CN1026015C - 编码脱乙酸基头孢菌素c合成酶和脱乙酰头孢菌素c合成酶的重组dna表达载体及dna化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码脱乙酸基头孢菌素C合成酶(DAOCS)和脱乙酰头孢菌素C合成酶(DACS)活性的DNA化合物和表达载体。该化合物可用来构建用于多种宿主细胞包括大肠杆菌、青霉和头孢霉的重组DNA表达载体。本发明也涉及顶头孢霉DACS/DAOCS基因的调控成分。还提供了选择青霉转化体的方法，包括那些因DACS/DAOCS编码DNA的存在而能够合成头孢菌素抗生素的转化体。本转化系统利用乙酰胺酶基因来选择转化体。

Description

本发明涉及编码脱乙酸基头孢菌素C合成酶和脱乙酰头孢菌素C合成酶活性的DNA顺序。脱乙酸基头孢菌素C合成酶（DAOCS）催化由青霉素N形成脱乙酸基头孢菌素C（DAOC）的反应，它通常被称为扩展酶（expandase）。脱乙酰头孢菌素C合成酶（DACS）催化由DAOC形成脱乙酰头孢菌素C（DAC），这是一个羟基化反应。这些反应是重要抗生素生物合成中的关键步骤，这些抗生素如来自顶头孢霉（Cephalosporium    acremonium）的头孢菌素和来自Streptomyces    clavuligerus的7α-甲氧基头孢菌素。
本发明方法中所用的DNA化合物在单一的开放读码中编码DAOCS和DACS。转录此开放读码，然后翻译所产生的mRNA，可产生具有DAOCS和DACS两种活性的单个多肽链。由于本发明化合物的这种双重性，术语“DAOCS/DACS”、“DACS/DAOCS”、“扩展酶/羟化酶”和“EXP/HYD”用来标明具有DACS和DAOCS两种属性的特定基因、编码顺序或酶。这些活性的连锁并未普遍观察到;例如，产生头霉素的链霉菌用两种不同的多肽表达DAOCS和DACS活性。虽然，同时表达DAOCS和DACS活性是方便的，并通常是最佳的，但它并不是本发明关键性的部分。正如本文所举例说明的，基因工程技术提供了现成的分离编码DAOCS和DACS的遗传信息而分别表达DAOCS或DACS活性的方法。因此，本发明方法中所用的说明性化合物、载体和酶活性的双重性并非一种限制，因为本发明还包 括单一特性的分子，即那些只表现DACS或DAOCS特性的分子，以及利用这些单一特性化合物的方法。
编码DACS/DAOCS活性的DNA化合物从顶头孢霉基因组DNA中分离得到，并用来构建重组DNA表达载体。其中有三种类型的表达载体特别适用于本发明的方法：第一种在大肠杆菌（E.Coli）中，第二种在顶头孢霉中，第三种在产黄青霉（Penicillium    chrysogenum中驱动DAOCS/DACS活性的高水平表达。
大肠杆菌产生的DAOCS/DACS活性催化由青霉素N形成DAOC，以及由DAOC形成DAC。本发明的这些大肠杆菌转化体的细胞粗提物表现出DAOCS/DACS活性，并且无需任何预先活化处理。这种大肠杆菌表达方法及相关的载体和转化体，为大量获取活性DAOCS/DACS酶提供了有效手段。DAOCS/DACS酶不仅可用于生产DAOC和DAC，还能用于扩展青霉素N以外的青霉素，以及使DAOC以外的头孢菌素羟基化以形成新的抗生素。
本发明的头孢霉表达方法及相关的载体，可用来构建用于制药工业的菌株。头孢霉是一种有重要经济意义的生物，用来生产青霉素和头孢菌素等抗生素。用本发明的表达载体转化头孢霉，可在转化体中产生较高水平的胞内DAOCS和DACS。这些转化体可用于工业发酵中，以提高其抗生素生产的效率和产率。
本发明的青霉素表达方法及相关载体，最适用于在高水平生产青霉素的青霉菌株中导入头孢菌素合成活性。DAOCS活性在单独或与其他活性（如DACS或差向异构酶）结合的情况下，都能用于将各种青霉素转化成头孢菌素。例如在青霉中，异青霉素N差向异构酶活性（例如来自顶头孢霉）和DAOCS活性的同时表达导致DAOC的产生， 这是一种在青霉中前所未知的代谢产物。
本发明还提供了一种将重组DNA分子导入青霉菌中的改进方法。这种新的转化系统采用构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的amdS基因。用乙酰胺（CH3CONH2）作为转化平皿上的唯一碳源或氮源，能够从未转化的细胞中选择出用含有amdS基因的载体转化的青霉宿主细胞，这是因为野生型的青霉宿主细胞不表达乙酰胺酶活性，因此它们不能在此平皿上生长。
编码DAOCS/DACS的DNA化合物很容易进行修饰以构建可提高其他生物如拟青霉菌（Paecilomyces）和链霉菌（Streptomyces），尤其是S.clavuligerus的发酵效率和产率的表达载体，因此可用于在这种宿主细胞中表达DAOCS/DACS的方法中。虽然本发明的编码DACS/DAOCS的DNA是从顶头孢霉中分离的，但此DNA可用于构建在多种宿主细胞中驱动DACS/DAOCS表达的载体，正如上面用大肠杆菌表达载体所说明的那样。用于构建本发明大肠杆菌、头孢霉和青霉的载体的方法，也可用于构建其他生物的类似载体，只需（如果有必要）置换合适的调控因子。产生青霉素和头孢菌素的大多数生物利用青霉素N作为共同的前体，它是DAOCS的底物。本发明的编码DACS/DAOCS的DNA化合物可用于构建这样的表达载体，它们可用于多种产生青霉素和头孢菌素抗生素的生物中，而改善它们的发酵效率和产率。
本发明的DNA化合物来自顶头孢霉的基因组DNA，其核苷酸顺序与其他产生头孢菌素生物（例如Streptomyces    clavuligerus）中的编码DAOCS和/或DACS活性的DNA化合物有显著的同源性。由于此同源性，本发明的编码DACS/DAOCS 的DNA化合物可进行标记，并用于在产生头孢菌素C或类似化合物的生物的基因组文库中筛选编码DACS或DAOCS的DNA。许多生物所包含的编码DACS/DAOCS活性的DNA都可用本发明的DNA化合物进行鉴定和分离，因此本发明包括这些等同物、同源DNA化合物以及分离这类化合物的方法。
本发明的编码DACS/DAOCS的DNA化合物是与调控顺序一同分离的，这些顺序控制顶头孢霉DAOCS/DACS活性的转录和最终的表达。本发明包括这些新的调控顺序，正如本文所公开的，这些顺序可用于驱动头孢霉中任何基因产物的转录、翻译和表达的新方法中。这些调控顺序尤其适用于顶头孢霉。
本发明还包括DACS/DAOCS基因的调控信号，它位于顶头孢霉DACS/DAOCS基因编码区的编码链的3′端。这些3′调控顺序编码DACS/DAOCS基因的转录终止以及mRNA的多聚腺苷酸化和加工信号。将这些信号置于待表达基因编码区的编码链的3′端，能促进头孢霉中所需基因产物的表达。
为了表达清楚和有助于理解此处公开的本发明及其权利要求，现将下述术语定义如下：
amdS：乙酰胺酶基因;也用于附图中指构巢曲霉的乙酰胺酶基因。
AmR：产生阿泊拉霉素抗性的基因;也用来指阿泊拉霉素抗性表型。
抗生素：一种由微生物产生的物质，其天然形式或经过有限修饰的形式能够抑制其他微生物或真核细胞的生长，或杀死它们。
抗生素生物合成基因：编码某种酶促反应的必需活性的DNA片 段，此反应是初级代谢产物转化成抗生素，或一种抗生素化合物转化成另一种抗生素化合物过程中的一个反应。
产生抗生素的生物：任何产生抗生素，或含有表达后能产生抗生素的基因的生物，包括（但不限于）链霉菌属、杆菌属（Bacillus）、单孢菌属（Monospora）、头孢霉属、拟青霉菌属、柄孢壳菌属（Podospora）、青霉属和诺卡氏菌属（Nocardia）。
产生抗生素抗性的基因：编码能产生抗生素抗性的活性的DNA片段。
ApR：产生氨苄青霉素抗性的基因;也用来指氨苄青霉素抗性表型。注意ApS指氨苄青霉素敏感性表型。
双功能克隆穿梭载体：一种能在两种不同的生物类群中复制和/或整合的重组DNA克隆载体。
bp：双链DNA的碱基对。
CAT：产生氯霉素抗性的基因，它编码一种乙酰基转移酶。
c1857：编码λpL启动子的温度敏感型阻遏物的基因。
cIPS：顶头孢霉的异青霉素N合成酶或编码异青霉素N合成酶的DNA。
克隆：将一个DNA片段掺入重组DNA克隆载体中的过程。
编码顺序：基因中的DNA顺序，它或者编码由该基因表达的蛋白的氨基酸残基顺序，或者在rRNA或tRNA基因的情况下，编码由该基因表达的rRNA或tRNA的RNA顺序。
编码链：即“有意义”链，双链编码顺序中的单链，它与“反意义链”互补，是由RNA聚合酶转录的链。
cos：λ噬菌体粘性末端顺序。
柯斯质粒：一种重组DNA克隆载体，它能以与质粒相同的方式在宿主细胞中复制，但同时还能被包入噬菌体头部。
DAC：脱乙酰头孢菌素C。
Figure 881016446_IMG1
DACS：脱乙酰头孢菌素C合成酶，即催化DAOC转化成DAC的酶活性。
DAOC：脱乙酸基头孢菌素C。
Figure 881016446_IMG2
DAOCS：脱乙酸基头孢菌素C合成酶，由DAOCS基因编码的酶活性，催化青霉素N转变为DAOC。
EkbGH：连有肠激酶的牛生长激素或其编码DNA。
EXP/HYD：扩展酶/羟化酶的缩写，用于附图中指编码DAOCS/DACS的DNA的位置。
基因：一个DNA片段，它包括启动子、翻译活化顺序、编码顺 序、驱动基因产物表达的3′调控顺序，该表达产物是蛋白质（因此还必有mRNA）、tRNA或rRNA。
基因组文库：一套重组DNA克隆载体，其中克隆有基本上代表特定生物完整基因组的DNA片段。
hGH：人生长激素或其编码DNA。
HmR：产生潮霉素抗性的基因;也用来指潮霉素抗性表型。
杂交：使两个同源的单链DNA分子退火，形成可能是完全或不完全碱基配对的双链DNA分子的过程。
IPS：异青霉素N合成酶。
IPSp或cIPSp：顶头孢霉异青霉素N合成酶（IPS）基因的启动子和其他5′调控顺序。
IPSt或cIPSt：顶头孢霉IPS基因的转录终止、mRNA多聚腺苷酸化和其他3′调控和加工信号。
异青霉素N合成酶：一种酶，也称为环化酶，催化由δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸形成异青霉素N。
KmR：产生卡那霉素抗性的基因;也用来指卡那霉素抗性表型。
lacI：大肠杆菌lacI基因。
lacZα：来自大肠杆菌lac操纵子的启动子和β-半乳糖苷酶（lacZ）α-片段。
lppT：大肠杆菌lpp基因的转录终止区。
lppP：大肠杆菌lpp基因的启动子。
M13    ORI：噬菌体M13的复制起点。
mel：酪氨酸酶基因。
MCS：多克隆位点。
mRNA：信使核糖核酸。
ORI：质粒或载体的复制起点，作为DNA聚合酶附着或起始位点的DNA顺序。
PGK：啤酒酵母（Saccharomyces    cerevisiae）磷酸甘油酸激酶基因的启动子和其他5′调控顺序。
pIPS：产黄青霉的IPS基因或IPS编码顺序。
pIPSp：产黄青霉IPS基因的启动子。
pL：λ噬菌体的左向启动子。
启动子：促进邻接DNA转录的DNA顺序。
rbs：核糖体结合位点，由翻译活化顺序编码的mRNA分子的5′端顺序，核糖体能够结合在上面。
重组DNA克隆载体：任何能独立复制或整合的单位，它包括（但不限于）质粒。该质粒含有能够或已经加入一个或多个外加DNA分子的DNA分子。
重组DNA表达载体：任何能独立复制或整合的单位，它包括（但不限于）质粒，该质粒含有驱动DNA片段表达的启动子和其他5′调控顺序，该DNA片段编码一种具有研究或商业意义的多肽或RNA。
重组DNA载体：任何重组DNA克隆或表达载体。
限制片段：任何由一种或多种酶的作用产生的线性DNA分子。
rRNA：核糖体核糖核酸。
敏感型宿主细胞：在一给定的抗生素的存在下，没有编码该抗生素抗性的DNA片段便不能生长的宿主细胞。
TcR：产生四环素抗性的基因;也用来指四环素抗性表型。注 意，TcS是指四环素敏感性表型。
转录终止区：阻断RNA聚合酶进行DNA转录的DNA顺序。
转染子：一种经历了由噬菌体DNA或噬菌体颗粒中包装的DNA转化的受体宿主细胞。
转化体：一种经历了转化的受体宿主细胞。
转化：将DNA导入受体宿主细胞中，它改变受体细胞的基因型并导致受体细胞变化。
翻译活化顺序：5′调控DNA顺序，它转录成mRNA以后，促进mRNA至蛋白质的翻译。
tRNA：转移核糖核酸。
trp：大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子和翻译活化顺序。
图1-33给出的限制位点和功能图谱大致上代表了本文所公开的重组DNA载体。图谱中限制位点的间隔是按载体上限制位点的实际间隔成比例绘制的，但观察到的限制位点距离可能与计算的图谱距离有些不同。限制位点的信息并不是完全的;因此，对于给定的位点类型来说，在载体上有可能存在着比图谱上实际显示的更多的限制位点。
图1.质粒pIT503的限制位点和功能图谱。
图2.质粒pKEN111（101）、pBR322（102）和103（构建质粒pCZR336的中间质粒）的限制位点和功能图谱、衍生过程和相互关系。
图3.质粒103、104和105（构建质粒pCZR336的中间质粒）的限制位点和功能图谱、衍生过程和相互关系。
图4.质粒pKEN021（106和107）和pKEN111（101）（构 建质粒pCZR336的中间质粒）的限制位点和功能图谱、衍生过程和相互关系。
图5.质粒ptrpED50chGH800（108）、pBR322（102）和pNM575（109）（构建质粒pCZR336的中间质粒）的限制位点和功能图谱、衍生过程和相互关系。
图6.质粒pNM575（109）、pKEN021（107）和pNM702（p1101）（构建质粒pCZR336的中间质粒）的限制位点和功能图谱、衍生过程和相互关系。
图7.质粒p1103（构建质粒pCZR336的中间质粒）的限制位点和功能图谱。
图8.质粒pL110、pL110A和pL110C以及噬菌体m13    mp18、m13Tc3和pL110B（构建质粒pCZR336的中间载体）的限制位点和功能图谱、衍生过程和相互关系。
图9.质粒pIT160的限制位点和功能图谱。
图10.质粒pCZR111的限制位点和功能图谱。
图11.质粒pCZR336的限制位点和功能图谱。
图12.质粒pIT507的限制位点和功能图谱。
图13.质粒p1104的限制位点和功能图谱。
图14.质粒p1105的限制位点和功能图谱。
图15.质粒pIT511的限制位点和功能图谱。
图16.质粒p1106的限制位点和功能图谱。
图17.质粒p3SR2的限制位点和功能图谱。
图18.质粒pMLC12的限制位点和功能图谱。
图19.质粒pPS34的限制位点和功能图谱。
图20.质粒pPS51的限制位点和功能图谱。
图21.质粒pPS52的限制位点和功能图谱。
图22.质粒pPS53的限制位点和功能图谱。
图23.质粒pPS54的限制位点和功能图谱。
图24.质粒pPS55的限制位点和功能图谱。
图25.质粒pPS56的限制位点和功能图谱。
图26.质粒pPS57的限制位点和功能图谱。
图27.质粒pPS58的限制位点和功能图谱。
图28.质粒pPS59的限制位点和功能图谱。
图29.质粒pPS60的限制位点和功能图谱。
图30.质粒pPS61的限制位点和功能图谱。
图31.质粒pPS62的限制位点和功能图谱。
图32.质粒pLC1的限制位点和功能图谱。
图33.本发明中几种质粒的关系及衍生。
