을 감소시켰고 SOS-레귤론 유전자 융합체의 상향조절의 특이성을 입증한다. 게다가, 모 플라스미드를 함유하는 균주로부터의 신호는 프로모터-lux 융합체를 사용한 균주의 신호보다 극적으로 낮은 크기를 갖고, 따라서 데이타 포착에서 냉각 CCD 카메라의 이점이 입증된다.
Lux 어레이 1.0. 매우 평행한 프로모터 활성 분석법
lux 유전자 융합체의 최대로 중복되지 않은 세트의 선택
게놈 등록 Lux-A luxCDXBE 유전자 융합 집합체 (실시예 1에 기재) 4988 개의 플라스미드-생성 유전자 융합체의 목록, 각각의 대장균 게놈에 대한 경계 정보 및lux 오페론에 대한 방향을 제공한다. 작동가능하게 연결되거나 기능적인 구조물은 lux 오페론으로 및 lux 오페론을 통해 진행되는 프로모터에서 개시되는 전사를 일으키는 방향에서 프로모터 없는 lux 오페론에 인접한 프로모터를 포함하는 게놈 단편으로 구성된 것으로 정의되었다. 그러므로, 집합체의 기능적 서브세트를 확인하기 위해, 첫째로 기능성 및 둘째로 중복성의 기준을 클론의 목록을 여과하기 위해 컴퓨터로 계산하여 적용하였다. 입증되고 예상된 오페론의 정의 목록 [Thieffry et al. (1998) Bioinformatics 14: 391-400]을 오페론에서 첫번째 오픈리딩프레임 (ORF)의 전사 개시 코돈 위치 및 오페론에서 마지막 ORF의 전사 종결 코돈 위치와 같은 오페론의 게놈 좌표를 정의하는데 사용하였다. 추가의 정보는 오페론이 코딩된 (전사 방향) 가닥 및 유전자 명칭 (보통 또는 "b" 개수)을 포함하였다. lux 유전자 융합체를 하기 가정을 사용하여 계산하여 여과하였다; (i) 기능적 전사 융합체가 첫번째 ORF의 개시 코돈의 50 염기쌍 초과의 상류에서 개시하고 오페론에서 첫번째 ORF의 개시 코돈과 오페론에서 마지막 ORF의 종결 코돈 사이의 임의의 장소에서 종결하고, 그 때문에 프로모터와 lux 오페론 사이의 구조물에서 전사 종결 신호의 발생을 제거하는 임의의 게놈 단편을 생성하고; 및 (ii) 게놈 단편을 함유하는 프로모터는 lux 오페론에 대해 정확한 방향으로 만나야 한다 (도 6에서 그림으로 표현). 마지막으로, 하나 이상의 클론이 단일 오페론에서 기준에 맞는 경우, 중복성을 제거하고 상류 서열의 최대량을 나태내는 게놈 단편을 함유하는 하나의 구조물만이 남았다. 사용된 PERL 코드 및 선택된 유전자 융합체의 689 개의 생성된 목록을 반응식 1 및 표 18에 나타냈다 (하기 실시예 7). 상기 융합체는 대장균게놈에서 2584 개의 공지되고 예상된 전사 단위의 27％를 나타낸다. 확인된 유전자 융합체를 함유하는 균주의 개별 배양물은 90 개의 기점 배양 플레이트로부터 다시 어레이되어 나란한 대칭으로 반복된 모든 확인된 융합체를 함유하고 적절히 위치한 대조군을 포함하는 16 개 96-웰 마이크로플레이트의 세트를 생성하였다. 이 16 개 플레이트 표현을 후속적인 분석에서 세포 어레이를 형성하는데 사용하였다.
리포터 어레이의 제조
대장균 균주 37℃의 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된 LB 배지 40 ㎕ 중에서 16 개 96-웰 디시의 세트에서 밤새 성장시켰다. 이 배양물을 "프린팅 플레이트"로 디자인하였고 어레이를 제조하기 위한 세포원으로 사용하였다. 다공성 막 (바이오딘 B, 넌크)을 UV 조명으로 10 분 동안 멸균한 후 배양 디시 (옴니트레이, 넌크)에서 예열된 고체 LB 성장 배지와 접촉하여 두었다. 4 X 4 서브어레이의 프린팅을 고밀도 복제 장비 (HDRT)를 갖춘 바이오메크 2000 (베크만 쿨터)를 사용하여 달성하였다. 이동 사이에서 멸균은 물 중 0.2％ SDS, 멸균수 및 70％ 에탄올에 연속적으로 핀을 적셔 달성하였다. 멸균 후에, 핀을 다음 이동에 앞서 공기-건조시켰다. LuxArray에서 대장균 균주를 3 중의 2 개의 세트에서 약 8x12 cm 막 상에 프린팅하였다.
어레이에서 성장
초기 실험에서 시스템 중 리포터 균주들의 성장 속도의 분포가 크다는 것이 명확히 입증되었기 때문에, 개개의 콜로니의 성장 속도를 평가하였다. 이러한 차이에 대해 클론-의존성 또는 시스템-의존성 공급원 사이를 차별화하기 위해서, 테트라졸리늄 블루 10 ㎍/ml을 함유하는 LB 아가 배지를 사용하여 생물발광 세포 어레이를 다른 날에 3 회 생성하였다. 생세포가 테트라졸리늄 블루를 환원하는 경우, 발생된 생성물은 불용성 청색 침전물이다. 이는 정상적인 광에 의한 세포의 직접 화상을 단순화하는 세포와 배지 사이에서의 명암 대비를 크게 증가시켰다. 각각의 3 번의 실험에서, 각각의 클론을 가시적으로 스코어링하여 37℃에서 8 시간 동안의 인큐베이션 동안 발생되는 성장 규모를 측정했다 (데이타는 나타내지 않음). 상기 차이는 명확히 클론-특이적이고 매우 일관되었다. 제안된 분석의 대부분이 상대적인 측정치이고 클론간 비교가 쉽지 않기 때문에, 이런 유형의 성장 차이가 전체 분석 시스템의 유용성 또는 신뢰성에 영향을 미치지 않는다. 이러한 차이의 원인을 결정하기 위한 추가의 시도를 하지는 않았으나, 이는 클론이 보유한 플라스미드 구조물에 의한 것이라고 추정할 수 있다.
LuxArray 1.0의 생물발광
생물발광의 화상을 추가의 광원없이 냉각 CCD 카메라 (플루오로켐 8000: fO. 85 렌즈, 2 분 노출, 알파이노테크)를 사용하여 얻었다. 풍부한 배지에서 16 시간 동안 성장시킨 상기 어레이로부터 생물발광을 도 7에 나타낸다. 도 7에서 어레이는 대조군 균주, lacZYA 프로모터 융합체와의 균주 및 모플라스미드 (pDEW201)를 함유하는 균주를 포함하는 나란히 복제된 서브어레이를 나타낸다.
