CN1446258A - 用固定化的寡核苷酸纯化三股螺旋体结构 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了纯化双链DNA的方法，通过此方法，含有混合其它组分的上述DNA的溶液流经其上共价偶联了寡核苷酸的支持物，此寡核苷酸能够与上述DNA中的特异序列杂交形成三股螺旋。
Description
参照相关申请
本申请要求2000年5月26日申请的美国申请第09/580 923号的优先权利益。后者是1997年6月9日申请的美国申请第08/860 038号的部分继续申请，而美国申请08/860,038是1995年11月8号申请的PCTFR95/01468的美国国家阶段申请，其内容作为根据并引为参考文献。
发明背景
这个发明涉及新的DNA纯化方法。根据本发明的方法可以迅速纯化药用双螺旋DNA。更具体地，根据本发明的方法包括DNA序列和寡核苷酸的特异性杂交。
基因和细胞治疗目前正经历着显著的发展。但是，这些技术要求可能生产大量药用纯度的DNA。实际上，在这些新的疗法里，药剂本身经常含有DNA，关键是能够生产合适的量，分离和以适合人体治疗使用的方式纯化。
近年来，注射质粒DNA用于基因治疗或疫苗接种已被大量的报告证明可行，这些报告证明DNA表达载体可以被多种细胞类型吸收，而且接着可以表达这些质粒编码的基因(Ledley，1995 Hum.GeneTher.6，1129).
基因治疗和疫苗接种应用中的目的基因可能包括，例如，肿瘤抑制基因， 自杀基因或者反义序列。它们也可编码蛋白，比如，甲胎蛋白AFP(Morinaga，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，4604)，酶，激素，细胞因子，生长因子如FGF(Jounanneau等，1991，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，88，2893)或者VEGFB(Olofsson B等，1996，Proceedings 93，576)，凝血因子如B缺失因子VIII(Truett等，1985，DNA 4，333)，载脂蛋白，神经递质，神经营养因子，天然或嵌合免疫球蛋白。也使用了报告基因，例如编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶的lacZ。
使用质粒DNA作为人体基因传送载体的主要挑战是：1)此药品的制造和2)纯度。最近发展了一些技术用于在大肠杆菌宿主中产生高拷贝数的质粒载体。目前使用的质粒要么是ColE1衍生质粒，比如pBR322，pUC或者pBluescript(Lahijani等，1996，Hum.Gene.Ther.，7，1971)，或者pCOR质粒(Soubrier等，1999，Gene Therapy，6，1482)。
使用质粒DNA作为基因治疗载体所产生的第二个考虑事项是质粒载体本身的纯度。目前的纯化方法，比如氯化铯梯度超离心或者层析，在去除宿主基因组DNA和RNA或蛋白质污染时效率低下。特别是，化学结构和质粒DNA非常接近的宿主基因组DNA，使用常规层析极难去除。常规层析法制备的质粒中有典型浓度达0.5％到1％的宿主基因组DNA。因此，为了发展作为用于人类基因治疗的安全载体的质粒DNA，需要纯化技术可以降低宿主基因组DNA的含量到很低的水平，典型为0.1％，甚至0.01％或者更低。
本发明描述简单而特别有效的DNA纯化新方法。特别是，它使获得高产量高纯度成为可能。根据本发明的方法本质上是基于要纯化的DNA中所插入的序列和由天然或修饰过的碱基组成的寡核苷酸的特异性相互作用。
最近表明一些寡核苷酸能够在DNA双螺旋的大沟特异性地相互作用而局部形成三股螺旋，导致目的基因的转录被抑制(Helene et，Toulme，Biochim.Biophys.Acta 1049(1990)99)。这些寡核苷酸在寡嘌呤-寡嘧啶序列选择性地识别DNA双螺旋，也就是这样的区域：一条链是寡嘌呤序列，而互补链是寡嘧啶序列，从而在那里形成局部三股螺旋。第三条链(寡核苷酸)的碱基与Watson-Crick碱基对的嘌呤形成氢键(Hoogsteen键或反Hoogsteen键)。
现有技术里已经描述了这种相互作用在分离质粒中的用途。Ito等(PNAS 89(1992)495)描述了能够识别质粒的特定序列从而与之形成三股螺旋的生物素化的寡核苷酸的用途。然后让这样形成的复合体与链亲和素包被的磁珠接触。生物素和链亲和素之间的作用使得能够通过磁分离磁珠然后洗脱而将质粒分离出来。然而，这个方法有一些缺点。尤其是，需要两个连续的特异性相互作用，第一在寡核苷酸和质粒之间，而第二在生物素化的复合体和链亲和素的珠子之间。并且，最后的溶液可能被生物素化的寡核苷酸所污染，这样就不能用于药物组合物。
发明概述
本发明描述了新的改进的利用这种相互作用的DNA纯化方法。更具体的是，本发明的方法使用共价偶联于支持物的寡核苷酸。这个方法极为快速，且导致特别高的产量和纯度。而且，它能够从复杂混合物中纯化DNA，特别是当复杂混合物含有其他核酸，蛋白质，内毒素(如脂多糖)，核酸酶，等等。另外，支持物可以方便再生，且得到的DNA表现改进的药用安全的性质。最后，与现有技术相比，这个方法只需一步。
因此，本发明的首要主题是用于纯化双链DNA的方法，根据这个方法，含有混有其它组分的上述DNA的溶液流经共价偶联寡核苷酸的支持物，而这段寡核苷酸能够和上述DNA中的特定序列杂交形成三股螺旋。这段特定序列可以是双螺旋DNA中天然存在的序列，也可以是人工引入其中的合成序列。
本发明中使用的寡核苷酸是直接与双链DNA杂交的寡核苷酸。这些寡核苷酸可以包括以下碱基：
-胸腺嘧啶脱氧核苷(T)，能够与双链DNA的A.T对形成三体(Rajagopal等，Biochem 28(1989)7859)；
-腺嘌呤(A)，能够与双链DNA的A.T对形成三体；
-鸟嘌呤(G)，能够与双链DNA的C.G对形成三体；
-质子化胞嘧啶(C+)，能够与双链DNA的G.C对形成三体(Rajagopal等)；
-尿嘧啶(U)，能够与A.T碱基对或A.U碱基对形成三体；
优选地，使用的寡核苷酸含有富含胞嘧啶的单一嘧啶(homopyrimidine)序列，而DNA中的特定序列是单一嘌呤(homopurine)-单一嘧啶序列。胞嘧啶的存在使得可以具有在性pH值下胞嘧啶质子化时是稳定的，而在碱性pH值下胞嘧啶中性时不稳定的三股螺旋。
为了允许通过杂交形成三股螺旋，寡核苷酸和DNA中的特定序列互补是很重要的。在这种关系中，为了得到最好的产率和最好的选择性，在本发明的方法中使用完全互补的寡核苷酸和特定序列。具体的，这些可以是寡核苷酸聚(CTT)和特定序列聚(GAA)。作为一个例子，可能会提到这样的寡核苷酸序列：5’-GAGG C TT C TT C TT C TT C TT CTT C TT-3’(GAGG(CTT)7；SEQ ID NO：1)，其中碱基GAGG并不形成三股螺旋但使寡核苷酸可以从偶联臂上分开；序列(CTT)7(SEQ ID NO：26)也可能提到。这些寡核苷酸能够跟含有互补单元(GAA)的特定序列形成三股螺旋。特别是，讨论中的序列可以是含有7，14，17个GAA单元的区域，如实施例中所述。
另一段特别有用的序列是：5’-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3’(SEQIDNo：5)，这段序列与寡核苷酸：5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’(SEQ IDNo：6)或者5’-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3’(SEQ ID NO：7)形成三股螺旋.
