DE69813836T2

DE69813836T2 - Oligonukleotide zur identifizierung von amidierten polypeptid-hormonvorläufern

Info

Publication number: DE69813836T2
Application number: DE69813836T
Authority: DE
Inventors: Jean Martinez; Catherine Goze
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
Current assignee: Ipsen Pharma SAS; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1997-08-26
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2018-08-08
Also published as: HUP0003567A2; ATE238338T1; BR9811374A; CN1275988A; ZA987444B; IS5383A; ES2198066T3; EP1007532A1; AU8989598A; US20020031765A1; NO20000889D0; NO20000889L; KR20010023284A; PL339084A1; JP2001513981A; FR2767830A1; IL134672A0; CA2301737A1; WO1999010361A1; DK1007532T3

Description

Die Erfindung betrifft neue Oligonukleotide und ihre Verwendung als Sonden für die Identifizierung der für die Vorläufer von amidierten Polypeptidhormonen codierenden mRNA und auf diese Weise für die Identifizierung von neuen amidierten Polypeptidhormonen. Die Erfindung betrifft somit Oligonukleotide, deren Nukleotidsequenz im nachstehenden beschrieben wird, und eine Methode zur Identifizierung der Vorläufer von amidierten Hormonen.
Die amidierten Polypeptidhormone werden in Form eines Vorläufers synthetisiert, der einer Reifung unterzogen wird. Diese Reifung besteht in einer Amidierungsreaktion.
Die Amidierungsreaktion des endständigen C-Atoms ist eine charakteristische Reaktion der amidierten Polypeptidhormone. Diese Reaktion, die an dem Vorläufer eines oder mehrerer Hormone auftritt, gestattet die Reifung des Hormons und gewährleistet auch seine Biostabilität in dem physiologischen Medium: Die gebildete Amid-Gruppe ist weniger angreifbar als die freie Säurefunktion. Das Hormon ist nun gegenüber den Carboxypeptidasen resistenter, bleibt in der Zelle länger aktiv und behält eine optimale Affinität zu seiner Rezeptorstelle bei.
Die Amidierung wurde ausführlich beschrieben ("Peptide amidation", Alan F. Bradbury und Derek G. Smyth, TIBS 16: 112–115, März 1991, und "Functional and structural characterization of peptidylamidoglycolate lyase, the enzyme catalyzing the second step in peptide amidation", A. G. Katopodis, D. S. Ping, C. E. Smith und S. W. May, Biochemistry, 30(25): 6189–6194, Juni 1991); ihr Mechanismus ist der folgende:

1. Spaltung der Vorläufer-Polypeptidkette des Hormons durch eine Endoprotease auf Höhe von zwei basischen Aminosäuren, die Arginin und/oder Lysin sind,
2. dann finden zwei Spaltungen durch die Carboxypeptidase statt, die zu dem Intermediat extendiertes Glycin führen;
3. das Enzym PAM (Peptidyl-glycin-α-Amidatin Monooxygenase) umfaßt zwei verschiedene enzymatische Aktivitäten: in einem ersten Schritt wandelt es das Intermediat extendiertes Glycin in α-Hydroxyglycin-Derivat um, die Untereinheit des Enzyms PAM, die wirksam ist, ist das PHM (Peptidyl-glycin-α-Hydrolylating Monooxygenase). Das erhaltene Derivat dient als Substrat für die zweite Untereinheit des PAM (mit PAL bezeichnet: Peptidyl-α-hydroxyglycin-α-Amidating Lyase), das die Aminfunktion des Glycins an der der N-terminalen Seite unmittelbar benachbarten Aminosäure bindet und das Glyoxylat freisetzt.

Diese Reaktion verlangt das Vorhandensein einer Erkennungsstelle an dem Vorläufer des oder der Hormone, eine Stelle, die immer die Sequenz: Glycin und zwei basische Aminosäuren (Arginin oder Lysin) aufweist (vgl. A. G. Katopodis et coll., Biochemistry, 30(25), 6189–6194, Juni 1991, und genannte Verweise).
Die amidierten Polypeptid-Hormone, die dazu bestimmt sind, aus dem endoplasmatischen Retikulum sekretiert zu werden, sind dafür bekannt, daß sie eine Konsensus-Signal-Sequenz von 15 bis 30 Aminosäuren aufweisen, die am endständigen N-Atom der Polypeptidkette vorliegt. Sie wird später durch ein Enzym Signalpeptidase zerschnitten, so daß man sie in dem sekre tierten Protein nicht mehr vorfindet (vgl. F. Cuttitta, The Anatomical Record, 236, 87–93 (1993) und genannte Verweise).
Die Entdeckung eines neuen Proteins ist gegenwärtig nicht einfach. Die Isolierung und die Reinigung von Proteinen können mit verschiedenen Techniken durchgeführt werden: Ausfällung am isoelektrischen Punkt, selektive Extraktion mit Hilfe von bestimmten Lösungsmitteln und dann Reinigung durch Kristallisation, Abgabe im Gegenstrom, Adsorptionschromatographie, Verteilungschromatographie oder durch Innenaustausch, Elektrophorese ... Diese Techniken setzen jedoch die Kenntnis der Eigenschaften des zu isolierenden Proteins voraus. Wenn man ferner über eine reine Probe eines neuen Proteins verfügt, das in therapeutischer Hinsicht interessant ist, sind noch zahlreiche Schritte auszuführen, bevor man über einen genetisch modifizierten Mikroorganismus verfügt, der es synthetisieren kann.
Die durch die Erfindung vorgeschlagene Methode bietet durch die Verwendung einer Besonderheit der Peptidsequenz des Vorläufers aller bisher bekannten amidierten Hormone den Vorteil, daß es den gleichzeitigen Nachweis von mehreren neuen Hormonen dieser Kategorie gestattet. Diese Untersuchung geht durch die direkte Identifikation der für diese Vorläufer codierenden Nukleotidsequenz in cDNA-Banken vor sich, die aus Geweben hergestellt wurden, in denen die Vorläufer dieser Hormone synthetisiert werden können.
Die Untersuchung durch diese Methode ist viel weniger eingeengt als die oben genannten herkömmlichen biochemischen Techniken, denn