本发明涉及编码DAOCS和DACS活性的DNA化合物及重组DNA克隆和表达载体。这些化合物可用于表达具有两种活性的单一蛋白，或可用于表达只具有两种活性之一的蛋白质。下面给出了一个具体的DNA顺序，它来自顶头孢霉的Brotzu株并编码DACS和DAOCS两种活性。下面只给出了双链DNA分子的“有意义”链或编码链，DNA是按5′→3′方向从左至右绘出的。DNA顺序上方给出了核苷酸顺序的号码。紧靠每一行DNA顺序的下面，按照氨基端→羧基端方向自左至右列出了由DNA编码的合成酶的氨基酸残基顺序。每个氨基酸残基出现在对其编码的DNA之下。在氨基酸残基顺序下方给出了氨基酸残基顺序的号码。
Figure 881016446_IMG3
Figure 881016446_IMG4
Figure 881016446_IMG5
其中，A是脱氧腺苷基，G是脱氧鸟苷基，C是脱氧胞苷基，T是脱氧胸苷基，ALA是丙氨酸残基，ARG是精氨酸残基，ASN是门冬酰胺残基，ASP是门冬氨酸残基，CYS是半胱氨酸残基，GLN是谷氨酰胺残基，GLU是谷氨酸残基，GLY是甘氨酸残基，HIS是组氨酸残基，ILE是异亮氨酸残基，LEU是亮氨酸残基，LYS是赖氨酸残基，MET是甲硫氨酸残基，PHE是苯丙氨酸残基，PRO是脯氨酸残基，SER是丝氨酸残基，THR是苏氨酸残基，TRP是色氨酸残基，TYR是酪氨酸残基，VAL是缬氨酸残基。
上述DNA顺序的G和C含量为～63%，所编码多肽的计算分子量为～36，462道尔顿，测定分子量为大约40，000道尔顿。本领域专业人员将认识到，上述DNA顺序是本发明的一个重要部分。上述顺序可利用完全保护的脱氧核糖核苷酸构件分子，根据修改的磷酸三酯法按常规合成。这种合成法是本领域内公知的，可以基本上根据下述方法进行：Itakura    et    al.，1977，Science    198∶1056和Crea    et    al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    75∶5765。此外，特别优选的方法见于Hsiung    et    al.，1983，Nucleic    Acid    Research    11∶3227和 Narang    et    al.，1980，Methods    in    Enzymology    68∶90。除了上述的人工方法以外，DNA顺序也可用自动化DNA合成仪合成，例如Systec    1450A或ABS（Applied    Biosystems，850    Lincoln    Centre    Drive，Foster    City，CA    94404）380A型DNA合成仪。
由于遗传密码的简并性导致大多数氨基酸残基和翻译终止信号有不止一个密码子，上述DACS/DAOCS酶的氨基酸残基顺序能由多种不同的DNA顺序来编码。由于这些不同的DNA顺序能编码本发明的同一氨基酸残基顺序，因此本发明进一步包括这些可供选择的顺序及使用这种选择顺序的方法。
由于头孢霉属中有许多种，甚至同一种中也有不同菌株，因此存在本发明编码DACS/DAOCS的DNA的遗传变异体。这些基因变异体中的DNA和氨基酸残基顺序与本发明的化合物基本同源，并编码具有类似活性的蛋白质（如果并不是所有的实际目的都一致的话），但与本发明的实际化合物有些不同。这些遗传变异体也是本发明化合物的等同物，并能用于本发明的方法中。
本发明的编码DACS/DAOCS活性的DNA化合物，是从顶头孢霉中通常称为Brotzu株的菌株中分离得到的，该菌株得自美国典型培养物保藏中心（Rockville，Maryland，寄存号为ATCC11550）。在双功能柯斯载体pKC462A（从号码为NRRL    B-15973的大肠杆菌K12SF8中得到）中构建Brotzu株全部基因组DNA的基因组文库，检查其中是否存在与一套32种不同的寡聚脱氧核糖核苷酸同源的顺序。这一套32种不同的寡聚脱氧核糖核苷酸，是根据顶头孢霉DACS/DAOCS酶的部分氨基酸顺序及其遗传 密码构建的。鉴别到许多与32种不同的寡聚脱氧核糖核苷酸中的一种或多种同源的载体。DNA顺序测定揭示出其中编码顶头孢霉DACS/DAOCS酶的载体。
鉴别出编码DACS/DAOCS酶的载体后，分离出含有DACS/DAOCS基因的～7.0kb的BamHI限制片段，将它插入市售质粒pUC8中产生质粒pIT503，然后将pIT503转化至大肠杆菌K12    JA221宿主细胞中。大肠杆菌K12    JA221/pIT503转化体已经寄存，并成为北方地区研究实验室（NRRL）（Peoria，IL61604）所收集的储备培养物的一部分，寄存号为NRRL    B-18170（该转化体已保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏编号为CCTCC    No.M88024）。在附图中，图1给出了质粒pIT503的限制位点和功能图谱。
质粒pIT503可用作构建本发明其他表达载体的起始材料。这些载体特别适用于在重组体的宿主细胞中生产DACS/DAOCS活性的方法，该方法包括：（1）用重组DNA表达载体转化宿主细胞，该表达载体包括：（a）启动子和翻译活化顺序;（b）编码DACS/DAOCS活性的DNA顺序，它位于由所述启动子表达的位置;（2）在能够表达DACS/DAOCS活性的条件下培养步骤（1）中转化的宿主细胞。
根据实例1所述方法，可从大肠杆菌K12    JA221中分离质粒pIT503，并用它构建本发明的大肠杆菌DACS/DAOCS表达载体。用质粒pIT503作为构建质粒pIT507的起始材料，后者在大肠杆菌中驱动DACS/DAOCS活性的高水平表达。实例2给出了质粒pIT507的构建程序（见2K），它涉及将质粒pIT503的编码DACS/DAOCS的～2.2Kb    SstI-BamHI限制片段与pCZR336 的～5.8Kb    NdeI-BamHI片段和～60bp的SstI-NdeI合成片段连接起来。
质粒pCZR336包括λpL衍生的启动子、翻译活化顺序、由c1857阻遏物基因编码的λpL操纵基因、编码位于目的基因之前的一个小肽的第一“顺反子”和编码hCH衍生物的DNA顺序。在大约30℃的低温下，由质粒pCZR336和pIT507编码的c1857蛋白质具有活性，能够阻遏λpL启动子的活性，但温度升至约42℃时，c1857蛋白失活，λpL启动子驱动大量编码hCH（pCZR336）或DACS/DAOCS（pIT507）的mRNA的转录。在附图中，图11给出了质粒pCZR336的限制位点和功能图谱。
质粒pIT507与质粒pCZR336含有相同的第一顺反子、c1857基因、λpL启动子和翻译活化顺序，但它没有hCH编码顺序，而含有来自质粒pIT503的DACS/DAOCS基因编码顺序。质粒pIT503的～2.2kb    SstI-BamHI限制片段含有DACS/DAOCS的大部分编码顺序，其余的编码顺序则包含在～60bp的NdeI-SstI合成片段中，为了方便以后的操作，稍微改变了一下野生型DNA顺序。限制性酶NdeI的识别顺序是
其中包含的
Figure 881016446_IMG7
编码DACS/DAOCS的氨基端甲硫氨酰残基。质粒pIT507以这样的方式构建，即使λpL启动子和翻译活化顺序位于驱动DACS/DAOCS编码DNA表达的位置。在附图中，图12给出了质粒pIT507的限制位点和功能图谱。实例2更详细 地描述了质粒pIT507的构建。
在约42℃的温度下，大肠杆菌K12    JM109/pIT507高水平表达DACS/DAOCS活性，接近全部细胞蛋白的～15%。来自这些大肠杆菌K12    JM109/pIT507转化体的细胞粗提物能够催化青霉素N至DAOC和DAC的转化，而来自未转化的大肠杆菌K12    JM109细胞的细胞提取物不能催化这一转化。实例3给出了转化反应的检测方法及检测结果。
许多大肠杆菌K12株含有内源头孢菌素酶活性，可能是由ampC座位所编码。由于这一原因，最好是对DAOCS/DACS多肽进行部分纯化，以便得到最佳的DAOCS/DACS活性。为此目的，通过DEAE-三丙烯基（DEAE-Trisacryl）进行酶的纯化，就足以将大肠杆菌内源头孢菌素酶活性与所需的DAOCS/DACS活性分离。下面的实例3概述了这种部分纯化的一个实例。除了利用部分纯化以克服头孢菌素酶的不利效应以外，另一种可供选择的方法是利用不能产生此活性的菌株。大肠杆菌K12    A85892就是这样一种菌株，它可以NRRL    B-18096的保藏号从北方地区研究中心得到。
质粒pIT507和pIT511（见下述）提供了在大肠杆菌中大量生产DACS/DAOCS的有效手段。由于大肠杆菌/pIT507以接近细胞总蛋白15%的水平表达DACS/DAOCS，并由于培养大肠杆菌比培养天然产生DAOCS和/或DACS的生物更为简单，因此，与非重组体或“天然的”DACS/DAOCS生产株相比，大肠杆菌/pIT507转化体能更有效和更经济地生产重组DACS/DAOCS。
如实例3所述，DAOCS可用来在无细胞体系中由青霉素N生产DAOC。DAOC不仅是一种有用的抗生素，也可用作生产一些重要抗 生素例如头孢力新和其他头孢菌素的起始物质（参见4，307，192号美国专利）。DACS/DAOCS的另一个重要用途是，将青霉素N以外的青霉素用该酶转化成新的头孢菌素衍生物。
产生青霉素和头孢菌素生物的无细胞提取物可用来合成非天然的（不是天然产生的）β-内酰胺。本发明的大肠杆菌表达载体为获取DACS/DAOCS提供了廉价而有效的方法，此方法可用来将自然界中非天然存在的青霉素在体外转化成新的抗生素或抗生素核心结构。
质粒pIT507特别适于驱动大肠杆菌中的DACS/DAOCS表达，这不仅由于使用此质粒能得到高水平的表达，还由于此质粒上存在有可选择的标记。许多重组DNA载体编码一种β-内酰胺酶，因此含有这种载体的细胞能够在某种β-内酰胺抗生素（如氨苄青霉素）的存在下生长。但是，如果希望使用含有DACS/DAOCS的无细胞提取物来构建β-内酰胺，则不希望提取物中含有β-内酰胺酶活性。因此，质粒pIT507不编码β-内酰胺酶作为选择标记，而是利用一种产生四环素抗性的基因，它编码一种不与β-内酰胺反应的蛋白质。
本发明的DACS/DAOCS表达方法及相关载体并不限于某种具体的可选择的标记。本领域专业人员知道，许多可选择的标记适用于DACS/DAOCS表达载体中。这种可选择的标记包括赋予卡那霉素抗性的基因、赋予氯霉素抗性的基因或产生其他抗生素抗性的基因。
对于将作为DACS/DAOCS底物的非天然青霉素的寻找可借助于寻找突变的DACS/DAOCS酶来完成，这些酶将接受青霉素N以外的青霉素作为底物。本发明为寻找这种突变的DACS/DAOCS提供了起始材料，包括通过DACS/DAOCS编码顺序的诱变而产生的DNA化合物。大肠杆菌是突变克隆实验的最好宿主，本发明的大肠杆菌表达 载体能够容易地通过本领域的已熟知的步骤进行突变，例如辐射（X-射线或UV）或化学诱变剂（例如乙基甲烷磺酸酯、亚硝基胍或甲基甲烷磺酸酯）处理，或进行位点特异性诱变，以得到将非天然青霉素作为底物的突变酶，催化那样不常见的和/或非天然的青霉素转化成非天然的头孢菌素。
实例4描述了另一种称为pIT511表达载体的构建方法，它与质粒pIT507的是基本一致的，只是从表达载体中去掉了除大约120bp外的所有的3′非编码（翻译终止信号的下游）信息。此载体对于诱变来说是更好的起始材料，因为DACS/DAOCS编码区在整个载体中所占百分比更大。
正如本领域专业人员将认识到的，本发明允许DACS/DAOCS基因的密码子被随意改变。在给定DACS/DAOCS基因的DNA顺序的情况下，只需进行常规操作就能产生突变的DACS/DAOCS酶，突变酶可在任一位置序号的氨基酸残基处与天然的DACS/DAOCS不同。这种突变酶由突变的DACS/DAOCS编码顺序所编码，这些顺序包括在天然的DACS/DAOCS编码顺序中缺失或插入了氨基酸密码子的顺序。这种突变的DACS/DAOCS酶在本发明的范围之内，因为即使不能绝对预测某一特定的突变是否将破坏所编码的DACS/DAOCS的活性，也只需如本文所述将突变顺序进行表达，以确定对DACS/DAOCS活性的影响。
实例5给出了生产突变型DACS/DAOCS的实例。实例5描述了DACS/DAOCS酶编码信息的位点特异性诱变及突变多肽在大肠杆菌中的表达。DACS/DAOCS蛋白质在100位含有半胱氨酸残基，实例5描述了在表达载体质粒pIT513中的DACS/DAOCS编码区中 将此残基变为丝氨酸的方法。这一通用方法可用来将任何残基变为其他19个天然编码的氨基酸中的任一个。体外拼接由这种方法产生的突变基因能生产具有多种突变结合的蛋白质。此突变的DACS/DAOCS由质粒pIT513表达，正如用大肠杆菌K12    JM109/pIT513转化体所说明的那样。通过标准方法很容易得到其他突变的DACS/DAOCS酶。
DACS/DAOCS    DNA编码顺序中的遗传信息量的改变（并因此导致所产生蛋白的氨基酸插入或缺失）导致所编码的氨基酸顺序的改变。
本发明并不限于本文说明的具体载体。相反，本发明包括编码任何DAOCS和/或DACS活性的DNA化合物。本发明的DNA化合物可用来构建在任何宿主细胞中驱动DACS/DAOCS活性表达的表达载体，表达载体在宿主细胞中复制或整合，其中的启动子和翻译活化顺序被用来表达DACS/DAOCS活性功能。
因此，虽然本文说明的大肠杆菌表达载体使用的二顺反子构建体的转录是由大肠杆菌中的λpL所驱动，本发明仍然包括任何在大肠杆菌中驱动DACS/DAOCS表达的大肠杆菌表达质粒或载体。因此，本发明包括驱动DACS/DAOCS表达的表达方法和相关载体，其中，载体利用大肠杆菌中的功能复制子，例如来自质粒pBR322、pACYC184、F、ColV-K94、R1、R6-5或R100的复制子。本发明也不仅仅限于使用质粒载体，因为本发明还包括这样一些表达载体以表达DACS/DAOCS活性，这些载体利用整合或病毒复制过程在宿主细胞中复制和保留。
本发明的方法和载体并不限于用以驱动DACS/DAOCS合成酶活 性编码DNA表达的特定启动子和翻译活化顺序。本发明包括任何能在大肠杆菌中起作用并用于在大肠杆菌中表达DACS/DAOCS的启动子和翻译活化顺序的使用。在大肠杆菌中起作用的许多启动子和翻译活化顺序都是已知的，且适用驱动DACS/DAOCS活性在大肠杆菌中的表达。这种转录和翻译活化顺序包括（但不限于）lpp、lac、trp、tac、λpL和λpR启动子以及翻译活化顺序。
除了上述的各种大肠杆菌转录和翻译活化顺序外，来自其他生物的转录和翻译活化顺序也能连接到本发明编码DAOC合成酶的DNA化合物上，形成驱动DAOC合成酶活性在宿主细胞中表达的表达载体，所述活化顺序能在这些细胞中起作用。虽然对于DACS/DAOCS的生产和随后为了体外使用而进行的纯化来说，大肠杆菌是最适宿主，但驱动DAOC合成酶活性在大肠杆菌以外的宿主细胞中表达的载体也可使用，尤其在为了提高某一给定生物特别是合成β-内酰胺抗生素的生物的头孢菌素的生产能力和效率时。
许多生物都能产生β-内酰胺抗生素。下表不完全地列举了生产β-内酰胺抗生素的生物。
表1.生产β-内酰胺抗生素的生物
生物    抗生素
农杆菌（Agrobacterium）    各种β-内酰胺
Arachnomyces    minimus    青霉素和头孢菌素