在这个例子里，寡核苷酸以反平行方向结合聚嘌呤链。这些三股螺旋只有在存在镁离子(Mg2+)时才稳定(Vasquez等，Biochemistry，1995，34，7243-7251；Beal和Dervan，Science，1991，251，1360-1363).
正如以上所述，特定序列可以是双链DNA中天然存在的序列，也可以是人工引入到双螺旋DNA中的合成序列。尤其有利的是使用和双链DNA中比如在质粒的复制起始点或在标记基因中天然存在的序列形成三股螺旋的寡核苷酸。因此，本申请人进行了质粒序列分析，且能够表明这些DNA的一些区域，尤其在复制起始处，有单一嘌呤-单一嘧啶区域。能够跟这些天然的单一嘌呤-单一嘧啶区域形成三股螺旋的寡核苷酸的合成可以有利地将本发明的方法应用于未经修改的质粒，尤其是pUC，pBR322，pSV之类的商品质粒。在双螺旋DNA里天然出现的单一嘌呤-单一嘧啶序列，可提到大肠杆菌质粒ColE1的复制起始处存在的序列，它包含以下序列的全部或者部分：5-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3’(SEQ ID NO：2)。在此情况下，形成三股螺旋的寡核苷酸有以下序列：5-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3’(SEQ IDNO：3)，并且根据Beal和Dervan(J.Am.Chem.Soc.1992，114，4976-4982)与Jayasena和Johnston(Nucleic Acids.Res.1992，20，5279-5288)的叙述，它也可以跟双螺旋的两条链结合。可能也会提到pBR322质粒的β-内酰胺酶基因(Duval-Valentin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，504-508)中的序列5’-GAAAAAGGAAGAG-3’(SEQ ID NO：4)。
在ColE1和pCOR的复制起始处已经鉴定了另两个目的序列，它们可以跟特定寡核苷酸形成三体结构。ColE1的衍生质粒含有一段12碱基的单一嘌呤序列(5’-AGAAAAAAAGGA-3’)(SEQ ID NO：27)，这段序列位于与质粒复制有关的RNA-II转录的上游(Lacatena等，1981，Nature，294，623)。这一序列与互补的12碱基寡核苷酸5’-TCTTTTTTTCCT-3’(SEQ ID NO：28)形成稳定的三体结构。pCOR骨架含有14个非重复的碱基的单一嘌呤区域(5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’)(SEQ ID NO：29)，此区域位于pCOR复制子的γ复制起始点的富含A+T的部分(Levchenko等，1996，Nucleic Acids Res.，24，1936)。这一序列与互补的14碱基寡核苷酸5’-T TCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO：30)形成稳定的三体结构。相应的寡核苷酸5’-TCTTTTTTTCCT-3’(SEQ ID，NO：28)和5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO：30)有效并特异的靶向它们各自位于ColE1 ori或者pCOR(oriγ)的复制起点中的互补序列。事实上，单个非规范的三联体(T*GC或C*AT)就可能导致三体结构的完全去稳定。
尤其有利的是使用能够与复制起始或标记基因中的序列形成三股螺旋的寡核苷酸，因为它使得用相同的寡核苷酸可能纯化任何含有上述复制起始或标记基因的DNA。这样就不必修饰质粒或者双链DNA以向其中加入人工特异序列。
尽管优选完全互补的序列，但是可以理解，如果并不导致亲和力的太大损失则可以容忍寡核苷酸和DNA中的序列之间的一些错配。可提到大肠杆菌β-内酰胺酶基因中的序列5’-AAAAAAGGGAA
TAAGGG-3’(SEQ ID NO：8)。在此例中，打断聚嘌呤序列的胸腺嘧啶可以被第三条链的鸟嘌呤所识别，从而形成G*TA三联体，如果两翼是两个T*AT三联体时，它就是稳定的(Kiessling等，Biochemistry，1992，31，2829-2834)。
根据特定的实施方案，本发明中的寡核苷酸包含序列(CTT)n，序列(CT)n，或者序列(CTT)n，其中n表示1到15(包括1和15)的整数。特别有利的是使用(CT)n或者(CTT)n类型的序列。实际上，本申请人表明，纯化产率受到寡核苷酸中C的含量的影响。具体，如实施例7中所示，当寡核苷酸含有较少的胞嘧啶时，纯化产量增加。可以理解的是，本发明中的寡核苷酸同样可以联合(CTT)，(CT)或者(CTT)单元。
使用的寡核苷酸可以是天然的(由未修饰的天然碱基组成)或者是化学修饰过的。具体地，寡核苷酸具有某些化学修饰可能是有利的，这使得它可以抵抗或抵御核酸酶，或者提高对特定序列的亲和力。
根据本发明，可以理解的是，寡核苷酸指的是任何相连的核苷酸连续体，它经历过目的是使它更能抵抗核酸酶的骨架修饰。在可能的修饰里，可能会提到可以和DNA形成三股螺旋的硫代磷酸寡核苷酸(Xodo等，Nucleic Acids Res.，1994，22，3322-3330)，以及有formacetal或膦酸甲酯(methylphosphonate)骨架的寡核苷酸(Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.，1991，113，7767-7768)。也可能使用由核苷酸的α异头物合成的寡核苷酸，它也可以跟DNA形成三股螺旋(Le Doan等，Nucleic Acids Res.，1987，15，7749-7760)。骨架的另一种修饰是氨基磷酸酯键。例如，可能提到Gryaznov和Chen描述的N3’-P5’核苷酸间的氨基磷酸酯键，那将得到跟DNA形成特别稳定三股螺旋的寡核苷酸(J.Am.Chem.Soc.，1994，116，3143-3144)。在其它的骨架修饰中，使用核糖核苷酸，2’-0-甲基核糖，磷酸二脂等等(Sun和Helene，Curr.Opinion Struct.Biol.，116，3143-3144)，也可被提到。最后，磷基础的骨架在PNAs(肽核酸)中可能被聚酰胺骨架所替代，这样也可以形成三股螺旋(Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500；Kim等，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，6477-6481)；或者如在DNGs(脱氧核糖核酸胍，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6097-6101)中被胍基础的骨架所替代，或者被DNA的聚阳离子类似物所代替，这样也可形成三股螺旋。
