DE60132200T2

DE60132200T2 - Reinigung einer tripelhelixformation mittels eines immobilisierten oligonukleotides

Info

Publication number: DE60132200T2
Application number: DE60132200T
Authority: DE
Inventors: Joel Crouzet; Daniel Scherman; Pierre Wils; Francis Blanche; Beatrice Cameron
Original assignee: Centelion SAS
Current assignee: Centelion SAS
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2008-12-18
Anticipated expiration: 2021-05-26
Also published as: NO330571B1; CN1446258B; DE60132200D1; MXPA02011463A; WO2001092511A2; HU228891B1; CZ303086B6; SK16602002A3; ZA200209579B; HUP0302565A3; BR0111145B1; KR100853040B1; NO20025567D0; BR0111145A; EP1290156A2; AU2001263459B2; HUP0302565A2; ATE382688T1; IL196444A; NO20025567L

Description

KREUZVERWEIS ZU VERWANDTEN ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht den Prioritätsvorteil der U.S.-Anmeldung mit der laufenden Nr. 09/580.923, eingereicht am 26. Mai 2000, der eine Teilweiterbehandlungsanmeldung der U.S.-Anmeldung mit der laufenden Nr. 08/860.038, eingereicht am 9. Juni 1997, der nationalen Phase der U.S.-Anmeldung von PCT FR95/01468 , eingereicht am 8. November 1995, ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur DNA-Aufreinigung. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine schnelle Aufreinigung von pharmakologisch verwendbarer Doppelstrang-DNA. Insbesondere betrifft das erfindungsgemäße Aufreinigungsverfahren eine spezifische Hybridisierung zwischen einer Sequenz der DNA und einem Oligonukleotid.
Gen- und Zelltherapietechniken machen derzeit eine bemerkenswerte Entwicklung durch. Jedoch beinhalten diese Techniken die Möglichkeit, große Mengen an DNA mit pharmazeutischer Reinheit zu produzieren. Tatsächlich besteht bei diesen neuen Therapien das Arzneimittel häufig aus der DNA selbst, und es ist wesentlich, dass man sie in geeigneten Mengen herstellen kann, um sie zu isolieren und in einer Weise aufzureinigen, die für die therapeutische Verwendung beim Menschen geeignet ist.
In den letzten Jahren ist die Möglichkeit einer Injektion von Plasmid-DNA zur Gentherapie oder Impfung durch zahlreiche Berichte demonstriert worden, die zeigen, dass DNA-Expressionsvektoren von verschiedenen Zelltypen aufgenommen und die Gene, die von diesen Plasmiden codiert werden, anschließend exprimiert werden können (Ledley, 1995 Hum. Gene Ther. 6, 1129).
Die Gene von Interesse für Anwendungen bei der Gentherapie oder Impfung können zum Beispiel Tumorsuppressorgene, Selbstmordgene oder Antisense-Sequenzen einschließen. Sie können auch Proteine codieren, wie Alpha-Fötalprotein AFP (Morinaga, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4604), Enzyme, Hormone, Cytokine, Wachstumsfaktoren, wie FGF (Jouanneau et al., 1991, Proc. Nal. Acad. Sci. USA, 88, 2893) oder VEGFB (Olofsson B al., 1996, Proceedings 93, 576), Gerinnungsfaktoren wie B-deletierter Faktor VIII (Truett et al., 1985, DNA 4, 333), Apolipoproteine, Neurotransmitter, neurotrophische Faktoren, natürliches oder chimäres Immunglobulin. Reportergene, wie lacZ, das die Escherichia-coli-β-Galactosidase codiert, werden ebenfalls verwendet.
Die hauptsächlichen Herausforderungen für die Verwendung von Plasmid-DNA als Genzufuhrvektor beim Menschen sind i) die Herstellung und ii) die Reinheit dieses Arzneimittelprodukts. Technologien zur Produktion von Plasmidvektoren mit hoher Kopienzahl in Escherichia-coli-Wirten sind vor kurzem entwickelt worden. Die derzeit verwendeten Plasmide sind entweder von ColE1 abgeleitete Plasmide, wie pBR322, pUC oder pBluescript (Lahijani et al., 1996, Hum. Gene Ther., 7, 1971 und Winnacker E-L: "From genes to clones" From Genes to clones. Introduction to gene technology, Weinheim, VCH Verlagsgesellschaft, DE, 1987, Seiten 125–132) oder pCOR-Plasmide (Soubrier et al., 1999, Gene Therapy, 6, 1482).
Die zweite Sorge, die durch die Verwendung von Plasmid-DNA als Gentherapievektor erregt wird, ist die Reinheit des Plasmidvektors selbst. Gegenwärtige Aufreinigungsverfahren, wie Ultrazentrifugation in CsCl-Gradienten oder Chromatographie, können zur Entfernung von Verunreinigungen, wie genomischer DNA und RNA oder Proteinen des Wirts, ineffizient sein. Insbesondere genomische DNA, deren chemische Struktur sehr ähnlich zu derjenigen von Plasmid-DNA ist, ist unter Verwendung von herkömmlicher Chromatographie äußerst schwierig zu entfernen. Typische Konzentrationen von bis zu 0,5 bis 1% genomischer Wirts-DNA findet man in Plasmidpräparationen, die durch herkömmliche Chromatographie erhalten werden. Damit Plasmid-DNA als sicherer Vektor für die Gentherapie beim Menschen entwickelt werden kann, besteht folglich ein Bedarf an Aufreinigungstechnologien, die den Gehalt an genomischer Wirts-DNA auf viel niedrigere Spiegel, gewöhnlich 0,1% oder sogar 0,01% oder weniger, senken.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein einfaches und besonders effizientes neues Verfahren zur DNA-Aufreinigung. Es ermöglicht es insbesondere, besonders hohe Reinheiten bei hohen Ausbeuten zu erreichen. Das erfindungsgemäße Verfahren basiert im Wesentlichen auf einer spezifischen Wechselwirkung zwischen einer Sequenz, die in die aufzureinigende DNA inseriert wird, und einem Oligonukleotid, das aus natürlichen oder modifizierten Basen besteht.
Es ist vor kurzem gezeigt worden, dass einige Oligonukleotide zu einer spezifischen Wechselwirkung mit der großen Furche der DNA-Doppelhelix unter Bildung von Tripelhelices fähig sind, was zu einer Hemmung der Transkription von Zielgenen führt (Helene und Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Diese Oligonukleotide erkennen selektiv die DNA-Doppelhelix an Oligopurin-Oligopyrimidin-Sequenzen, d. h. an Regionen, die eine Oligopurin-Sequenz auf einem Strang und eine Oligopyrimidin-Sequenz auf dem komplementären Strang besitzen, und bilden dort eine Tripelhelix. Die Basen des dritten Stranges (des Oligonukleotids) bilden Wasserstoffbindungen (Hoogsteen- oder reverse Hoogsteen-Bindungen) mit den Purinen der Watson-Crick-Basenpaare.
Eine Verwendung dieses Typs der Wechselwirkung zur Isolation eines Plasmid ist im Stand der Technik beschrieben worden. WO9618744 (Rhone Poulenc Rorer S. A.) offenbart die Aufreinigung von Plasmiden über Tripelhelix-Hybridisierung mit Oligonukleotiden, die gegen den Replikationsursprung gerichtet sind. WO9949067 (Rhone Poulenc Rorer S. A.) offenbart spezifische Oligonukleotide, die bei einer Tripelhelix-Hybridisierung an Plasmidsequenzen binden. So beschreiben Ito et al. (PNAS 89 (1992) 495) die Verwendung biotinylierter Oligonukleotide, die zur Erkennung einer bestimmten Sequenz eines Plasmids und zur Bildung einer Tripelhelix fähig sind. Die so gebildeten Komplexe werden dann mit Streptavidin-überzogenen Magnetkügelchen in Kontakt gebracht. Eine Wechselwirkung zwischen dem Biotin und dem Streptavidin ermöglicht dann die Isolation des Plasmids durch magnetische Abtrennung, gefolgt von Flution. Dieses Verfahren hat jedoch einige Nachteile. Insbesondere sind zwei aufeinander folgende spezifische Wechselwirkungen erforderlich, die erste zwischen dem Oligonukleotid und dem Plasmid und die zweite zwischen dem biotinylierten Komplex und den Streptavidin-Kügelchen. Außerdem kann die endgültige Lösung mit biotinyliertem Oligonukleotid kontaminiert sein, das in einer pharmazeutischen Zusammensetzung nicht verwendet werden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein neues, verbessertes Verfahren zur DNA-Aufreinigung, das diesen Typ der Wechselwirkung nutzt. Genauer gesagt, setzt das erfindungsgemäße Verfahren Oligonukleotide ein, die kovalent an einen Träger gekoppelt sind. Dieses Verfahren ist besonders schnell, und es führt zu besonders hohen Ausbeuten und Reinheitsgraden. Außerdem kann DNA aus komplexen Gemischen aufgereinigt werden, die insbesondere andere Nukleinsäuren, Proteine, Endotoxine (wie Lipopolysaccharide), Nukleasen und dergleichen umfassen. Die verwendeten Träger können zusätzlich leicht rückgewonnen werden, und die erhaltenen DNAs zeigen verbesserte Eigenschaften hinsichtlich der pharmazeutischen Sicherheit. Zuletzt beinhaltet dieses Verfahren im Gegensatz zum Stand der Technik nur einen Schritt.
Folglich liegt eine erste Aufgabe der Erfindung in einem Verfahren zur Aufreinigung von Doppelstrang-DNA, bei dem man eine Lösung, die die Doppelstrang-DNA im Gemisch mit anderen Bestandteilen enthält, über einen Träger mit einem kovalent gekoppelten Oligonukleotid, das durch Hybridisierung mit einer in der DNA vorhandenen spezifischen Sequenz eine Tripelhelix bilden kann, leitet. Die spezifische Sequenz kann eine Sequenz sein, die natürlicherweise in der Doppelstrang-DNA vorhanden ist, oder eine synthetische Sequenz, die künstlich in letztere eingeführt worden ist.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Oligonukleotide sind Oligonukleotide, die direkt mit der Doppelstrang-DNA hybridisieren. Diese Oligonukleotide können folgende Basen enthalten:

– Thymidin (T), das Tripletts mit A. T-Dubletts von Doppelstrang-DNA bilden kann (Rajagopal et al., Biochem. 28 (1989) 7859);
– Adenin (A), das Tripletts mit A. T-Dubletts von Doppelstrang-DNA DNA bilden kann;
– Guanin (G), das Tripletts mit G. C-Dubletts von Doppelstrang-DNA bilden kann;
– protoniertes Cytosin (C+), das Tripletts mit G. C-Dubletts von Doppelstrang-DNA bilden kann (Rajagopal et al., siehe oben);
– Uracil (U), das Tripletts mit A. U- oder A. T-Basepaaren bilden kann.