Anixiopsis    peruviana    青霉素和头孢菌素
顶头    孢霉（Cephalosporium    青霉素和头孢菌素
acremonium）
C.purpurascens
C.polyaleurum
C.chrysogenum
C.curtipes
色杆菌（Chromobacterium）    各种β-内酰胺
Emericellopsis    terricola    青霉素和头孢菌素
E.minima
E.synnematicola
E.glabra
E.mirabilis
E.salmosynnemata
葡糖杆菌（Gluconobacter）    各种β-内酰胺
Nocardia    lactamadurans    头霉素C
均匀诺卡氏菌（N.uniformis）    诺卡杀菌素
Paecilomyces    carneus    青霉素和头孢菌素
P.persicinus
产黄青霉    各种青霉素和其他β-内酰胺
赛氏杆菌（Serratia）    各种β-内酰胺
Spiroidium    fuscum    青霉素和头孢菌素
抗生素链霉菌（Streptomyces    棒酸
antibioticus）
银样链霉菌（S.argenteolus）    asparenomycinA，
MM4550和MM13902
S.cattleya    thienamycin
教酒链霉菌（S.charteusis）    SF1623，头霉素A和B
肉桂淡粉链霉菌    头霉素A和B
（S.cinnamonensis）
S.clavuligerus    pA-32413-I，头霉素C，
A16886A，青霉素，头孢霉素
棒酸和其他氧氮双环庚酮
（clavams）
镶边链霉菌（S.fimbriatus）    头霉素A和B
黄微绿链霉菌（S.flavovirens）    MM4550和MM13902
黄色链霉菌（S.flavus）    MM4550和MM13902
暗黄绿链霉菌（S.fulvoviridis）    MM4550和MM13902
灰色链霉菌（S.griseus）    头霉素A和B，
carpetimycin    A和B
赫斯氏链霉菌（S.halstedi）    头霉素A和B
S.heteromorphus    C2081X，头霉素A和B
S.hygroscpicus    脱乙酸基头孢菌素C
利波曼氏链霉菌（S.lipmanii）    头霉素、青霉素N，
7-甲氧基头孢菌素C
A16884、MM4550、MM13902
橄榄色链霉菌（S.olivaceus）    epithienamycin    F、
MM4550和MM13902
S.panayensis    C2081X、头霉素A和B
S.pluracidomyceticus    pluracidomycin    A
娄彻氏链霉菌（S.rochei）    头霉素A和B
盐屋链霉菌（S.sioyaensis）    MM4550和MM13902
sp.OA-6129    OA-6129A
sp.KC-6643    carpetimycin    A
S.tokunomensis    asparenomycin    A
产绿色链霉菌    头霉素A和B
（S.viridochromogenes）
S.wadayamensis    WS-3442-D
在前述的这些产生β-内酰胺抗生素的生物中，有许多被用于制药工业中生产抗生素。通过提高发酵时细胞内的抗生素生物合成酶的浓度，能够提高这些生物生产抗生素的能力。本发明的编码DACS/DAOCS活性的DNA化合物可用来构建这样的表达载体，当它们转化入合适的宿主细胞中后，可提高转化的宿主细胞内的DACS/DAOCS活性的浓度，并因此提高该细胞生产抗生素的能力和效率，只要这种宿主细胞能生产β-内酰胺抗生素。
转化入特定宿主细胞后能提高其DACS/DAOCS活性的胞内浓度的载体需要有下列要素：1）本发明的编码DACS/DAOCS活性的DNA化合物;2）启动子和翻译活化顺序，它们不仅能在待转化的宿主细胞中起作用，而且还位于驱动DACS/DAOCS活性编码DNA表达的正确方向和位置上。当然，只有载体在宿主细胞中复制时才能得到稳定的转化体，或者作为染色体外的成分复制，或者整合进基因组DNA中。上述载体还可包括产生抗生素抗性的基因或某些其他成分，以提供选择含有该载体的宿主细胞的手段，但如果载体整合进宿主细胞的染色体DNA中，则这种可选择的成分既不必要也不期望。
本发明还为青霉属和头孢霉属提供了说明性的表达载体。为方便起见，将下面以及实例中所述的中间质粒及表达质粒的重要特性列于下面的表2中。在附图中，图33还以图解的形式给出了这些质粒之间的关系。
Figure 881016446_IMG8
质粒pPS56是本发明的头孢霉表达载体。质粒pPS55（图24）是构建质粒pPS56（图25）的中间体。质粒pPS55是由质粒pMLC12（图18）的HindⅢ主干和质粒pPS34（图19）的～2.3kb    HindⅢ片段构建的，质粒pPS34含有与潮霉素B磷酸转移酶编码顺序融合的顶头孢霉IPS启动子（见实例6）。如实例6B所述。质粒pIT503（图1）的～7kb的含有DACS/DAOCS基因的BamHI片段与用BamHI部分消化的质粒pPS55融合，产生质粒pPS56。
在质粒pIT503上编码的顶头孢霉启动子和翻译活化顺序处于正确的位置，驱动编码DACS/DAOCS合成酶活性的DNA表达，因为在构建质粒pIT503时，在DACS/DAOCS活性编码DNA的编码链5′端的邻接DNA中，没有引入影响启动子和翻译活化顺序的缺失和插入。因此，质粒pIT503及其含有DACS/DAOCS完整基因的衍生物可用来提高头孢霉及相关的宿主细胞（顶头孢霉启动子和翻译活化顺序能在其中行使功能）生产抗生素的能力和效率。质粒pPS56最适用于这一目的，但也可使用质粒pIT503和pPS52。这种抗生素生产能力和效率的提高是由于提高了DACS/DAOCS活性水平所致，而后者又是由于存在有DACS/DAOCS基因额外的表达拷贝产生的。质粒pPS56还含有能在顶头孢霉中起作用的产生潮霉素抗性的基因，使得能够对顶头孢霉/pPS56转化体进行选择。
但是，一旦顶头孢霉/pPS56转化体被选择出来（实例20），则没有必要在生长培养基中维持潮霉素B选择压力。此时不需要选择压力，因为顶头孢霉/pPS56转化体非常稳定。这一稳定性据信是由于质粒pPS56是通过染色体整合转化顶头孢霉所致。但本发明并 不限于通过染色体整合转化顶头孢霉以驱动DACS/DAOCS合成酶活性表达的质粒，而且还包括染色体外复制的DACS/DAOCS表达载体（参见US4，492，758）。
顶头孢霉的DACS/DAOCS启动子也能在青霉中起作用（参见下面关于质粒pPS52的讨论），但最佳的青霉表达载体使用来自青霉属基因的启动子。如实例9所述，借助于合成的连接子，将来自质粒pLC1（NRRL    B-18181，图32）的青霉IPS启动子与质粒pMLC12的主干连接，产生质粒pPS53（图22）。质粒pPS53是构建几种其他克隆载体和表达质粒的中间质粒（图33）。如实例11所述，使质粒pPS53的含有启动子的～1.0kb    BamHI片段与质粒pPS55的含有HmR编码顺序的～4.3kb    BamHI片段融合，产生质粒pPS57（图26）。
质粒pPS57是构建青霉表达载体pPS62（图33）的中间质粒。质粒pPS62含有一个可选择的标记（HmR）和一个杂交的DACS/DAOCS基因，DACS/DAOCS和HmR编码顺序二者都在青霉IPS基因启动子（2拷贝）的控制下。下面进一步详细描述质粒pPS62的构建过程（同时参见实例16）。
没有可选择的标记的青霉DACS/DAOCS表达载体如实例12所述进行构建，将质粒pPS53中含有启动子的～1.0kb    BamHI片段插入大肠杆菌DACS/DAOCS表达载体pIT511的BglⅡ位点中，产生质粒pPS60（图29）。质粒pPS60含有青霉IPS启动子，接近于而并非位于表达DACS/DAOCS编码顺序的最佳位置。如实例13所述可使之达到合适的排列，首先从质粒pPS60中去掉两个小的XbaⅠ限制片段产生质粒pPS58（图27）。然后如实例14所 述，将合成连接子插入XbaⅠ位点得到质粒pPS59，并使青霉IPS启动子和DACS/DAOCS编码顺序达到更好的排列。质粒pPS59可用于在青霉细胞和其他青霉IPS启动子能在其中起作用的细胞中表达DACS/DAOCS活性。
质粒pPS59也是说明性的青霉DACS/DAOCS表达载体pPS62和pPS61的中间质粒。在两种情况中，都是用质粒pPS59的～2.1kb    BamHI-NruⅠ限制片段作为DACS/DAOCS编码顺序的来源，用Klenow酶使该片段形成平末端后与青霉IPS启动子融合。质粒pPS61和pPS62都含有用于青霉的可选择标记。实例16描述了质粒pPS59的～2.13kb片段与用HindⅢ切割的、Klenow处理的质粒pPS57主干的融合，并产生质粒pPS62（图31）。质粒pPS62是在青霉，尤其是在产黄青霉宿主细胞中表达DACS/DAOCS活性的优选载体。质粒pPS62最适用于可利用质粒pPS62上的HmR基因进行附加选择的细胞中。实例17描述了用此方法选择青霉转化体的说明性实例。
然而，青霉菌株对潮霉素具有某种程度的天然抗性;用HmR作为可选择标记的最佳转化条件要求加入潮霉素敏感化试剂。一种选择青霉转化体的较好方法（构成本发明的重要方面）包括（1）将含有乙酰胺酶基因的重组DNA载体导入青霉宿主细胞中;（2）在含有乙酰胺作为唯一碳源或氮源的生长培养基中培养步骤（1）产生的所述宿主细胞。构巢曲霉的乙酰胺酶（amd    S）基因可用于此方法中，此说明性基因的一个较好的来源是质粒p3SR2（NRRL    B-18182）。
本发明的一个有用的中间载体称为质粒pPS51（图20），如实例7所述，它是由质粒p3SR2的amd    S基因与质粒pMLC12 的主干相融合而组成的。如实例15所述，用HindⅢ使质粒pPS51线性化，用Klenow处理，然后与质粒pPS59中含有杂交的DACS/DAOCS基因的～2.13kb平末端片段相连接，产生质粒pPS61（图30）。质粒pPS61可用于在青霉中，尤其在产黄青霉中表达DACS/DAOCS活性。质粒pPS61尤其适用于转化能通过在乙酰胺上的生长进行选择的细胞。实例19描述了这种用amd    S基因鉴定青霉转化体的方法。
在其他的构建中，使用质粒pPS51作为乙酰胺酶基因的方便来源（图33）。实例8描述了质粒pPS52的构建程序，它含有位于～7kb    BamHI片段（来自质粒pPS51）上的DACS/DAOCS基因和合成连接子。质粒pPS52（图21）可用于表达DACS/DAOCS活性，尤其是在头孢霉的DACS/DAOCS启动子可在其中起作用，同时能用amd    S选择转化体的细胞中。质粒pPS52在头孢霉或青霉中都能作为表达载体使用。
amdS可选择标记能够掺入任何表达载体中。说明性载体pPS54含有质粒pPS51的amdS基因和青霉IPS基因。质粒pPS54（图23）可用于表达IPS活性，尤其是在如上所述的细胞，即青霉IPS启动子能在其中起作用并能用amdS基因选择转化体的细胞中。实例10描述了质粒pPS54的构建程序。
转化青霉的能力和青霉和头孢霉IPS基因（如本文所述，并参见美国专利申请系列859，008号，申请日为1986年8月8日;801，523号，申请日为1985年11月25日，它们列为本文参考文献）以及DACS/DAOCS基因的现实可得性，使得能够对基因和受体进行许多有用的结合。例如，正如在实例17、18和19的方 法中用质粒pPS54的使用和方法作为例子说明的那样，可将青霉IPS基因导入青霉的高产株中，以提高发酵生产的青霉素的效价。另一个实例是实例17、18和19的方法，用质粒pIT503、pPS52、pPS56、pPS58、pPS59、pPS60、pPS61或pPS62将DACS/DAOCS基因导入青霉中，从而在青霉中促进前所未有的头孢菌素生产。
有几种青霉表达质粒特别适用于实例17-19所述的方法中，即用于转化体的选择。质粒p3SR2、pPS51、pPS52、pPS54和pPS61含有amdS基因，携有这些质粒的青霉细胞能利用实例17和19所述的乙酰胺选择法进行选择。质粒pPS57和pPS62含有使用pIPS启动子的杂交的潮霉素抗性基因。携有这些质粒的青霉细胞可用实例18所述的潮霉素B选择法进行选择。
本发明一个特别有用的方面是，通过DACS/DAOCS或其修饰形式的作用，将青霉素G和青霉素V在青霉中体内转化成相应的头孢菌素。所需的发酵产物（头孢菌素G和头孢菌素V）是可用有机萃取得到的。本发明包括一种在青霉宿主细胞中制备头孢菌素的方法。该方法包括用重组DNA载体转化青霉宿主细胞，该载体含有表达DAOCS活性的编码基因。
此处所述的本发明并不限于DACS/DAOCS基因的编码顺序。由于质粒pIT503含有3kb以上的位于顶头孢霉基因组DACS/DAOCS编码DNA上游的基因组DNA，质粒pIT503必然含有DACS/DAOCS基因的启动子和翻译活化顺序。大多数启动子和结合的翻译活化顺序编码在待活化的DNA的上游（某些编码rRNA的DNA顺序不是由位于编码顺序上游的启动子活化）。“上游”是分子生物学 领域内使用的一个词，在本文中，它是指DACS/DAOCS顺序从编码链5′端起的5′方向的DNA。
质粒pIT503、pPS52和pPS56含有DACS/DAOCS基因的顶头孢霉启动子和翻译活化顺序。由于位于质粒pIT503、pPS52和pPS56上的顶头孢霉启动子和翻译活化顺序能用来驱动多种DNA顺序的表达，此顺序也构成了本发明的一个重要部分。虽然有关顶头孢霉启动子和翻译活化顺序的顺序数据有限，但相信此活化顺序是由～440bp的SstⅠ-HindⅢ限制片段所编码，并位于DACS/DAOCS编码顺序的上游并与之密切相邻。任何含有上述～440bpSstⅠ-HindⅢ限制片段的限制片段必然含有顶头孢霉启动子和翻译活化顺序。小于～440bp片段的片段，可通过常规方法检查其启动子活性。
已经有关于质粒pIT503上编码的顶头孢霉启动子和翻译活化顺序的顺序数据。下面的顺序是处于质粒pIT503上的DACS/DAOCS基因编码链上游的DNA顺序，它代表～440bp    SstⅠ-HindⅢ限制片段的顺序。为了进一步明确质粒pIT503中的活化顺序是如何定向的，在顺序的5′（上游）端标出了HindⅢ切割位点，在其3′端标出了编码DACS/DAOCS基因的氨基端甲硫氨酸的“ATG”（前述的SstⅠ位点在进入编码顺序的60bp处）。由质粒pIT503编码的顶头孢霉DACS/DAOCS启动子和翻译活化顺序的DNA顺序
Figure 881016446_IMG9
↑→DACS/DAOCS蛋白编码区
（编码顺序）起始
顶头孢霉启动子和翻译活化顺序可用来驱动任何DNA顺序的表达。例如，DACS/DAOCS启动子与细菌的潮霉素B抗性基因的融合，将提供在头孢霉中进行潮霉素B选择的优越性和实用性。这种杂交的HmR基因能作为可选择标记用于头孢霉中。
本发明还包括DACS/DAOCS基因3′端的转录终止顺序和其他调控信号。质粒pIT503及其衍生质粒如质粒pPS56，含有1kb以上的顶头孢霉基因组DACS/DAOCS基因的翻译终止位点的下游DNA。这种3′调控DNA顺序有一部分是已知的并绘制如下。5′-TAG-3′是翻译终止顺序：