第三链的胸腺嘧啶也可能被5’-溴尿嘧啶所代替，后者提高了寡核苷酸跟DNA的亲和力(Posic和Devan，J.Am.Chem.Soc.，1989，111，3059-3061)。第三条链还可能含有非天然碱基，当中有将会提到的7-脱氮-2’-脱氧黄嘌呤核苷(Milligan等，Nucleic AcidsRes.，1993，21，327-333)，1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-甲基-5-氨基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(Koh和Dervan，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1470-1478)，8-氧代腺嘌呤，2-氨基嘌呤，2’-0-甲基假异胞嘧啶，或本领域技术人员已知的其他任何修饰(综述见Sun和Helene，Curr.Opinion Struct.Biol.，1993，3，345-356)。
另一类寡核苷酸的修饰目的更特别，是提高寡核苷酸和特定序列的相互作用或/和亲和力。具体的，根据本发明的最有利的修饰包括甲基化寡核苷酸中的胞嘧啶(参看实施例5)，这样甲基化的寡核苷酸表现了这样值得注意的特性：在接近中性的pH值(≥5)下跟特定序列形成稳定的三股螺旋。这样就有可能在比现有技术的pH值高的情况下作用，也就是说，在导致质粒DNA降解的风险更低的PH值下。
本发明中的方法所使用的寡核苷酸的长度是至少3个碱基，且优选5到30个。长度大于10的寡核苷酸用起来比较有利。长度由本领域技术人员根据每个单独案例调整以适合相互作用需要的选择性和稳定性。
根据本发明的寡核苷酸可以由任何已知技术合成。具体地，可以由核酸合成仪制备。显然本领域技术人员已知的任何方法都是可以用的。
为了允许它共价偶联于支持物，寡核苷酸通常都官能化。这样，可以在5’或者3’位置用硫醇，胺或羧基末端基团来修饰它。具体地，另加的硫醇，胺或羧基基团使得寡核苷酸可以偶联于带有二硫化物，马来酰亚胺，胺，羧基，酯，环氧化物，溴化氰或乙醛官能基的支持物。这些偶联通过在寡核苷酸和支持物之间建立二硫键，硫醚，酯，酰胺或胺键而形成。也可以使用本领域技术人员所熟悉的任何其他方法，例如，双功能偶联剂。
而且，为了改善与偶联的寡核苷酸的杂交，寡核苷酸含有“手臂”和“间隔区”碱基序列是有利的。实际上，使用手臂可以在选定的与支持物的距离上结合寡核苷酸，使得跟DNA相互作用的条件得到改善。手臂最好是由线性碳链(它含有1到18个，优选6或者12个(CH2)基团)及允许结合于柱子的胺组成。手臂连接于寡核苷酸的磷酸酯，或者是含有不干扰杂交的碱基的间隔区的磷酸酯。这样，间隔区可以含有嘌呤碱基。一个例子是，间隔区可以含有GAGG序列。手臂最好是由含6或者12个碳原子的线性碳链构成。
为实施本发明，可以使用不同类的支持物。这些可以是官能化的层析支持物，散装或者预装于柱中，官能化的塑料表面或者官能化的胶乳珠，磁性的或者其它的。优选使用层析支持物。例如，可以使用的层析支持物是琼脂糖，丙烯酰胺，葡聚糖以及它们的衍生物(如Sephadex，Sepharose，Superose等)，聚合物如聚(苯乙烯/二乙烯基苯)，或者接枝或非接枝二氧化硅(silica)。层析柱可以扩散或灌注模式操作。
为了获得更好的纯化产量，特别有利的是质粒上使用含有几个跟寡核苷酸杂交的位置的序列。实际上，几个杂交位置的存在促进了上述序列和寡核苷酸的相互作用，这导致纯化产量的提高。这样，对于含有(CCT)，(CT)或者(CTT)基元的n个重复的寡核苷酸，优选使用最少含n个互补基元，优选n+1个互补基元的DNA序列。含有n+1个互补基元的序列可以提供两个跟寡核苷酸杂交的位置。有利的是，DNA序列含有多达11个杂交位置，也就是说，n+10个互补基元。
根据本发明的方法可以用于纯化任何类型的双链DNA。比如环状DNA如质粒，通常带有一或更多有治疗意义的基因。这个质粒也可能带有复制起点，标记基因或者类似的东西。本发明的方法可以直接用于细胞裂解液。在这个实施方案中，通过转化然后培养细胞来扩增得到的质粒，可以在细胞裂解后直接纯化。本发明的方法也可用于澄清的裂解液，亦即细胞裂解液中和，离心后得到的上清。显然它也可应用于以已知方法预纯化过的溶液。此方法也可从含有不同序列DNA的混合物中纯化带有重要序列的线性或环状DNA。根据本发明的方法也可用于纯化双链DNA。
细胞裂解液可以是原核细胞或者是真核细胞的裂解液。
对于原核细胞，可提到细菌大肠杆菌，枯草杆菌，鼠伤寒沙门氏菌或链霉菌属作为实例。对于真核细胞，可提到动物细胞，酵母，真菌等等，尤其是克鲁维氏酵母属或糖酵母属酵母或者COS，CHO，C127，NIH3T3等细胞。
本发明的方法特别有利，因为它能够快速简单地获得高纯度的质粒DNA。特别是，如实施例所示，此方法有效地将讨论的质粒跟如染色体DNA片段，内毒素，蛋白质，核酸酶等污染组分分离，更特别的是，本发明中的方法可以制备双链DNA，尤其是质粒起源的，得到少于或等于0.5％的染色体DNA含量。更优选，获得的DNA制备物的染色体DNA含量少于或等于0.2％。本发明因此描述含可药用的质粒DNA的组合物，尤其用于基因或细胞治疗。这样，本发明的主题也是含有根据上述方法制备的线性或质粒起源的双链DNA的药用组合物。