LuxArray 1.0을 사용한 날리딕스산 반응 유전자 융합체의 확인
항생물질인 날리딕스산, SOS DNA 손상 스트레스 반응의 효과적인 유도인자로 공지된 DNA 자이레이즈의 억제제를 본 어레이의 이용을 설명하는데 사용하였다.어레이는 LB 배지를 함유하는 플레이트상의 막에서 새로운 철야 배양물로부터 프린팅되었다. 37℃에서 6 시간 동안 성장시킨 후 막을 LB 배지 또는 5 ㎍/ml 날리딕스산 (NA)으로 보충한 LB 배지를 함유하는 예열된 플레이트로 이동시킨 후 교체하여 37℃에서 연속 성장시켰다. 냉각 CCD 카메라 (플루오로켐 8000: fO.85 렌즈, 2 분 노출. 알파이노테크)를 사용하여 재배치한 후화상을 0 내지 8 시간 동안 2 시간 마다 각각의 어레이에서 수집하였다. 스폿 세기를 어레이비전TM(이메이징 리서치, 캐나다 토론토 소재)을 사용하여 결정하였고, 생성된 픽셀 밀도 측정은 각각의 스폿에 대한 확인물질을 사용하여 주형으로 들여왔다. 각각의 3 중의 스폿에 대한 평균 신호를 계산하였다. 근접한 스폿의 교차 조명에서 생성되는 배경 신호를 각각의 3 중 화살표에 모 플라스미드와 함께 있는 균주를 함유하고 3 개의 중앙치의 평균을 계산한 24 개 스폿의 중앙치를 찾아냄으로써 계산하였다. 이 배경 신호를 각각의 시점에서 계산하고 상응하는 시점에서 각각 측정된 것에서 뺐다. 모든 음수는 0으로 전환하였다.
날리딕스산에 의한 성장의 억제를 설명하기 위한 데이타 표준화를 각각의 시점에서 각각 처리한 어레이의 각각의 스폿의 평균 신호의 합을 찾아냄으로써 수행하였다. 표준화 인자 (NF)를 하기에 따라 계산하였다:
NF = 전체 어레이 신호 (제0시점, LB 대조군) / 전체 어레이 신호 (시간 x, 조건 y)
각각의 측정치에 NF를 곱하여 표준화된 신호를 수득하였다. 날리딕스산 처리된 스폿과 상응하는 대조군 스폿의 비율을 표준화 데이타를 사용하여 계산하였다.
표준화된 데이타의 비율을 어레이의 독립된 배양물에서 얻어진 각각의 2 중 스폿과 비교하였다. 추정되는 날리딕스산 상향조절된 유전자 융합체를 2중 스폿 둘 다의 비율이 2 시간과 4 시간 시점 모두에서 2 이상인 것을 선택하였다. 12 개 유전자 융합체를 상기 기준으로 선택하였다 (표 15).
상기 12 개 유전자 융합체는 SOS 레귤론의 3 개의 잘 특성화된 구성원 뿐만 아니라 날리딕스산 처리에 의해 상향조절되는 것으로 사전에 공지되지 않은 프로모터에 대한 여러가지 융합체를 포함한다. 각각의 12 개 배양물로부터 단리된 플라스미드 DNA의 DNA 서열은 각각의 인서트 DNA의 동일성을 재확인하였다. LuxArray는 SOS 레귤론 오페론에 대한 전체 6 개 유전자 융합체를 함유하고, 모두는 날리딕스산에 의해 상향조절되는 것으로 예상된다. 따라서 3 개가 잘못하여 음성으로 기록되었다. 데이타의 조사는 2 개의 상기 가음성이 선택 기준의 수준이 아니지만 재현되는 것을 나타냈다; uvrD에 대한 융합체는 4 시간 동안 날리딕스산을 처리했을 때 1.6 및 1.9 배로 상향조절 되었고, ruvA에 대한 융합체는 동일한 시점에서 1.7 및 2.1 배로 상향조절 되었다. 3 번째는 일관된 반응을 보이지 않았다; dinF-lux 융합체에서 날리딕스산의 처리와 비처리 비율이 2 중 스폿 중 하나에서는 4.2이고 다른 하나에서는 0.7이었다.
액체 배지에서 시험하여 날리딕스산 상향조절된 유전자 융합체의 확인
각각의 신규 확인된 추정되는 날리딕스산 상향조절되는 유전자 융합체 및 2개의 공지된 SOS 유전자 융합체를 7 개 농도의 날리딕스산 (80 ㎍/ml을 1.2 ㎍/ml로 2 배 희석)을 갖는 액체 배지에서 지수적으로 성장시킨 배양물을 사용하여 다시 시험하였다. 액체와 고체 성장 사이의 반응에 차이가 공지되지 않았기 때문에 여러가지 농도의 날리딕스산을 사용하였다. 37℃에서 2 중 배양물 100 ㎕의 광 생성을 96 웰 플레이트 발광 측정기 (루미노스칸 아센트 (Luminoskan Ascent), 랩시스템 (Labsystems))를 사용하여 측정하였다. 표 15는 2 시간에서 최대 반응을 수득한 농도의 날리딕스산 처리된 배양물과 처리되지 않은 대조군의 신호 비율로 발현된 결과를 나타낸다. 또한 반응비가 1.5 이상인 시험된 여러 농도의 날리딕스산을 나타낸다. 액체 배지 시험은 날리딕스산에 의한 성장 억제에 옳지 않다는 것을 주목해야한다. 1.8 이상의 최대 반응 비의 표준 및 3 개 이상의 농도에서 1.5 배 초과의 반응비를 사용하여, 9 개의 추정되는 신규 날리딕스산 상향조절되는 유전자 융합체 중 7 개가 액체 배지에서 재현되는 것으로 나타났다.