Vorzugsweise umfasst das verwendete Oligonukleotid eine Cytosin-reiche Homopyrimidin-Sequenz, und die spezifische Sequenz in der DNA ist eine Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz. Durch die Anwesenheit von Cytosinen lässt sich eine Tripelhelix erhalten, die bei saurem pH beständig ist, bei dem die Cytosine protoniert sind, und bei alkalischem pH, bei dem die Cytosine neutralisiert sind, destablisiert ist.
Damit die Bildung einer Tripelhelix durch Hybridisierung möglich ist, ist es wichtig, dass das Oligonukleotid und die spezifische Sequenz in der DNA komplementär sind. In diesem Zusammenhang werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Oligonukleotid und eine spezifische Sequenz verwendet, die völlig komplementär sind, um die besten Ausbeuten und die beste Selektivität zu erhalten. Diese können insbesondere ein Oligonukleotid Poly(CTT) und eine spezifische Sequenz Poly(GAA) sein. Als Beispiel kann das Oligonukleotid der Sequenz 5'-GGGCTTCTTCTTICTTCTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT)₇; SEQ ID NO: 1) erwähnt werden, in dem die Basen GAGG keine Tripelhelix bilden, aber die Beabstandung des Oligonukleotids von dem Kopplungsarm ermöglichen; die Sequenz (CTT)₇ (SEQ ID NO: 26) kann ebenfalls erwähnt werden. Diese Oligonukleotide sind zur Bildung einer Tripelhelix mit einer spezifischen Sequenz fähig, die komplementäre (GAA)-Einheiten enthält. Die in Frage kommende Sequenz kann insbesondere eine Region sein, die 7, 14 oder 17 GAA-Einheiten enthält, wie in den Beispielen beschrieben.
Eine andere Sequenz von spezifischem Interesse ist die Sequenz: 5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (SEQ ID NO: 5).
Diese Sequenz bildet eine Tripelhelix mit den Oligonukleotiden 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ ID NO: 6) oder 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEQ ID NO: 7).
In diesem Fall bindet das Oligonukleotid in antiparalleler Orientierung an den Polypurinstrang. Diese Tripelhelices sind nur in Anwesenheit von Mg²⁺ stabil (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243–7251; Beal und Dervan, Science, 1991, 251, 1360–1363).
Wie oben angeführt, kann die spezifische Sequenz eine Sequenz sein, die in der Doppelstrang-DNA natürlicherweise vorhanden sind, oder eine synthetische Sequenz, die künstlich in letztere eingeführt wird. Es ist besonders vorteilhaft, ein Oligonukleotid zu verwenden, das zur Bildung eine Tripelhelix mit einer Sequenz fähig ist, die in der Doppelstrang-DNA natürlicherweise vorhanden ist, zum Beispiel im Replikationsursprung eines Plasmids oder in einem Markergen. In diesem Zusammenhang hat die Anmelderin Plasmidsequenzanalysen durchgeführt und konnte zeigen, dass einige Regionen dieser DNAs, insbesondere im Replikationsursprung, Homopurin-Homopyrimidin-Regionen aufweisen könnten. Durch Synthese von Oligonukleotiden, die zur Bildung von Tripelhelices mit diesen natürlichen Homopurin-Homopyrimidin-Regionen fähig sind, kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft auf unveränderte Plasmide, insbesondere auf kommerzielle Plasmide des Typs pUC, pBR322, pSV und dergleichen, angewendet werden. Unter den Homopurin-Homopyrimidin-Sequenzen, die natürlicherweise in einer Doppelstrang-DNA vorkommen, kann eine Sequenz erwähnt werden, welche die gesamte oder einen Teil der Sequenz 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID NO: 2) umfasst, die im Replikationsursprung des E.-coli-Plasmids ColE1 vorliegt. In diesem Fall besitzt das die Tripelhelix bildende Oligonukleotid die Sequenz: 5'-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ ID NO: 3) und bindet alternativ an die zwei Stränge der Doppelhelix, wie von Beal und Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976–4982) und Jayasena und Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279–5288) beschrieben. Die Sequenz 5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 4) des β-Lactamase-Gens des Plasmids pBR322 (Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504–508) kann ebenfalls erwähnt werden.
Zwei zusätzliche Zielsequenzen, die mit bestimmten Oligonukleotiden Triplex-Strukturen bilden können, sind in den Replikationsursprüngen von ColE1 und pCOR charakterisiert worden. Von ColE1 abgeleitete Plasmide enthalten eine 12-mer-Homopurin-Sequenz (5'-AGAAAAAAAGGA-3') (SEQ ID NO: 27), die stromaufwärts des RNA-II-Transkripts kartiert wurde und an der Plasmidreplikation beteiligt ist (Lacatena et al., 1981, Nature, 294, 623). Diese Sequenz bildet eine stabile Triplex-Struktur mit dem komplementären 12-mer-Oligonukleotid 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 28). Das pCOR-Rückgrat enthält eine Homopurin-Abfolge von 14 nichtrepetitiven Basen (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (SEQ ID NO: 29), die sich im A + T-reichen Segment des γ-Ursprungsreplicons von pCOR befindet (Levchenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936). Diese Sequenz bildet eine stabile Triplex-Struktur mit dem komplementären 14-mer-Oligonukleotid 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 30). Die entsprechenden Oligonukleotide 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 28) und 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 30) steuern effizient und spezifisch ihre jeweiligen komplementären Sequenzen an, die sich innerhalb des Replikationsursprungs des ColE1-ori bzw. von pCOR (oriγ) befinden. Tatsächlich kann eine einzelne nicht-kanonische Triade (T·GC oder C·AT) zu vollständiger Destabilisierung der Triplex-Struktur führen.
Die Verwendung eines Oligonukleotids, das zur Bildung eine Tripelhelix mit einer Sequenz fähig ist, die in einem Replikationsursprung oder einem Markergen vorliegt, ist besonders vorteilhaft, da sie es ermöglicht, mit dem gleichen Oligonukleotid jegliche DNA zu aufreinigen, die den Replikationsursprung oder das Markergen enthält. Folglich ist es nicht notwendig, das Plasmid oder die Doppelstrang-DNA zu modifizieren, um darin eine künstliche spezifische Sequenz einzuführen.
Obgleich vollständig komplementäre Sequenzen bevorzugt sind, sollte jedoch selbstverständlich sein, dass einige Fehlpaarungen zwischen der Sequenz des Oligonukleotids und der Sequenz in der DNA toleriert werden können, vorausgesetzt dass sie nicht zu einem zu großen Verlust der Affinität führen. Die Sequenz 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ ID NO: 8) im E. coli-β-Lactamase-Gen kann erwähnt werden. In diesem Fall kann das Thymin, das die Polypurin Sequenz unterbricht, durch ein Guanin des dritten Strangs erkannt werden, wodurch ein G·TA-Triplett gebildet wird, das stabil ist, wenn es durch zwei T·AT-Tripletts flankiert wird (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829–2834).
Gemäß einer bestimmten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Oligonukleotide die Sequenz (CCT)_n, die Sequenz (CT)_n oder die Sequenz (CTT)_n, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und einschließlich 15 ist. Es ist besonders vorteilhaft, Sequenzen des Typs (CT)_n oder (CTT)_n zu verwenden. Die Anmelderin hat gezeigt, dass die Aufreinigungsausbeute tatsächlich durch die Menge an C im Oligonukleotid beeinflusst wurde. Wie in Beispiel 7 gezeigt, erhöht sich insbesondere die Aufreinigungsausbeute, wenn das Oligonukleotid weniger Cytosine enthält. Es ist selbstverständlich, dass die erfindungsgemäßen Oligonukleotide auch (CCT)-, (CT)- oder (CTT)-Einheiten kombinieren können.
Das verwendete Oligonukleotid kann natürlich (aus unveränderten natürlichen Basen bestehend) oder chemisch modifiziert sein. Insbesondere kann das Oligonukleotid vorteilhafterweise bestimmte chemische Modifizierungen besitzen, die es ermöglichen, dass seine Resistenz oder sein Schutz gegenüber Nukleasen oder seine Affinität für die spezifische Sequenz erhöht wird.
Erfindungsgemäß soll Oligonukleotid außerdem jede verknüpfte Aufeinanderfolge von Nukleosiden bedeuten, die einer Modifikation des Skeletts mit dem Ziel, sie stabiler gegen. Nukleasen zu machen, unterzogen wurde. Unter möglichen Modifikationen können Oligonukleotid-Phosphorthioate, die zur Bildung von Tripelhelices mit DNA fähig sind (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322–3330), sowie Oligonukleotide, die Formacetal- oder Methylphosphonat-Skelette besitzen (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767–7768), erwähnt werden. Es ist ebenfalls möglich, Oligonukleotide zu verwenden, die mit α-Anomeren von Nukleotiden synthetisiert wurden, die ebenfalls Tripelhelices mit DNA bilden (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749–7760). Eine andere Modifikation des Skeletts ist die Phosphoramidat-Verknüpfung. Zum Beispiel kann die von Gryaznov und Chen beschriebene N³ ^'-P⁵ ^'-Internukleotid-Phosphoramidat-Verknüpfung erwähnt werden, die Oligonukleotide liefert, die besonders stabile Tripelhelices mit DNA bilden (J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143–3144). Unter anderen Modifikationen des Skeletts kann auch die Verwendung von Ribonukleotiden, 2'-O-Methylribose, Phosphodiester usw. (Sun und Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143–3144) erwähnt werden. Zuletzt kann das Skelett auf Phosphor-Basis durch ein Polyamid-Skelett, wie in PNAs (Peptidnukleinsäuren), die ebenfalls Tripelhelices bilden können (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497–1500; Kimet al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 6477–6481), oder durch ein Skelett auf Guanidin-Basis, wie in DNGs (Desoxyribonukleinguanidin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097–6101), oder durch polykationische Analoga von DNA, die ebenfalls Tripelhelices bilden, ersetzt werden.
Das Thymin des dritten Strangs kann auch durch ein 5-Bromuracil ersetzt werden, das die Affinität des Oligonukleotids für DNA erhöht (Povsic und Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059–3061). Der dritte Strang kann auch unnatürliche Basen enthalten, unter denen 7-Deaza-2'-desoxyxanthosin (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327–333), 1-(2-Desoxy-β-D-ribofuranosyl)-3-methyl-5-amino-1H-pyrazolo-[4,3-d]-pyrimidin-7-on (Koh und Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470–1478), 8-Oxoadenin, 2-Aminopurin, 2'-O-Methylpseudoisocytidin oder eine andere Modifikation, die dem Fachmann bekannt ist (eine Übersicht siehe in Sun und Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345–356), erwähnt werden können.
Ein anderer Typ der Modifikation des Oligonukleotids hat insbesondere zum Ziel, die Wechselwirkung und/oder die Affinität zwischen dem Oligonukleotid und der spezifischen Sequenz zu verbessern. Insbesondere besteht eine am stärksten vorteilhafte erfindungsgemäße Modifikation in der Methylierung der Cytosine des Oligonukleotids (siehe Beispiel 5). Das so methylierte Oligonukleotid zeigt die bemerkenswerte Eigenschaft, dass es eine stabile Tripelhelix mit der spezifischen Sequenz in pH-Bereichen bildet, die näher bei der Neutralität (≥ 5) liegen. Dadurch wird es somit möglich, bei höheren pH-Werten zu arbeiten als mit den Oligonukleotiden des Standes der Technik, d. h. bei pH-Werten, in denen die Risiken eines Abbaus der Plasmid-DNA viel kleiner sind.
Die Länge des Oligonukleotids, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, beträgt mindestens 3 Basen und vorzugsweise zwischen 5 und 30. Ein Oligonukleotid mit einer Länge von mehr als 10 Basen wird vorteilhafterweise verwendet. Die Länge kann durch den Fachmann für jeden einzelnen Fall derart angepasst werden, dass er der gewünschten Selektivität und Stabilität der Wechselwirkung entspricht.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können durch jede bekannte Technik synthetisiert werden. Insbesondere können sie mithilfe von Nukleinsäuresynthesegeräten hergestellt werden. Jedes andere Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, kann ganz offensichtlich verwendet werden.