本发明也涉及染色体DNA含量少于或等于0.5％的质粒DNA制备物，所述含量优选少于或等于0.2％，更优选少于或等于0.1％，且更优选少于或等于0.01％。正如以下示例，三体亲和相互作用步骤与常规层析步骤的下游纯化过程相整合。此亲和步骤极大提高了质粒制备物的纯度，无论其起始纯度如何。寡核苷酸(共价结合于层析支持物)与要纯化的目标质粒之间三体结构的形成依赖于质粒上存在可以和寡核苷酸形成三体结构的序列。这个三体结构只有在酸性pH值下稳定，这时寡核苷酸的胞嘧啶是质子化的。然后，简单的将pH值提高到中性就能将质粒DNA从柱上洗脱。
这些组合物包含的质粒DNA可以是“裸露的”，也可以是与如脂质体，微颗粒，阳离子脂，多聚物，重组病毒或蛋白质等转运载体组合的。
在一个实施方案里，根据本发明的方法可以用来从含有2或更多的不同类和序列的双链DNA的混合物中纯化出一种双链DNA。这种方法可以直接用于细胞裂解液，其中通过细胞培养而扩增的双链DNA可以在裂解培养的细胞之后被纯化。本方法也可用于澄清的裂解液，亦即细胞裂解液中和，离心后得到的上清。这个方法也可应用于已经预纯化的溶液。
更确切的，从含有第一和第二双链DNA的溶液中纯化第一双链DNA的方法包含：i)使溶液流经第一支持物，此支持物共价偶联有能够通过跟第二双链DNA中的特定序列杂交从而与之形成三股螺旋的寡核苷酸，ii)回收流经第一支持物的溶液，它富集有未结合的第一双链DNA，和iii)将回收的溶液流经第二支持物，此支持物共价偶联有能够通过跟上述第一双链DNA中的特定序列杂交从而与之形成三股螺旋的寡核苷酸。接着是可选的淋洗步骤，然后可以从第二支持物上洗脱第一双链DNA。使用这个双纯化方法，第一双链DNA可以从第二支持物中回收而不含任何可检测水平的第二双链DNA。
在本发明特定的实施方案里，第一双链DNA分子是pCOR分子，它有特定序列：5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’(SEQ ID NO：29)，并与含有序列5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ IN NO：30)的寡核苷酸形成三股螺旋。第二双链DNA分子是ColE1衍生质粒，含有特异序列：5’-AGAAAAAAAGGA-3’(SEQ ID NO：27)，并与含有序列5’-TCTTTTTTTCCT-3’(SEQ IN NO：28)的寡核苷酸形成三股螺旋。相应的，通过使用根据本发明的双纯化方法，有利地从含有其它质粒比如ColE1衍生质粒的溶液中纯化pCOR质粒。
将通过下面的实施例更加详细的描述本申请，这些实施例用于说明而非限制
发明详述克隆和分子生物学的一般方法
传统的分子生物学方法，比如限制性内切酶消化，凝胶电泳，转化大肠杆菌，核酸沉淀等等，文献中已有叙述(Maniatis等，T.，E.F.Fritsch，和J.Sambrook，1989.Molecular Cloning：alaboratory mannual，第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，纽约；Ausubel F.M，R.Brent，R.E.Kinston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G.Seidman和K.Struhl.1987.Current protocols in molecularbiology 1987-1988.John Willey and Sons，纽约)。用末端终止法根据已发表的流程(Ausubel等，1987)确定核酸序列。
限制性内切酶由New England Biolabs，Beverly，MA(biolabs)提供。
为了进行连接，在含50mM Tris-HCl pH7.4，10mM MgCl2，10mM DTT，2mM ATP的缓冲液中，有噬菌体T4 DNA连接酶(Biolabs)存在时孵育DNA片段。
寡核苷酸的合成使用Biosearch自动DNA合成仪，根据生产商的建议，采用亚磷酰胺化学，其中由氰乙基在β位保护亚磷酰胺(Sinha，N.D.，J.Biernat，J.McManus和H.Koster，1984.Polymersupport oligonucleotide synthesis，XVIII；Use of β-cyanoethyl-N，N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite ofdeoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifyingdeprotection and isolation of the final product.Nucl.AcidsRes.，12，4539-4557：Giles，J.W.1985.Advances in automated DNAsynthesis.Am.Biotechnol.，Nov./Dec)。
连接好的DNA或用于测试转化效率的DNA转化下面的感受态细胞株：大肠杆菌DH5α(
E.coli DH5α)[F/
endA1，hsdR17，
supE44，
thi-1，recA1，
gyrA96，
relA1，Δ(
lacZYA-arqF)U169，
deoR，80dlac(
lacZΔM15)](用于任何ColE1质粒)，或者大肠杆菌XAC-pir(用于任何pCOR衍生质粒)。
根据Klein等1980的方法小量制备质粒DNA.
大肠杆菌的生长使用LB培养基(Maniatis，等，1982)。细菌在37℃下培养。细菌涂布于补充有合适抗生素的LB培养基的平板。
实施例1
1.1柱子制备
设备
柱子使用1ml经NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，Pharmacia)活化的HiTrap柱，与蠕动泵(流速小于1ml/mim)相连。使用的特异性寡核苷酸5’末端有NH2基团，其序列如下：
5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQID NO：1)此实施例中的缓冲液是：
偶联缓冲液：0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.3.
缓冲液A：0.5M 乙醇胺，0.5M NaCl，pH8.3.