미토마이신 C 반응 및 lexAind 돌연변이의 효과
날리딕스산과 다른 작용 메카니즘을 갖는 DNA 손상 화합물인 미토마이신 C을 사용하여 이들 신규 개발된 날리딕스산 상향조절된 유전자 융합체가 DNA 손상에 일반적으로 반응하는지를 결정하였다. 추가로, lexAind 돌연변이의 효과를 시험하여 이들이 SOS 레귤론의 일부분인지를 결정하였다. 예상은 SOS 레귤론 구성원 lexA 기능 [Walker, G; C., (1996)Escherichia coliandSalmonella: Cellular and Molecular Biology ASM Press]에 의존하는 방법으로 날리딕스산과 미토마이신 C 둘다에 의해 유도되는 것이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, b1728의 프로모터 영역의luxCDABE에 대한 융합체가 lexA+ 숙주에서 날리딕스산과 미토마이신 C 둘다에 의해 명백히 유도되지만, lexAind 숙주 균주에서 이들 화학물질에 의해 유도되지는 않았다. 따라서, 상기 결과는 날리딕스산 뿐만 아니라 미토마이신 C에 의해 상향조절이 LexA에 의해 조절된다는 것을 설명한다. 이는 LexA 의존 경향에서 미토마이신 C 처리할 때 b1728 mRNA 전사물의 상향조절의 관측과 일치된다 [Fernandez de Henestrosa et al. (2000). Mol. Microbiol. 35: 1560-1572]. 유사하게, 2 개의 유전자 융합체, oraA 및 yigN은 SOS 레귤론의 신규 구성원으로 확인되었다 (표 16). 흥미롭게도, 4 개의 날리딕스산 반응 유전자 융합체가 일반적인 DNA 손상 반응이 없는 lexA+ 숙주에서 미토마이신 C에 의해 상향조절되지 않았지만, 날리딕스산에 대해 더 특이적으로 반응하였다. 음성, 비-DNA 손상 반응 유전자 융합체가 또한 포함되었다 (표 16).
따라서, LuxArray 분석법은 대장균에서 신규 날리딕스산 상향조절되는 유전자를 확인하는데 유용하였다. 유사하게, 상기 강력한 분석법은 전사 변화를 모니터링하는 혼성화 분석에 대한 경향 평행에서 일반적으로 사용될 수 있다. 다중의 온전한 게놈 수준 용량 및 제조의 상대적인 단순성은 충분한 처리량을 허용한다. 상기 분석법은 프로모터 활성의 기능적인 연구를 수행하는데 중요하다.
실시예 6
집합체의 추가 및 리포터에 융합된 박테리아 게놈 단편 집합체를 생성하는 별법의 방법
랜덤로 생성된 유전자 융합체의 게놈-등록된 집합체를 추가하기 위해 리포터 유전자에 대한 박테리아 프로모터 영역의 융합체를 제조하는 여러가지 방법들이 있다. 이들 방법 중 일부는 또한 유전자 융합체의 커다란 집합체를 만들기 위한 별법의 방법이다.
우선, 더욱 랜덤인 유전자 융합체로부터의 DNA 서열 데이타를 이용하여 완전히 포화되지 않은 집합체에 대한 추가의 유용한 구성원을 확인한다. 이러한 추가 서열은 생성할 수 있다.
처음부터 서열분석되어 있던 동일한 게놈 융합체의 라이브러리, 예를 들어 LuxA, 또는 독립적으로 생성된 라이브러리의 구성원으로부터 생성될 수 있다. 상기 실시예에서 요약한 단계를 통해, 새로 서열분석한 융합체를 게놈 등록할 수 있다.
랜덤로 생성된 융합체의 DNA 서열 분석을 통해, 염색체 DNA의 방향이 역위되어 관심 프로모터 영역이 리포터 유전자에 작동가능하게 작동가능하게 연결되지 못한 경우를 제외하면 유용할 융합체를 확인한다. 이러한 융합체의 선택 및 인서트 DNA 방향의 역위는 집합체에 더욱 작동가능하게 연결된 융합체를 많이 추가함으로써 서열분석된 집합체의 유용성을 상당히 향상시킬 수 있다. 이를 위한 간단한 방법은 클로닝된 영역의 바로 바깥쪽을 절단하는 제한 효소를 사용하여 상기 플라스미드 DNA를 소화시키고, 이 조각들을 재라이게이션시키는 것이다. 이 절차에 의해 플라스미드들의 혼합물이 생성되지만, 이를 함유하지만 다른 가능한 생성물은 함유하지 않는 세포들이 발광할 것이기 때문에 많은 경우에서 올바르게 방향이 잡힌 플라스미드가 발견될 수 있다. 상기 방법은 중합효소 연쇄 반응을 사용하지 않아서 증폭에 의해 가능한 DNA 서열 변화를 피할 수 있다는 잇점이 있다.
이러한 접근법은 Lux-A 집합체 중 비-작동가능하게 연결된 clpB 융합체를 확인하고, 염색체 DNA 절편을 벡터에 대해 역위시키고, 생성된 플라스미드를 보유하는 대장균 균주를 clpB 프로모터 영역의 적당한 방향에 대해 상기 집합체 중 다른 균주와 비교함으로써 입증되었다. Lux-A 집합체로부터의 한 단리물인 lux-a.pkO43.d3는 clpB 프로모터가 있는 대장균 염색체 영역을 함유하지만, 이는 프로모터와 리포터 유전자를 작동가능하게 연결하는데 요구되는 방향과는 반대 방향으로 배향되어 있다. 상기 균주는 광을 매우 낮은 수준으로 생성하는 것으로 측정되었다. 반대로, luxCDABE 리포터 유전자에 적당한 방향으로 작동가능하게 연결된 clpB 프로모터 영역을 갖는 플라스미드를 보유하는 균주인 lux-a.pk054.c3은 광을 높은 수준으로 생성했다. lux-a.pkO43.d3로부터 플라스미드 DNA를 단리하여 제한효소 ZmaI로 소화시키고 T4 DNA 리가제로 라이게이션시켰다. 라이게이션 반응물을 이용하여 대장균 균주 DPD1675를 전기천공법으로 통해 형질전환시켰다. 암피실린 내성을 이용하여 형질전환체를 선택했다. X-선 필름을 노출시켜 검출했을 때, 생성된 형질전환된 콜로니 중 3％가 생물발광하였다. 이들 광 생성 형질전환체 중 염색체 인서트가 역위된 채로 함유되어 있을 것이라 추정되는 luxCDABE 리포터에 작동가능하게 연결된 clpB 프로모터를 보유한 플라스미드를 함유하는 lux-a.pk054.c3 (DPD2243) 및 원래의 lux-a.pk043.d3 2개에서 에탄올 처리에 대한 반응을 비교하였다. 37℃에서 LB 배지에서 활발하게 성장하는 배양물에 4％ 에탄올을 처리하고, 37℃에서 마이크로플레이트 발광측정기 (Dynex ML3000)를 이용하여 광 생성량을 정량하였다. 표 17은 처리한지 38분 후에 2벌 샘플들의 평균 생물발광량을 요약한 것이다.