– sie kann dazu führen, nach demselben Prinzip mehrere verschiedene Vorläufer zu isolieren, die in demselben Gewebe vorliegen;
– sie gestattet unter denselben technischen Bedingungen den Nachweis von Vorläufern, die Hormonen mit sehr verschiedenen biochemischen und biologischen Eigenschaften entsprechen;
– sie gestattet die gleichzeitige Identifizierung aller Peptidhormone, die im selben Vorläufer enthalten sein können.

Infolgedessen gestattet die Erfindung einen Zeit- und Kostengewinn, der in einem Sektor nicht vernachlässigbar ist, in dem die Ausgaben für Forschung und Entwicklung einen sehr hohen Anteil des Umsatzes ausmachen.
Die Erfindung gestattet auch die pharmakologische Untersuchung von aktiven Substanzen, die im Organismus von Säugetieren eine grundlegende physiologische Rolle spielen: den Hormonen und insbesondere den amidierten Polypeptid-Neurohormonen. Verfügt man zunächst über die den aktiven Substanzen entsprechenden cDNA's, so ist es möglich, auf genetischem Weg den klonierten Vektor einzuführen, um die Synthese der Hormone, die eine therapeutische Anwendung besitzen, durch Mikroorganismen durchzuführen.
Gegenstand der Erfindung ist zunächst ein einzelsträngiges Oligonukleotid OX das bei milden Bedingungen mit einem Oligonukleotid OY der Sequenz Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 hybridisieren kann, in der Y1 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 12 Nukleotiden darstellt oder Y1 unterdrückt ist, Y2 ein für Gly codierendes Trinukleotid darstellt, Y3 und Y4 unabhängig voneinander ein für Arg oder Lys codierendes Trinukleotid darstellen und Y5 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 21 Nukleotiden darstellt oder Y5 unterdrückt ist.
Unter Nukleotid versteht man eine monomere Einheit der RNA oder der DNA mit der chemischen Struktur eines Nukleosid- Phosphorsäureesters. Ein Nukleosid ergibt sich aus der Verbindung einer Purin-Base (Purin, Adenin, Guanin oder analoges) oder einer Pyrimidin-Base (Pyrimidin, Cytosin, Uracil oder analoges) mit der Ribose oder Desoxyribose. Ein Oligonukleotid ist ein Polymer von Nukleotiden, das eine Primersequenz, eine Sonde oder ein RNA- oder DNA-Fragment bezeichnet.
Die genannten Oligonukleotide können durch Synthese hergestellt werden. Es gibt eine automatisierte Bezugsmethode, die in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben wird: "DNA synthesis" von S. A. Narang, Tetrahedron, 39, 3 (1983), und "Synthesis and use of synthetic oligonucleotides" von K. Itakura, J. J. Rossi und R. B. Wallace, Annu. Rev. Biochem., 53, 323 (1984).
OX kann vorzugsweise bei stringenten Bedingungen mit OY hybridisieren.
Bevorzugter kann OX mit einem Oligonukleotid OY der Sequenz Y2-Y3-Y4-Y5 hybridisieren.
Noch bevorzugter kann OX mit einem Oligonukleotid OY der Sequenz Y1-Y2-Y3-Y4 oder Y2-Y3-Y4 hybridisieren.
Insbesondere kann OX mit einem Oligonukleotid OY hybridisieren, bei dem Y5 eine Nukleotidsequenz Y6-Y7-Y8-Y9 darstellt, in der Y6 ein für Ser, Thr oder Tyr codierendes Trinukleotid darstellt, Y7 ein für eine beliebige Aminosäure codierendes Trinukleotid darstellt, Y8 ein für Glu oder Asp codierendes Trinukleotid darstellt und Y9 eine Nukleotidsequenz mit 1 bis 12 Nukleotiden darstellt. OX kann insbesondere mit einem Oligonukleotid OY hybridisieren, bei dem Y1 und Y9 unterdrückt sind: Insbesondere kann OX mit einem Oligonukleotid OY hybridisieren, bei dem Y2 ein für Gly codierendes Trinukleotid darstellt, Y3 ein für Lys codierendes Trinukleotid, Y4 ein für Arg codierendes Trinukleotid und Y5 eine Sequenz von 3 für Ser-Ala-Glu codierenden Trinukleotiden darstellt: Diese Sequenz wurde mit Hilfe einer statistischen Untersuchung an 27 bekannten Amidierungsstellen bestimmt und hat dazu geführt, daß an 6 Positionen ein bestimmtes Aminosäuremuster definiert wurde: Gly-Lys-Arg-Ser-Ala-Glu.
Aufgrund der Entartung des genetischen Codes und der hohen Anzahl von Codons, die Gly (4 Codons), Arg (6 Codons) und Ser (6 Codons) entsprechen, wurde die Sequenz des Oligonukleotids mit Hilfe von zwei Verfahren konstruiert, die die Berücksichtigung dieser Entartung gestatten:

– Verwendung in manchen Positionen von Inosin, einem Nukleotid, dessen Stickstoffbase, das Hypoxanthin, beliebig mit den vier die DNA bildenden Stickstoffbasen paart,
– Änderung in manchen Positionen der Natur der inkorporierten Stickstoffbase, wodurch eine Anzahl von Kombinationen von Oligonukleotiden erzeugt wird, die zur Anzahl von verschiedenen eingeführten Basen proportional ist.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Nukleotid OY mit 9 bis 42 Nukleotiden der Sequenz Y1-Y2-Y3-Y4-Y5, in der Y1 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 12 Nukleotiden darstellt oder Y1 unterdrückt ist, Y2 ein für Gly codierendes Trinukleotid darstellt, Y3 und Y4 unabhängig voneinander ein für Arg oder Lys codierendes Trinukleotid darstellen und Y5 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 21 Nukleotiden darstellt oder Y5 unterdrückt ist.
Gegenstand der Erfindung ist vorzugsweise ein Oligonukleotid OY, bei dem Y1 unterdrückt ist oder bei dem Y5 unterdrückt ist.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Oligonukleotid OY, bei dem Y5 eine Nukleotidsequenz Y6-Y7-Y8-Y9 darstellt, in der Y6 ein für Ser, Thr oder Tyr codierendes Trinukleotid darstellt, Y7 ein für eine beliebige Aminosäure codierendes Trinukleotid darstellt, Y8 ein für Glu oder Asp codierendes Trinukleotid darstellt und Y9 eine Nukleotidsequenz mit 1 bis 12 Nukleotiden darstellt.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Oligonukleotid OY, bei dem Y1 und Y9 unterdrückt sind.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Oligonukleotid OY, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Y1 unterdrückt ist, Y2 ein für Gly codierendes Trinukleotid darstellt, Y3 ein für Lys codierendes Trinukleotid, Y4 ein für Arg codierendes Trinukleotid und Y5 eine Sequenz von drei für Ser-Ala-Glu codierenden Trinukleotiden darstellt.
Die Erfindung betrifft auch ein einsträngiges Oligonukleotid OZ, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es 15 bis 39 Nukleotide umfaßt und mit einer für die amidierten Polypeptidhormone charakteristischen Konsensus-Signal-Sequenz hybridisieren kann, wobei diese Sequenz die Formel Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 hat, in der Z1 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 12 Nukleotiden darstellt oder Z1 unterdrückt ist, Z2 und Z3 zwei für Leu codierende Trinukleotide darstellen, Z4 und Z5 zwei für zwei beliebige Aminosäuren codierende Trinukleotide darstellen, Z6 ein für Leu codierendes Trinukleotid darstellt und Z7 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 12 Nukleotiden darstellt oder Z7 unterdrückt ist.
In der vorliegenden Erfindung versteht man unter Hormon die amidierten Polypeptidhormone des endokrinen Systems und insbesondere die Neurohormone.
Die Konsensus-Signal-Sequenz ist eine Sequenz, die-von den Vorläufern der Proteine getragen wird, die von den Zellen nach ihrer Reifung sekretiert werden.
Die Erfindung betrifft schließlich eine Gruppe von Oligonukleotiden OX oder OZ, die so beschaffen ist, daß sie eine kombinatorische Bibliothek bilden.
In der hier beschriebenen Erfindung versteht man unter kombinatorischer Bibliothek eine Menge von Oligonukleotiden, die synthetisiert wurden, indem als Modell eine Nukleotidsequenz genommen wurde, die für eine Sequenz von Aminosäuren codiert, von denen manche veränderlich sein können. Infolge der Entartung des genetischen Codes erhält man eine Menge von ver8schiedenen Oligonukleotiden.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist ein Methode zur Identifizierung des Vorläufers eines Peptids mit einem endständigen amidierten C-Atom, gekennzeichnet durch die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte:

1. Erstellung einer DNA-Bank;
2. Hybridisierung einer oder mehrerer Oligonukleotide OX mit dieser DNA-Bank;
3. Identifizierung der DNA-Sequenz oder -Sequenzen der Bank, die mit einem Oligonukleotid OX hybridisiert bzw. hybridisieren;
4. Identifizierung in dieser Sequenz oder in diesen Sequenzen eines oder mehrerer Peptide mit einem möglichen endständigen amidierten C-Atom.