缓冲液B：0.1M 醋酸，0.5M NaCl，pH4.方法6毫升1mM HCl洗柱，用偶联缓冲液稀释后的寡核苷酸(1ml中含50nmol)上柱，室温下放置30分钟。然后用6ml缓冲液A和缓冲液B连续洗柱3次。这样寡核苷酸就通过CONH键与柱子共价结合。柱子存于4℃在PBS，0.1％NaN3中，可以最少使用4次。1.2质粒构建合成下面两段寡核苷酸。寡核苷酸4817：5’-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3’(SEQ ID NO：9)寡核苷酸4818：5’-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3’(SEQ ID NO：10)
这些寡核苷酸，当被杂交并克隆于一个质粒时，如前所述，将单一嘌呤-单一嘧啶序列(GAA)17(SEQ ID NO：33)导入相应的质粒。
将这两个杂交的寡核苷酸的对应序列克隆到质粒pBKS+的多克隆位点(Stratagene Cloning System，La Jolla，CA)，此质粒带有氨苄青霉素抗性基因。最后，这些寡核苷酸通过以下方式杂交：1μg两种寡核苷酸共同置于40ml含50mM Tis-HCl pH7.4，10mM MgCl2的终缓冲液中。混合物加热到95℃，然后置于室温让温度逐渐下降。200ng经BamHI和EcoRI消化的pBKS+质粒(Stratagene Cloning System，LaJolla，CA)与10ng杂交后的寡核苷酸混合物在终体积30μl中连接。连接之后，部分用于转化DH5α。转化混合物涂平板于有氨苄青霉素(50mg/l)和X-gal(20mg/l)的L培养基。重组克隆在此培养基上应该表现没有蓝色，相反，原质粒(pBKS+)允许大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的ω片段的α-互补。从6个克隆中小量制备质粒DNA，它们都表现出位于pBKS+的BamHI和EcoRI之间的PstI位点的消失，以及含多克隆位点的448bpPvuII条带分子量增加。选出一个克隆并将相应质粒命名为pXL2563。使用质粒pBKS+(Stratagene Cloning System，La Jolla(A)的引物-20(5’-TGACCGGCAGCAAAATG-3’(SEQ ID NO：11))(VieraJ.和J.Messing.1982.The pUC plasmids，an M13mp7-derived systemfor insertion mutagenesis and sequencing with syntheticuniversal primers.Gene，19，259-268)测序鉴定克隆的序列。根据供应商的推荐，使用Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.Madison，WI)纯化pXL2563质粒。然后此质粒DNA制备物用于下述例子。
1.3质粒纯化
仪器
如1.1中所述，从还含有pBKS+质粒的溶液中，在偶联寡核苷酸的HiTrap柱子上纯化pXL2563质粒(1.2中所述)。这步纯化中使用的缓冲液是：
缓冲液F：2M Nacl，0.2M醋酸盐，pH4.5至5。
缓冲液E：1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA。方法：
用6毫升缓冲液F洗柱，并将质粒(400μl缓冲液F中含20μgpXL2563和20μg pBKS+)上柱，室温下放置2小时。用10ml缓冲液F淋洗，然后用缓冲液E洗脱。在1％的琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色来检测质粒。溶液中质粒含量比例通过测量其对大肠杆菌的转化活性来估计。
结果：
从含有30％的pXL2563和70％的pBKS+的混合物开始，从柱子出口回收了含100％的pXL2563，由260nm与280nm的OD值比估计的纯度，从1.9上升至2.5，这表明此方法已去除了蛋白污染。
实施例2
2.1此实施例叙述质粒DNA纯化实验。如例1中所述，偶联寡核苷酸(5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’)(SEQ ID NO：1)于柱子。为了偶联，寡核苷酸在5’端修饰有胺基，后者通过含6碳原子的手臂(Modified oligonucleotide EurofentecSA，Belgium)连接于间隔区的磷酸上。根据供应商的推荐，使用Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.Madison，WI)纯化pXL2563质粒。使用的缓冲液是：
缓冲液F：0-2M NaCl，0.2M醋酸盐，pH4.5至5。
缓冲液E：1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA.
用6毫升1mM缓冲液F洗柱，稀释于400μl缓冲液F中的100ug的pXL2563质粒上柱，室温下放置2小时。柱子用10ml缓冲液F淋洗，然后用缓冲液E洗脱。通过测定260nm处的光密度来定量质粒。
在此实施例中，结合用的缓冲液里NaCl的摩尔浓度从0到2M(缓冲液F)变化。当NaCl的摩尔浓度下降时，纯化产率下降。结合缓冲液的pH值可以从4.5到5变化，在4.5时纯化产率较好。也可以用碱性pH下的其它洗脱缓冲液：这样用含50mM硼酸盐，pH9，0.5mM EDTA的缓冲液洗脱.2.2如例1中所叙述，将寡核苷酸(5’
-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO：1))偶联于柱上。根据供应商的推荐，使用Wizard Megaprep试剂盒(PromegaCorp.Madison，WI)纯化pXL2563质粒。本实施例使用的缓冲液是：
缓冲液F：0.1M NaCl，0.2M醋酸，pH5。
缓冲液E：1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA.
6毫升1mM缓冲液F洗柱，且将稀释于400μl缓冲液F中的100μg pXL2563质粒上柱，室温下放置1小时。柱子用10ml缓冲液F淋洗，然后用缓冲液E洗脱。测量流经寡核苷酸柱之前和之后质粒样品中的大肠杆菌基因组或染色体DNA的含量。基因组DNA用PCR的方法定量，使用大肠杆菌galK基因中的引物。根据如下方法：Debouck等对这些引物作过描述(Nucleic Acids Res.1985，13，1841-1853)：5’-CCG AAT TCTGGG GAC CAA AGC AGT TTC-3’(SEQ ID NO：24)和5’-CCA AGC TTC ACTGTT CAC GAC GGG TGT-3’(SEQ ID NO：25).
反应介质包括，在25μlPCR缓冲液(Promega France，Charbonnieres)中：1.5mM MgCl2；0.2mM dXTP(Pharmacia，Orsay)；0.5μM引物；20U/ml Taq酶(Promega)。反应按以下顺序进行：
-95℃ 5分钟
-95℃ 10秒
60℃ 30秒
78℃ 1分钟 30循环
-78℃ 10分钟
扩增的长度为124碱基对的DNA片段通过在有SybrGreenI(Molecular Probes，Eugene，USA)的3％的琼脂糖上电泳而分离，然后以大肠杆菌菌株B的超纯基因组DNA系列(Sigma，ref D4889)对比而定量。
上柱的样品中有1％的染色体DNA，从寡核苷酸柱上纯化后的样品含0.2％的染色体DNA。
实施例3.清裂解液的实验
本实验描述了从细菌培养物的清裂解液中纯化质粒DNA，规模是所谓的“小量制备”：离心含有pXL2563质粒的过夜培养的1.5ml DH5α菌株，重悬沉淀于100μl的50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，pH8，10mMEDTA中。然后加上200μl的0.2M NaOH，1％SDS，颠倒管子以混合，接着加150μl的3M乙酸钾，pH5，再颠倒管子以混合。离心之后，回收上清，上样于实施例1所述的寡核苷酸柱。结合，淋洗，洗脱与实施例1所述一样。从1.5ml培养物里可以大约回收1μg质粒。得到并通过琼脂糖电泳和溴乙锭染色分析的质粒的形式是单一条带的超螺旋环状DNA。在此方法纯化的质粒中没有发现高分子量DNA(染色体的)或RNA的痕迹。260nm与280nm的光密度比大于2。
实施例4
4.1：本实施例叙述的质粒DNA纯化实验，进行的条件跟实施例3一样，但起点是20ml含有pXL2563质粒的过夜培养的DH5α菌株。细菌沉淀重悬于1.5ml的50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，pH8，10mM EDTA.裂解用2ml的0.2M NaOH，1％SDS，而中和用1.5ml的3M乙酸钾，pH5。然后用3ml的2-异丙醇沉淀DNA，沉淀用0.5ml的0.2M乙酸钾，pH5，0.1M NaCl悬浮，并上样于例1所述得到的寡核苷酸柱。结合，淋洗，及洗脱与例1所述一样，只是淋洗缓冲液中NaCl的摩尔浓度为0.1M.大约得到16μg的质粒DNA。得到并通过琼脂糖电泳和溴乙锭染色分析的质粒的形式是单一条带的超螺旋环状DNA。在此方法纯化的质粒中没有发现高分子量DNA(染色体的)或RNA的痕迹。用限制性酶消化质粒得到单一条带，位于预期的3kb的分子量处。样品中的蛋白质浓度从澄清裂解液中的125μg/ml下降到纯化后质粒中的少于1μg/ml(Micro-BCAassay，Pierce)。由LAL方法(Biosepra)估侧的内毒素浓度，与起始清裂解液相比，纯化后质粒中少了至少10倍。
4.2：使用的质粒含有含巨细胞病毒启动子，编码萤光素酶的基因，以及来自质粒pXL2563的单一嘌呤-单一嘧啶序列(GAA)17(SEQ IDNO：33)的盒。含有此质粒的DH1菌株(Maniatis等，1989)在7L的发酵罐中培养，从200g细菌中制备清裂解液：细菌沉淀重悬于2L的50mMglucose，25mMTris，pH6.8，10mM EDTA，然后加2L的0.2M NaOH，1％SDS。用加1L的3M乙酸钾中和裂解液。渗滤之后，根据实施例1.1所述，4ml这样的裂解液上样于5ml偶联以下寡核苷酸序列的HiTrap-NHS柱：5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO：1)。淋洗和洗脱也如实施例1所述进行。回收大约400微克质粒。按照实施例2.2中的技术测出的样品中基因组DNA的含量是0.1％。
实施例5：使用修饰过的寡核苷酸
本实施例描述了使用有甲基化胞嘧啶的寡核苷酸。使用的寡核苷酸的序列如下：5’-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTT-3’(SEQ IDNO：12).