Damit es an den Träger kovalent gekoppelt werden kann, wird das Oligonukleotid in der Regel funktionalisiert. So kann es durch eine endständige Thiol-, Amin- oder Carboxylgruppe an der 5'- oder 31 Position modifiziert werden. Insbesondere die Hinzufügung einer Thiol-, Amin- oder Carboxylgruppe ermöglicht es zum Beispiel, das Oligonukleotid an einen Träger zu koppeln, der Disulfid-, Maleinsäureimid-, Amin-, Carboxyl-, Ester-, Epoxid-, Cyanogenbromid- oder Aldehydfunktionen trägt. Diese Kopplungen bilden sich durch die Bildung von Disulfid-, Thioether-, Ester-, Amid- oder Aminverknüpfungen zwischen dem Oligonukleotid und dem Träger. Jedes andere Verfahren, das einem Fachmann bekannt ist, kann verwendet werden, wie zum Beispiel bifunktionale Kopplungsreagenzien.
Zur Verbesserung der Hybridisierung mit dem gekoppelten Oligonukleotid kann es außerdem vorteilhaft sein, wenn das Oligonukleotid eine "Arm"- und eine "Spacer"-Basensequenz enthält. Die Verwendung eines Arms ermöglicht es tatsächlich, das Oligonukleotid in einem gewählten Abstand von dem Träger zu binden, wodurch die Bedingungen für seine Wechselwirkung mit der DNA verbessert werden. Der Arm besteht vorteilhafterweise aus einer geraden Kohlenstoffkette, die 1 bis 18 und vorzugsweise 6 oder 12 (CH₂)-Gruppen und ein Amin umfasst, das die Bindung an die Säule gestattet. Der Arm wird mit einem Phosphat des Oligonukleotids oder eines "Spacers verbunden, der aus Basen besteht, welche die Hybridisierung nicht behindern. So kann der "Spacer" Purin-Basen umfassen. Als Beispiel kann der "Spacer" die Sequenz GAGG umfassen. Der Arm besteht vorteilhaft aus einer geraden Kohlenstoffkette, die 6 oder 12 Kohlenstoffatome umfasst.
Zur Ausführung der vorliegenden Erfindung können unterschiedliche Trägertypen verwendet werden. Diese können lose oder in einer Säule vorgepackte, funktionalisierte chromatographische Träger, funktionalisierte Kunststoffoberflächen oder magnetische oder anderweitig funktionalisierte Latexkugeln sein. Chromatographische Träger werden vorzugsweise verwendet. Als Beispiel sind chromatographische Träger, die verwendet werden können, zum Beispiel Agarose, Acrylamid oder Dextran sowie ihre Derivate (wie Sephadex, Sepharose, Superose usw.), Polymere wie Poly-(Styrol/Divinylbenzol) oder gepfropftes oder ungepfropftes Siliziumdioxid. Die Chromatographiesäulen können im Diffusions- oder Perfusionsmodus arbeiten.
Um bessere Aufreinigungsausbeuten zu erhalten, ist es besonders vorteilhaft, wenn auf dem Plasmid eine Sequenz verwendet wird, die mehrere Positionen für die Hybridisierung mit dem Oligonukleotid enthält. Das Vorliegen mehrerer Hybridisierungspositionen fördert tatsächlich die Wechselwirkungen zwischen der Sequenz und dem Oligonukleotid, was zu einer Verbesserung in den Aufreinigungsausbeuten führt. Bei einem Oligonukleotid, das n Wiederholungen von (CCT)-, (CT)- oder (CTT)-Motiven enthält, ist es somit bevorzugt, wenn man eine DNA-Sequenz verwendt, die mindestens n komplementäre Motive und vorzugsweise n + 1 komplementäre Motive enthält. Eine Sequenz, die n + 1 komplementäre Motive trägt, liefert somit zwei Positionen für die Hybridisierung mit dem Oligonukleotid. Vorteilhafterweise enthält die DNA-Sequenz bis zu 11 Hybridisierungspositionen, d. h. n + 10 komplementäre Motive.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Aufreinigung jedes Typs der Doppelstrang-DNA verwendet werden. Ein Beispiel für letztere ist zirkuläre DNA, wie ein Plasmid, das im Allgemeinen ein oder mehrere Gene von therapeutischem Wert trägt. Dieses Plasmid kann auch einen Replikationsursprung, ein Markergen und der dergleichen tragen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann direkt auf ein Zelllysat angewendet werden. Bei dieser Ausführungsform wird das Plasmid, das durch Transformation, gefolgt von Zellkultur, amplifiziert wird, direkt nach der Lyse der Zellen aufgereinigt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch auf ein klares Lysat, d. h. auf Überstand, angewendet werden, das/der nach Neutralisation und Zentrifugation des Zelllysats erhalten wird. Es kann ganz offensichtlich auch auf eine Lösung angewendet werden, die durch bekannte Verfahren vorgereinigt wurde. Dieses Verfahren ermöglicht auch die Aufreinigung von linearer oder zirkulärer DNA, die eine Sequenz von Bedeutung trägt, aus einem Gemisch, das DNAs unterschiedlicher Sequenzen umfasst. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch für die Aufreinigung von Doppelstrang-DNA verwendet werden.
Das Zelllysat kann ein Lysat von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen sein.
Hinsichtlich prokaryotischer Zellen können die Bakterien E. coli, B. subtilis, S. typhimurium oder Strepomyces als Beispiele genannt werden. Hinsichtlich eukaryotischer Zellen können tierische Zellen, Hefen, Pilze und dergleichen, genannt werden und insbesondere Kluyveromyces- oder Saccharomyces-Hefen oder COS-, CHO-, C127-, NIH3T3-Zellen und dergleichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft, da es die schnelle und einfache Gewinnung von Plasmid-DNA mit sehr hoher Reinheit ermöglicht. Wie in den Beispielen veranschaulicht, kann mit diesem Verfahren insbesondere die in Frage kommende Plasmid-DNA effizient von verunreinigenden Komponenten, wie fragmentierter chromosomaler DNA, Endotoxinen, Proteinen, Nukleasen und dergleichen, abgetrennt werden. Genauer gesagt, kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Präparation von Doppelstrang-DNA, insbesondere derjenigen des Plasmidursprungs, mit einem Gehalt an chromosomaler DNA von kleiner als oder gleich 0,5% erhalten werden. Noch stärker bevorzugt haben die erhaltenen DNA-Präparationen einen Gehalt an chromosomaler DNA von kleiner als oder gleich 0,2%. Die vorliegende Erfindung beschreibt folglich Zusammensetzungen, die Plasmid-DNA umfassen, die pharmazeutisch, insbesondere bei der Gen- oder Zelltherapie, verwendet werden kann. In diesem Zusammenhang ist der Gegenstand der Erfindung ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die lineare oder aus einem Plasmid stammende Doppelstrang-DNA umfasst, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wird.
Die Erfindung betrifft auch Plasmid-DNA-Präparationen, die einen chromosomalen DNA-Gehalt von kleiner als oder gleich 0,5%, vorzugsweise kleiner als oder gleich 0,2% und noch stärker bevorzugt kleiner als oder gleich 0,1% und noch stärker bevorzugt kleiner als oder gleich 0,01% aufweisen. Wie nachstehend erläutert, wird ein Triplex-Affinitätswechselwirkungsschritt in ein Aufreinigungsverfahren stromabwärts von herkömmlichen Chromatographieschritten eingeführt. Dieser Affinitätsschritt verbessert die Reinheit der Plasmidpräparation ungeachtet ihrer Ausgangsreinheit erheblich. Die Bildung einer Triplex-Struktur zwischen einem (kovalent an einen Chromatographieträger gebundenen) Oligonukleotid und dem interessierenden Plasmid, das aufgereinigt werden soll, beruht auf der Anwesenheit einer Sequenz, die eine Triplex-Struktur mit dem Oligonukleotid bilden kann, auf dem Plasmid. Diese Triplex-Struktur ist bei nur saurem pH stabil, bei dem die Cytosine des Oligonukleotids protoniert sind. Dann wird die Plasmid-DNA von der Säule einfach durch Erhöhung des pH auf neutral eluiert.
Die Zusammensetzungen können Plasmid-DNA enthalten, die "nackt" oder mit Transportträgern, wie Liposomen, Nanopartikeln, kationischen Lipiden, Polymeren, rekombinanten Viren oder Proteinen und dergleichen, kombiniert ist.
Bei einer Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu verwendet werden, einen Typ der Doppelstrang-DNA aus einem Gemisch aufzureinigen, das zwei oder mehrere Doppelstrang-DNAs unterschiedlicher Typen und Sequenzen umfasst. Dieses Verfahren kann direkt auf ein Zelllysat angewendet werden, in dem die durch Zellkultur amplifizierten Doppelstrang-DNAs nach der Lyse der kultivierten Zellen aufgereinigt werden. Dieses Verfahren kann auch auf ein klares Lysat, d. h. den Überstand, der nach Neutralisation und Zentrifugation des Zelllysats erhalten wird, angewendet werden. Das Verfahren kann ferner auf eine vorgereinigte Lösung angewendet werden.
Genauer gesagt, wird bei dem Verfahren zum Aufreinigen einer ersten Doppelstrang-DNA aus einer die erste sowie eine zweite Doppelstrang-DNA enthaltenden Lösung (i) die Lösung über einen ersten Träger mit einem kovalent gekoppelten Oligonukleotid, das mit der zweiten Doppelstrang-DNA durch Hybridisierung mit einer darin vorhandenen spezifischen Sequenz eine Tripelhelix bilden kann, geleitet, (ii) die über den ersten Träger geleitete Lösung, die mit ungebundener erster Doppelstrang-DNA angereichert ist, aufgefangen und (iii) die aufgefangene Lösung über einen zweiten Träger mit einem kovalent gekoppelten Oligonukleotid, das mit der ersten Doppelstrang-DNA durch Hybridisierung mit einer darin vorhandenen spezifischen Sequenz eine Tripelhelix bilden kann, geleitet. Nach einem wahlfreien Waschschritt kann die erste Doppelstrang-DNA von dem zweiten Träger eluiert werden. Unter Verwendung dieses doppelten Aufreinigungsverfahrens kann die erste Doppelstrang-DNA von dem zweiten Träger ohne nachweisbare Spiegel der zweiten Doppelstrang-DNA aufgefangen werden.
Bei einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erste Doppelstrang-DNA-Molekül ein pCOR-Plasmid mit einer spezifischen Sequenz 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEQ ID NO: 29), die eine stabile Triplex-Struktur mit einem Oligonukleotid der Sequenz 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 30) bildet. Das zweite Doppelstrang-DNA Molekül ist ein von ColE1 abgeleitetes Plasmid mit einer spezifischen Sequenz 5'-AGAAAAAAAGGA- 3' (SEQ ID NO: 27), die einen Triplex mit einem Oligonukleotid der Sequenz 5'-TCTTTTTTTCCT-3 (SEQ ID NO: 28) bildet. Dementsprechend wird vorteilhafterweise das pCOR-Plasmid aus einer Lösung, die andere Plasmide, wie von ColE1 abgeleitete Plasmide enthält, unter Verwendung des erfindungsgemäßen doppelten Aufreinigungsverfahrens aufgereinigt.
Die vorliegende Anmeldung wird anhand der folgenden Beispiele detaillierter beschrieben, die nur als veranschaulichend und nicht als beschränkend aufgefasst werden sollen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Allgemeine Klonierungs- und Molekularbiologietechniken
Die herkömmlichen Verfahren der Molekularbiologie, wie Spaltung mit Restriktionsenzymen, Gelelektrophorese, Transformation in E. coli, Fällung von Nukleinsäuren und dergleichen, sind in der Literatur beschrieben (Maniatis et al., T., E. F. Fritsch und J. Sambrook, 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, zweite Auflage. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York; Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman und K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987–1988. John Wiley and Sons, New York). Die Nukleotidsequenzen wurden durch das Kettenterminationsverfahren gemäß dem bereits veröffentlichten Protokoll (Ausubel et al., 1987) bestimmt.
Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs) bezogen.
Zur Durchführung von Ligationen werden DNA-Fragmente in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2 mM ATP umfasst, in Anwesenheit von Phage-T4-DNA-Ligase (Biolabs) inkubiert.
Die Oligonukleotide werden unter Verwendung von Phosphoramiditchemie, wobei die Phosphoramidite an der β-Position durch eine Cyanoethylgruppe geschützt werden (Sinha, N. D., J. Biernat, J. McManus und H. Köster, 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII:
Use of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539–4557: Giles, J. W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dez.) mit einem automatischen DNA-Synthesegerät Biosearch 8600 unter Verwendung der Empfehlungen des Herstellers synthetisiert.
Ligierte DNAs oder DNAs, die hinsichtlich ihrer Effizienz zur Transformation getestet werden sollen, werden zur Transformation des folgenden, kompetent gemachten Stammes verwendet:

E. coli DH5α [F/endAI, hsdR17, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, Δ(lacZYA-arqF)U169, deoR, Φ80dlac (lacZΔM15)] (für jedes ColE1-Plasmid); oder
E. coli XAC-pir (für jedes von pCor abgeleitete Plasmid).

Minipräparationen von Plasmid-DNA werden gemäß dem Protokoll von Klein et al., 1980, durchgeführt.
LB-Kulturmedium wird für das Wachstum von E.-coli-Stämmen verwendet (Maniatis et al., 1982). Die Stämme werden bei 37°C inkubiert. Die Bakterien werden auf LB-Medium-Platten, die mit geeigneten Antibiotika angereichert sind, plattiert.
Beispiel 1
1.1. Herstellung der Säule
Ausrüstung
Die verwendete Säule ist eine mit NHS (N-Hydroxysuccinimid, Pharmacia) aktivierte 1-ml-HiTrap-Säule, die an eine peristaltische Pumpe angeschlossen ist (Ausstoß < 1 ml/min). Das spezifische verwendete Oligonukleotid besitzt eine NH₂-Gruppe am 5'-Ende, seine Sequenz ist wie folgt:

5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(SEQ ID NO: 1)

Die in diesem Beispiel verwendeten Puffer sind folgende:

Kopplungspuffer: 0,2 M NaHCO₃, 0,5 M NaCl, pH 8,3.
Puffer A: 0,5 M Ethanolamin, 0,5 M NaCl, pH 8,3.
Puffer B: 0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl, pH 4.

Verfahren:
Die Säule wird mit 6 ml 1 mM HCl gewaschen, und das im Kopplungspuffer verdünnte Oligonukleotid (50 nmol in 1 ml) wird dann auf die Säule aufgebracht und für 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Die Säule wird dreimal nacheinander mit 6 ml Puffer A und dann 6 ml Puffer B gewaschen. Das Oligonukleotid wird so durch eine CONH-Verknüpfung kovalent an die Säule gebunden. Die Säule wird bei 4°C in PBS, 0,1% NaN₃ aufbewahrt und kann mindestens viermal verwendet werden.
1.2. Konstruktion von Plasmiden
Die beiden folgenden Oligonukleotide wurden synthetisiert.