Figure 881016446_IMG10
此顺序和含有DACS/DAOCS基因3′调控顺序的更大的顺序，能够掺入重组DNA表达载体中。
本发明是一个开创性发明，因为它代表了首次对编码DAOCS酶活（通常称为扩展酶活性）的DNA顺序进行克隆和基因工程，这一酶活性是将青霉素转化为头孢菌素所必需的。许多顶头孢霉以外的生物表达基本相似（如果不是完全一致）的扩展酶活性。不同属的生产抗生素的生物中的扩展酶活性的相似性，是由于不同扩展酶的氨基酸顺序和编码扩展酶活性的DNA顺序的相似性。
本发明涉及扩展酶尤其是顶头孢霉DAOC合成酶的氨基酸顺序和DNA顺序，此顺序信息能用来从生产β-内酰胺的生物中分离编码扩展酶的DNA。因此，本发明包括所有能够根据与顶头孢霉的DACS/DAOCS编码顺序的任何部分的同源性而分离得到的编码DAOCS的DNA化合物。例如，本DNA顺序能够用来制备标记探针，而此探针又能用来在前述生产β-内酰胺的生物中寻找编码扩展酶的DNA顺序。本发明编码DAOCS的DNA中的～63%的高G和C含量，使得本发明的DNA化合物尤其适用于分离链霉菌中编码DAOCS的DNA，尤其是从S.clavuligerus中分离。已知链霉菌DNA具有较高的G和C含量，通常接近70%，因此，本发明DNA的高G和C含量使得本发明的DNA化合物尤其适用于从S.clavuligerus或其他链霉菌中分离同源的编码DAOCS的DNA顺序。同样，这种DNA顺序的同源性使得本发明的DNA化合物能够用来鉴定编码DACS活性或DACS和DAOCS二种活性的化合物。这些同源化合物构成了本发明的一个重要方面。
下述实例用来进一步阐述和说明本发明，但并不限制本发明的范 围。
实例1.培养大肠杆菌K12    JA221/pIT503（中国典型物培养物保藏中心，保藏号：CCTCC    No.M88024）及分离质粒pIT503
从NRRL（Peoria，IL）得到寄存号为NRRL    B-18170的大肠杆菌K12    JA221/pIT503的冻干粉。在下述方法中，此冻干粉可直接作为“培养物”使用。
1升含有50μg/ml氨苄青霉素的L液体培养基（每升含有10g胰蛋白胨，10g NaCl，5g酵母提取物）用大肠杆菌K12JA221/pIT503（CCTCC No.M88024）培养物接种，在旋转恒温器中于37℃下培养，当590nm处的光密度（OD590）为～1吸收单位时，向培养物中加入150mg氯霉素。继续培养大约16小时;氯霉素的加入抑制蛋白质合成，因此进一步抑制细胞分裂，但质粒可以继续复制。
使培养物在Sorvall    GSA转子（DuPontCo.，Instrument    Products，Biomedical    Division，Newtown，CN    06470）于4℃下以6000rpm离心5分钟。弃去所得到的上清液，细胞沉淀在40ml    TES缓冲液（10mM    Tris-HCl，pH7.5;10mM    NaCl;1mM    EDTA）中洗涤，然后再次沉淀，弃去上清液，细胞沉淀在干冰-乙醇浴中冷冻后融化。融化的细胞沉淀再悬浮于10ml    25%蔗糖和50mM    EDTA的溶液中。在此溶液中加入大约1ml    5mg/ml溶菌酶溶液;3ml    0.25M    EDTA，pH8.0;100μl    10mg/ml    RNA酶A，混合后在冰水上保温15分钟。在此溶菌酶处理的细胞中加入3ml溶解液（使3ml    10%    Triton-X100;75ml    0.25M    EDTA，pH8.0;15ml    1M    Tris-HCl，pH8.0;7ml水混合而制成），混合后使产生的溶液在冰上再保温15分钟。使溶解后的细胞在干冰 -乙醇浴中冻结后融化。
通过在SW27转子（Beckman，7360N.Lincoln    Ave.，Lincolnwood，IL    60646）中以25，000rpm离心40分钟，从此溶液中去掉细胞碎片。上清液用缓冲的苯酚萃取。在溶液中加入大约30.44g    CsCl和～1ml    5mg/ml溴化乙锭溶液，使溶液体积调整到40ml，然后倾入VTi50超心管（Beckman）中。使管子密封，该溶液在VTi50转子中以42，000rpm离心～16小时。用紫外光可观察到产生的质粒带，将其分离，置于Ti75管和转子（Beckman）中，以50，000rpm离心16小时。所有必需的体积调整都使用含有0.761g/ml    CsCl的TES进行。再次分离质粒带，用盐饱和的异丙醇萃取以除去溴化乙锭，用TES缓冲液以1∶3的比例稀释。在溶液中加入二倍体积的乙醇，然后于-20℃下保温过夜。通过在SS34转子（Sorvall）中以10，000rpm离心该溶液15分钟而沉淀质粒DNA。
取～1mg用此方法得到的质粒pIT503    DNA悬浮于1ml    TE缓冲液（10mM    Tris-HCl    pH8.0，1mM    EDTA）中，贮存于-20℃下。在附图中，图1给出了质粒pIT503的限制位点和功能图谱。
实例2.质粒pIT507的构建
A.质粒pKEN021的构建及其～5.1kb    XbaI-BamHI限制片段的分离
本实例的这一部分给出了质粒pKEN021（图4中的106）的～5.1kb    XbaI-BamHI限制片段的分离方法。质粒pKEN021是质粒pKEN111的衍生质粒（pKEN111即图2中的101，进一步的描述见于Lee et    al.，1981，J.Bact，146：861-866;Zwiebel    et    al.，1981，J.Bact，145：654-656）。质粒pKEN111能够从寄存号为NRRL    15011的大肠杆菌CC620中得到（该菌株得自NRRL，Agricultural    Research    Service，Peoria，IL    61604）。质粒pKEN111具有～2.8kb的EcoRI限制片段，其中含有大肠杆菌的lpp基因（参见Nakamura    and    Inouye，1979，Cell    18：1109-1117）。
在质粒pKEN021中，质粒pBR322的650bp    EcoRI-SalI限制片段已由大肠杆菌lpp基因顺序所取代。lpp基因顺序包括462bp的AluI片段，此片段位于lpp编码顺序第一个三联体的上游。此462bp片段含有启动子、5′非翻译区和核糖体结合位点。在翻译起始的甲硫氨酸密码子之前16bp处的核糖体结合位点中，存在有唯一的XbaI限制位点。在lpp编码顺序的翻译终止密码子上游105bp处，存在有一个PvuⅡ限制位点，通过加入合成的DNA连接子（5′-CCGGATCCGG-3′，Collaborative    Research    Inc.，128    Spring    Street，Lexington，MA    02173）使之变为BamHI限制位点。跟随在BamHI位点之后，有脂蛋白最后35个氨基酸的编码顺序、翻译终止信号和相应于mRNA3′端非翻译区的顺序。质粒pKEN021还包括大约850bp的额外顺序，它位于大肠杆菌染色体中lpp基因的下游。这些顺序作为最初分离基因时所用方法及限制性酶切位点的结果而被包括进来，它们决不限制本发明。
正如图2、3和4所示，质粒pKEN021是由质粒pKEN111按 下述方法产生的。将大约50μg质粒pKEN111（图2中的101）用25单位HpaⅡ限制性酶（除非特别指出，限制性酶及单位的定义是指New England Biolabs，32 Tozer Rood，Beverly，MA 01915的定义）在300μl 1×HpaI缓冲液（10mM Tris-HCl，pH7.4;10mM MgCl2;20mM KCl;6mM β-巯基乙醇）中于37℃下消化2小时。混合物用300μl 50∶50的苯酚与氯仿的混合物萃取2次，回收的水相用2.5倍体积的乙醇和0.1倍体积的3M乙酸钠（NaOAc）沉淀。将DNA沉淀溶于100μl电泳缓冲液中，在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行分级分离（除非特别指出，所有聚丙烯酰胺凝胶中的丙烯酰胺∶双丙烯酰胺的比率为29∶1）。凝胶在含有0.5μg/ml溴化乙锭的溶液中染色，在长波紫外光下观察DNA带。通过电泳洗脱至透析袋中，从凝胶上分离和回收950bp的HpaⅡ限制片段。在苯酚/CHCl3萃取及乙醇沉淀后，将回收的DNA（～2.5μg）溶于25μl TEN（10mM NaCl;10mM Tris-HCl，pH7.4;1mM乙二胺四乙酸钠（EDTA））中。
将约2μg 950bp的HpaⅡ片段用AluⅠ限制性酶在200μl 1×AluⅠ缓冲液（50mM NaCl;6mM Tris-HCl，pH7.6;6mM MgCl2;6mM β-巯基乙醇）中于37℃下消化2小时。使此DNA在6%聚丙烯酰胺凝胶上进行分级分离，并如上所述回收和纯化462bp的AluⅠ片段。将462bp的AluⅠ片段（～1μg）溶于10μl T4 DNA连接酶缓冲液（66mM Tris-HCl，pH7.6;10mM MgCl2;10mM二硫苏糖醇;0.4mM ATP）中，其中含有150微微摩尔磷酸化的EcoRI连接子（5′-GGAATTCC -3′，得自Collaborative Research）和2单位T4 DNA连接酶。于4℃下保温16小时后，使混合物加热至65℃10分钟，然后稀释至100μl，以得到含有40单位EcoRI酶的1×EcoRI缓冲液（100mM Tris-HCl，pH7.2;50mM NaCl;10mM MgCl2;6mM β-巯基乙醇）的组合物。于37℃下2小时以后，样品用苯酚/CHCl3萃取并用乙醇沉淀。然后使DNA溶于20μl T4 DNA连接酶缓冲液中，其中含有T4 DNA连接酶和0.1μg用EcoRI消化并用碱性磷酯酶处理的质粒pBR322（图2中的102）。于4℃下连接16小时后，用产生的DNA按照常规方法转化大肠杆菌K12 HB101（NRRL B-15626）（中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.M88028）。在含有12μg/ml四环素的琼脂平皿上选择转化体，按照Birnboim和Doly所述的快速碱提取法（1979，Nucleic Acids Research 7∶1513-1523）从抗性集落中分离质粒。选择到一个含有466bp XbaI-BamHI片段的质粒（图2中的103），将它作为下述步骤中的起始材料使用。
大约2μg此质粒（图3中的103）用2单位HindⅢ酶在50μl 1×HindⅢ缓冲液（60mM NaCl;10mM Tris-HCl，pH7.4;10mM MgCl2;6mM β-巯基乙醇）中于37℃下消化1小时。反应混合物用苯酚/CHCl3萃取并用乙醇沉淀后，将DNA溶于200μl 1×S1核酸酶缓冲液（300mM NaCl;30mM NaOAc，pH4.25;3mM ZnCl2）中，其中含有200单位的S1核酸酶（Miles Laboratories，30W.475，N.Aurora Road，Naperville，IL60566）。于15℃下1小时后，通过苯酚/CHCl3萃取终止反应，然后用乙醇沉淀DNA。将此用 HindⅢ消化并用核酸酶处理的DNA溶于10μl T4 DNA连接酶缓冲液中，其中含有20微微摩尔磷酸化的BamHI连接子（5′-CCGGATCCGG-3′，来自Collaborative Research）和2单位T4 DNA连接酶。于4℃下16小时以后，将反应混合物加热至65℃10分钟以使连接酶失活，然后稀释至100μl，得到1×BamHI缓冲液的组成（150mM NaCl;20mM Tris-HCl，pH8.0;10mM MgCl2;6mM β-巯基乙醇）并加有20单位的BamHI酶。37℃下2小时以后，混合物在1%琼脂糖凝胶上纯化。凝胶用溴化乙锭染色，较大的片段（～4.5kb）如下述回收：从凝胶上切下条带，冰冻琼脂糖片后将片段洗脱，然后通过苯酚/CHCl3萃取和乙醇沉淀进行纯化。另外，所需片段也可用NA45膜（Schleicher and Schuell，Keene NH 03431）按照生产厂家的说明从琼脂糖凝胶上分离。
回收的片段具有BamHI粘性末端，使它溶于20μl含有T4    DNA连接酶的T4DNA连接酶缓冲液中。于4℃16小时以后，用此DNA转化大肠杆菌K12    HB101（NRRL    B-15626）（中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC    No.M88028）。通过以100μg/ml筛选氨苄青霉素抗性（ApR）及以10μg/ml筛选四环素敏感性（TcS）而选择转化体。检查了来自ApR、TcS集落的几种质粒（用前述的Birnboim方法制备），看是否缺乏HindⅢ位点及是否存在有单一的BamHI位点。用EcoRI、SalI依次消化产生两个较小的片段（大小为466bp和305bp）以及一个大得多的片段。选择到一个具有这些特性的质粒（图3中的104），然后对其加以修饰，使位于lpp启动子上游的EcoRI位点转化为HindⅢ限制位点。
这种修饰作用如下述完成，首先使2μg此质粒（图3中的104） 在100μl 1×EcoRI缓冲液中用限制性酶EcoRI部分消化。通过在65℃的加热失活来终止反应，用苯酚/CHCl3萃取反应混合物后，用乙醇使DNA沉淀。将DNA沉淀溶于200μl含有1000单位/ml S1核酸酶的1×S1核酸酶缓冲液中，然后于12℃下保温1小时。通过苯酚/CHCl3萃取终止反应，DNA用乙醇沉淀。将DNA沉淀再悬浮于10μl T4 DNA连接酶缓冲液中，其中含有20微微摩尔磷酸化的HindⅢ连接子（5′-CCAAGCTTGG-3′，来自Collaborative Research）和2单位T4 DNA连接酶。于4℃下16小时后，混合物加热至65℃10分钟，稀释至150μl，得到含有10单位HindⅢ限制性酶的1×HindⅢ缓冲液的组成，于37℃下保温2小时，然后在1%琼脂糖凝胶上进行分级分离。通过常规方法回收最大的带（相当于线性的完整长度质粒），纯化后溶于20μl含有T4连接酶的T4连接酶缓冲液中，于4℃下保温16小时，用以转化大肠杆菌HB101（NRRL B-15626）。用限制性酶分析分析ApR转化体的质粒DNA。选择到一个具有～500bp EcoRI-HindⅢ片段的质粒（图3中105）。用此质粒作为lpp基因3′区域的克隆载体。
将约2μg此质粒（图4中105）在50μl 1×SalI缓冲液（150mM NaCl;6mM Tris-HCl，pH7.9;6mM MgCl2;6mM β-巯基乙醇）中用2单位SalI酶于37℃下消化1小时。然后使SalI反应混合物稀释至150μl，得到含有2单位BamHI酶的1×BamHI缓冲液的组成。于37℃下1小时后，加入大约2.5单位碱性磷酸酯酶，混合物于65℃下保温1小时。所需物质经苯酚/CHCl3萃取后用乙醇沉淀，溶于TEN中，作为lpp3′ 片段的克隆载体使用。