Man bevorzugt eine Methode, bei der die DNA-Bank eine cDNA-Bank ist.
Die komplementäre DNA (cDNA) ist eine Nukleotidkette, deren Sequenz zu der einer mRNA komplementär ist, wobei die zu den einkettigen cDNA führende Reaktion durch die inverse Transkriptase katalysiert wird. Die zweikettige cDNA kann durch Einwirkung der DNA-Polymerase erhalten werden, sie wird anschließend mit Hilfe einer Ligase in ein Plasmid oder einen vom Bakteriophagen λ abgeleiteten Vektor eingeführt.
Eine cDNA-Bank umfaßt die cDNA, die den aus einer gegebenen Zelle extrahierten zytoplasmischen mRNA entsprechen. Die Bank wird vollständig genannt, wenn sie mindestens einen bakteriellen Klon für jede Ausgangs-mRNA enthält.
Die Hybridisierung findet statt, wenn zwei Oligonukleotide im wesentlichen komplementäre Nukleotidsequenzen haben, sie können sich auf ihrer Länge durch Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basen kombinieren.
Man bevorzugt insbesondere eine Methode, bei der das Oligonukleotid OX mit Hilfe eines Markierungsmittels, wie z. B. ³²P oder Digoxygenin, erfaßbar ist.
Die am häufigsten verwendeten Mittel zur radioaktiven Markierung der Nukleotide sind die Elemente, die β-Strahlen aussenden, und zwar beispielsweise ³H, ¹²P, ³²P, ³³P und ³⁵S.
Die Markierung des Oligonukleotids findet statt, indem an sein Ende 5' eine durch (y-³²P)-ATP zugeführte Phosphat-Gruppe angesetzt wird; diese Reaktion wird durch das Enzym T4-Polynukleotid-Kinase katalysiert. Die Markierung mit Digoxygenin ist immunoenzymatisch, das Digoxygenin wird mit einer Stickstoffbase assoziiert und in das Oligonukleotid inkorporiert. Sein Vorhandensein wird durch die Verwendung eines gegen das Digoxygenin gerichteten Antikörpers nachgewiesen, der mit einem alkalischen Phosphat gekoppelt ist. Für den Nachweis wird die Farbe verwendet, die durch ein durch das alkalische Phosphat hydrolysiertes Substrat entwickelt wird.
Es können auch andere Markierungstechniken verwendet werden: Oligonukleotide, die chemisch so modifiziert sind, daß sie ein Metallkomplexierungsmittel enthalten (man verwendet häufig Lanthanid-Komplexe), eine Biotin- oder Acridinester enthaltende Gruppe, eine fluoreszierende Verbindung (Fluorescin, Rhodamin, Texas Rot) oder andere.
Man bevorzugt insbesondere eine Methode zur Identifizierung des Vorläufers eines amidierten Polypeptidhormons, beider im Hybridisierungsschritt eine kombinatorische Bibliothek von Oligonukleotiden OX verwendet wird.
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Methode zur Identifizierung des Vorläufers eines Peptids mit einem endständigen amidierten C-Atom, die die nachfolgenden Schritte umfaßt:

1. Erstellung einer DNA-Bank;
2. Verwendung der PCR-Technik zur Vervielfältigung des Fragments von Interesse mit Hilfe einer Gruppe von Oligonukleotiden OX und einer anderen Gruppe von Oligonukleotiden OZ;
3. Identifizierung der DNA-Sequenz der Bank, die mit einem Oligonukleotid OX hybridisiert und die durch die PCR-Reaktion vervielfältigt wurde;
4. Identifizierung eines oder mehrerer Peptide mit einem möglichen endständigen amidierten C-Atom in dieser Sequenz.

Unter Fragment von Interesse versteht man die cDNA-Sequenz, die für den Vorläufer eines oder mehrerer amidierter Polypeptidhormone codiert.
Die Reaktion der Vervielfältigung der DNA durch PCR (Polymerase Chain Reaction) erfordert ein DNA-Präparat, das durch Erhitzen auf 95°C denaturiert wurde. Dann wird dieses Präparat mit einem Überschuß von zwei Oligonukleotiden, die zu den entgegengesetzten Strängen der DNA komplementär sind, auf beiden Seiten der zu vervielfältigenden Sequenz gepaart. Jedes Oligonukleotid dient dann als Primer für eine DNA-Polymerase (extrahiert aus thermophilen Bakterien vom Typ Thermus aquatitus: Taq-Polymerase) für die Kopie jeder der Stränge der DNA. Dieser Zyklus kann durch aufeinanderfolgende Denaturierungen und Renaturierungen automatisiert wiederholt werden.
Es gibt zahlreiche Literaturstellen, an denen die Protokolle der PCR detailliert beschrieben werden: Patente US Nr. 4 683 192, 4 683 202, 4 800 159 und 4 965 188, "PCR technology: principles and applications for DANN amplification", H. Erlich, ed. Stockton Press, New York (1989) und "PCR protocols: a guide to methods and applications", Innis et al., eds. Academic Press, San Diego, Californien (1990).
Die DNA-Bank ist vorzugsweise eine cDNA-Bank.
Das Oligonukleotid OX ist noch bevorzugter mit Hilfe eines Markierungsmittels, wie z.B. ³²P oder Digoxygenin, erfaßbar.
Man bevorzugt insbesondere ein Verfahren zur Identifizierung des Vorläufers eines amidierten Polypeptidhormons, bei dem in dem Schritt der Vervielfältigung eine kombinatorische Bibliothek von Oligonukleotiden OX und eine andere kombinatorische Bibliothek von Oligonukleotiden OZ verwendet wird.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung eines Vorläufers eines Peptids mit einem endständigen amidierten C-Atom, das die folgenden Schritte umfaßt:

1. Erstellung einer DNA-Bank;
2. Verwendung der PCR-Technik zur Vervielfältigung des Fragments von Interesse mit Hilfe einer Gruppe von Oligonukleotiden OX;
3. Identifizierung der DNA-Sequenz der Bank, die mit dem Oligonukleotid OX hybridisiert und die durch die PCR-Reaktion vervielfältigt wurde.
4. Identifizierung eines oder mehrerer Peptide mit einem möglichen endständigen amidierten C-Atom in dieser Sequenz.