따라서, 역위된 단리물에서 luxCDABE 오페론의 전사를 구동하는 프로모터의존재는 LB 배지 중에서의 광 생성에 의한 것으로 나타났다. 또한, 열충격 레귤론의 상기 구성원에 대한 에탄올 처리에 의해 상향-조절이 유도된다고 예상되었던 생물학적 반응 역시 증명되었다.
이러한 역위 방법은 유전자 융합체를 Lux-A 집합체에 추가하기 위한 대등한 방식이다. 우선, Lux-A 집합체 중 올바른 게놈 단편을 함유하지만 그 방향이 lux 오페론에 대해 잘못된 방향이고, 현재의 집합체에는 존재하지 않는 약 400개 유전자 융합체의 목록을 유추했다. 8000개 융합체로 이루어진 원래의 집합체로부터 이러한 융합체를 함유하는 균주 각각을 골라내서 다시 성장시켰다. 각각의 생물발광을 정량하였는데, 이는 일부의 경우, 클로닝된 DNA 단편에 전환된 (divergent) 프로모터가 존재하면, 상기 DNA가 관심 프로모터에 대해 역위되었다고 할지라도 광을 생성하기 때문이다. 작업 플레이트로부터 배양물의 10 ㎕로 100 ㎕ LB 배지에 접종한 후 37℃에서 3 시간 동안 인큐베이션 한 후 선택된 균주 중 약 절반 가량이 >0.1 RLU의 광을 생성했다. 이는 <0.1 RLU의 광을 생성하는 균주의 세트가 초기에 수행하기 다 쉽다는 것을 제안하였다. 따라서, 96 웰 포맷에서 플라스미드 DNA의 단리, XmaI 소화 및 재라이게이션한 후, 0.1 RLU 미만의 광을 생성하는 균주로부터 생성되는 라이게이션 반응 혼합물을 0.1 RLU 이상의 광을 생성하는 균주로부터 생성된 라이게이션 반응 혼합물로부터 별도의 플레이트로 분류하였다. 대장균 DPD 1675를 염화 칼슘을 처리하여 감응성으로 만들고 암피실린 내성으로 선택된 재라이게이션된 플라스미드 DNA로 형질전환하였다. X-선 필름 상에 형질전환체 콜로니와 함께 페트리 플레이트에 두고 확인된 광 생성 형질전환체와 접촉하는 다양한 시점에서 노출된 필름을 현상하였다. 광 생성 콜로니를 암피실린을 함유하는 고체화 LB 배지에서 단일 콜로니를 단리하여 정제하였고 and 광 생성을 발광 측정기로 확인하였다. 상기 방법을 0.1 RLU 미만의 광을 생성하는 균주로부터 단리된 36 개 플라스미드에 대해 완결하였다. 역위 염색체 절편을 함유하는 각각의 균주의 플라스미드 DNA를 단리하고 DNA 서열을 결정하여 역위 생성물이 수득되었는지를 확인하였다. 36 개 플라스미드 중 13 개는 BLASTN (기본 세팅)을 사용한 대장균 게놈 DNA 서열과 비교하는 경우 높은 기록을 나타내는 DNA 서열 정보를 수득하였다. 이들 중, 5 개는 기점 클론으로부터 역위 방향에 있는 DNA를 갖는다.
비교적 낮은 성공 비율에는 몇가지 가능성 있는 이유가 있다. 예를 들어, 주석이 달린 몇개의 프로모터는 사용된 조건에서 기능적이지 않거나 생물학적으로 명백한 프로모터가 아닐 수 있다. 따라서, 역위 클론의 광 생성에 의한 선택이 성공적이지 않다. 이와는 반대로, 분류하기 위해 사용된 생물발광에 대한 액체 배양물 시험에서 활성이 없는 전환된 프로모터는 광 생성 클론에 대한 스크리닝에 사용되는 고체화 배지에서 활성을 가질 수 있다. 이는 초기 플라스미드를 함유하는 콜로니의 선택을 이끌 수 있다. 추가로, 마이크로플레이트에서 병렬로 수행하는 경우 불량한 플라스미드 DNA 수율, 불량한 절단 및(또는) 불량한 재라이게이션을 가질 수 있다. 이는 세포간 라이게이션을 최소화하거나 생성된 적은 개수의 형질전환체 콜로니 같은 라이게이션에서 DNA 농도를 이끌 수 있고 역위 인서트 DNA를 사용한 드문 형질전환체가 나타나지 않았다. 따라서, 제한 소화, 재라이게이션, 형질전환 및 광 생성 형질전환체의 선택의 상기 접근은 연구에서 설명되었다. 그러나, 효율적인 병렬 실행에 대한 추가의 최적화가 필요하다.
전환된 프로모터를 함유하는 플라스미드에서 염색체 절편의 역위를 시험하기 위해, yebF에 대한 역방향 융합체를 선택하였다. yebF 유전자가 DNA 손상제인 미토마이신 C에 의해 강하게 유도되는 DNA 마이크로어레이 실험에서 밝혀진 공지되지 않은 오픈리딩프레임이기 때문에 작동가능하게 연결된 yebF에 대한 리포터 유전자 융합체를 수득하는 것은 특히 관심있는 것이었다. 이런 경우, purT 유전자에 대한 전환된 프로모터는 염색체 단편에 존재하였고 역방향 yebF 융합체를 함유하는 균주는 광을 생성하였다. XmaI 소화, 재라이게이션 및 형질전환 후에, 형질전환체의 10％ 가 광을 생성하였다. 이 중에서, 20％ (또는 초기 형질전환체의 2％) 다른 DNA 손상제인 날리딕스산에 의해 강하게 유도되는 것으로 밝혀졌다. 이 결과는 염색체 절편의 원하는 역위가 발생하는 것을 강하게 제안한다. 이는 DNA 서열 분석에 의해 확인되었다. 따라서, 전환된 프로모터를 함유하는 염색체 절편의 역위는 가능하고 2 개의 프로모터가 이들의 생물학적 활성에 의해 구분될 수 있는지를 쉽게한다.