为了得到lpp3′片段，将10μg质粒pKEN111（图2中101）在200μl含有10单位HpaI酶的1×HpaI缓冲液中于37℃下消化2小时。苯酚/CHCl3萃取和乙醇沉淀后，将DNA溶于10μl T4 DNA连接酶缓冲液中，其中含有20微微摩尔磷酸化的SalI连接子（5′-GGTCGACC-3′，来自Collaborative Research）和T4 DNA连接酶，然后于4℃下保温16小时。通过加热至65℃10分钟使连接酶失活。将得到的物质稀释至100μl，得到含有10单位SalI酶的1×SalI缓冲液的组成，于37℃下保温1小时。将反应混合物稀释至300μl，得到含有10单位PvuⅡ酶的1×PvuⅡ缓冲液的组成（60mM NaCl;6mM Tris-HCl，pH7.5;6mM MgCl2;6mM β-巯基乙醇）于37℃下1小时后，将DNA在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行分级分离。回收到大约0.5μg的950bp片段，纯化后溶于TEN中。
将0.2μg此片段稀释至20μl    T4    DNA连接酶缓冲液中，其中含有20微微摩尔磷酸化的BamHI连接子（5′-CCGGATCCGG-3′，来自Collaborative    Research）和2单位T4    DNA连接酶，然后于4℃下保温16小时。然后使产生的DNA于65℃加热10分钟，然后稀释至100μl，得到含有20单位BamHI酶的1×BamHI缓冲液的组成，于37℃下保温2小时，然后在5%聚丙烯酰胺凝胶上进行分级分离以去掉多余的连接子分子。通过常规方法纯化所产生的具有BamHI和SalI粘性末端的950bp片段，溶于20μl    T4    DNA连接酶缓冲液中，其中含有0.2μg用BamHI和SalI消化的质粒105和T4    DNA连接酶。于 4℃下保温16小时后，用此DNA转化大肠杆菌K12    HB101（NRRL    B-15626）。从ApR转化体中制备质粒，分析其SalI-BamHI片段。所需的质粒（～5.2kb）称为pKEN021（图4中106）。
将10μg质粒pKEN021在200μl含有BamHI和XbaI酶各10单位的BamHI缓冲液中于37℃下消化1小时。然后将所需的XbaI-BamHI消化的DNA用2.5单位碱性磷酸酯酶于65℃下处理1.5小时，经苯酚/CHCl3萃取后通过乙醇沉淀收集，溶于50μl TEN中以备将来之用（图4中107）。
B.质粒pNM575的构建
用Martial等人所述的质粒ptrpED50    chGH800（图5中108）（1979，Science    205：602-607）作为含有一部分hGH编码顺序的DNA来源。此片段可通过人工合成构建，或使用公认的方法得到（Goodman    et    al.，1979，Methods    in    Enzymology    68∶75-90），即从人垂体中分离编码hGH的mRNA。质粒ptrpED    50    chGH800的hGH部分含有唯一的SmaI限制位点，此位点位于编码顺序翻译终止密码子下游6bp处。使此位点如下述变成BamHI位点。
将约6μg质粒ptrpED50 chGH800在200μl 1×SmaI缓冲液（15mM Tris-HCl，pH8.0;6mM MgCl2;15mM KCl;6mM β-巯基乙醇）中用6单位SmaI于37℃下消化1.5小时。消化完成以后，进行苯酚/CHCl3萃取，通过乙醇沉淀回收DNA，然后溶于24μl TEN中。取上面消化的质粒0.5μg（0.2微微摩尔末端）置于16μl含有T4 DNA连接酶的连接 酶缓冲液中，加入40微微摩尔磷酸化的BamHI连接子（Collaborative    Research）。将此混合物于22℃下保温2小时，于4℃下16小时，然后于65℃下10分钟。用BamHI限制性酶进行常规消化产生BamHI粘性末端。此酶既切断连接子顺序，又切断位于克隆的hGH    cDNA顺序起始处的BamHI位点。此消化过程产生具有BamHI粘性末端的691bp片段，使之在6%聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后按照常规方法回收。
将回收的DNA片段与0.2μg用BamHI消化并用碱性磷酸酯酶处理的质粒pBR322连接（图5）。于4℃下16小时后，基本上根据Wensink等人的转化方法（1974，Cell    3∶315-325），用此材料转化大肠杆菌K12    JA221（NRRL    B-15014）（中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC    No.M88033）。在含有100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平皿上选择转化体，按照常规方法分离质粒，并通过限制性酶和凝胶电泳分析进行鉴定。所需的质粒称为pNM575（图5中的109），它含有～700bp    BamHI片段，通过常规方法使其扩增（实例1）以备将来之用。
C.质粒p1101的构建
成熟的hGH的编码顺序含有一个FnuDⅡ位点，它位于离翻译起始位点第一核苷酸～47bp处。将约25μg质粒pNM575在250μl BamHI缓冲液中用25单位BamHI酶于37℃下消化1小时（图6）。按照常规方法由6%聚丙烯酰胺凝胶中分离691bp的BamHI片段并进行纯化。纯化后，取三分之一的片段（相当于8μg质粒）在100μl FnuDⅡ缓冲液（6mM NaCl;6mM Tris-HCl，pH7.4;6mM MgCl2;6mM β-巯基乙醇）中用2.5单位FnuDⅡ酶于37℃下消化1.5小时。利用6%聚丙烯酰胺凝 胶电泳和标准回收方法分离538bp的DNA片段，该片段含有hGH的最后175个氨基酸的编码顺序，其后是翻译终止信号。
用磷酸三酯法合成一个双链DNA片段（图6中1100），使lpp启动子区和hGH编码区连在一起。该双链DNA片段（图6中1100）具有如下顺序：
Figure 881016446_IMG11
此片段通过公认的磷酸三酯法制备，通过该方法先制备下述片段：
1）5′-CTAGAGGGTA-3′;2）5′-TTACATATGGATTTCC-3′;
3）5′-CAACCATTCCCCTCTCGAGGC-3′;4）5′-TTTTTGACAACG-3′;
5）5′-CTATGCTCCG-3′;6）5′-CGGAGCATAGCGTT-3′;
7）5′-GTCAAAAAGCCT-3′;8）5′-CGAGAGGGGAAT-3′;
9）5′-GGTTGGGAAATC-3′;10）5′-CATATGTAATACCCT-3′。
利用上述制备的片段，如下述逐步进行T4连接酶催化的连接反应：
a）5′-未磷酸化的片段1与磷酸化的片段2、9和10混合，通过T4连接酶的作用形成DNA双链1（Bromn    et    al.，1979，Methods    in    Enzymology    68：109-151）。通过在15%聚丙烯酰胺上进行制备凝胶电泳分离此双链。
b）5′-未磷酸化的片段6与磷酸化的片段3、4、5、7和8混合，通过T4    DNA连接酶的作用形成DNA双链2。通过15%聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化此双链。
c）然后，通过T4连接酶使DNA双链1和2连在一起形成DNA双链1100（图6），通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳使之纯化。然后，通过下述已建立的方法，利用T4多核苷酸激酶和γ-32P-ATP使此DNA双链进行酶促磷酸化。
在24μl连接缓冲液中，用T4    DNA连接酶使0.1微微摩尔（0.4μg）的质粒pKEN021（图4中107）的XbaI-BamHI片段、0.025微微摩尔的合成DNA片段（图6中1100）和0.3微微摩尔（0.08μg）质粒pNM575的538bp片段连接起来，从而构建表达质粒p1101。于4℃下保温16小时后，用此混合物转化大肠杆菌JA221（NRRL    B-15014）（中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC    No.M88033）。在含有100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平皿上选择转化体，并作为所需的表达质粒p1101的优选来源进行常规培养。
D.质粒p1103的构建
质粒p1101中的hGH基因顺序中含有一个XhoI位点，它始于翻译起始位点下游24碱基处;及一个位于5′非编码区中的XbaI位点。将约25μg质粒p1101在250μl    BamHI缓冲液中用25单位XbaI和25单位XhoI于37℃下消化1小时。如实例2A所述，从琼脂糖凝胶中纯化比线性质粒泳动稍快的大片段。
通过磷酸三酯法合成一个双链DNA片段，在hGH编码顺序之前掺入一个短的开放读码（顺反子）。此双链DNA片段具有下述顺序：
该片段通过公认的磷酸三酯法制备，通过该方法先制备下列片段：
1）5′-CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTTTAATAAGGAG-3′;
2）5′-GAATAATCATATGGATTTCCCAACCATTCCCCTC-3′;
3）5′-TCGAGAGGGGAATGGTTGGGAAATCCATATGATTATTCCTCCTT-3′
4）5′-ATTAAAATCAATATACATTATTAATACCCT-3′。
利用上述制备的片段进行T4连接酶催化的连接反应，即，使5′未磷酸化的片段1和3与5′磷酸化的片段2和4混合，使此混合物经受T4连接酶的作用。然后通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化所产生的双链。然后通过下述已建立的方法，用T4多核苷酸激酶和γ-32P-ATP对此DNA双链进行酶促磷酸化。在24μl连接缓冲液中，用T4DNA连接酶使0.1微微摩尔（0.4μg）质粒p1101的XbaI-XhoI片段与0.025微微摩尔合成DNA片段连接起来，从而构建hGH表达质粒p1103。于4℃下保温16小时后，用此混合物转化大肠杆菌JA221（NRRL B-15014）（中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.M88033）。在含有100μg/ml氨苄青霉素的琼脂平皿上选择转化体，并作为所需的表达质粒p1103（图7）的优选来源进行常规培养。
E.大肠杆菌K12    RV308/pL110A的构建
质粒pL110公开了0217529号欧洲专利公开的实例1-11中，该文献作为本文的参考文献。在附图中，图8给出了质粒pL110的限制位点和功能图谱。
将约1μg质粒pL110的DNA在含有2μl10×高盐缓冲液（1.0M NaCl;0.50M Tris-HCl，pH7.5;0.10M MgCl2;10mM二硫苏糖醇）的20μl总体积中用3单位NdeI酶于37℃下消化1小时。用苯酚/氯仿萃取反应混合物，用乙醇沉淀DNA。将NdeI消化的质粒pL110DNA溶于50μl 1×Klenow缓冲液中（40mM KPO4，pH7.5;6.6mM MgCl2;1.0mM 2-巯基乙醇;33μM dATP;33μM dCTP;33μM dGTP;33μM TTP）。加入2μl（～10单位，New England Biolabs）大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段（称为 Klenow）并与DNA混合，产生的反应液于16℃下保温1小时。用苯酚萃取终止反应，DNA则通过常规方法纯化。然后用T4    DNA连接酶，使经NdeI消化并经Klenow处理的DNA于4℃下连接16小时。用所产生的DNA按常规转化大肠杆菌K12    RV308株（NRRL    B-15624）。在含有100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平皿上选择转化体，通过Birnboim和Doly所述的快速碱提取法从抗性集落中分离质粒。选择到一个没有NdeI位点的质粒（图8中pL110A）。
F.通过位点专一性诱变构建噬菌体pL110B
在附图中，图8的右侧显示了通过位点专一性诱变去掉四环素抗性基因中的BamHI位点的方法。
F（ⅰ）噬菌体MBTc3的构建
用质粒pL110作为四环素抗性基因的来源。将约50μg在50μlTE缓冲液中的质粒pL110加至25μl 10×HindⅢ缓冲液和170μl H2O中。在此质粒pL110 DNA的溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶HindⅢ，产生的反应液于37℃下保温2小时。在HindⅢ消化的质粒pL110 DNA中，加入大约13μl的2M Tris-HCl，pH7.4和5μl（～50单位）限制性酶EcoRI，反应液于37℃下再保温2小时。通过用TE饱和的苯酚萃取反应混合物终止反应;通过氯仿萃取除去苯酚。然后，通过沉淀和离心收集EcoRI-HindⅢ消化的质粒pL110 DNA，加至1%琼脂糖凝胶上，分离和纯化大的～4.3kb的EcoRI-HindⅢ限制片段。
将约5μg噬菌体Ml3mp18（New    England    Biolabs）溶 于50μl    TE缓冲液中，然后如上述用HindⅢ和EcoRI消化。如上述处理pL110一样纯化HindⅢ-EcoRI切割的噬菌体M13mp18    DNA，不同的是分离纯化～7.25kb的限制片段。
将约100ng质粒pL110的～4.3kb HindⅢ-EcoRI片段与大约100ng噬菌体M13mp18的～7.25kb HindⅢ-EcoRI片段、2μl 10×连接酶缓冲液、1μl（～100单位）T4 DNA连接酶和14μl H2O混合。连接反应液于15℃下保温1.5小时。连接好的DNA即组成了所需的噬菌体m13Tc3DNA。在附图中，图8给出了噬菌体m13Tc3的限制位点和功能图谱。
用1ml大肠杆菌K12JM109（可从New England Biol-abs得到的大肠杆菌K12JM101可用来代替大肠杆菌K12JM109）的过夜培养物接种15ml L液体培养基，产生的培养液于37℃下通气培养，直至OD660在0.3和0.4之间。将细胞再悬浮于25ml 10mM NaCl中，在冰上保温10分钟，通过离心收集。将细胞再悬浮于1.25ml 75mM CaCl2中;取出200μl等分试样的细胞，加至10μl如上述制备的连接好的DNA中，在冰上保温大约40分钟。然后使细胞-DNA混合物于42℃下保温2分钟，取出不同量的等分试样（1、10和100μl）加至3ml上等琼脂中（L液体培养基加有0.5%在45℃下保持融化状态的琼脂），其中还含有50μl2%X-Gal，50μl 100mM IPTG和200μl处于对数生长期的大肠杆菌K12 JM109。然后将细胞-上等琼脂混合物涂布在L-琼脂平皿上，其中含有40μg/ml X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-硫代半乳糖苷）和0.1mM IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），平皿于37℃下保温过夜。