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die Nukleotidsequenzen zu charakterisieren, die für Vorläufer codieren, die mehr als eine Amidierungsstelle aufweisen.
Die DNA-Bank ist vorzugsweise eine cDNA-Bank.
Das Oligonukleotid OX ist noch bevorzugter mit Hilfe eines Markierungsmittels, wie z.B. ³²P oder Digoxygenin, erfaßbar.
Man bevorzugt insbesondere ein Verfahren zur Identifizierung eines Vorläufers eines amidierten Polypeptidhormons, bei dem im Schritt der Vervielfältigung eine kombinatorische Bibliothek von Oligonukleotiden OX verwendet wird.
Ein anderes von der Erfindung vorgeschlagenes Verfahren zur Identifizierung des Vorläufers eines Polypeptids mit einem endständigen amidiertem C-Atom ist durch die folgenden Schritte gekennzeichnet:

1. Erstellung einer DNA-Bank;
2. Verwendung der PCR-Technik zur Vervielfältigung des Fragments von Interesse mit Hilfe eines Oligonukleotids OX und eines anderen einsträngigen Oligonukleotids, das bei milden oder stringenten Bedingungen mit einer universellen Kon- sensus-Sequenz hybridisieren kann, die in der Sequenz des Plasmidvektors enthalten ist, in den die DNA der DNA-Bank kloniert sind, wie z. B. die Primer T3, T7, KS, SK, M13, Revers;
3. Identifizierung der DNA-Sequenz der Bank, die mit einem Oligonukleotid OX hybridisiert;
4. Identifizierung eines oder mehrerer Peptide mit einem möglichen endständigen amidierten C-Atom in dieser Sequenz.