별도의 역위 방법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서 주형으로서 재배열을 필요로하는 클론의 플라스미드 DNA를 사용한다. 보편적인 PCR 프라이머는 게놈 단편 클로닝 부위 (Bam H1)의 측면에 있는 pDEW201 플라스미드를 사용하여 특이적으로 혼성화되도록 디자인하였다. 첫번째 프라이머, pDEWE2S (서열 3, 5'-GGAATTGGGGATCGGAGCTCCCGGG-3'), EcoRl 부위 (GAATTC)의 사용은 내부 AT의 GC로의 미스매치를 통해 SacI 부위 (GAGCTC)으로 전환된다. 두번째 프라이머, pDEWS2E (서열 4, 5'-GAATGGCGCGAATTCGGTACCCGGG-3')의 사용은 내부 GC의 AT로의 전환을 통한 SacI 부위의 EcoRl 부위로의 전환을 초래한다. 따라서, 임의의 pDEW201 클론으로부터 생성된 PCR 생성물은 EcoRI 및 SacI으로 소화될 수 있고 EcoRI-및 SacI-소화된 pDEW201로 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드는 lux 오페론과 관련된 기점 클론의 반대 방향에 기점 염색체 절편을 함유한다. 프라이머가 벡터에 대해 특이성이기 때문에 이는 모든 클론에 대해 사용될 수 있고 고처리량 (96-웰 플레이트) 접근에 이용가능하다.
luxCDABE 리포터와 융합된 대장균 게놈 단편의 추가의 랜덤 라이브러리를 제작, 서열 분석 및 등록
플라스미드 pDEW201에서 대장균 게놈 단편의 독립 랜덤 라이브러리가 제작되었고 LuxZ 라이브러리라 불렀다. 대장균 균주 W3110로부터 단리된 염색체 DNA [Emsting et al., (1992) J Bacteriol. 174: 1109-1118]를 제한 효소 Sau3A1을 사용하여 부분적으로 소화시키고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 크기 분별시키며, 대략 0.7 KB 평균 크기를 갖는 분율을 단리하였다. 이 분율을 BamHI으로 미리 소화시키고 송아지 장 알칼린 포스파타제로 처리한 pDEW201와 라이게이션하였다. 라이게이션 생성물을 사용하여 스트라타진에서 제공된 프로토콜에 따라 초감응성 대장균 XL2Blue 세포 (스트라타진)를 암피실린 내성으로 형질변환시켰다. 랜덤하게 선택된 개별 XL2Blue 형질전환체의 예비 특성은 큰 퍼센트 (16의 16)는 0.1 내지 1.5 KB의 크기 범위인 인서트 DNA를 함유하는 것을 지시하였다. 대략 150,000 개의 상기 형질변환체가 풀링되고 퀴아젠 팁20 칼럼 (퀴아젠 코포레이션)을 사용하여 단리된 외생의 LuxZ 라이브러리 플라스미드 DNA의 근원으로 사용되었다. 상기 플라스미드 DNA 풀을 100 배 희석한 후 사용히여 전기영동에 의해 대장균 DPD1675를 형질전환하였다 [Van Dyk and LaRossa (1998) Methods in Molecular Biology: Bioluminescence Methods and Protocols, Humana Press inc. vol. 102: 85-95]. 전기감응성 DPD 1675 세포를 대략 2.4 x 108세포/ml의 LB 배양물 1 리터로 시작하여 제조하였다. 얼음으로 냉각한 후, 상기 배양물의 세포를 6,555의 평균 상대적인 원심력으로 5 분 동안 원심분리하여 수집하였다. 세포를 were washed twice 얼음 냉각된 멸균 증류수로 2 회 세척하고 (첫번째 세척은 1 리터이고 두번째 세척은 500 ml) 원심분리하였디. 그 다음 세포를 증류수 중 얼음 냉각된 멸균 10％ 글리세롤로 세척하고 원심분리하였다. T 세포 펠렛의 마지막 재현탁을 증류수 중 얼음 냉각된 멸균 10％ 글리세롤로 수행하여 최종 부피 2.1 ml을 수득하였다. 55 ㎕ 분액을 제조하고 건조 얼음 및 에탄올에서 빠르게 동결시킨 후, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 상기 하나의 분액을 얼음에서 해동시키고, 희석한 LuxZ 라이브러리 플라스미드 DNA 1.0 ㎕을 첨가하고, 세포 및 플라스미드 DNA를 얼음에서 전기영동 큐벳 (바이오라드 (Biorad), 젠 펄서 (Gene Pulser) (등록상표)/E.coli 펄서 (Pulser)TM)으로 이동하였다. 캡을 씌운 큐벳을 25 μF 전기 용량에서 1.85 볼트로 전기영동한 후 SOC 배지 (리터 당: 20 g 트립톤, 5 g 효모 추출물, 0.5 g NaCl, 2.5 mM KC1, 2.5 mM MgCl2, 20 mM 글루코스, pH 7.0) 0.5 ml을 첨가하였다. 37℃에서 30 분의 표현형의 발현 시간을 사용하여 시블링 (sibling)의 존재를 최소로 하였다. 상기 인큐베이션 후, 물 중 24％ 멸균 글리세롤 500 ㎕를 첨가하고 분액 100 ㎕를 제조하고 건조 얼음으로 동결시키고 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 이 분액을 해동하고, 암피실린을 함유하는 LB 배지에 플레이트를 두고, 4608 개 단일 콜로니를 선택하여 384 개 웰 마이크로플레이트에서 1 x 동결 배지 (100 ㎍/ml 암피실린, 5.54％ 글리세롤, 36 mM K2HP04, 13.2 mM KH2PO4, 1.7 mM NaC6H507: 2H20, 4O mM MgS04, 6.8 mM NH4S04를 함유한 LB) 80 ㎕ 에 성장 배양물을 접종하는데 사용하였다. 상기 플레이트는 96 웰의 깊은-웰 플레이트에 100 ㎍/ml 암피실린을 함유한 테리픽 브로스 (Terrific Broth) (깁코 BRL, 인크 제품)에 포화되는 접종 및 성장에 사용될 때까지 -80℃에서 저장하였다. 플라스미드 DNA를 퀴아젠 R.E.A.L.TM프렙 방법을 사용하여 하기 변형에 따라 배양물로부터 추출하였다: 세포 용해 후, 플레이트를 5 분 동안 끓는 수조에 둔 후 완충용액 R3으로 침전시키기 전에 재빨리 얼음-수조에서 냉각시킨다. 상기 변형은 비말단A 숙주 균주, DPD 1675가 존재할 때, 뉴클레아제에 의한 플라스미드 DNA의 분해를 예방한다. DNA 서열 분석 반응을 대략 1 ㎍ 의 플라스미드 DNA로 표준 ABI 프리즘TMd로다민 다이터미네이터 레디 리액션 조건 하에서 전방향 프라이머 pDEW201 (서열 1, 5'-GGATCGGAATTCCCGGGGAT-3') 및 역방향 pDEW201 (서열 2, 5'-CTGGCCGTTAATAATGAATG-3')을 사용하여 수행함으로써 각각의 인서트 말단의 서열 정보를 수득하였다. DNA 서열을 5％ PAG 롱레인저TM(FMC, Inc.) 겔의 4x 운행 조건하에서 ABI377TM-XL 96-레인 개발된 시퀀서로 결정하였고 ABI 소프트웨어로 분석하였다. DNA 서열을 UNFIX 기초로 하는 유틸리티로 이동하여 추가의 분석을 하였다. 각각의 Lux-Z 클론 (양쪽 방향)의 시작부 및 말단부 서열의 상동성 조사 및 대장균 게놈에 대한 등록을 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였고 1799 개의 추가의 게놈 등록 유전자 융합체를 생성하였다.