此寡核苷酸在5’端有NH2基团。MeC代表5-甲基胞嘧啶。在实施例1的条件下，使用pH5的结合缓冲液(这样降低质粒降解的风险)，该寡核苷酸使pXL2563质粒被纯化。
实施例6
在以上的实施例里，使用的寡核苷酸在5’端由胺基修饰，后者通过含6个碳原子的手臂NH2-(CH2)6结合磷酸。在此实施例中，氨基通过含12碳原子的手臂NH2-(CH2)12与5’端的磷酸结合。寡核苷酸偶联和过柱按照实施例2所述进行，使用缓冲液F：2M NaCl，0.2M醋酸，pH4.5。此寡核苷酸使得可以得到较好的纯化产率：达到53％，而使用含6个碳原子的寡核苷酸，在相同的条件下产率是约45％。
实施例7
按照实施例1.2中叙述的克隆策略，构建了另外两个带有单一嘌呤-单一嘧啶序列的质粒：含有序列(GGA)16(SEQ ID NO：34)的质粒pXL2725和含有序列(GA)25(SEQ ID NO：35)的质粒pXL2726。
实施例7.1：质粒构建
质粒pXL2725和质粒pXL2726跟质粒pXL2563类似，按照实施例1.2所叙述的克隆策略构建，使用了以下寡核苷酸对：
5986：5’GATCC(GA)25GGG-3’(SEQIDNO：13)
5987：5’-AATTCCC(TC)25G-3’(SEQIDNO：14)
5981：5’-GATCC(GGA)17GG-3’(SEQIDNO：15)
5982：5’-AATT(CCT)17CCG-3’(SEQIDNO：16)
使用寡核苷酸对5986和5987构建质粒pXL2726，方法是将寡核苷酸克隆至pBKS+(Stratagene Cloning System，La Jolla CA)的BamHI和EcoRI位点之间，使用寡核苷酸对5981和5982构建质粒pXL2725。使用构建质粒pXL2563相同的实验条件，只是寡核苷酸对改变。相似地，克隆的序列通过质粒测序来鉴定。可以看出质粒pXL2725有跟预期序列相关的修饰：不是GGA重复17次，而是GGAGA(GGA)15(SEQ ID NO：17).
实施例7.2：制备柱子和纯化
根据实施例1.1中叙述的技术，与这些单一嘌呤序列形成三股螺旋的寡核苷酸偶联于HiTrap柱。纯化质粒pXL2725使用的寡核苷酸的序列是5’-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3’(SEQ ID NO：18)，而纯化质粒pXL2726使用的寡核苷酸的序列是5’-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3’(SEQ ID NO：19).
根据实施例2中的技术，这样得到的两柱可以纯化相应的质粒，使用以下的缓冲液：
缓冲液F：2M NaCl，0.2M醋酸，pH4.5。
缓冲液E：1M Tris-HCl，pH9，0.5mM EDTA.
纯化质粒pXL2725和质粒pXL2726的产率分别是23％和31％。
实施例8
此例说明了质粒中特定序列的长度对纯化产率的影响。
实施例8.1：质粒构建
本实验中使用的用于表明本发明组合物活性的报告基因是编码萤光素酶的基因(Luc).
质粒pXL2621有含661碱基对的巨细胞病毒(CMV)启动子的盒，该盒通过用限制性酶MluI和HindIII酶切从pcDNA3(InvitrogenCorp.，San Diego，CA)中取出，然后克隆至载体pGL basic Vector的编码萤光素酶的基因的上游的Ml1uI和HindIII位点。此质粒的构建使用标准的分子生物学技术。
质粒pXL2727-1和质粒pXL2727-2按照以下方法构建：
2微克质粒pXL2721质粒用BamHI线性化；然后在65℃中处理10分钟失活酶；同时按照质粒pXL2563构建的方法杂交寡核苷酸6006和6008。
6006：5’-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3’(SEQIDNO：20)
6008：5’-GATCAGATCTGCAG(TTC)17A-3’(SEQIDNO：21)
杂交混合物克隆至质粒pXL2621的BamHI末端，然后，在转化DH5α后，使用PstI酶限制分析鉴定重组克隆，因为寡核苷酸引入PstI位点。挑选2个克隆，使用引物(6282，5’-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3’(SEQ ID NO：22)))作为测序反应引物(Viera J.和J.Messing.1982.The pUC plasmids，an M13mp7-derived system for insertionmutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.Gene，19，259-268)测序克隆片段的核苷酸序列。
第一克隆(pXL2727-1)含有GAA重复10次的序列，第二克隆(pXL2727-2)含有序列5’-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3’(SEQ IDNO：23).
实施例8.2：制备柱子和纯化
使用的柱子如实施例1中所叙述，并与寡核苷酸5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO：1)偶联。
质粒pXL2727-1有序列GAA的14次重复。上述寡核苷酸，只含有相应杂交序列CTT的7次重复，因此可以和该质粒在8个不同位置上杂交。相反，质粒pXL2727-2，有和结合于柱上的寡核苷酸相同长度的杂交序列(GAA)7(SEQID NO：36)。这样的寡核苷酸只能在一个位置上跟pXL2727-2杂交。
实验与实施例2中的叙述一样，使用以下缓冲液：缓冲液F：2M NaCl，0.2M醋酸，pH4.5。
缓冲液E：1M Tris-HCl，pH9，0.5mMEDTA.