Die universelle Konsensus-Sequenz ist eine Sequenz, die von dem Vektor getragen ist, in den die DNA der Bank kloniert ist. Diese Sequenz kann als Primer für die Sequenzierung dienen. Die Nukleotidsequenzen dieser Primer sind verfügbar in: Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., "Molecular cloning, a laboratory manual", 2. Ausgabe, 1989, Colel Spring Harbor Laboratory Press.
Die PCR-Reaktion erfordert, daß zwei Oligonukleotide sich an die in einen Vektor klonierte cDNA binden, damit ihre Vervielfältigung stattfindet. Wenn man nur eine Sequenz des zu vervielfältigenden DNA-Fragments kennt, besteht eine Lösung zur Umgehung dieses Problems darin, daß man ein Oligonukleotid verwendet, das mit einer Nukleotidsequenz des Vektors hybridisieren kann, in den die cDNA kloniert wurde, wie z. B. eine universelle Konsensussequenz.
Die DNA-Bank ist vorzugsweise eine cDNA-Bank.
Man bevorzugt ein Oligonukleotid OY, das mit Hilfe eines Markierungsmittels, wie z. B. ³²P oder Digoxygenin, erfaßbar ist.
Man bevorzugt insbesondere einen Vervielfältigungsschritt, bei dem eine kombinatorische Bibliothek von Oligonukleotiden OX verwendet wird.
BEISPIEL:
Das durch die Erfindung beschriebene Verfahren wurde durch seine Anwendung auf ein bereits isoliertes Hormon bestätigt. Das gewählte Neurohormon ist das Cholecystokinin (CCK), das der im Gehirn quantitativ am stärksten repräsentierte Neurotransmitter ist.
1.1 Herstellung der DNA-Matrix für die PCR-Reaktionen aus einer handelsüblichen Bank Lambda Zapp II (Rat Brain cDNA Library Vector, ref. 936 501) von STRATAGENE (Lafolla, USA).
Diese cDNA-Bank von Stratagene enthält die Klonierung der cDNA von Rattenhirnzellen.
1.1.1. Freisetzung der klonierten cL)NA in Form von Phagemiden Bluescript (Stratagene, Lajolla, USA).
Sie findet nach dem folgenden Protokoll statt: Man bringt während 15 Minuten bei 37°C folgendes in Kontakt: 250 μl der cDNA-Bank zu 2.108 PFU/ml, 200 μl Bakterien XL₁ blue (Genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac [F' proAB lacI^qZΔM15 Tn10 (Tet^r)]^c – vgl. Bullock, Fernandez, Short, Biotechniques, 5, 376–379 (1987) – optische Dichte bei 600 nm: D. O. = 2,5) und 1 μ1 des Phagen ExAssist^TM (vgl. Hay, B., Short, J., Strategies, 5, 16–18 (1992)) zu 1010 PFU/ml. Dann wird das Ganze während 3 Stunden unter Rühren bei 37°C auf 50 ml LB-Medium inkubiert (Zusammensetzung: auf 1 l keim freies physiologisches Wasser mischt man 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt und 10 g Bactotrypton). Die Kulturbrühe wird zentrifugiert und dann wird der Überstand durch Erhitzung auf 70°C während 20 Minuten inaktiviert.
1.1.2. Herstellung der cDNA in Form einer Bank von doppelsträngigen Plasmiden.
Dieser Schritt erfordert 15 Minuten Inkubation bei 37°C von 100 μl inaktiviertem Überstand und 200 μ1 Bakterien SOLR^TM (Genotyp: e14-(McrA^–) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 sbcC recB recJ uvrC umuC::Tn5 (Kan^r) lac gyrR96 relA1 thi-1 endA1 λ^R [F' proAB lacI^qZΔM15]^cSu- (nonsuppressing) – vgl. Hay, B., Short, J. M., Strategies, (5(1), 16–18 (1992) – D.O. = 1 bis 600 nm). Nach Zusatz von 50 μ1 Ampicillin (zu 100 mg/ml) und 50 ml LB-Medium wird das Ganze während einer Nacht bei 37°C unter Rühren zum Inkubieren gebracht. Die Plasmide werden aus 50 ml Kultur mit dem Protokoll und den Säulen QUIAGEN Plasmid Midi Kit von QUIAGEN hergestellt (die QIAGEN-Säulen enthalten ein Anionenaustauschharz, das auf seiner Oberfläche positiv geladene Diethylaminoethanol-Gruppen besitzt, die mit den Phosphaten des Gerüsts der DNA interagieren). Man hat auf diese Weise eine DNA-Lösung von 1,37 μg/μl erhalten.
1.2. Vervielfältigung eines Teils des Vorläufers der CCK aus der auf diese Weise hergestellten Plasmidbank.
1.2.1. Erstellung der Sequenzen der beiden für die PCR-Reaktion erforderlichen Oligonukleotide.
Eines dieser beiden Nukleotide enthält die Sequenz, die zu derjenigen komplementär ist, die für die Amidierungsstelle des CCK codiert, diese Stelle ist bekannt und hat als Sequenz Gly-Arg-Arg-Ser-Ala-Glu. Dieses Oligonukleotid, das man Oligo CCK amid nennt, hat die Nukleotidsequenz:
Das zweite Oligonukleotid, Oligo CCK 5' genannt, entspricht der Konsensus-Signalsequenz:
Die Größe des erwarteten Vervielfältigungsprodukts beträgt 315 Basenpaare; dies ist die Entfernung zwischen den diesen beiden Oligonukleotiden entsprechenden Sequenzen auf der Vorläufersequenz des CCK.
1.2.2. PCR-Reaktion
Man stellt eine Verdünnung D₁ her, die 1 μl Enzym Taq-Polymerase Goldstar 5 U/μl (vgl. Reynier, P., Pellisier, J. F., Harle, J. R., Malthiery, Y., Biochemical and Biophysical Research Communications, 205(1), 375–380 (1994)), 1 μl eines hinsichtlich Standard-Taq-Polymerase 10-fach konzentrierten Puffers und 8 μl Wasser enthält.
Dann mischt man 1 μl Oligo CCK 5' a 250 ng/μl, 1 μl Oligo CCK amid a 250 ng/μl, 1 μl dNTP a 10 mM jeweils, 1 μl DNA der cDNA-Bank a 250 ng/μl, 5 μl 10-fach konzentrierten Puffer des Enzyms Taq-Polymerase, 2 μl MgCl₂ a 25 mM, 1 μl der Verdünnung D₁ und 37 μl Wasser.
Die Vervielfältigungsbedingungen sind die folgenden: man führt zunächst eine thermische Behandlung von 5 Minuten bei 95°C aus und erneuert dann 30 Zyklen. Die Denaturierungen finden während 45 Sekunden bei 95°C statt, die Hybridisierung während 30 Sekunden bei 60°C und die Elongation während 1 Minute bei 72°C. Schließlich wird ein zusätzlicher Zyklus mit einer Elongation von 10 Minuten bei 72°C durchgeführt.
1.2.3. Ergebnisse
Die Ergebnisse werden durch Migration von 1/10 des Produkts der PCR-Reaktion auf Agarosegel zu 0,8 % abgelesen. In Gegenwart von 3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromid (Ethydiumbromid) macht man auf dem Gel eine einzige starke Bande sichtbar, die etwas größer als der Marker mit dem Molekulargewicht 300 ist.
1.3. Subklonierung des PCR-Produkts in einen die Sequenzierung gestattenden Vektor
Der verwendete Vektor ist der pGEM T-easy Vector (vertrieben von PROGEMA Corporation, Madison, USA, Ref. A 1380 – Sequenz in den Figuren 1/3 bis 3/3 angegeben). Der Plasmid pGEM^® -T Easy Vector wurde mit EcoR V an der Base 60 dieser Sequenz , (mit einem Stern angegeben) linearisiert. Es wurde an den beiden Enden 3' ein T angesetzt. Das angesetzte T ist nicht in diese Sequenz eingeschlossen. Die im nachstehenden wiedergegebene Sequenz entspricht der durch die T7 RNA-Polymerase synthetisierten RNA und ist das Komplementär zu der durch die SP6 ARN-Polymerase synthetisierten RNA: Die Schritte sind die folgenden:

– Reinigung der dem PCR-Produkt entsprechenden Bande durch Elektroelution,
– Ligation während einer Nacht bei 16°C mit 1 μl Vektor pGEM T-easy zu 50 ng/μl, 1 μl Puffer Ligase 10-fach konzentriert,
– 3 μ1 Produkt, das aus der gereinigten Bande, geschätzt auf 20 ng/μl, extrahiert wurde
- man ergänzt mit Wasser auf 10 μl.