실시예 7
액체 배지에서 Lux Array 1.04, 게놈 수준, 프로모터 활성 분석 및 리모넨 센서를 개발하기 위한 그의 용도
LuxArray 1.0을 확장하기 위한 추가의, 중복되지 않은 lux 유전자 융합체의 선택
작동가능하게 연결된 유전자 융합체를 실시예 5에 기재된 계산 필터를 사용하여 실시예 6에 기재된 게놈 등록 LuxZ 유전자 융합 집합체로부터 선택하였다. 그 다음 이 목록을 Lux Array 1.0을 함유하는 프로모터의 현재 목록과 비교하여 중복되는 것을 제거하였다. 이 방법은 LuxArray를 확장하는데 유용한 149 개 유전자 융합체의 확인을 초래한다.
또한, 실시예 6에 기재된 사전에 서열분석된 유전자 융합체의 역위에 의해 발생되는 5 개 유전자 융합체 및 다른 근원으로부터의 6 개 유전자 융합체를 첨가하였다. 표 19는LuxArray 1.0 에서 유전자 융합체와 함께 LuxArray 1.04를 수득하는 이들 추가의 160 개 유전자 융합체를 열거한다. 따라서, Lux Array 1.04에서 849 개 유전자 융합체는 대장균 게놈에서 2584 개 공지되고 예상된 전사 단위의 33％를 나타낸다. 신규 확인된 유전자 융합체를 함유하는 개별 배양물을 마이크로플레이트 번호 15 및 신규 마이크로플레이트 번호 17 내지 19로 존재하는 비어있는 웰에 첨가하고 나란한 대칭으로 중복하여 만들었다. 모 플라스미드 및 멸균 대조군을 가진 균주를 함유하기 때문에 전자의 마이크로플레이트 16은 제거되었다. 따라서, the Lux Array 1.04는 세포 어레이를 나타내는 18 마이크로플레이트를 함유한다. 이들은 동결 배지에서 -80℃에서 저장되었다.
액체 배양물에서 리포터 어레이의 리모넨 스트레스
LuxArray 1.04 대장균 균주를 함유하는 -80℃의 마이크로플레이트를 해동하고 코스타 (Costar) 번호 3595 평평한 바닥 96-웰 마이크로플레이트에서 100 ㎍/ml 암피실린으로 보충된 LB 배지 100 ㎕에 접종하는데 사용하였다. 37℃에서 밤새 성장시킨 후, 플레이트를 광학적으로 조사하고 혼탁도가 거의 없는 임의의 웰을 기록하였다. 그 다음 상기 배양물을 코스타 (Costar) 번호 3595 평평한 바닥 96-웰 마이크로플레이트에서 15 ㎕ 내지 135 ㎕ LB 배지로 이동시켜 희석하고 습기있는 박스에서 IKA 셔틀러 (Schuttler) MTS 4 진탕기로 37℃에서 2 시간 동안 400으로 세팅하여 온건하게 진탕하였다. 각각의 활발하게 성장시킨 배양물 20 ㎕를 하나는 80 ㎕의 LB 배지를 함유하고, 다른 하나는 실온의 리모넨으로 포화된 80 ㎕ of LB 배지를 함유하고 세번째는 리모넨으로 포화된 40 ㎕의 LB 배지 및 40 ㎕의 LB 배지를 함유하는 3 개의 마이크로플레이트 세트에 상응하는 웰로 이동시켰다. 초기 (제0시간) 기록은 37℃로 예열된 MLX 마이크로플레이트 발광 측정기 (Dynex)를 사용하여 얻었다. 그 다음 플레이트를 37℃에서 진탕하지 않고 두었다. 추가의 생물발광 측정을 45, 90 및 135 분에서 하였다. 각각의 날에 취급하는 마이크로플레이트의 번호를 제한하기 위해, LuxArray 1.04 마이크로플레이트 1 내지 5, 마이크로플레이트 6 내지 10, 마이크로플레이트 11 내지 15 및 마이크로플레이트 17 내지 19를 각각의 다른 4 일에 사용하였다.
리모넨 유도 반응의 데이타 분석.
데이타를 각각의 개별 날에 수집된 데이타를 기준으로 리모넨에 의한 성장-억제를 정정하기 위해 표준화하였다. 각각의 3 가지 조건하에서 각각의 날의 실험에서 각각의 개별 배양물의 생물발광 (RLU)을 첨가하여 매일의 어레이 전체 RLU를 결정하였다. 이를 사용하여 하기의 매일 표준 인자 (DNF)를 찾았다:
DNF = 매일 전체 어레이 신호 (제0시점, LB 대조군) / 매일 전체 어레이 신호 (시간 x, 조건 y)
상응하는 날, 시점 및 조건로부터 각각의 측정은 DNF에 의해 곱해져서 표준화된 신호를 수득하였다. 거의 성장하지 않은 것으로 기록된 웨로부터 데이타를 추가의 분석에 사용하지 않았다. 표준화된 데이타를 젠스프링 (GeneSpring) (실리콘 제네틱스 (Silicon Genetics)) 소프트웨어로 분석하였는데, 이 때 각각의 리포터 유전자 융합체에 대한 각각의 중복 배양물로부터 신호를 평균하였다.