第二天上午，用几个清晰的（与蓝色相衬）单个空斑接种2mlL液体培养基，产生的培养液于37℃下通气培养2小时。没有蓝色则表明发生了所需的DNA插入。然后离心培养液，将200μl所产生的上清液加至10ml于37℃通气培养的大肠杆菌K12 JM109培养物中（OD550＝0.5）。这些培养物于37℃下再保温30分钟。然后，离心沉淀细胞，并用来制备其中含有的复制型重组噬菌体。利用实例1所述方法缩小其规模，从细胞中分离双链复制型噬菌体DNA。通过限制性酶分析噬菌体DNA而鉴定含有噬菌体m13Tc3 DNA的转化体。
F（ⅱ）单链噬菌体m13Tc3    DNA的制备
使1.5ml大肠杆菌K12 JM109/m13Tc3的过夜培养物离心，用100μl含有噬菌体m13Tc3的上清液接种25ml OD660大约为0.4-0.5的大肠杆菌JM109培养液。培养液于37℃通气培养6小时，然后离心培养液，产生大约20ml上清液，转移至一个新管中。在上清液中加入大约2ml含有20%聚乙二醇（PEG）6000和14.6%NaCl的溶液，然后在冰上保温20分钟。
上清液以7000rpm离心25分钟，产生的沉淀含有单链噬菌体m13Tc3 DNA，使之再悬浮于500μl TE缓冲液中。DNA溶液用TE饱和的苯酚和氯仿各萃取2次。然后用NaOAc和乙醇沉淀单链DNA并离心。得到的沉淀用70%乙醇洗涤，干燥后溶于60μl H2O中。
F（ⅲ）诱变
用于诱变的单链DNA片段在自动化DNA合成仪上合成。该片 段的顺序为5′-CCCGTCCTGTGGATACTCTACGCCGA-3′，它同源于质粒pBR322四环素抗性基因中围绕BamHI位点（5′-GGATCC-3′）的区域，只是从5′端起的第2个A残基（或从3′端起第3个）在质粒pBR322中是C。此变化并不改变四环素抗性蛋白的氨基酸组成，但去掉了BamHI位点。
将约10微微摩尔诱变引物和M13普遍引物（Bethesda Research Laboratories（BRL），P.O.Box 6009，Gaithersburg，MD20760）分别用10单位（BRL）T4多核苷酸激酶在20μl1×激酶缓冲液（60mM Tris-HCl，pH7.8;15mM 2-巯基乙醇;10mM MgCl2;0.41μM ATP）中于37℃下处理30分钟。将用激酶处理的DNA用于下述诱变程序中。
使300ng（1.2μl）单链噬菌体m13Tc3、1微微摩尔（2μl）普遍引物、1微微摩尔（2μl）诱变引物、2μl    10×退火缓冲液（100mM    Tris-HCl，pH7.5;1mM    EDTA;500mM    NaCl）和12.8μl水在一起混合，进行退火反应。反应液于80℃下保温2分钟，于50℃下5分钟，然后使之冷却至室温。
在退火的DNA混合物中，加入5μl 10×延伸缓冲液（500mM Tris-HCl，pH8;1mM EDTA;120mM MgCl2）;5μl 2mM dATP;1μl含有dGTP、TTP、dCTP各6mM的溶液;1μl（～2单位，Pharmacia P-L Biochemicals，800 Centennial Avenue，Piscataway，NJ 08854）Klenow酶;1μl（100单位）T4 DNA连接酶和17μl水，进行延伸反应。延伸反应液于室温下保温1小时，然后于37℃ 下2.5小时，然后于4℃下过夜。
用TE饱和的苯酚萃取2次以终止反应。然后用CHCl3萃取2次。DNA用乙醇和NaOAc沉淀。离心收集DNA，再悬浮于50μl水中，然后在DNA溶液中加入6μl 10×S1缓冲液。
将DNA溶液均匀地分入三支管中。在2支管中加入大约200单位（Miles    Laboratories）S1核酸酶。1份S1反应液于室温下保温5分钟，另1份保温10分钟。反应混合物用TE饱和的苯酚萃取2次以终止反应。苯酚萃取以后用氯仿萃取2次;然后，用NaOAc和乙醇从反应混合物中沉淀DNA。未处理的DNA样品作为阴性对照。在剩下的所有步骤中，分别处理S1处理的样品，但它们产生相似的结果。
将DNA沉淀再悬浮于20μl水中，用10μl所产生的溶液转化大肠杆菌K12    JM109（也可使用大肠杆菌K12    JM101），转化根据构建噬菌体m13Tc3时所用方法进行，但在平皿中不加入IPTG或X-Gal。
如上述分离来自大约48个空斑的双链复制型DNA，筛选具有BamHI限制位点的DNA。如上述制备单链DNA。进一步筛选没有BamHI位点的分离物。利用双脱氧测序法（J.H.Smith，1980，Methods    in    Enzymology    65∶560-580）测定单链DNA顺序。所需的分离物称为pL110B（图8）。
G.质粒pL110C的构建
将约50μg复制型噬菌体pL110B DNA在250μl含有～50单位NheI限制性酶的1×NheI缓冲液（50mM NaCl;6mM Tris-HCl，pH7.5;6mM MgCl2;6mMβ-巯基乙醇） 中于37℃下消化2小时。然后，在NheI消化的噬菌体pL110B    DNA中加入5μl    5M    NaCl，然后加入5μl（～50单位）SalI限制性酶。于37℃下继续消化2小时。然后用丙烯酰胺凝胶分离所需的～422bp    NheI-SalI片段，它含有四环素抗性基因的突变区域。
在同样的条件下用NheI和SalI消化质粒pL110A    DNA，但用质粒pL110A取代噬菌体pL110B。用琼脂糖纯化质粒pL110A的～6.1kb    NheI-SalI限制片段。
利用常规方法，通过使pL110A的NheI-SalI片段（～6.1kb）和pL110B的NheI-SalI片段（～422bp）各100ng连在一起而构建所需的质粒pL110C。所需的质粒pL110C赋予大肠杆菌对于10μg/ml四环素的抗性，但在四环素抗性基因中没有BamHI位点。
H.质粒pCZR111的构建
通过使质粒pL110C的～3.5kb    EcoRI-PstI限制片段（含有完整的bGH编码顺序）与质粒pIT160的～3kb    EcoRI-PstI限制片段相连接而构建质粒pCZR111。质粒pIT160所含的～3.0kb    EcoRI-pstI限制片段是将质粒pL110C中的该片段插入用EcoRI-PstI消化的质粒pUC18（New    England    Biolabs）中而产生的。此3.0kb片段含有质粒pL110C的四环素抗性基因，但去掉了ClaI位点。在附图中，图9给出了pIT160的限制位点和功能图谱。质粒pIT160可基本上根据实例1所述方法从大肠杆菌K12    JM109/pIT160（中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC    No.M88025）中得到，该菌株可以NRRL    B-18185的寄存号从NRRL得到。质粒pIT160赋予 对于10μg/ml四环素的抗性，并缺乏ClaI限制位点。将质粒pIT160的四环素抗性基因在PstI-EcoRI限制片段上纯化出来，用于质粒pCZR111的构建。
将约50μg质粒pL110C的DNA（实例2G）在总体积为250μl的含有10μl（～50单位）EcoRI的1×EcoRI缓冲液中于37℃下保温2小时。然后加入1μl（～5单位）PstI限制性酶，于37℃下继续保温。每隔约5分钟取出等分试样用苯酚/CHCl3萃取。合并等分试样，混合物在琼脂糖凝胶上电泳。所需的～3.5kb EcoRI-PstI片段含有完整的bGH基因并包括一个内部PstI位点（在PstI部分消化时未被切断）。将所需片段从下述不需要的片段中分离出来：只有部分bGH基因的～2.5kb PstI-PstI片段;含有四环素抗性基因的～3kb EcoRI-PstI片段;以及～6.5kb的EcoRI片段（未被PstI消化）。纯化～3.5kb的PstI-EcoRI片段，使之与质粒pIT160的～3kb PstI-EcoRI片段连接。用连接的DNA转化大肠杆菌K12JM109，附图中的图10显示了称为pCZR111的所需质粒，将此质粒从转化体中分离出来并用常规方法鉴别其特征。质粒pCZR111也能以NRRL B-18249寄存号从NRRL得到。
I.质粒pCZR336的构建
质粒pCZR336是hGH的表达载体，由质粒pCZR111（实例2H）的XbaI-BamHI主干和质粒p1103（实例2D和图7）的二顺反子、hGH构建体构建而成。将约50μg质粒p1103在250μl含有BamHI和XbaI限制性酶各～50单位的1×高盐缓冲液中于37℃下保温2小时。用丙烯酰胺凝胶分离并纯化含有第 一顺反子和hGH编码顺序基因的～650bp    XbaI-BamHI片段。大约50μg质粒pCZR111（实例2H）也用XbaI和BamHI酶消化，用琼脂糖纯化大的XbaI-BamHI片段。将两个XbaI-BamHI限制片段连接在一起，用连接的DNA利用常规方法转化大肠杆菌K12    RV308（NRRL    B-15624）（中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC    No.M88029）。通过质粒分离及随后的限制性酶分析，从转化体中鉴定所需的质粒pCZR336（图11）。
J.质粒p1104的构建
质粒pCZR336是使用λpL启动子的表达载体。为了使DACS/DAOCS与质粒pCZR336中的λpL启动子连接，必须使用一个合成的DNA连接子。此连接子连接质粒pCZR336的NdeI位点和DACS/DAOCS编码顺序中的SstI位点，并具有下述结构：
Figure 881016446_IMG13
此连接子是用常规方法以两条分离单链的形式用自动化DNA合成仪合成的。此连接子与天然的头孢霉顺序具有若干差别，但都不影响由所产生的编码顺序编码的蛋白质。这些变化包括：1）产生一个含有翻译起始位点的NdeI位点;2）第10个密码子第3位由C至A的变化，CTA与CTC密码子一样编码亮氨酸，但产生一个XbaI位点;3）第5个密码子第3位由C至T的变化，GTT与GTC一样编码缬氨酸。
为了方便以后的克隆操作，首先将连接子克隆至质粒pUC19（New England Biolabs）中。将约5μg质粒pUC19溶于50μl含有～10单位SstI酶（BRL）的1×SstI缓冲液中（50mM NaCl;50mM Tris-HCl，pH7.5;10mM MgCl2）。 反应液于37℃下保温2小时。然后加入1μl    5M    NaCl，使反应混合物的NaCl浓度上升至150mM。加入大约2μl（10单位）NdeI酶，混合物于37℃下再保温2小时。然后使DNA沉淀并通过离心收集。
将约100ng    SstI-NdeI消化的质粒pUC19在含有T4    DNA连接酶的连接酶缓冲液中与1微微摩尔的合成连接子混合。用连接的DNA转化大肠杆菌K12    JM109细胞，将混合物的等分试样涂在L-琼脂（每升含15g琼脂的L液体培养基）平皿上，其中含有100μg/ml氨苄青霉素，40μg/ml    X-Gal，40μg/ml    IPTG。平皿于37℃保温过夜。在这些平皿上，含有不带插段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    JM109/pUC19）呈现蓝色。含有带插段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    JM109/p1104）呈现白色。选择出若干白色集落，并通过其质粒DNA的限制性分析，筛选与上述合成片段具有相同顺序的～60bp    NdeI-SstI片段的集落。所需构建体的一个代表性分离物称为质粒p1104（图13）。
K.质粒pIT507的最终构建
使质粒pIT503的含有DACS/DAOCS编码顺序的SstI-BamHI片段与质粒p1104的NdeI-SstI插段和用NdeI-BamHI切割的质粒pCZR336的主干相互连接，构建质粒pIT507。用BamHI进行完全消化并用SstI进行部分消化，得到质粒pIT503（实例1）的～2.2kb    SstI-BamHI限制片段（另一个SstI位点位于离所需的～2.2kb片段中的BamHI位点～50bp处）。
将约50μg质粒pIT503溶于250μl含有～50单位 BamHI的1×SstI缓冲液中，反应混合物置于37℃下2小时。然后加入1μl（～10单位）SstI酶，使反应于37℃下继续进行。每隔5分钟取出等分试样，用苯酚/CHCl3停止反应，使DNA沉淀下来并通过离心进行收集。用7%丙烯酰胺凝胶分离纯化含有大部分扩展酶/羟化酶编码顺序的～2.2kb SstI-BamHI片段。
将约50μg质粒pCZR336    DNA（实例2I）悬浮于250μl含有NdeI和BamHI限制性酶各约50单位的高盐缓冲液中，混合物置于37℃下2小时。然后，用琼脂糖凝胶分离质粒pCZR336的～5.8kb    NdeI-BamHI限制片段，它缺乏hGH编码顺序。
将约100μg质粒p1104（实例2J）悬浮于500μl含有大约100单位SstI酶的1×SstI缓冲液中，反应混合物置于37℃下2小时。然后通过加入10μl    5M    NaCl，使NaCl浓度从50mM上升至150mM。加入大约20μl（～100单位）NdeI酶，混合物于37℃下再保温2小时。用15%丙烯酰胺凝胶纯化所需的～60bp    NdeI-SstI片段。
用T4    DNA连接酶，使大约100ng质粒pCZR336的～5.8kb    NdeI-BamHI片段、～100ng质粒pIT503的～2.2kb    SstI-BamHI片段和～50ng质粒p1104的～60bp    SstI-NdeI片段相互连接。用连接的DNA利用常规方法转化大肠杆菌K12    JM109细胞，不同的是使细胞在30℃而不是在37℃下生长（以防止由λpL启动的转录）。将连接的DNA与100μl感受态JM109细胞（从Stratagene    Corp.，3770    Tansy    Street，San    Diego，CA92121购得）混 合，于4℃下保温1小时，然后于42℃保温1分钟，然后用2ml新鲜的L液体培养基稀释，于室温下保温1小时（不加摇动）。将等分试样涂在含有10μg/ml四环素的L琼脂平皿上。平皿于30℃下保温。通过用限制性酶分析其质粒DNA而鉴定大肠杆菌K12    JM109/pIT507转化体。在附图中，图11给出了质粒pIT507的限制位点和功能图谱。
实例3    检测大肠杆菌产生的DACS/DAOCS活性
A.培养用于表达DACS/DAOCS活性的大肠杆菌K12    JM109/pIT507
大肠杆菌K12    JM507转化体（实例2K）在500ml    L液体培养基（含有10μg/ml四环素）中于30℃下在旋转恒温器中以250rpm培养过夜。将100ml过夜培养物加至900ml在2.8升Fernbach培养瓶中的含有10μg/ml四环素的新鲜培养基中，从而以1∶10的比例使细胞稀释，在同样的生长条件下于30℃再培养1小时。然后使空气振荡器的温度升至42℃，再继续培养6.5小时。在42℃的温度下，用以驱动质粒pIT507上的DACS/DAOCS表达并对温度敏感的λpL启动子的c1857阻遏物失活，因此使DACS/DAOCS得以表达。诱导后，离心收集细胞，并作为大肠杆菌产生的DACS/DAOCS活性的优选来源使用。