Oligonukleotid 4817:
Oligonukleotid 4818:

Wenn sie hybridisiert und in ein Plasmid kloniert werden, führen diese Oligonukleotide eine Homopurin-Homopyrimidin Sequenz (GAA)₁₇ (SEQ ID NO: 33) in das entsprechende Plasmid ein, wie oben beschrieben.
Die Sequenz, die diesen beiden hybridisierten Oligonukleotiden entspricht, wurde an die Mehrfach-Klonierungsstelle des Plasmids pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) kloniert, das ein Ampicillinresistenzgen trägt. Zu diesem Zweck wurden die Oligonukleotide folgendermaßen hybridisiert: Ein μg dieser zwei Oligonukleotide wurde zusammen in 40 ml eines endgültigen Puffers überführt, der 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl₂ umfasste. Dieses Gemisch wurde auf 95°C erhitzt und dann bei Zimmertemperatur belassen, so dass die Temperatur langsam fiel. Zehn ng des Gemischs der hybridisierten Oligonukleotide wurden mit 200 ng Plasmid pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), das mit BamHI und EcoRI gespalten worden war, in 30 μl Endvolumen ligiert. Nach der Ligation wurde ein Aliquot in DH5α transformiert. Die Transformationsgemische wurden auf L-Medium ausplattiert, das mit Ampicillin (50 mg/l) und X-Gal (20 mg/l) angereichert war. Rekombinante Klone sollten ein Fehlen von blauer Färbung auf diesem Medium zeigen, im Gegensatz zum Parentalplasmid (pBKS+), das eine α-Komplementierung des ω-Fragments der E.-coli-β-Galactosidase gestattet. Nach Minipräparation der Plasmid-DNA von 6 Klonen zeigten diese sämtlich das Verschwinden der zwischen den EcoRI- und BamHI-Stellen von pBKS+ gelegenen PstI-Stelle und eine Erhöhung des Molekulargewichts der 448-bp-PvuII-Bande, die die Mehrfach-Klonierungstelle enthält. Ein Klon wurde selektiert und das entsprechende Plasmid als pXL2563 bezeichnet. Die klonierte Sequenz wurde mittels Sequenzieren unter Verwendung des Primers -20 (5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3' (SEQ ID NO: 11)) (Viera J. und J. Messing. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal Primers. Gene, 19, 259–268) für das Plasmid pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) bestätigt. Das Plasmid pXL2563 wurde entsprechend dem Wizard Megaprep Kit (Promega Corp. Madison, WI) gemäß den Empfehlungen des Zulieferers aufgereinigt. Diese Plasmid-DNA-Präparation wurde anschließend in den nachstehend beschriebenen Beispielen verwendet.
1.3. Plasmid-Aufreinigung
Ausrüstung:
Das Plasmid pXL2563 (unter 1.2 beschrieben) wurde an der unter 1.1. beschriebenen HiTrap-Säule mit dem gekoppelten Oligonukleotid aus einer Lösung aufgereinigt, die außerdem das Plasmid pBKS+ enthielt. Die bei dieser Aufreinigung verwendeten Puffer sind folgende:

Puffer F: 2 M NaCl, 0,2 M Acetat, pH 4,5 bis 5.
Puffer E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Verfahren:
Die Säule wird mit 6 ml Puffer F gewaschen, und die Plasmide (20 μg pXL2563 und 20 μg pBKS+ in 400 μl Puffer F) werden auf die Säule aufgebracht und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säule wird mit 10 ml Puffer F gewaschen, und dann wird die Elution mit Puffer E durchgeführt. Die Plasmide werden nach Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel und Ethidiumbromidfärbung nachgewiesen. Der Anteil der Plasmide in der Lösung wird durch Messen ihrer Transformationsaktivität an E. coli gemessen.
Ergebnis:
Ausgehend von einem Gemisch, das 30% pXL2563 und 70% pBKS+ enthält, wird am Säulenauslass eine Lösung aufgefangen, die 100% pXL2563 enthält. Die durch das OD-Verhältnis bei 260 und 280 nm untersuchte Reinheit steigt von 1,9 bis 2,5, was zeigt, dass verunreinigende Proteine durch dieses Verfahren entfernt werden.
Beispiel 2
2.1. – Dieses Beispiel beschreibt ein Plasmid-DNA-Aufreinigungsexperiment.
Die Kopplung des Oligonukleotids (5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(SEQ ID NO: 1)) an die Säule wird durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Für die Kopplung wird das Oligonukleotid am 5'-Ende mit einer Amingruppe modifiziert, die mit dem Phosphat des Spacers durch einen Arm, der 6 Kohlenstoffatome enthält (modifiziertes Oligonukleotid, Eurogentec SA, Belgien) verknüpft wird. Das Plasmid pXL2563 wurde unter Verwendung des Wizard Megaprep Kits (Promega Corp., Madison, WI) gemäß den Empfehlungen des Zulieferers aufgereinigt. Die in diesem Beispiel verwendeten Puffer sind folgende:

Puffer F: 0–2 M NaCl, 0,2 M Acetat, pH 4,5 bis 5.
Puffer E: 1 M Tris-HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.

Die Säule wird mit 6 ml Puffer F gewaschen, und dann werden 100 μg Plasmid pXL2563, verdünnt in 400 μl Puffer F, auf die Säule aufgebracht und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säule wird mit 10 ml Puffer F gewaschen, und die Elution wird dann mit Puffer E durchgeführt. Das Plasmid wird durch Messen der optischen Dichte bei 260 nm quantifiziert.
Bei diesem Beispiel erfolgt die Bindung in einem Puffer, dessen Molarität in Bezug auf NaCl von 0 bis 2 M variiert (Puffer F). Die Aufreinigungsausbeute verringert sich, wenn die Molarität des NaCl fällt. Der pH des Bindungspuffers kann von 4,5 bis 5 variieren, wobei die Aufreinigungsausbeute bei 4,5 besser ist. Es ist ebenfalls möglich, einen anderen Elutionspuffer mit basischem pH zu verwenden: Also wurde die Elution mit einem Puffer durchgeführt, der 50 mM Borat, pH 9, 0,5 mM EDTA umfasste.
2.2. – Die Kopplung des Oligonukleotids
(5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1) an die Säule wird durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Plasmid pXL2563 wurde unter Verwendung des Wizard Megaprep Kits (Promega Corp., Madison, WI) gemäß den Empfehlungen des Zulieferers aufgereinigt. Die in diesem Beispiel verwendeten Puffer sind folgende:

Puffer F: 0,1 M NaCl, 0,2 M Acetat, pH 5.
Puffer E: 1 M Tris-HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.

Die Säule wird mit 6 ml Puffer F gewaschen, und dann werden 100 μg Plasmid pXL2563, verdünnt in 400 μl Puffer F, auf die Säule aufgebracht und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säule wird mit 10 ml Puffer F gewaschen, und die Elution wird dann mit Puffer E durchgeführt. Der Gehalt an genomischer oder chromosomaler E.-coli-DNA, der in den Plasmidproben vor und nach der Passage durch die Oligonukleotidsäule vorhanden ist, wird gemessen. Diese genomische DNA wird mittels PCR unter Verwendung von Primern im E.-coli-galK-Gen quantifiziert. Gemäß dem folgenden Protokoll: Die Sequenz dieser Primer ist von Debouck et al. beschrieben (Nucleic Acids Res. 1985, 13, 1841–1853): 5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (SEQ ID NO: 24) und 5'-CCAAGC TTC TAT GTT CAC GAC GGG TGT-3' (SEQ ID NO: 25). Das Reaktionsmedium umfasst in 25 μl PCR-Puffer (Promega Frankreich, Charbonnieres): 1,5 mM MgCl₂; 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 μM Primer; 20 U/ml Taq-Polymerase (Promega). Die Reaktion wird gemäß folgender Reihenfolge durchgeführt:

– 5 Minuten bei 95°C
– 30 Zyklen von 10 s bei 95°C 30 s bei 60°C 1 Minute bei 78°C
– 10 Minuten bei 78°C.