전체적으로, LB 배지 중 40％ 포화된 리모넨 의 조건하에서 유전자 발현의 상향조절이 거의 없었다. 따라서, LB 배지 중 80％ 포화된 리모넨으로부터 유전자 발현 패턴을 추가로 조사하였다. 목록은 각각의 시점에서 2 배 이상으로 상향조절된 유전자 융합체로 만들어졌다. 이 목록은 조사되었고 모든 조건에서 매우 낮은 표준화된 RLU 값 ( < 0. 012 RLU)을 갖는 유전자 융합체를 제거하였다. 상항조절된 유전자 융합체를 하기 표 20에 열거하였는데, 이 때 가장 작은 b 번호를 갖는 각각의 오페론에서 유전자의 명칭을 사용하여 각각의 유전자 융합체를 확인하였다. "*"가 발현이 2 배 미만으로 증가되었는지를 나타내는 반면, "> 2X"의 지시는 상향 조절을 나타낸다. 45 분에서, 14 개 유전자 융합체의 발현이 증가되었다; 이들 중 어느것도 3 배 이상 증가되지 않았다. 90 분에서, 37 개 유전자 융합체가 유도되었다; 이들은 45 분에 관측된 유전자 융합체 중의 하나를 거의 포함하였다. 그러나, 90 분에 가장 강하게 상향조절된 유전자 융합체는 45 분에 상향조절이 관측되지 않았다. 이들은 luxCDABE 리포터의 uhpT (3.8X), nirB (3.7X) 및 narK (3.6X)의 프로모터 영역에 대한 융합체였다. 135 분에서, 39 개 유전자 융합체가 유도되었는데, 이 때 45 분 또는 90 분에서 관측되지 않은 13 개 융합체가 포함되었다. 이 시점에서, 가장 강하게 상향조절된 유전자 융합체는 uhpT (7.7X), nirB (4.1X) 및 katG (4.1X)의 프로모터 영역에 대한 융합체이다. 따라서, uhpT의 프로모터 영역에 대한 유전자 융합체가 90 분 및 135 분 시점에서 가장 강하게 상향조절되었다.
리모넨에 의한 uhpT-lux 상향조절의 확인
대장균 균주 DPD3228은 aIhpT- luxCDABE 유전자 융합체를 함유하는 lux-a.pk034.b9 균주와 동일하다. 이 균주를 37℃의 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 밤새 성장시키고 LB 배지로 하기 날에 희석하며 37℃에서 대수 증식기로 성장시켰다. 상기 배양물의 20 ㎕ 분액을 리모넨으로 포화된 LB 배지 80 ㎕, 리모넨으로 포화된 LB의 LB 배지로 2 배 희석된 계열 80 ㎕ 및 LB 배지 80㎕에 첨가하였다. 광 생성을 37℃에서 루미노스칸 아센트 (Luminoskan Ascent), (랩시스템 (Labsystems)) 마이크로플레이트 발광 측정기로 측정하였다. 도 10은 그 결과를 나타낸다. 초기 LuxArray 관측과 유사하게, 리모넨 존재에 대해 늦은 반응이 관측되었다. 이 반응은 시험된 리모넨의 가장 높은 농도에서 최대이지만, 또한 리모넨이 LB 배지 중 40％ 또는 20％의 포화된 양으로 존재하는 경우에 검출되었다. 따라서, 이 균주로부터 리모넨에 의한 생물발광의 상향조절이 확인되었고, 리모넨에 대한 센서로의 이용이 입증되었다.

Claims (22)

  1. (a) 게놈 수준의 게놈 등록 집합체 둘 이상을 조립하는 단계,
    (b) 하나 이상의 교란물 (perturbations)로 상기 (a)의 각 집합체를 교란시키는 단계,
    (c) 각 집합체에서 상기 (b)의 각 교란에 대한 반응을 측정하는 단계, 및
    (d) 상기 하나 이상의 교란 결과를 분석하여 둘 이상의 게놈 등록 집합체 사이의 패턴의 유사성 및 차이를 확인하는 단계
    를 포함하는, 둘 이상의 게놈 등록 집합체 사이에서 유전자 기능을 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 교란이 방사선, 습도, 온도 변경, 탄소원 변경, 에너지원 변경, 질소원 변경, 인원 (phosphorus source) 변경, 황원 (sulfur source) 변경, 미량 원소원의 변경, pH의 변화, 다른 유기체의 존재, 화학물질의 존재, 독소의 존재 및 비정상 수준의 정상 대사물질로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  3. (a) 1) 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 게놈 단편 및 2) 상기 1)에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 포함하는 유전자 융합체 세트를 생성하는 단계,
    (b) 단계 (a)에서의 리포터 유전자 융합체를 숙주 유기체에 시험관내 도입하는 단계,
    (c) 상기 유기체의 게놈 서열에 대한 서열 상동성을 기초로 리포터 유전자 융합체를 등록하는 단계, 및
    (d) 상기 리포터 유전자 융합체가 상기 유기체의 공지된 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 될 때까지 단계 (a), (b) 및(또는) (c)를 반복하는 단계
    를 포함하는, 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 생성하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단계 (a)에서의 유전자 융합체가 생체내 또는 시험관내에서 생성되는 것인 방법.
  5. (a) 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 DNA로부터 핵산 단편을 무작위로 생성시키는 단계,
    (b) 상기 (a)에서 생성된 무작위 핵산 단편을 프로모터 없는 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 함유하는 벡터에 작동가능하게 연결시키는 단계,
    (c) 상기 유전자 융합체를 함유하는 벡터 (b)를 숙주 유기체에 도입하는 단계,
    (d) 상기 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체와 관련된 무작위 핵산 단편의 원위 말단 및 근위 말단의 핵산 서열을 결정하는 단계,
    (e) 상기 숙주 유기체의 게놈 서열에 대한 서열 상동성을 기초로 단계 (d)에서 서열 결정된 융합체를 등록하는 단계, 및
    (f) 상기 리포터 유전자 융합체가 상기 유기체의 공지된 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 될 때까지 단계 (a), (b) 및(또는) (c)를 반복하는 단계
    를 포함하는, 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 생성하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단계 (a)에서의 무작위 핵산 단편이 제한 효소 소화, 게놈의 물리적인 전단 및 중합효소 연쇄 반응으로 구성된 군에서 선택된 방법에 의해 생성되는 것인 방법.
  7. (a) 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 게놈을 제공하는 단계,
    (b) 상기 (a)의 게놈 중 특정한 공지 영역에 대해 상동성을 갖는 일련의 증폭 프라이머를 제공하는 단계,
    (c) 상기 (b)의 프라이머를 사용하여 상기 (a)의 게놈의 일부를 증폭시켜 핵산 증폭 생성물의 집합체를 형성하는 단계,
    (d) 상기 (c)의 증폭 생성물을 프로모터 없는 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 함유하는 벡터에 작동가능하게 연결하는 단계,
    (e) 상기 리포터 유전자 융합체를 상기 유기체에 도입하는 단계, 및
    (f) 리포터 유전자 융합체가 상기 유기체의 공지된 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 될 때까지 단계 (a) 내지 (e)를 반복하는 단계
    를 포함하는, 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 생성하는 방법.
  8. (a) 각각이 프로모터 없는 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 함유하는 트랜스포존 하나 이상을 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 게놈에 도입하는 단계,
    (b) 게놈 DNA의 근위 말단과 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 함유하는 트랜스포존 사이에 있는 접합부의 핵산 서열을 결정하고, 상기 리포터 유전자 융합체를 상기 유기체의 게놈 서열에 대해 등록하는 단계, 및
    (c) 상기 리포터 유전자 융합체가 상기 유기체의 공지된 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 될 때까지 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계
    를 포함하는, 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 생성하는 방법.
