DE19751242C2 - DNA-Sequenzen aus Fimbriengenen von Escherichia coli Stamm DSM 6601 - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen aus den Fimbriengenclustern von Escherichia coli Stamm DSM 6601.

Escherichia coli ist ein gramnegatives Bakterium, das in der menschlichen und tierischen Darmflora, aber auch extra­ intestinal vorkommt. E.coli tritt in zahlreichen Varianten auf, die sich hinsichtlich der Kapselantigene, Oberflächenanti­ gene und Flagellenantigene unterscheiden und daher in zahlreiche serologische Typen unterteilt werden können. Die Einordnung nach den Serotypen läßt allerdings keine Aussage über die unterschiedliche Virulenz der Keime zu. Vertreter ein- und desselben Serotyps können sowohl im menschlichen als auch im tierischen Körper ein unterschiedliches Patho­ genitätspotential besitzen, das im Extremfall von avirulent bis hochgradig pathogen reichen kann. Der E.-coli-Stamm DSM 6601 gehört zu der Serogruppe O6:K5 und wird als nicht human- oder tierpathogen bewertet.

Dieser Stamm besitzt zwei chromosomal kodierte Fimbriengencluster, nämlich ein Typ I (fim)- bzw. FIC (foc)-Gen­ cluster. Es ist bekannt, daß die Fimbrien dieses Stammes ein Adhäsin tragen. Adhäsine sind Strukturen, die bei der An­ heftung des bakteriellen Organismus an andere Zellen eine wichtige Rolle spielen.

Fimbriengene finden hauptsächlich Anwendung in der Analytik und Diagnostik. Anwendungsmöglichkeiten sind aber auch in der Medizin und Ernährungsphysiologie bzw. in der Biotechnik gegeben.

Fimbriengene bzw. deren Hauptuntereinheiten können so z. B. zur Charakterisierung eines bestimmten Stammes her­ angezogen werden, so daß ein Bedarf nach weiteren Untersuchungen über die Sequenz dieser Gene gegeben ist.

Erfindungsgemäß wurden jetzt Untersuchungen mit dem E.-coli-Stamm DSM 6601 durchgeführt und die enthaltenen DNA-Sequenzen der Fimbrienhauptuntereinheiten fimA (Abb. 1) und focA (Abb. 2) genauer analysiert. Die von dem Stamm erhaltenen DNA-Sequenzen wurden mit Hilfe von Datenbankprogrammen einer DNA-Sequenzanalyse unterzo­ gen und mit den DNA-Sequenzen bekannter Stämme verglichen. Während bei den Hauptuntereinheiten focA des Stam­ mes DSM 6601 im Vergleich zum Stamm AD 110 Abweichungen an einer Stelle der DNA-Sequenz festzustellen waren, sind in der DNA-Sequenz des fimA-Gens des Stammes DSM 6601 zum Vergleichsstamm HB 101 Abweichungen an mehreren Stellen zu finden, wie Abb. 1 und 2 zeigen:

Zur Analyse der beiden Fimbrienhauptuntereinheiten fimA und focA des Stammes DSM 6601 - und der Vergleichs­ stämme AD 110 und HB 101 - wurden die entsprechenden DNA-Fragmente zunächst mit Hilfe von PCR-Reaktionen aus dem Chromosom der Stämme angereichert.

Die Erfindung wird nunmehr anhand der Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 Anreicherung des fimA-Gens aus den Stämmen DSM 6601 und HB 101

Folgende Primerpaare wurden für diese PCR-Reaktion verwendet:
fimA1: 5'-GTG TAC AGA ACG ACT GCC-3'
fimA2: 5'-GTA ATG ACG TCC CTC AAC-3'
Bedingungen für die PCR:
Schritt 1: 3 min bei 95°C denaturieren
Schritt 2: 45 sec 95°C
Schritt 3: 45 sec 53°C
Schritt 4: 45 sec 72°C
Schritt 5: 5 min bei 72°C
Die Schritte 2-4 wurden 30mal wiederholt.

Beispiel 2 Anreicherung des focA-Gens aus den Stämmen DSM 6601 und AD 110

Folgende Primerpaare wurden für diese PCR-Reaktion verwendet:
focA1: 5'-CTC ACA TTG CAT TTA TGA AG-3'
focA2: 5'-GGT ATA TAT CCG TTA CAC TG-3'
Bedingungen für die PCR: Schritt 1: 3 min bei 95°C denaturieren
Schritt 2: 45 sec 95°C
Schritt 3: 45 sec 51°C
Schritt 4: 45 sec 72°C
Schritt 5: 5 min bei 72°C
Die Schritte 2-4 wurden 30mal wiederholt.

Beispiel 3 Klonierung und Plasmidisolierung

Die in Beispiel 1 und 2 erhaltenen PCR-Produkte werden in Anlehnung an das Verfahren von Sambrook et al. (Sam­ brook, J., Fritsch, E. E, and Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, se­ cond edition (1989), Cloning, Transformation: 1.53-1.84; PCR: 14.00-14.35) in den Vektor pUC 18 kloniert und die re­ sultierende Plasmid-DNA in den E.-coli-K12-Stamm DH5α transformiert.

Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgt in Anlehnung an das Verfahren von Birnboim et al. (Birnboim, A. C. and Doly, J. (1979) Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA).