质粒pXL2727-1的纯化产率是29％，而pXL2727-2是19％。
实施例8.3：体外转染哺乳动物细胞
使用的细胞是NIH 3T3细胞，实验前在24孔培养板上按照50000细胞/孔接种。质粒用150mM NaCl稀释，并与脂转染物RPR115335混合。使用的脂转染物正电荷与DNA负电荷的比等于6。混匀混合物，室温下放置10分钟，用不含胎牛血清的培养基稀释，然后加入到细胞中，比例是每个培养孔1μgDNA。37℃下2小时后，加入体积比为10％的胎牛血清，然后细胞在5％CO2下37℃培养48小时。细胞用PBS洗涤2次，根据所述方法(Promega试剂盒，Promega Corp.Madi son，WI)在LumatLB9501发光计上(EG and G Berthold，Evry)测量萤光素酶活性。按照实施例8.2纯化的质粒pXL2727-1给出的转染效率是使用WizardMegaprep试剂盒(Promega Corp.Madison，WI)纯化的那些质粒的2倍。
实施例9：纯化pCOR衍生质粒
下面的例子论证使用三股螺旋亲和层析纯化pCOR衍生质粒。表明此技术去除核酸污染(尤其是宿主基因组DNA和RNA)的水平是常规层析方法所达不到的。
使用Sephacryl S-1000 SF(Amersham-Pharmacia Biotech)作为层析基质合成三体亲和凝胶。首先使用溶于0.2M醋酸钠(pH4.7)的m-高碘酸钠(3mM，室温，1小时)活化Sephacryl S-1000。然后按照前述偶联蛋白质的方法(Hornsey等，J.Immunol.Methods，1986，93，83-88)，通过在抗坏血酸存在(5mM)时的还原性氨基化，将寡核苷酸通过其5’-NH2末端部分偶联到已活化的基质的醛基上。这些实验中的单一嘧啶寡核苷酸(来自Eurogentec，HPLC纯)有这样的序列：跟出现于pCOR质粒(Soubrier等，Gene Therapy，1999，6，1482-1488)的复制起点(oriγ)的短的14碱基单一嘌呤序列(5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’)(SEQ IDNO：29)互补。如上所讨论，单一嘧啶寡核苷酸的序列是5’-TTCTTTTTTTTCT-3’(SEQ ID NO：30)。
层析了以下质粒：pXL3296(无转基因的pCOR，2.0kbp)，pXL3179(pCOR-FGF，2.4kbp)，pXL3579(pCOR-VEGFB，2.5kbp)，pXL3678(pCOR-AFP，3.7kbp)，pXL3227(pCOR-lacZ，5.4kbp)和pXL3397(pCOR-Bdeleted FVIII，6.6kbp)。所有的质粒从实施例4中所述得到的清裂解液中经过二步阳离子交换层析而纯化。也研究了pBKS+(pBluescript II KS+来自Stratagene)质粒，它是一种ColE1衍生质粒，用氯化铯超离心纯化。所有使用的质粒都是在其超螺旋(＞95％)的拓扑状态。
在每个质粒DNA纯化实验中，溶于6毫升的2M NaCl，0.2M乙酸钾(pH5.0)中的300μg质粒DNA以30cm/h的流速上样于含有上面所提寡核苷酸5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO：30)的亲和柱。用5倍体积的相同缓冲液淋洗之后，用1M Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH9.0洗脱结合的质粒，并用UV(260nm)和Millipore Gen-Pak柱(Marquet等，BioPharm，1995，8，26-37)离子交换层析定量。收集的部分中质粒回收是207μg pXL3296；196μg pXL3179；192μg pXL3579；139μgpXL3678；97μg pXL3227和79μg pXL3397。
用此柱层析pBKS时，检测不到质粒结合(＜3μg)。这表明寡核苷酸5’-TTCTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO：30)与pCOR(oriγ)中出现的互补的14碱基序列5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’(SEQ ID NO：29)形成稳定的三体结构，但与pBKS中出现的很相关的序列5’-AGAAAAAAAGGA-3’(SEQ ID NO：27)却不然。这表明引入单一非规范的三联体(此例中是T*GC)导致三体结构的完全去稳定。
作为对照，当用在非常相近的条件但是没有寡核苷酸的空的柱子上层析pXL3179时，没有观察到质粒结合(＜1μg)。
在此报告的条件下操作这个亲和层析柱，对于制备pXL3296，宿主基因组DNA的污染水平从2.6％降低到0.07％。与此类似，对于制备pXL3179，当样品用相同的亲和柱层析时，宿主基因组DNA的污染水平从0.5％降低到0.008％。而且，当用此亲和纯化柱制备pXL3179时，RNA的污染水平从43％大大减少到0.2％。
除此之外，当亲和柱上寡核苷酸5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ IDNO：30)被寡核苷酸5’-TTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO：31)替换时，质粒pXL3579的回收率小于8％。尽管SEQ ID NO：31中的寡核苷酸与pXL3579中的VEGFB的部分序列互补(即相对于ATG的核苷酸379到389)，没有明显的三体亲和出现。这表明此亲和纯化需要非随机的单一嘌呤-单一嘧啶DNA序列。实施例10：纯化ColE1衍生质粒
下面的例子论证了使用三股螺旋亲和层析纯化ColE1衍生质粒。表明此技术去除核酸污染(尤其是宿主基因组DNA和RNA)的水平是常规层析方法所达不到的。
三体亲和凝胶的合成是偶联具有序列5’-TCTTTTTTTCTT-3’(SEQID NO：28)的寡核苷酸到高碘酸盐氧化的Sephacryl S-1000 SF上，如
实施例9所述。
质粒pXL3296(无转基因的pCOR)和质粒pBKS，ColE1衍生质粒，在实施例9所述的条件下，在1ml的含寡核苷酸5’-T CTTTTTTTCCT-3’(SEQ ID NO：28)的柱上层析。收集部分中质粒回收是pBKS 175μg和小于1ug的pXL3296。这表明寡核苷酸5’-TCTTTTTTTCCT-3’(SEQ IDNO：28)与pBKS中出现的互补的12碱基序列(5’-AGAAAAAAAGGA-3’)(SEQ ID NO：27)形成稳定的三体结构，但与pCOR中出现的很相关的12碱基序列(5’-AGAAAAAAAAGA-3’(SEQ ID NO：32)则不形成。这表明引入单一非规范的三联体(此例中是C*AT)导致三体结构的完全去稳定。
实施例11：双纯化方法
下面的实施例阐述，用三股螺旋亲和层析，从含另一种超螺旋双链分子如pBSK的混合物中，纯化超螺旋双链DNA分子，如pXL3296。两个超螺旋双链DNA双链分子可以有相似的大小，但是每个DNA分子含有能与不同的目的序列形成三股螺旋的独特序列。正如以上所讨论，pXL3296之类的分子含有序列5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’(SEQ ID NO：29)，但是不含序列5’-AGAAAAAAAGGA-3’(SEQ ID NO：27)。相反的，pBSK之类的分子含有SEQ ID NO：27，但是不含SEQ ID NO：29。
在第一步里，含pXL3296和pBKS的混合物上样于有寡核苷酸5’-TCTTTTTTTCCTT-3’(SEQ ID NO：28)的第一亲和柱，如实施例10中所述柱子。含有未结合的DNA分子的溶液流经第一柱。在第二步里，第一步中未结合的DNA分子上样于有寡核苷酸5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQID NO：30)的第二亲和柱，如实施例9中所叙述柱子。然后淋洗此柱并洗脱下结合的分子，如实施例9中所叙述。只有pXL3296分子从第二柱中洗脱。在第二柱的洗脱液中(即，从柱上洗脱的溶液)没有检测到pBKS分子。
序列表
<110>AVENTIS PHARMA S.A.