B.测定生长于42℃的大肠杆菌K12    JM109/pIT507细胞中的扩展酶和羟化酶活性
将如实例3A所述制备的大约14g（湿重）大肠杆菌12K    JM109/pIT507细胞再悬浮于Tris-GEDA缓冲液（15mM    Tris-HCl，pH7.5;10%甘油;10%乙醇;10mM二硫苏糖醇;10mM抗坏 血酸）中，使总体积为20ml。在4℃或更低的温度下，以3次30秒的全功率冲击处理超声破碎细胞。进行声波处理时，多次加入苯基甲磺酰氟（PMSF），直至最终浓度为2mM。加入DNA酶和硫酸镁，使其浓度分别达到1μg/ml和2mM。声波处理的悬浮液以40，000×g离心30分钟。上清液提供了DACS/DAOCS酶的粗提液。
将体积为13ml的粗提液加到50ml    DEAE-三丙烯柱上，该柱预先用15mM    Tris-GEDA，pH7，5平衡。用4倍柱体积的15mM    Tris-GEDA缓冲液洗柱，然后使用0.015mM    Tris-GEDA至0.3mM    Tris-GEDA的线性梯度。以15ml/小时的流速收集5ml的各组分。酶作为一个主活力峰被洗脱;DAOCS（扩展酶）和DACS（羟化酶）活性以同样的保留时间被洗脱。
利用以HPLC为基础的检测法测定酶活。扩展酶催化的反应用0.28mM青霉素N，0.60mM    α-酮戊二酸（α-KG），0.06mM硫酸亚铁，0.67mM抗坏血酸，1.00mM二硫苏糖醇，0.05mM    ATP，0.0003-0.003单位在1ml    50mM    Tris-HCl    pH7.5中的酶于30℃下进行15分钟。羟化酶催化的反应在同样的基质中于36℃进行，但用浓度为0.05mM的脱乙酸基头孢菌素C代替青霉素N。
加入1ml乙醇中止酶促反应。以4，000×g离心5分钟分离沉淀。如下述用HPLC检测含有酶反应产物的上清液。通过监测由青霉素N形成DAOC和DAC的过程测定扩展酶活性，因为该酶具有表观的双重功能。通过监测由DAOC形成DAC的过程测定羟化酶活性。
利用外部标准用HPLC测定上清液试样（20-100μl）中 的DAOC和DAC。优选的HPLC系统含有如下成分：721型系统控制器，730型数据组件，510EF型泵，Model    710B    Waters智能型样品处理器（Intelligent    Sample    Processor）和Lambda-Max    Model    481    LC分光光度计（Waters    Assoc.，Milfor，MA）。DAC和DAOC最好通过辐射状装填并压缩的mico    Bondpak-NH4柱（0.8×10cm）（Waters    Assoc.）分离，流动相为2%乙酸;0.4%甲醇;6-7%乙腈;87-92%水;pH3.8。流速为1.5-2.0ml/分。在260nm处检测（头孢菌素生色团）。对于扩展酶和羟化酶二者催化的反应，双份样品的分析是可重复的，误差为2%。对于扩展酶的检测来说，DAC的定量（以及DAOC的定量）由于共洗脱的存在要对于青霉素N作出校正。下面概括了检测结果。
实例4    质粒pIT511的构建
质粒pIT507（实例2K）含有头孢霉基因组中位于DACS/DAOCS编码顺序的翻译终止位点下游的～1.4kb    DNA。为了减少此下游DNA的量，利用位于DACS/DAOCS编码顺序末端的翻译终止密码子下游的XbaI限制位点去掉此DNA中的除～120bp外的全部。
将约10μg质粒pIT503（实例1）在50μl含有～10单位XbaI限制性酶的1×Sst缓冲液中用XbaI限制性酶于37℃消化2小时。由XbaI切割留下的5′延伸的4bp由Klenow酶即DNA聚合酶大片段的作用补齐。然后使DNA在50μl1×SstI缓冲液中用10单位SstI于37℃消化2小时。然后在丙烯酰胺凝胶上按常规纯化～1.12kb    SstI-XbaI片段（已补齐）。
将约10μg质粒p1104（实例2J）悬浮于50μl含有SstI和BamHI限制性酶各约10单位的1×SstI缓冲液中，混合物于37℃保温2小时。BamHI的5′延伸端用Klenow酶补齐。
将约100ng质粒pIT503的XbaI（已补齐）-SstI片段与100ng    BamHI（已补齐）-SstI消化的质粒p1104混合，使混合物连接后转化至大肠杆菌K12    JM109中。所需的构建体称为质粒p1105（图14），将它从转化体中分离出来并通过限制性酶分析进行鉴定。质粒p1105特别有用，因为补齐的XbaI和BamHI末端的融合重新构建了BamHI位点（虽然XbaI位点被破坏），这是通过质粒p1105的构建而达到的。
将约50μg质粒p1105溶于250μl含有NdeI和BamHI限制性酶各约50单位的1×高盐缓冲液中，混合物于37℃保温2 小时。用丙烯酰胺凝胶纯化～1.1kb的NdeI-BamHI片段。大约100ng此纯化的片段与100ng质粒pCZR336（实例2K）的大NdeI-BamHI片段混合，混合物连接后转化至大肠杆菌K12    JM109中。通过限制性酶分析其质粒DNA而鉴定所需的大肠杆菌K12    JM109/pIT511转化体。在附图中，图15给出了质粒pIT511的限制位点和功能图谱。大肠杆菌K12    JM109/pIT511细胞可根据实例3所述方法用作DACS/DAOCS活性的来源。
实例5    质粒pIT513的构建
除了插入和缺失突变外，DACS/DAOCS基因产物的氨基酸组成和顺序可通过改变蛋白编码区中的碱基对而加以改变。如下所述，进行这种改变的途径之一是使用定位诱变法。此实例描述用丝氨酸残基取代半胱氨酸残基（野生型DACS/DAOCS编码顺序中的残基100）。
定位诱变的一般方法见实例2F所述。首先将目的基因克隆入m13噬菌体中，以提供单链DNA的方便来源。将约5μg    M13    mp18    DNA（New    England    Biolabs）在50μl含有～10单位BamHI酶的1×SstI缓冲液中于37℃保温2小时。
将约50μg质粒pIT511（实例4）在250μl含有BamHI和BglⅡ酶各50单位的1×SstI缓冲液中于37℃保温2小时。BglⅡ位点在表达载体pIT511的DACS/DAOCS编码顺序翻译起始密码子上游的5′非编码区中，BamHI位点在翻译终止密码子下游大约100bp处。用丙烯酰胺按常规纯化质粒pIT511的～1.1kb    BamHI-BglⅡ片段。
在100ng纯化的质粒pIT511的BamHI-BglⅡ片段中，加入大约100ng    BamHI消化的噬菌体M13    mp18    DNA。混合物连接后转化至大肠杆菌K12    JM109中。由所需的插入产生的质粒具 有这样定向的片段，即DACS/DAOCS编码顺序的5′端（BglⅡ位点）最邻近lacZ基因片段，而编码顺序的3′端（BamHI位点）最邻近于M13载体上的lacI基因。合适的分离物称为mIT113。
用于此实验的诱变引物是人工合成的，它具有下述顺序：
5′-TCGGACTACTCGACGAGCTACTCCATGGGCATC-3′
如实例2F所述鉴定含有上述顺序而不是野生型顺序的所需要的mIT113的衍生质粒，并测定其特性，将它称为mIT114。借助于在正确诱变的基因中产生一个新的AluI限制位点而鉴定所需的分离物。
将约10μg噬菌体mIT114    DNA溶于50μl含有BamHI和NdeI酶各约10单位的1×高盐缓冲液中，混合物于37℃保温2小时。用丙烯酰胺凝胶用常规方法分离～1.1kb    NdeI-BamHI片段，与NdeI-BamHI切割的质粒pCZR336混合，连接后转化至大肠杆菌K12    JM109中。通过限制性酶分析其质粒DNA而鉴定所需的大肠杆菌K12    JM109/pIT513转化体。质粒pIT513驱动DACS/DAOCS突变衍生物的表达，突变物在100位用丝氨酸残基置换了野生型顺序中的半胱氨酸残基。大肠杆菌K12    JM109/pIT513是此突变蛋白的一个优选来源。
实例6    质粒pPS56和pPS55的构建
质粒pPS56是顶头孢霉表达载体，它赋予潮霉素B抗性并含有顶头孢霉DACS/DAOCS基因。用质粒pMLC12（NRRL    B-18097）、质粒pIT503（实例1A）和质粒pPS34构建质粒pPS56。质粒pPS34公开于200425号欧洲专利公开中，此文列为本文的 参考文献。
A.中间质粒pPS55的构建
将约5μg质粒pMLC12（图18，NRRL    B-18097）溶于5μl    10×HindⅢ缓冲液和40μl水中。在DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶HindⅢ，得到的反应液于37℃保温2小时。用缓冲的苯酚进行萃取以终止反应，然后用氯仿萃取。调整NaCl浓度至0.25M，加入2倍体积的冷乙醇，并在-70℃冷冻10分钟，使HindⅢ消化的pMLC12质粒DNA沉淀。离心收集HindⅢ消化的质粒pMLC12DNA并悬浮于5μl水中。
质粒pPS34的～2.3kb    HindⅢ限制片段含有顶头孢霉异青霉素N合成酶的启动子，它与赋予潮霉素B抗性的大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因的编码顺序相连接，将约10μg质粒pPS34（图19）用限制性酶HindⅢ于37℃消化2小时。然后将反应混合物加至0.8%琼脂糖凝胶上，分离出所需的～2.3kb的HindⅢ限制片段，它含有顶头孢霉IPS基因的启动子，该启动子与编码潮霉素抗性编码顺序相连接并位于该顺序的框架之中。回收到大约1μg所需片段，悬浮于5μl水中。
在4μl质粒pPS34的～2.3kb    HindⅢ限制片段中，加入1μl    HindⅢ消化的质粒pMLC    12    DNA，并一同加入2μl10×连接酶缓冲液、2μl    T4    DNA连接酶和11μl水。得到的连接反应液于15℃保温过夜。连接的DNA构成所需的质粒pPS55及其他有关连接产物。
用连接混合物转化大肠杆菌K12 JM109（Pharmacia P-L Biochemicals）。细胞生长至OD590为～0.5吸收单位。培 养物在冰上冷冻10分钟，离心收集细胞。细胞沉淀再悬浮于25ml冷的100mM CaCl2中，然后在冰上保温25分钟。再次离心沉降细胞，沉淀再悬浮于2.5ml冷的100mM CaCl2中并于冰上保温过夜。
将200μl此细胞悬浮液与上述制备的连接DNA混合，于冰上保温20分钟。此阶段结束后，将细胞置于42℃水浴中2分钟，然后放回冰上再保留10分钟。离心收集细胞，再悬浮于1μl    L液体培养基中，于37℃保温2小时。
将细胞混合物的等分试样涂在L琼脂平皿上，其中含有25μg/ml氯霉素、40μg/ml    X-Gal和40μg/ml    IPTG。平皿于37℃保温过夜。含有不带插段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    JM109/pMLC12）在这些平皿上呈现蓝色。含有带有一个插段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    JM109/pPS55）在这些平皿上呈现白色。选择若干白色集落，通过用限制酶分析其质粒DNA，筛选具有含有顶头孢霉IPS启动子的～2.3kb    HindⅢ限制片段的集落，此片段连接于潮霉素抗性基因编码顺序。基本上根据实例1的方法，大规模制备质粒pPS55（图24）。
B.质粒pPS56的最终构建
质粒pIT503的～7.0kb    BamHI限制片段含有顶头孢霉DACS/DAOCS基因。将约20μg质粒pIT503（实例1）溶于5μl    10×BamHI缓冲液和40μl水中。在DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶BamHI，得到的溶液于37℃保温2小时。然后将反应混合物加到0.8%制备型琼脂糖凝胶中，分离所需的含有DACS/DAOCS基因的～7.0kb    BamHI限制片段。 回收到大约3μg所需片段并悬浮于5μl水中。
将约15μg质粒pPS55（实例6A）溶于5μl    10×BamHI缓冲液和40μl水中。在DNA溶液中加入大约5μl（约50单位）限制性酶BamHI，得到的反应液于37℃保温3分钟。用缓冲的苯酚进行萃取以终止反应，然后用氯仿萃取。将BamHI部分消化的质粒pPS55    DNA加至0.8%制备型琼脂糖凝胶上，分离所需的～5.0kb的线性DNA。回收到大约3μg    BamHI线性化的质粒pPS55    DNA。用BamHI部分消化而产生的线性分子，代表质粒pPS55的大约等量的两种可能形式的线性片段。切割潮霉素B磷酸转移酶（HmR）基因中的BamHI位点而产生的线性片段是不需要的分子。所需分子通过切割质粒pPS55中CAT和HmR基因间的BamHI而形成。
在大约4μl质粒pIT503的～7.0kb    BamHI限制片段中，加入1μl    BamHI消化的质粒pPS55    DNA，并一同加入2μl    10×连接酶缓冲液、2μl    T4    DNA连接酶和11μl水。得到的连接反应液于15℃保温过夜。连接的DNA构成所需的质粒pPS56和其他有关连接产物。
用此连接混合物转化大肠杆菌K12    C600（ATCC    33524）。将转化的细胞混合物的等分试样涂在含有25μg/ml氯霉素的L琼脂平皿上。平皿于37℃保温过夜。基本上根据Eckardt的方法（Eckardt，T.，1978，细菌中质粒DNA的快速鉴定方法。Plasmid    1∶584-588），从含有带有一个插入片段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    C600/pPS56）中，分辨出含有不带插入片段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    C600/pPS55）。鉴别出若干 含有插段的质粒，通过限制酶分析进一步筛选，看是否存在含有顶头孢霉DACS/DAOCS基因并插入合适的BamHI位点的～7.0kb    BamHI限制片段，得到质粒pPS56。基本上根据实例1的方法，大规模制备质粒pPS56（图25）。
实例7    质粒pPS51的构建
将约15μg质粒pMLC12    DNA（NRRL    B-18097）溶于5μl    10×EcoRI缓冲液和40μl水中。在DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶EcoRI，得到的反应液于37℃保温3分钟以进行部分消化。用缓冲的苯酚进行萃取以终止反应，然后用氯仿萃取。质粒pMLC12含有两个EcoRI限制位点。所需的EcoRI位点的部分切割应发生于lacZα片段中，而不是在CAT基因中。这种EcoRI消化产生质粒pMLC12    DNA分子的一种混合物：未切割的;在不期望的位点切割的;在所需的位点切割的;在这两个位点切割的，产生全长小于～2.7kb的分子片段。使EcoRI消化的质粒pMLC12    DNA沉淀，离心收集，溶于5μl    TE缓冲液中，加在0.8%制备型琼脂糖凝胶上。分离完整长度的线性分子（即～2.7kb）。