3 ml LB-Medium werden mit einer Bakterienkolonie beimpft und über Nacht bei 37°C geschüttelt. Diese Kultur wird in einem Eppendorfgefäß abzentrifugiert, der Medienrückstand wird mit einer Pipette entfernt. Das Zellsediment wird mit 100 µl Lösung I (50 mM Glukose; 10 mM EDTA, pH 8; 25 mM Tris-HCl, pH 8) resuspendiert. Nach 5 min Inkuba­ tion bei Raumtemperatur gibt man 200 µl Lösung II (0,2 N NaOH; 1% SDS) dazu, mischt bis zum Aufklären und läßt das Eppendorfgefäß weitere 5 min auf Eis stehen. Dann fügt man 150 µl Lösung II (3 M Na-Acetat, pH 4,8) hinzu, schüttelt kurz bis die chromosomale DNA flockig ausfällt und beläßt den Ansatz nochmals 5 min auf Eis. Die ausgefällte chromo­ somale DNA und die Zellreste werden 5 min in der Zentrifuge pelletiert und der Überstand mit der Plasmid-DNA wird in ein neues Gefäß überführt. Zur Reinigung der Plasmid-DNA werden 50 µl Phenol und 150 µl Chloroform/Isoamylalko­ hol (24 : 1) zugegeben und nach kurzem Schütteln 2 min abzentrifugiert. Die wäßrige Phase wird in ein neues Gefäß pi­ pettiert. Die Plasmid-DNA wird mit 2 Volumina eiskaltem Ethanol ausgefällt und 10 min abzentrifugiert. Das Pellet wird mit 70% Ethanol gewaschen und in der Speedvac getrocknet. Die Plasmid-DNA wird in 20 µl H₂O_bidest resuspendiert und bei -20°C aufbewahrt.

Beispiel 4 DNA-Sequenzierung

Die DNA-Sequenzierung erfolgte in Anlehnung an das Verfahren von Sanger et al. (Sanger, F, Nicklen, S. and Coul­ son, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467. DNA sequencing with chain terminating inhibitors).

Die DNA-Sequenzierung erfolgte mit dem T7-Sequenzier-Kit der Firma Phamacia-LKB.

Für den Denaturierungsschritt werden 8 µl (1,5 bis 2 µg) Plasmid-DNA mit 2 µl 2 N NaOH gemischt, kurz abzentrifu­ giert und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA wird mit 3 µl 3 M Na-Acetat, pH 4,8 sowie 7 µl H₂O_bidest und 60 µl eiskaltem Ethanolal_absolut 15 min bei -70°C gefällt. Die gefällte DNA wird 10 min abzentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen und getrocknet.

Für die Annealing-Reaktion wird die denaturierte DNA in 10 µl H₂O_bidest suspendiert und mit 2 µl Annealing-Puffer und 2 µl Primer (40 ng) gemischt. Der Ansatz wird 20 min bei 37°C inkubiert, so daß eine Bindung des Primers an die Template-DNA erfolgen kann. Der Reaktionsansatz wird 10 min bei Raumtemperatur abgekühlt und dann entweder so­ fort für die Labelling-Reaktion verwendet oder bei -20°C eingefroren. Für die Labelling-Reaktion werden 3 µl Label­ ling-Mix, 1 µl [α-³²P]dATP und 2 µl T7-Polymerase (die T7-Polymerase wurde 1 : 5 mit Enzymverdünnungspuffer ver­ dünnt) in den Annealing-Reaktionsansatz einpipettiert und nach kurzem Mischen 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Währenddessen werden die für die Terminationsreaktion bereits vorbereiteten Sequenziermixe (je 1 Gefäß mit 2,5 µl "G"-, "A"-, "T"- und "C"-Mix "short") bei 37°C vorgewärmt. Nach Ablauf der Labelling-Reaktion werden jeweils 4 µl davon zu den vier Sequenziermixen zugegeben und kurz mit der Pipette gemischt. Die Terminationsreaktionen werden 5 min bei 37°C inkubiert. Zum Beenden der Terminationsreaktionen werden je 5 µl Stop-Lösung zugegeben. Die Ansätze werden nun in einen Inkubator mit 95°C überführt, 2 min denaturiert und dann auf Eis gestellt. Je 2,5 µl der Reaktionen werden auf ein Sequenziergel [25,2 g Harnstoff, 22 ml H₂O_bidest, 6 ml 10 × TBE, 10 ml Polyacrylamid (40%), 2 ml Am­ moniumpersulfat (16 mg/ml), 60 µl TEMED] in der Reihenfolge "G", "A", "T", "C" aufgetragen. Die Elektrophorese er­ folgt bei 40 Watt und 1500 Volt für 4,5 h.

Diese DNA-Sequenzen können auch in an sich bekannter Weise synthetisch hergestellt und bestimmte Sequenzab­ schnitte als Primer verwendet werden, womit dann eine Identifizierung von E.-coli-Stamm DSM 6601 einwandfrei er­ möglicht wird. Es besteht aber auch die Möglichkeit, die entsprechenden DNA-Sequenzen dieses Stammes gentechno­ logisch in andere E.-coli-Stämme einzubringen, um damit z. B. das Verhalten bei der Anheftung der Zellen zu modifizie­ ren und damit die Kolonisationseigenschaften anderer Stämme zu beeinflussen.

SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (4)

1. Nukleinsäure mit der Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO: fimadsm.

2. Nukleinsäure mit der Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO: focadsm.

3. Verwendung der Nukleinsäuren nach Anspruch 1 oder 2 in der mikrobiologischen Analytik und/oder Diagnostik.

4. Verwendung der Nukleinsäuren nach Anspruch 1 oder 2 in der Bio­ technik als Expressionsvektoren.