Die Bakterien JM 109 (Genotyp: e14-(McrA-) recAl endAl gyrA96thi-1 hsdRl7(r_K _–mK₊) supE44 relAl Δ(lac-proAB) [F' traD36 proAB lacI^qZΔM15] – vgl. Yanish-Perron, C. Viera, J. Messing, J. Gene, 33, 103–1099 (1985)) werden durch eine Vorbehandlung mit CaCl₂ kompetent gemacht und dann durch einen Hitzeschock von 45 Sekunden bei 42°C mit 1/5 der Ligation transformiert. Die Zellen werden dann auf dem Medium LB/Ampicillin in einer Petrischale während einer ganzen Nacht bei 37°C kultiviert.
Man stellt die Plasmid-DNA von einigen rekombinanten Klonen her. Dann wird die Subklonierung durch die enzymatische Verdauung mit Eco RI verifiziert.
1.4. Sequenzierung
Sie wird mit Hilfe der gebräuchlichen Didesoxynukleotid-Technik von SANGER an dem Vektor pGEM T-easy Vector durchgeführt, der das PCR-Produkt von 315 Basenpaaren inkorporiert hat (in großem Maßstab durch das Kit QUIAGEN tip 100 hergestellt). Der für die Sequenzierung verwendete Primer ist das universelle Oligonukleotid T7, das auf dem Plasmid pGEM Teasy Vector vorliegt.
1.5. Ergebnis
Es wurde folgende Rohsequenz erhalten:
Die Übersetzung der erhaltenen Sequenz in Aminosäuren führt zu:
Dies gestattet das Auffinden der Nukleotidsequenz des Vorläufers der CCK (deren Sequenz von der Datenbank Swiss Prot Nr. p01355 geliefert wurde). Abkürzung der Aminosäuren:

Claims

Einzelsträngiges Oligonukleotid OX, dadurch gekennzeichnet, daß es 9 bis 42 Nukleotide umfaßt und bei milden Bedingungen mit einem Oligonukleotid OY der Sequenz Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 hybridisieren kann, in der Y1 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 12 Nukleotiden darstellt oder Y1 unterdrückt ist, Y2 ein für Gly kodierendes Trinukleotid darstellt, Y3 und Y4 unabhängig voneinander ein für Arg oder Lys kodierendes Trinukleotid darstellen und Y5 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 21 Nukleotiden darstellt oder Y5 unterdrückt ist.
Oligonukleotid OX nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 9 bis 42 Nukleotide umfaßt und bei stringenten Bedingungen mit einem Oligonukleotid OY der Sequenz Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 hybridisieren kann, in der Y1 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 12 Nukleotiden darstellt oder Y1 unterdrückt ist, Y2 ein für Gly kodierendes Trinukleotid darstellt, Y3 und Y4 unabhängig voneinander ein für Arg oder Lys kodierendes Trinukleotid darstellen und Y5 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 21 Nukleotiden darstellt oder Y5 unterdrückt ist.
Oligonukleotid OX nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Y1 in dem Oligonukleotid OY unterdrückt ist.
Oligonukleotid OX nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß Y5 in dem Oligonukleotid OY unterdrückt ist.
Oligonukleotid OX nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß Y5 in OY eine Nukleotidsequenz Y6-Y7-Y8-Y9 darstellt, in der Y6 ein für Ser, Thr oder Tyr kodierendes Trinukleotid darstellt, Y7 ein für eine beliebige Aminosäure kodierendes Trinukleotid darstellt, Y8 ein für Glu oder Asp kodierendes Trinukleotid darstellt und Y9 eine Nukleotidsequenz mit 1 bis 12 Nukleotiden darstellt..
Oligonukleotid OX nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Y1 und Y9 in dem Oligonukleotid OY unterdrückt sind.
Oligonukleotid OX nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es mit dem Oligonukleotid OY hybridisieren kann, in dem Y2 ein für Gly kodierendes Trinukleotid darstellt, Y3 ein für Lys kodierendes Trinukleotid darstellt, Y4 ein für Arg kodierendes Trinukleotid und Y5 eine Sequenz von 3 für Ser-Ala-Glu kodierenden Trinukleotiden darstellt.
Einzelsträngiges Oligonukleotid OY, dadurch gekennzeichnet, daß es 9 bis 42 Nukleotide der Sequenz Y1-Y2-Y3-Y4-Y5 umfaßt, in der Y1 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 12 Nukleotiden darstellt oder Y1 unterdrückt ist, Y2 ein für Gly kodierendes Trinukleotid darstellt, Y3 und Y4 unabhängig voneinander ein für Arg oder Lys kodierendes Trinukleotid darstellen und Y5 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 21 Nukleotiden darstellt oder Y5 unterdrückt ist.
Oligonukleotid OY nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Y1 unterdrückt ist.
Oligonukleotid OY nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß Y5 unterdrückt ist.
Oligonukleotid OY nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß Y5 eine Nukleotidsequenz Y6-Y7-Y8-Y9 darstellt, in der Y6 ein für Ser, Thr oder Tyr kodierendes Trinukleotid darstellt, Y7 ein für eine beliebige Aminosäure kodierendes Trinukleotid darstellt, Y8 ein für Glu oder Asp kodierendes Trinukleotid darstellt und Y9 eine Nukleotidsequenz mit 1 bis 12 Nukleotiden darstellt.
Oligonukleotid OY nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Y1 und Y9 unterdrückt sind.
Oligonukleotid OY nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß Y2 ein für Gly kodierendes Trinukleotid darstellt, Y3 ein für Lys kodierendes Trinukleotid darstellt, Y4 ein für Arg kodierendes Trinukleotid darstellt und Y5 eine Sequenz von 3 für Ser-Ala-Glu kodierenden Trinukleotiden darstellt.
Einzelsträngiges Oligonukleotid OZ, dadurch gekennzeichnet, daß es 15 bis 39 Nukleotide umfaßt und bei milden oder stringenten Bedingungen mit einer für die amidierten Polypeptidhormone charakteristischen Konsensus-Signal-Sequenz hybridisieren können, die die Formel Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7 hat, in der Z1 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 12 Nukleotiden darstellt oder Z1 unterdrückt ist, Z2 und Z3 zwei für Leu kodierende Trinukleotiden darstellen, Z4 und Z5 zwei für zwei beliebige Aminosäuren kodierende Trinukleotide darstellen, Z6 ein für Leu kodierendes Trinukleotid darstellt und Z7 eine Nukleotidsequenz von 1 bis 12 Nukleotiden darstellt oder Z7 unterdrückt ist.
Gruppe von Oligonukleotiden OX nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder von Oligonukleotiden OZ nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine kombinatorische Bibliothek bildet.
Verfahren zur Identifizierung eines Vorläufers eines Peptids mit einem endständigen amidierten C-Atom, gekennzeichnet durch die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte: – Erstellung einer DNA-Bank; – Hybridisierung einer oder mehrerer Oligonukleotide nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit der DNA-Bank; – Identifizierung der DNA-Sequenz en) der Bank, die mit einem Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hybridisiert (en); – Identifizierung dieser Sequenzen) von einem oder mehreren Peptidvorläufern mit einem möglichen endständigen amidierten C-Atom.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt der Hybridisierung eine kombinatorische Bibliothek nach Anspruch 15 verwendet wird.
Verfahren zur Identifizierung des Vorläufers eines Peptids mit einem endständigen amidierten C-Atom, gekennzeichnet durch die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte: - Erstellung einer DNA-Bank; – Verwendung der PCR-Technik zur Vervielfältigung des Fragments von Interesse mit Hilfe einer Gruppe von Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und einer anderen Gruppe von Oligonukleotiden nach Anspruch 14; – Identifizierung der DNA-Sequenzen) der Bank, die mit einem Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hybridisiert (en); – Identifizierung eines oder mehrerer Peptidvorläufer mit einem möglichen endständigen amidierten C-Atom. in dieser Sequenz oder in diesen Sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 18; dadurch gekennzeichnet, daß in dem Schritt der Vervielfältigung eine kombinatorische Bibliothek nach Anspruch 15 verwendet wird.
Verfahren zur Identifizierung eines Vorläufers eines Peptids mit einem endständigen amidierten C-Atom, gekennzeichnet durch die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte: – Erstellung einer DNA-Bank; – Verwendung der PCR-Technik zur Vervielfältigung des Fragments von Interesse mit Hilfe einer Gruppe von Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 7: – Identifizierung der DNA-Sequenzen) der Bank, die mit einem Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hybridisiert(en), – Identifizierung eines oder mehrerer Peptidvorläufer mit einem möglichen endständigen amidierten C-Atom in dieser Sequenz oder in diesen Sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt der Vervielfältigung eine kombinatorische Bibliothek nach Anspruch 15 verwendet wird.
Verfahren zur Identifizierung des Vorläufers eines Polypeptids mit einem endständigen amidierten C-Atom, gekennzeichnet durch die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte: – Herstellung einer DNA-Bank; – Verwendung der PCR-Technik zur Vervielfältigung des Fragments von Interesse mit Hilfe eines Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und einem anderen einsträngigen Oligonukleotid, das bei milden oder stringenten Bedingungen mit einer universellen Konsensus-Sequenz hybridisieren kann, die in der Sequenz des Plasmidvektors enthalten ist, in dem die cDNA der DNA-Bank geklont sind, wie z. B. die Primer T3, T7, KS, SK, M13, Revers; – Identifizierung der cDNA-Sequenz der Bank, die mit einem Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 hybridisiert; – Identifizierung eines oder mehrerer Peptidvorläufer mit einem möglichen endständigen amidierten C-Atom in dieser Sequenz.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt der Vervielfältigung eine kombinatorische Bibliothek nach Anspruch 15 verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Bank eine cDNA-Bank ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das einzelsträngige Oligonukleotid mit Hilfe eines Markiermittels, wie z.B. ³²P oder Digoxygenin erfaßbar ist.