Das amplifizierte DNA-Fragment mit einer Länge von 124 Basepaaren wird durch Elektrophorese auf einem 3%igen Agarosegel in Anwesenheit von SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA) aufgetrennt und dann durch Bezugnahme auf eine ultrapure genomische DNA-Reihe des E.-coli-Stamms B (Sigma, Ref. D4889) quantifiziert.
Es sind 1% chromosomale DNA in der auf die Säule aufgetragenen Probe und 0,2% in der auf der Oligonukleotidsäule aufreinigten Probe.
Beispiel 3. Experiment an klarem Lysat
Dieses Beispiel beschreibt eine Plasmid-DNA-Aufreinigung aus einem klaren Lysat einer Bakterienkultur im so genannten "Minipräp"-Maßstab: 1,5 ml einer Übernachtkultur von DH5α-Stämmen, die das Plasmid pXL2563 enthalten, werden zentrifugiert, und das Sediment wird in 100 μl 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA resuspendiert. 200 μl 0,2 M NaOH, 1% SDS werden hinzugefügt, die Röhrchen zum Mischen umgedreht, 150 μl 3 M Kaliumacetat, pH 5, werden dann hinzugefügt und die Röhrchen zum Mischen umgedreht. Nach einer Zentrifugation wird der Überstand aufgefangen und auf die Oligonukleotidsäule aufgetragen, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wird. Die Bindung, die Waschschritte und die Elution sind identisch mit den in Beispiel 1 beschriebenen. Etwa 1 μg Plasmid wird aus 1,5 ml Kultur gewonnen. Das erhaltene Plasmid, das durch Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung analysiert wird, hat die Form einer einzelnen Bande von superhelikaler zirkulärer DNA. Keine Spur von hochmolekularer (chromosomaler) DNA oder von RNA ist in dem durch dieses Verfahren aufgereinigten Plasmid nachweisbar. Das Verhältnis der optischen Dichten bei 260 und 280 nm ist größer als 2.
Beispiel 4
4.1: Dieses Beispiel beschreibt ein Plasmid-DNA- Aufreinigungsexperiment, das unter den gleichen Bedingungen, wie Beispiel 3, ausgehend von 20 ml Bakterienkultur von DH5α-Stämmen, die das Plasmid pXL2563 enthalten, durchgeführt wird. Das Zellsediment wird in 1,5 ml 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA aufgenommen. Die Lyse wird mit 2 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS und die Neutralisation mit 1,5 ml 3 M Kaliumacetat pH 5 durchgeführt. Die DNA wird dann mit 3 ml 2-Propanol ausgefällt und das Sediment in 0,5 ml 0,2 M Natriumacetat, pH 5, 0,1 M NaCl aufgenommen und auf die Oligonukleotidsäule aufgetragen, die wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten wird. Die Bindung, das Waschen der Säule und die Elution werden durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Ausnahme des Waschpuffers, dessen Molarität in Bezug auf NaCl 0,1 M beträgt. Etwa 16 μg Plasmid-DNA werden erhalten. Das erhaltene, mittels Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung analysierte Plasmid hat die Form einer einzelnen Band von superhelikaler zirkulärer DNA. Keine Spur von hochmolekularer (chromosomaler) DNA oder RNA ist im aufgereinigten Plasmid nachweisbar. Die Spaltung des Plasmids mit einem Restriktionsenzym ergibt eine einzelne Bande mit dem erwarteten Molekulargewicht von 3 Kilobasen. Die Proteinkonzentration in den Proben fällt von 125 μg/ml im klaren Lysat bis auf kleiner als 1 μg/ml im aufgereinigten Plasmid (Mikro-BCA Assay, Pierce). Die mit dem LAL-Assay (Biosepra) abgeschätzte Endotoxinkonzentration ist im aufgereinigten Plasmid verglichen mit dem klaren Ausgangslysat durch einen Faktor von mehr als 10 dividiert.
4.2: Das verwendete Plasmid enthält eine Kassette, die den Cytomegalievirus-Promotor, das für Luciferase codierende Gen und die Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz (GAA)₁₇ (SEQ ID NO: 33) enthält, die aus dem Plasmid pXL2563 stammt. Der Stamm DH1 (Maniatis et al., 1989), der dieses Plasmid enthält, wird in einem 7-Liter-Fermenter gezüchtet. Ein klares Lysat wird aus 200 Gramm Zellen hergestellt: Das Zellsediment wird in 2 Litern 25 mM Tris, pH 6,8, 50 mM Glucose, 10 mM EDTA aufgenommen, zu denen 2 Liter 0,2 M NaOH, 1% SDS hinzugefügt werden. Das Lysat wird durch Hinzufügen von einem Liter 3 M Kaliumacetat neutralisiert. Nach Diafiltration werden 4 ml dieses Lysats auf eine 5-ml-HiTrap-NHS-Säule aufgetragen, die mit dem Oligonukleotid der Sequenz 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3 (SEQ ID NO: 1) gemäß dem in Beispiel 1.1 beschrieben Verfahren gekoppelt wurde. Das Waschen und die Elution werden durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Etwa 400 Mikrogramm des Plasmids werden aufgefangen. Der durch die in Beispiel 2.2 beschriebene Technik gemessene Spiegel an genomischer DNA in dieser Probe beträgt 0,1%.
Beispiel 5: Verwendung eines modifizierten Oligonukleotids
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung eines Oligonukleotids, das methylierte Cytosine trägt. Die Sequenz des verwendeten Oligonukleotids ist wie folgt:
Dieses Oligonukleotid besitzt eine NH₂-Gruppe am 5'-Ende. ^MeC = 5-Methylcytosin. Mit diesem Oligonukleotid kann das Plasmid pXL2563 unter den Bedingungen von Beispiel 1 mit einem Bindungspuffer aufgereinigt werden, der pH 5 aufweist (das Risiko eines Abbaus des Plasmids wird dadurch verringert).
Beispiel 6
In den obigen Beispielen ist das verwendete Oligonukleotid am 5'-Terminus mit einer Amingruppe modifiziert, die mit dem Phosphat über einen Arm verbunden wird, der 6 Kohlenstoffatome enthält: NH₂-(CH₂)₆. In diesem Beispiel wird die Amingruppe mit dem Phosphat des 5'-Terminus über einen Arm verbunden, der 12 Kohlenstoffatome enthält: NH₂-(CH₂)₁₂.
Die Kopplung des Oligonukleotids und die Passage durch die Säule werden wie in Beispiel 2 beschrieben mit einem Puffer F: 2 M NaCl, 0,2 M Acetat, pH 4,5 durchgeführt. Mit diesem Oligonukleotid kann eine bessere Aufreinigungsausbeute erzielt werden: eine 53%ige Ausbeute wird erhalten, wohingegen diese Ausbeute mit dem Oligonukleotid, das 6 Kohlenstoffatome enthält, unter den gleichen Bedingungen in der Größenordnung von 45% ist.
Beispiel 7
Gemäß der in Beispiel 1.2 beschriebenen Klonierungstrategie wurden zwei weitere Plasmide mit Homopurin-Homopyrimidin-Sequenzen konstruiert: das Plasmid pXL2725, das die Sequenz (GGA)₁₆ (SEQ ID NO: 34) enthält, und das Plasmid pXL2726, das die Sequenz (GA)₂₅ (SEQ ID NO: 35) enthält.
Beispiel 7.1: Konstruktion der Plasmide
Die zu dem Plasmid pXL2563 analogen Plasmide pXL2725 und pXL2726 wurden gemäß der in Beispiel 1.2 beschriebenen Klonierungstrategie unter Verwendung der folgenden Oligonukleotidpaare konstruiert:
Das Oligonukleotidpaar 5986 und 5987 wurde zur Konstruktion des Plasmids pXL2726 verwendet, indem die Oligonukleotide an die BamHI- und EcoRI-Stellen von pBKS+ (Stratagene CloningSystem, La Jolla CA) kloniert wurden, während die Oligonukleotide 5981 und 5982 zur Konstruktion des Plasmids pXL2725 verwendet wurden. Die gleichen experimentellen Bedingungen wie für die Konstruktion des Plasmids pXL2563 wurden verwendet, und nur die Oligonukleotidpaare wurden ausgetauscht. Ebenso wurden die klonierten Sequenzen mittels Sequenzieren auf den Plasmiden überprüft. Dadurch ließ sich erkennen, dass Plasmid pXL2725 eine Modifikation im Vergleich zu der erwarteten Sequenz besitzt: Anstelle der 17-mal wiederholten Sequenz GGA findet sich GGAGA(GGA)₁₅ (SEQ ID NO: 17).
Beispiel 7.2: Herstellung der Säulen und Aufreinigung
Die Oligonukleotide, die Tripelhelices mit diesen Homopurin-Sequenzen bilden, wurden gemäß der im Beispiel 1.1 beschriebenen Technik an HiTrap-Säulen gekoppelt. Das Oligonukleotid der Sequenz 5'-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (SEQ ID NO: 18) wurde zur Aufreinigung des Plasmids pXL2725 verwendet, und das Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (SEQ ID NO: 19) wurde zur Aufreinigung des Plasmids pXL2726 verwendet.
Die beiden dadurch erhaltenen Säulen ermöglichten die Aufreinigung der entsprechenden Plasmide gemäß der in Beispiel 2 beschriebenen Technik mit folgenden Puffern:

Puffer F: 2 M NaCl, 0,2 M Acetat, pH 4,5.
Puffer E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Die erhaltenen Ausbeuten sind 23% und 31% für pXL2725 bzw. pXL2726.
Beispiel 8
Dieses Beispiel veranschaulicht den Einfluss der Länge der in dem Plasmid vorhandenen, spezifischen Sequenz auf die Aufreinigungausbeute.
Beispiel 8.1: Konstruktion der Plasmide
Das Reportergen, das in diesen Experimenten verwendet wird, um die Aktivität der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zu demonstrieren, ist das für Luciferase (Luc) codierende Gen.
Das Plasmid pXL2621 enthält eine Kassette, die den 661-bp-Promotor des Cytomegalievirus (CMV) enthält und aus pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen MluI und HindIII extrahiert und stromaufwärts des für Luciferase codierenden Gens an den MluI- und HindIII-Stellen in den Vektor pGL-Basisvektor (Promega Corp., Madison, WI) kloniert wurde. Dieses Plasmid wurde unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken konstruiert.
Die Plasmide pXL2727-1 und pXL2727-2 wurden auf folgende Weise konstruiert:
Zwei Mikrogramm des Plasmids pXL2621 wurden mit BamHI linearisiert; das Enzym wurde durch Behandlung für 10 Minuten bei 65°C inaktiviert; gleichzeitig wurden die Oligonukleotide 6006 und 6008 hybridisiert, wie für die Konstruktion des Plasmids pXL2563 beschrieben.
Dieses Hybridisierungsgemisch wurde an die BamHI-Enden des Plasmids pXL2621 kloniert, und nach Transformation in DH5α wurden rekombinante Klone durch enzymatische Restriktionsanalyse mit PstI charakterisiert, da die Oligonukleotide eine PstI-Stelle einführen. Zwei Klone wurden ausgewählt, und die Nukleotidsequenz des klonierten Fragments wurde unter Verwendung des Primers (6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (SEQ ID NO: 22) als Sequenzierprimer (Viera J. und J. Messing. 1982. The pUC Plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal Primers. Gene, 19, 259–268) überprüft.
Der erste Klon (pXL2727-1) enthält 10-mal wiederholt die Sequenz GAA.
Der zweite (pXL2727-2) enthält die Sequenz 5'-GAAGAAGAG(GAA)₇GGAAGAGAA-3' (SEQ ID NO: 23).
Beispiel 8.2: Herstellung der Säulen und Aufreinigung
Eine Säule, wie die in Beispiel 1 beschriebene, die an das Oligonukleotid 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID NO: 1) gekoppelt ist, wird verwendet.
Das Plasmid pXL2727-1 trägt 14 Wiederholungen der Sequenz GAA. Das oben beschriebene Oligonukleotid, das nur 7 Wiederholungen der entsprechenden Hybridisierungssequenz CTT enthält, kann mit dem Plasmid an 8 unterschiedlichen Positionen hybridisieren. Das Plasmid pXL2727-2 besitzt dagegen eine Hybridisierungssequenz (GAA), (SEQ ID NO: 36) der gleichen Länge wie diejenige des an die Säule gebundenen Oligonukleotids. Dieses Oligonukleotid kann somit an nur einer Position an pXL2727-2 hybridisieren.
Das Experiment ist identisch zu dem in Beispiel 2 beschriebenen mit folgenden Puffern:

Die Aufreinigungsausbeute beträgt 29% bei Plasmid pXL2727-1 und 19% bei pXL2727-2.
Beispiel 8.3: In-vitro-Transfektion von Säugerzellen
Die verwendeten Zellen sind NIH-3T3-Zellen, die am Tag vor dem Experiment in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen auf der Basis von 50000 Zellen/Vertiefungen überimpft werden. Das Plasmid wird in 150 mM NaCl verdünnt und mit dem Lipofectant RPR115335 gemischt. Ein Verhältnis von positiven Lipofectant-Ladungen zu negativen DNA-Ladungen gleich 6 wird eingesetzt. Das Gemisch wird gevortext, für 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen, in Medium ohne fötalem Kälberserum verdünnt und dann zu den Zellen in einem Verhältnis von 1 μg DNA pro Kulturvertiefung hinzugefügt. Nach zwei Stunden bei 37°C werden 10% Volumen/Volumen fötales Kälberserum hinzugefügt, und die Zellen werden 48 Stunden bei 37°C in Anwesenheit von 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen, und die Luciferase-Aktivität wird gemäß dem beschriebenen Protokoll (Promega-Kit, Promega Corp. Madison, WI) an einem Lumat-LB9501-Luminometer (EG und G Berthold, Evry) gemessen. Das Plasmid pXL2727-1, das wie in Beispiel 8.2 beschrieben aufgereinigt wurde, ergibt zweimal so hohe Transfektionsausbeuten wie das gleiche Plasmid, das mit dem Wizard Megaprep Kit (Promega Corp. Madison, WI) aufgereinigt wird.
Beispiel 9: Aufreinigung von pCOR-abgeleiteten Plasmiden
Das folgende Beispiel zeigt die Aufreinigung der von pCOR abgeleiteten Plasmide unter Verwendung von Tripelhelix-Affinitätschromatographie. Von dieser Technologie wurde gezeigt, dass sie Nukleinsäureverunreinigungen (insbesondere genomische DNA und RNA des Wirt) bis auf Spiegel entfernt, die mit herkömmlichen Chromatographieverfahren nicht erzielt worden sind.
Ein Triplex-Affinitätsgel wurde mit Sephacryl S-1000 SF (Amersham-Pharmacia Biotech) als Chromatographiematrix synthetisiert. Sephacryl S-1000 wurde zunächst mit Natrium m-periodat (3 mM, Raumtemperatur, 1 Std.) in 0,2 M Natriumacetat (pH 4,7) aktiviert. Dann wurde das Oligonukleotid über seine 5'-terminale NH₂-Einheit an die Aldehydgruppen der aktivierten Matrix mittels reduktiver Aminierung in Gegenwart von Ascorbinsäure (5 mM) gekoppelt, wie zuvor für die Kopplung von Proteinen beschrieben (Hornsey et al. J. Immunol. Methods, 1986, 93, 83–88). Das für diese Experimente verwendete Homopyrimidin-Oligonukleotid (von Eurogentec, HPLC-aufgereinigt) hatte eine Sequenz, die komplementär zu einer kurzen 14-mer-Homopurin-Sequenz (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3') (SEQ ID NO: 29) war, die im Replikationsursprung (oriγ) des pCOR-Plasmids vorliegt (Soubrier et al., Gene Therapy, 1999, 6, 1482–1488). Wie vorstehend erläutert, ist die Sequenz des Homopyrimidin-Oligonukleotids 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 30).
Die folgenden Plasmide wurden chromatographisch aufgetrennt: pXL3296 (pCOR ohne Transgen, 2,0 kbp), pXL3179 (pCOR-FGF, 2,4 kbp), pXL3579 (pCOR-VEGFB, 2,5 kbp), pXL3678 (pCOR-AFP, 3,7 kbp), pXL3227 (pCOR-lacZ 5,4 kbp) und pXL3397 (pCOR-B-deletierter FVIII, 6,6 kbp). Diese sämtlichen Plasmide wurden durch zwei Anionenaustauschchromatographieschritte aus klaren Lysaten aufgereinigt, die wie in Beispiel 4 beschrieben erhalten wurden. Durch Ultrazentrifugation in CsCl aufgereinigtes Plasmid pBKS+ (pBluescript II KS + von Stratagene), ein von ColE1 abgeleitetes Plasmid, wurde ebenfalls untersucht. Alle verwendeten Plasmide lagen in ihrem superhelikalen (> 95%) topologischen Zustand vor.
Bei jedem Plasmid-DNA-Aufreinigungsexperiment wurden 300 μg Plasmid-DNA in 6 ml 2 M NaCl, 0,2 M Kaliumacetat (pH 5,0) bei einer Flussrate von 30 cm/Std. auf eine Affinitätssäule aufgetragen, die das oben genannte Oligonukleotid 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 30) enthielt. Nach Waschen der Säule mit 5 Volumina des gleichen Puffers wurde gebundenes Plasmid mit 1 M Tris/HCl, 0,5 mM EDTA (pH 9,0) eluiert und mittels UV (260 nm) und Ionenaustauschchromatographie mit einer Millipore-Gen-Pak-Säule (Marquet et al., BioPharm, 1995, 8, 26–37) quantifiziert. Die Plasmidausbeuten in den gesammelten Fraktionen betrugen 207 μg für pXL3296, 196 μg für pXL3179, 192 μg für pXL3579, 139 μg für pXL3678, 97 μg für pXL3227 und 79 μg für pXL3397.
Keine Plasmidbindung (< 3 μg) konnte ermittelt werden, wenn pBKS auf dieser Säule chromatographisch aufgetrennt wurde. Dies zeigt, dass das Oligonukleotid 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3 (SEQ ID NO: 30) stabile Triplex-Strukturen mit der komplementären 14-mer-Sequenz 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEQ ID NO: 29) in pCOR (oriγ), aber nicht mit der nahe verwandten Sequenz 5'-AGAAAAAAAGGA-3' (SEQ ID NO: 27) in pBKS bildet. Dies deutet darauf hin, dass die Einführung einer einzelnen nichtkanonischen Triade (in diesem Fall T·GC) zu einer vollständigen Destabilisierung der Triplex-Struktur führt.
Als Kontrolle wurde keine Plasmidbindung (< 1 μg) beobachtet, wenn pXL3179 auf einer nackten Säule chromatographisch aufgetrennt wurde, die unter strikt denselben Bedingungen, aber ohne Oligonukleotid, synthetisiert wurde.
Indem diese Affinitätsaufreinigungssäule unter den hier beschriebenen Bedingungen betrieben wurde, wurde der Spiegel der Kontamination durch genomische Wirts-DNA für eine Präparation von pXL3296 von 2,6% bis hinunter auf 0,07% verringert. Ebenso wurde der Spiegel der Kontamination durch Wirts-DNA für eine Präparation von pXL3179 von 0,5% bis hinunter auf 0,008% verringert, wenn die Probe über die gleiche Affinitätssäule chromatographisch aufgetrennt wurde. Zusätzlich wurde der Spiegel der Kontamination durch RNA in einer Präparation von pXL3179 von 43% RNA bis hinunter auf 0,2% RNA unter Verwendung dieser Affinitätsaufreinigungssäule stark verringert.
Weiterhin betrug die Ausbeute des Plasmids PXL3579 weniger als 8%, wenn das Oligonukleotid 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 30) durch das Oligonukleotid 5'-TTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 31) an der Affinitätssäule ersetzt wurde. Während das in SEQ ID NO: 31 angegebene Oligonukleotid zu einem Teil der VEGFB-Sequenz in PXL3579 (d. h. den Nukleotiden 379 bis 389 in Bezug auf das ATG) komplementär ist, tritt keine signifikante Triplex-Affinität auf. Dies deutet darauf hin, dass diese Affinitätsaufreinigung eine nicht-zufallsgemäße Homopurin-Homopyrimidin-DNA-Sequenz erfordert.
Beispiel 10: Aufreinigung eines von ColE1-abgeleiteten Plasmids
Das folgende Beispiel zeigt die Aufreinigung von ColE1-abgeleiteten Plasmiden unter Verwendung von Tripelhelix-Affinitätschromatographie. Von dieser Technologie wurde gezeigt, dass sie Nukleinsäureverunreinigungen (insbesondere genomische DNA und RNA des Wirts) bis auf Spiegel entfernt, die mit herkömmlichen Chromatographieverfahren nicht erzielt worden sind.
Ein Triplex-Affinitätsgel wurde durch Kopplung eines Oligonukleotids mit der Sequenz 5'-TCTTTTTTTCCT- 3' (SEQ ID NO: 28) an Periodat-oxidiertes Sephacryl S-1000 SF, wie in Beispiel 9 beschrieben, synthetisiert.
Die Plasmide pXL3296 (pCOR ohne Transgen) und pBKS, ein von ColE1 abgeleitetes Plasmid, wurden auf einer 1-ml-Säule, die das Oligonukleotid 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 28) enthielt, unter den in Beispiel 9 beschriebenen Bedingungen chromatographisch aufgetrennt. Die Plasmidausbeuten in der gesammelten Fraktion betrugen 175 μg für pBKS und < 1 μg für pXL3296. Dies zeigt, dass das Oligonukleotid 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 28) stabile Triplex-Strukturen mit der komplementären 12-mer-Sequenz (5'-AGAAAAAAAGGA-3') (SEQ ID NO: 27) in pBKS, aber nicht mit der sehr nahe verwandten 12-mer-Sequenz (5'-AGAAAAAAAAGA-3') (SEQ ID NO: 32) in pCOR bildet. Dies deutet darauf hin, dass die Einführung einer einzelnen nicht-kanonischen Triade (in diesem Fall C·AT) zu vollständiger Destabilisierung der Triplex-Struktur führen kann.
Beispiel 11: Doppeltes Aufreinigungsverfahren
Das folgende Beispiel zeigt die Aufreinigung eines superhelikalen Doppelstrang-DNA-Moleküls, wie pXL3296, in einem Gemisch, das ein anderes superhelikales Doppelstrang-Molekül, wie pBSK, enthält, unter Verwendung von Tripeihelix-Affinitätschromatographie. Beide Doppelstrang-DNA-Moleküle können eine ähnliche Größe haben, aber jedes DNA-Molekül enthält eine einzigartige Sequenz, die zur Bildung einer Tripeihelix mit einer anderen Zielsequenz fähig ist. Wie zuvor erläutert, enthalten Moleküle, wie pXL3296, eine Sequenz 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEQ ID NO: 29), aber nicht die Sequenz 5'-AGAAAAAAAGGA-3' (SEQ ID NO: 27). Dagegen enthalten Moleküle, wie pBSK, SEQ ID NO: 27, aber nicht SEQ ID NO: 29.
In einem ersten Schritt wurde das Gemisch, das pXL3296 und pBSK enthielt, auf eine erste Affinitätssäule, wie die in Beispiel 10 beschriebene Säule, aufgetragen, die das Oligonukleotid 5'-TCTTTTTTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 28) enthielt. Die Lösung wurde durch die erste Säule geleitet, die ungebundene DNA Moleküle enthielt. Im zweiten Schritt wurden die ungebundenen DNA-Moleküle aus dem ersten Schritt auf eine zweite Affinitätssäule, wie die in Beispiel 9 beschriebene Säule, aufgetragen, die das Oligonukleotid 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEQ ID NO: 30) enthielt. Die zweite Säule wurde dann gewaschen, und die gebundenen Moleküle wurden eluiert, wie in Beispiel 9 beschrieben. Nur pXL3296-Moleküle eluierten von der zweiten Säule. Keine pBSK-Moleküle wurden im Eluat (d. h. in der von der Säule eluierenden Lösung) der zweiten Säule ermittelt.
SEQUENZPROTOROLL