  9. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 유기체가 원핵생물 및 진균으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 원핵생물이 장내 박테리아인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 장내 박테리아가 에쉐리히아 (Escherichia) 및 살모넬라 (Salmonella)로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  12. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체가 luxCDABE, lacZ, gfp, cat, galK, inaZ, luc, luxAB, bgaB, nptII, phoA, uidA 및 xylE로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  13. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 뉴클레오티드 서열의 50％ 이상이 공지되어 있는 것인 방법.
  14. (a) 유도 조건 및 비유도 조건하에서 유기체의 유전자 발현 프로파일을 수득하여, 유도된 유전자를 확인하는 단계,
    (b) 상기 (a)의 유기체의 게놈에 등록되어 있는 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체를 제공하는 단계,
    (c) 상기 (b)의 리포터 유전자 융합체 중 상기 (a)에서 유도된 유전자에 상응하는 융합체를 선택하여 게놈 등록 집합체의 서브세트를 형성하는 단계,
    (d) 상기 (c)의 게놈 등록 집합체의 서브세트를 상기 (a)의 유도 조건에 접촉시켜, 상기 (a)에서와 유사한 방식으로 발현이 변경된 대표적인 리포터 유전자 융합체 하나 이상을 확인하는 단계, 및
    (e) 상기 (d)의 대표적인 리포터 유전자 융합체 하나 이상을 다수의 상이한 유도 조건에 고처리량 방식으로 접촉시켜 상기 리포터 유전자 융합체에 대한 유도 조건의 프로파일을 확인하는 단계
    를 포함하는, 리포터 유전자 융합체의 유도 조건 프로파일을 확인하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 유기체의 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 것인 방법.
  16. (a) 유사유전형 균주의 유전자형과 관련된 관심 유전자형을 사용하여 미생물 배양물의 게놈 수준 유전자 발현 분석결과를 분석하여 대립유전자에 따라 발현이 상이해지는 유전자를 확인하는 단계,
    (b) 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체로부터 상기 (a)에서 발현이 변경된 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 영역을 함유하는 상응하는 리포터 유전자 융합체를 선택하거나 또는 상기 (a)에서 발현이 변경된 것으로 나타난 유전자와 동시 조절되는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 영역을 함유하는 동시 조절되는 리포터 유전자 융합체를 선택하는 단계,
    (c) 상기 리포터 유전자 융합체를 유사유전형 균주에 도입하여, 상기 (b)로부터 선택된 리포터 유전자 융합체의 발현을 시험하는 단계,
    (d) 상기 (c)에서 시험한 2 개의 균주에서 상이하게 발현되는 대표적인 리포터 유전자 융합체 하나 이상을 선택하는 단계, 및
    (e) 고처리량 스크리닝으로 상기 리포터 유전자 융합체를 사용하여 융합체의 발현을 변경시키는 다른 화학물질 또는 유전자를 찾는 단계
    를 포함하는, 고처리량 분석결과를 기초로 유전자 발현을 분석하는 방법.
  17. (a) 관심 조건 또는 관심 화학물질로 처리한 유기체의 게놈 수준의 유전자발현 분석결과를 분석하여, 발현이 변경된 유전자를 확인하는 단계,
    (b) 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체로부터 상기 (a)의 변경된 유전자에 상응하는 유전자 또는 상기 (a)의 변경된 유전자에 상응하는 유전자와 동시 조절되는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 영역을 함유하는 리포터 유전자 융합체를 선택하는 단계,
    (c) 상기 (b)에서 선택된 리포터 유전자 융합체의 발현을 상기 (a)에서 사용한 관심 조건 또는 관심 화학물질로 시험하는 단계, 및
    (d) (c)의 유전자 발현 결과를 (a)의 유전자 발현 결과와 비교하는 단계
    를 포함하는, 포괄적인 게놈 분석 결과를 확인하는 방법.
  18. (a) 가능한 오페론 영역에 맵핑되어 있는 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체로부터 리포터 유전자 융합체의 서브세트를 선택하는 단계,
    (b) 상기 서브세트를 리포터 유전자 기능에 대해 분석하는 단계, 및
    (c) 리포터 유전자의 기능에 대한 정량 결과를 기초로, 추정되는 오페론 구조를 결정하는 단계
    를 포함하는, 오페론 구조를 결정하는 방법.
  19. (a) 1) 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 게놈 단편 및 2) 상기 1)에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 포함하는 유전자 융합체 세트를 생성하는 단계,
    (b) 리포터 유전자 융합체의 게놈 등록 집합체로부터 공지되거나 짐작되는 프로모터 영역을 15％ 이상 대표하는 상기 (a) 세트로부터 각각이 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체에 작동가능하게 연결된 공지되거나 짐작되는 프로모터 영역을 함유하는, 리포터 유전자 융합체의 중복되지 않는 서브세트를 선택하는 단계, 및
    (c) 상기 (b)의 리포터 유전자 융합체의 중복되지 않는 서브세트를 어레이 포맷으로 고정시키는 단계
    를 포함하는, 리포터 유전자 융합체를 함유하는 세포 어레이를 제조하는 방법.
  20. (a) 각각이 1) 게놈 뉴클레오티드 서열의 15％ 이상이 공지되어 있는 유기체의 게놈 단편 및 2) 상기 1)에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자 또는 리포터 유전자 복합체를 포함하는 리포터 유전자 융합체를 포함하며, 하나 이상의 세포 어레이가 대조군 어레이이고 하나 이상의 세포 어레이가 실험 어레이인 2 개 이상의 동일한 세포 어레이를 제조하는 단계,
    (b) 상기 (a)의 실험 어레이를 교란 조건과 접촉시키는 단계, 및
    (c) 대조군 어레이와 실험 어레이의 유전자 발현 활성의 차이를 비교하여, 상기 교란 조건에 대한 유전자 발현 반응을 측정하는 단계
    를 포함하는, 교란에 대한 유전자 발현 반응을 측정하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 세포 어레이를 고체 배지상에 고정시키는 방식 및 액체 배지 중에 어레이시키는 방식으로 구성된 군에서 선택된 방식으로 고정시키는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 교란 조건이 방사선, 습도, 온도 변경, 탄소원 변경, 에너지원 변경, 질소원 변경, 인원 변경, 황원 변경, 미량 원소원의 변경, pH의 변화, 다른 유기체의 존재, 화학물질 존재, 독소의 존재 및 비정상 수준의 정상 대사물질로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
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