CROUZET，Joel
SCHERMAN，Daniel
WILS，Pierre
CAMERON，Beatrice
BLANCHE，Francis
<120>用固定化的寡核苷酸纯化三股螺旋体结构
<130>3804.1381304
<140>
<141>
<150>09/580，923
<151>2000-05-26
<160>36
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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<223>序列中所有的胞嘧啶都是甲基化的
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<213>人工序列
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<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>34
ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga 48
<210>35
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>35
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 50
<210>36
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>36
gaagaagaag aagaagaaga a 21
Claims (25)
1.从含混有其它组分的双链DNA的溶液中纯化双链DNA的方法，包括使溶液流经含有共价偶联的寡核苷酸的支持物，该寡核苷酸能通过与双链DNA中特定的序列杂交而与双链DNA形成三股螺旋，其中共价偶联的寡核苷酸含有序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO：28)或TTCTTTTTTTTCTT(SEQ ID NO：30)。
2.从含混有其它组分的双链DNA的溶液中纯化双链DNA的方法，包括使溶液流经含有共价偶联的寡核苷酸的支持物，该寡核苷酸能通过与双链DNA中特定的序列杂交而与双链DNA形成三股螺旋，其中双链DNA中特定的序列含有序列AGAAAAAAAGGA(SEQ ID NO：27)或AAGAAAAAAAAGAA(SEQ ID NO：29)。
3.从含有第一双链DNA和第二双链DNA的溶液中纯化第一双链DNA的方法，包括(i)使溶液流经第一支持物，此支持物含有共价偶联的寡核苷酸，它能通过与上述的第二双链DNA中的特定序列杂交而与之形成三股螺旋，(ii)回收流经第一支持物的溶液，(iii)使回收的溶液流经第二支持物，此支持物含有共价偶联的寡核苷酸，它能通过与上述的第一双链DNA中的特定序列杂交而与之形成三股螺旋，其中上述第一双链DNA中的特定序列包含序列AAGAAAAAAAAGAA(SEQ IDNO：29)，而上述第二双链DNA中的特定序列包含序列AGAAAAAAAGGA(SEQ ID NO：27)。
4.从含有第一双链DNA和第二双链DNA的溶液中纯化第一双链DNA的方法，包括(i)使溶液流经第一支持物，此支持物含有共价偶联的寡核苷酸，它能通过与上述的第二双链DNA中的特定序列杂交而与之形成三股螺旋，(ii)回收流经第一支持物的溶液，(iii)使回收的溶液流经第二支持物，此支持物含有共价偶联的寡核苷酸，它能通过与上述的第一双链DNA中的特定序列杂交而与之形成三股螺旋，其中能与上述第一双链DNA形成三股螺旋的寡核苷酸包含序列TTCTTTTTTTTCTT(SEQ ID NO：30)，而能与上述第二双链DNA形成三股螺旋的寡核苷酸包含序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO：28)。
5.根据权利要求1，2，3或4的方法，其中溶液是细胞裂解液。
6.根据权利要求5的方法，其中细胞裂解液是澄清的裂解液。
7.根据权利要求1，2，3或4的方法，其中双链DNA是预先纯化的。
8.根据权利要求1，2，3或4的方法，其中特定序列是人工引入双链DNA的。
9.根据权利要求1，2，3或4的方法，其中特定序列天然存在于双链DNA中。
10.根据权利要求1，2，3或4的方法，其中寡核苷酸通过二硫键，硫醚键，酯键，酰胺键或胺键偶联于支持物。
11.根据权利要求10的方法，其中寡核苷酸通过含碳链(CH2)n的手臂结合到柱上，其中n是1到18的整数，包括1和18，并且其中手臂通过磷酸酯连接到寡核苷酸，而通过酰胺键连接到柱上。
12.根据权利要求1，2，3或4的方法，其中寡核苷酸至少有一个化学修饰，使得它能够抵抗或抵御核酸酶，或者增加它对特定序列的亲和力。
13.根据权利要求12的方法，其中寡核苷酸至少有一个胞嘧啶被甲基化。
14.根据权利要求1，2，3或4的方法，其中双链DNA是环状DNA。
15.根据权利要求14的方法，其中环状DNA是质粒。
16.根据权利要求1，2，3或4的方法，其中双链DNA中存在的特定序列含有几个和寡核苷酸杂交的位点。
17.根据权利要求1，2，3或4的方法，其中支持物是官能化的层析支持物，官能化的塑料表面或官能化的胶乳珠。
18.根据权利要求17的方法，其中支持物是官能化的层析支持物。
19.根据权利要求18的方法，其中纯化的双链DNA里的染色体DNA含量少于或等于0.5％。
20.根据权利要求19的方法，其中纯化的双链DNA里的染色体DNA含量少于或等于0.01％。
21.从含混有其它组分的双链RNA的溶液中纯化双链RNA的方法，包括将溶液流经含有共价偶联的寡核苷酸的支持物，该寡核苷酸能通过与双链RNA中的特定序列杂交而与双链RNA形成三股螺旋，其中寡核苷酸含有序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO：28)或TTCTTTTTTTTCTT(SEQ IDNO：30)。
22.根据权利要求1或3的方法，其中共价偶联的寡核苷酸含有序列TCTTTTTTTCCT(SEQ ID NO：28)。
23.根据权利要求1或3的方法，其中共价偶联的寡核苷酸含有序列TTCTTTTTTTTCTT(SEQ ID NO：30)。
24.根据权利要求2或4的方法，其中双链DNA中存在的特定序列含有序列AGAAAAAAAGGA(SEQ ID NO：27)。
25.根据权利要求2或4的方法，其中双链DNA中存在的特定序列含有序列AAGAAAAAAAAGAA(SEQ ID NO：29)。
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