Claims

Verfahren zur Aufreinigung von Doppelstrang-DNA aus einer die Doppelstrang-DNA im Gemisch mit anderen Bestandteilen enthaltenden Lösung, bei dem man die Lösung über einen Träger mit einem kovalent gekoppelten Oligonukleotid, das mit der Doppelstrang-DNA durch Hybridisierung mit einer in der Doppelstrang-DNA vorhandenen spezifischen Sequenz eine Tripelhelix bilden kann, ohne daß dabei irgendeine nichtkanonische Triade gebildet wird, leitet, wobei das kovalent gekoppelte Oligonukleotid die Sequenz TCTTTTTTTCCT (SEQ ID NO: 28) oder TTCTTTTTTTTCTT (SEQ ID NO: 30) umfaßt.
Verfahren zur Aufreinigung von Doppelstrang-DNA aus einer die Doppelstrang-DNA im Gemisch mit anderen Bestandteilen enthaltenden Lösung, bei dem man die Lösung über einen Träger mit einem kovalent gekoppelten Oligonukleotid, das mit der Doppelstrang-DNA durch Hybridisierung mit einer in der Doppelstrang-DNA vorhandenen spezifischen Sequenz eine Tripelhelix bilden kann, ohne daß dabei irgendeine nichtkanonische Triade gebildet wird, leitet, wobei die in der Doppelstrang-DNA vorhandene spezifische Sequenz die Sequenz AGAAAAAAAGGA (SEQ ID NO: 27) oder AAGAAAAAAAAGAA (SEQ ID NO: 29) umfaßt.
Verfahren zur Aufreinigung einer ersten Doppelstrang-DNA aus einer die erste Doppelstrang-DNA sowie eine zweite Doppelstrang-DNA enthaltenden Lösung, bei dem man (i) die Lösung über einen ersten Träger mit einem kovalent gekoppelten Oligonukleotid, das mit der zweiten Doppelstrang-DNA durch Hybridisierung mit einer darin vorhandenen spezifischen Sequenz eine Tripelhelix bilden kann, ohne daß dabei irgendeine nichtkanonische Triade gebildet wird, leitet, (ii) die über den ersten Träger geleitete Lösung auffängt und (iii) die aufgefangene Lösung über einen zweiten Träger mit einem kovalent gekoppelten Oligonukleotid, das mit der ersten Doppelstrang-DNA durch Hybridisierung mit einer darin vorhandenen spezifischen Sequenz eine Tripelhelix bilden kann, ohne daß dabei irgendeine nichtkanonische Triade gebildet wird, leitet, wobei die in der ersten Doppelstrang-DNA vorhandene spezifische Sequenz die Sequenz AAGAAAAAAAAGAA (SEQ ID NO: 29) und die in der zweiten Doppelstrang-DNA vorhandene spezifische Sequenz die Sequenz AGAAAAAAAGGA (SEQ ID NO: 27) umfaßt.
Verfahren zur Aufreinigung einer ersten Doppelstrang-DNA aus einer die erste Doppelstrang-DNA sowie eine zweite Doppelstrang-DNA enthaltenden Lösung, bei dem man (i) die Lösung über einen ersten Träger mit einem kovalent gekoppelten Oligonukleotid, das mit der zweiten Doppelstrang-DNA durch Hybridisierung mit einer darin vorhandenen spezifischen Sequenz eine Tripelhelix bilden kann, leitet, (ii) die über den ersten Träger geleitete Lösung auffängt und (iii) die aufgefangene Lösung über einen zweiten Träger mit einem kovalent gekoppelten Oligonukleotid, das mit der ersten Doppelstrang-DNA durch Hybridisierung mit einer darin vorhandenen spezifischen Sequenz eine Tripelhelix bilden kann, leitet, wobei das Oligonukleotid, das mit der ersten Doppelstrang-DNA eine Tripelhelix bilden kann, die Sequenz TTCTTTTTTTTCTT (SEQ ID NO: 30) und das Oligonukleotid, das mit der zweiten Doppelstrang-DNA eine Tripelhelix bilden kann, die Sequenz TCTTTTTTTCCT (SEQ ID NO: 28) umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei der Lösung um ein Zellysat handelt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Zellysat um ein klares Lysat handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Doppelstrang-DNA vorgereinigt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die spezifische Sequenz künstlich in die Doppelstrang-DNA eingeführt wurde oder natürlicherweise in der Doppelstrang-DNA vorhanden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Oligonukleotid über eine Disulfid-, Thioether-, Ester-, Amid- oder Aminverknüpfung an den Träger gekoppelt ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Oligonukleotid an die Säule über einen eine Kohlenstoffkette (CH₂)_n umfassenden Arm gebunden ist, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 18 (einschließlich) ist und wobei der Arm mit dem Oligonukleotid über eine Phosphat- und mit der Säule über eine Amidverknüpfung verknüpft ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Oligonukleotid wenigstens eine chemische Modifikation besitzt, durch die es gegen Nukleasen resistent gemacht bzw. geschützt wird oder seine Affinität zu der spezifischen Sequenz erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei wenigstens eines der Cytosine des Oligonukleotids methyliert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei es sich bei der Doppelstrang-DNA um eine zirkuläre DNA handelt.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei es sich bei der zirkulären DNA um ein Plasmid handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die in der Doppelstrang-DNA vorhandene spezifische Sequenz mehrere Positionen für die Hybridisierung mit dem Oligonukleotid umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei es sich bei dem Träger um einen funktionalisierten chromatographischen Träger, eine funktionalisierte Kunststoffoberfläche oder funktionalisierte Latexkügelchen handelt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei es sich bei dem Träger um einen funktionalisierten chromatographischen Träger handelt.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die aufgereinigte Doppelstrang-DNA einen chromosomalen DNA-Gehalt kleiner gleich 0,5% aufweist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die aufgereinigte Doppelstrang-DNA einen chromosomalen DNA-Gehalt kleiner gleich 0,01% aufweist.