将EcoRI部分消化的质粒pMLC12    DNA溶于5μl    10×SalI缓冲液和40μl水中。在EcoRI线性化的质粒pMLC12    DNA中加入大约5μl（～50单位）限制性酶SalI，得到的反应液于37℃保温2小时。质粒pMLC12中唯一的SalI限制位点位于离质粒pMLC12的lacZα。片段中EcoRI位点24碱基对处。因此，EcoRI部分消化的质粒pMLC12    DNA用SalI进行完全消化产生四种DNA片段：一个～2.7kb，即所需分子;一个长度为～24 bp;一个～0.6kb;一个～1.9kb。在0.8%琼脂糖凝胶上使DNA分子按大小分级分离。分离出接近完整长度的～2.7kb线性分子。
从质粒p3SR2的～5.0kb    EcoRI-SalI限制片段中，可分离出构巢曲霉的乙酰胺酶基因。将约10μg质粒p3SR2（图17，NRRL    B-18182）溶于5μl    10×EcoRI缓冲液和40μl水中。在此DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶EcoRI，产生的反应液于37℃保温2小时。用缓冲的苯酚进行萃取以终止反应，然后用氯仿萃取。使EcoRI消化的p3SR2质粒DNA沉淀，离心收集，再悬浮于5μl    10×SalI缓冲液和40μl水中。在DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶SalI，得到的反应液于37℃保温2小时。在0.8%制备型琼脂糖凝胶上按大小分级分离消化产生的两种DNA片段。一个～4.3kb的片段含有pBR322    DNA，另一个～5.0kb的片段含有构巢曲霉的乙酰胺酶（amdS）基因。分离～5.0kb的EcoRI-SalI片段。回收到大约3μg～5.0kb的EcoRI-SalI片段，悬浮于5μl水中。
在大约4μl质粒p3SR2的～5.0kb    EcoRI-SalI限制片段中，加入1μl    EcoRI-SalI消化的质粒pMLC12    DNA，并一同加入2μl    10×连接酶缓冲液、2μl    T4    DNA连接酶和11μl水。得到的连接反应液于15℃保温过夜。连接的DNA构成所需质粒pPS51和其他有关的连接产物。
用此连接混合物转化大肠杆菌K12    C600（ATCC    33524）。将转化细胞混合物的等分试样涂在含有25μg/ml氯霉素的L琼脂平皿上。平皿于37℃保温过夜。基本上根据Eckardt的方法， 从含有带有一个插入片段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    C600/pPS51）中，鉴别出含有不带插入片段的质粒的集落[例如大肠杆菌K12    C600/pMLC12）（中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC    No.M88030）]。鉴别到一个含有带插段的质粒的集落。通过限制性分析筛选来自此集落的质粒DNA，看是否存在含有构巢曲霉需质amdS基因的～5.0kb    EcoRI-SalI限制片段并具有所需质粒：pPS51的正确结构。基本上根据实例1的方法大规模制备质粒能pPS51。在附图中，图20给出了质粒pPS51的限制位点和功能图谱。
实例8    质粒pPS52的构建
将约5μg质粒pPS51    DNA（实例7）溶于5μl    10×HindⅢ缓冲液和40μl水中。在此DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶HindⅢ，得到的反应液于37℃保温2小时。用缓冲的苯酚进行萃取以终止反应，然后用氯仿萃取。使HindⅢ消化的质粒pPS51    DNA沉淀，离心收集，悬浮于5μl水中。
使用自动化DNA合成仪合成下述连接子的单链：
Figure 881016446_IMG15
将约75微微摩尔此连接子的每条单链分别溶于22.5μl水和2.5μl连接酶缓冲液中。每种单链DNA分子的溶液中加入大约1μl（10单位）T4    DNA激酶（BRL），反应液于37℃保温30分钟。激酶反应以后，反应混合物于70℃保温15分钟使激酶失活。然后，为了使单链DNA分子退火以形成连接子，合并两个反应混合物，于65℃保温10分钟，于室温下保温大约2小时，然 后于4℃下保温过夜。
在4μl质粒pIT503（实例6B）的～7.0kb    BamHI限制片段和10μl退火的连接子中，加入1μl    HindⅢ消化的质粒pPS51    DNA。在此DNA混合物中，加入大约4μl    10×连接酶缓冲液、2μl    T4    DNA连接酶和29μl水，得到的反应液于4℃保温过夜。连接的DNA构成所需的质粒pPS52。
用此连接的DNA转化大肠杆菌k12    C600（ATCC    33524）。将转化细胞混合物的等分试样涂在含有25μg/ml氯霉素的L琼脂平皿上。平皿于37℃保温过夜。基本上根据Eckardt的方法，从含有带有一个插入片段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    C600/pPS52）中，鉴别出含有不带插入片段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    C600/pPS51）。鉴别到若干含有带有所需插入片段的质粒的集落。通过用限制性酶分析其质粒DNA而筛选这些集落，看是否存在含有顶头孢霉DACS/DAOCS基因的～7.0kb    BamHI限制片段，而且该基因是插在质粒pPS51的CAT和amdS基因之间的HindⅢ位点中。基本上根据实例1的方法，大规模制备质粒pPS52。在附图中，图21给出了质粒pPS52的限制位点和功能图谱。
实例9    质粒pPS53的构建
将约5μg    pMLC12质粒DNA（NRRL    B-18097）溶于5μl    10×BamHI缓冲液和40μl水中。在DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶BamHI，得到的反应液于37℃保温2小时。用缓冲的苯酚进行萃取以终止反应，然后用氯仿萃取。使BamHI消化的质粒pMLC12    DNA沉淀，离心收集，再悬浮于5μl水中。
从质粒pLC1的～1.0kb NcoI限制片段中，可分离出产黄青霉异青霉素N合成酶基因的启动子。将约10μg质粒pLC1（NRRLB-18181）溶于5μl 10×NcoI缓冲液（1.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH7.9;60mM MgCl2;1mg/ml BSA）和40μl水中。在DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶NcoI，得到的反应液于37℃保温2小时。然后将反应混合物加至0.8%琼脂糖凝胶上，分离出含有产黄青霉IPS基因启动子的所需的～1.0kb NcoI限制片段。回收到大约2μg所需片段，溶于5μl水中。
利用自动化DNA合成仪合成下述连接子的单链：
Figure 881016446_IMG16
此连接子的每条单链用T4    DNA激酶处理，然后退火形成完整的连接子。
在4μl质粒pLC1的～1.0kb    NcoI限制片段和10μl上述退火的连接子中，加入1μl    BamHI消化的质粒pMLC12    DNA。在此DNA混合物中，加入大约4μl    10×连接酶缓冲液、2μl    T4    DNA连接酶和29μl水，得到的反应液于4℃保温过夜。连接的DNA构成所需的质粒pPS53。
用连接的DNA转化大肠杆菌K12    JM109。将转化细胞混合物的等分试样涂在含有25μg/ml氯霉素、40μg/ml    X-Gal和40μg/ml    IPTG的L琼脂平皿上。平皿于37℃保温过夜。含有不带插入片段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    JM109/pMLC 12）在这些平皿上呈现蓝色。含有带有一个插入片段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    JM109/pPS53）在这些平皿上呈现白色。选择若干白色集落，通过其质粒DNA的限制性分析进行筛选，看是否存在含有产黄青霉异青霉素N合成酶基因启动子的～1.0kb限制片段，而且该启动子现与BamHI限制位点相连。基本上根据实例1的方法大规模制备质粒pPS53。在附图中，图22给出了质粒pPS53的限制位点和功能图谱。
实例10    质粒pPS54的构建
产黄青霉异青霉素N合成酶基因可从质粒pLC2的～3.3kb    HindⅢ限制片段中分离。将约10μg质粒pLC2（ATCC    53334）溶于5μl    10×HindⅢ缓冲液和40μl水中。在DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶HindⅢ，得到的反应液于37℃保温2小时。然后将反应混合物加至0.8%琼脂糖凝胶中，分离出所需的含有产黄青霉IPS基因的～3.3kb    HindⅢ限制片段。回收到大约1μg所需片段，悬浮于5μl水中。
在4μl质粒pLC2的～3.3kb    HindⅢ限制片段中，加入1μl    HindⅢ消化的质粒pPS51    DNA（实例8），并一同加入2μl    10×连接酶缓冲液、2μl    T4    DNA连接酶和11μl水。得到的连接反应液于15℃保温过夜。连接的DNA构成了所需质粒pPS54和其他有关的连接产物。
用此连接混合物转化大肠杆菌K12    C600（ATCC    33524）。将转化细胞混合物的等分试样涂在含有25μg/ml氯霉素的L琼脂平皿上。平皿于37℃保温过夜。基本上根据Eckardt的方法，从含有插段的集落（如大肠杆菌K12    C600/pPS54）中，鉴别出 含有不带插段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    C600/pPS51）。鉴别出若干含有带有插段的质粒的集落。通过限制性酶分析筛选这些含有插段的质粒，看是否存在质粒pLC2的～3.3kb    HindⅢ片段。基本上根据实例1的方法大规模制备质粒pPS54。在附图中，图23给出了质粒pPS54的限制位点和功能图谱。
实例11    质粒pPS57的构建
将约10μg质粒pPS55（实例6）溶于5μl    10×BamHI缓冲液和40μl水中。在DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶BamHI，得到的反应液于37℃保温2小时。然后将反应混合物加至0.8%琼脂糖凝胶上，分离出所需的含有HmR基因编码顺序的～4.3kb    BamHI限制片段。回收到大约1μg所需片段，悬浮于5μl水中。
质粒pPS53（实例9）的～1.0kb    BamHI片段含有产黄青霉异青霉素N合成酶基因的启动子。将10μg质粒pPS53溶于5μl    10×BamHI缓冲液和40μl水中，分离此片段。在此DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶BamHI，得到的反应液于37℃保温2小时。然后将反应混合物加至0.8%琼脂糖凝胶上，分离出所需的～1.0kb    BamHI限制片段。回收到大约1μg所需片段，悬浮于5μl水中。
在大约4μl质粒pPS53的～1.0kb    BamHI限制片段中，加入1μl质粒pPS55的～4.3kb    BamHI片段，并一同加入2μl    10×连接酶缓冲液、2μl    T4    DNA连接酶和11μl水。得到的连接反应液于15℃保温过夜。连接的DNA构成了所需质粒pPS57和其他有关的连接产物。
用此连接混合物转化大肠杆菌K12    C600（ATCC    33524）。将转化细胞混合物的等分试样涂在含有25μg/ml氯霉素的L琼脂平皿上。平皿于37℃保温过夜。基本上根据Eckardt的方法，从含有质粒pPS57的集落中分辨出含有不带插入片段的集落。鉴别到若干含有带插入片段质粒的集落。通过限制性分析筛选这些质粒，看是否存在含有产黄青霉IPS基因启动子的～1.0kb    BamHI限制片段，而且该启动子位于驱动HmR表达的位置上。基本上根据实例1的方法大规模制备质粒pPS57。在附图中，图26给出了质粒pPS57的限制位点和功能图谱。
实例12    质粒pPS60的构建
将约5μg质粒pIT511（实例4）溶于5μl 10×BglⅡ缓冲液（1.0M NaCl;100mM Tris-HCl，pH7.4;100mM MgCl2;100mM2-巯基乙醇;1mg/ml BSA）和40μl水中。在此DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶BglⅡ，得到的反应液于37℃保温2小时。用缓冲的苯酚进行萃取以终止反应，然后用氯仿萃取。使BglⅡ消化的质粒pIT511DNA沉淀，离心收集，再悬浮于5μl水中。
在约4μl质粒pPS53（实例12）的～1.0kb    BamHI限制片段中，加入1μl    BglⅡ消化的质粒pIT511    DNA，并一同加入2μl    10×连接酶缓冲液、2μl    T4    DNA连接酶和11μl水。得到的连接反应液于15℃保温过夜。连接的DNA构成了所需质粒pPS60和其他有关的连接产物。
用连接的DNA转化大肠杆菌K12    C600（ATCC    33524）。将转化细胞混合物的等分试样涂在含有15μg/ml四环素的L琼 脂平皿上。平皿于30℃保温过夜。基本上根据Eckardt的方法，从含有带插段质粒的集落（如大肠杆菌K12    C600/pPS60）中，分辨出含有无插段质粒的集落（例如大肠杆菌K12    C600/pIT511）。鉴别出若干含有带插段质粒的集落。通过限制性分析筛选这些带插段的质粒，看是否存在含有产黄青霉IPS基因启动子的限制片段，并且位于如pPS60所示的正确取向上。基本上根据实例1的方法大规模制备质粒pPS60。在附图中，图29给出了质粒pPS60的限制位点和功能图谱。
实例13    质粒pPS58的构建
将约5μg质粒pPS60（实例12）溶于5μl 10×XbaI缓冲液（500mM NaCl;60mM Tris-HCl，pH7.9;60mM MgCl2;1mg/ml BSA）和40μl水中。在DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶XbaI，得到的反应液于37℃保温2小时。用XbaI消化pPS60质粒DNA产生三种DNA片段：一个～7.9kb片段和两个较小的片段（在300bp以下）。消化反应液加在0.8%制备型琼脂糖凝胶上。分离～7.9kb片段，回收到大约3μg并悬浮于5μl水中。
将约0.5μg质粒pPS60的～7.9kb    XbaI限制性片段溶于10μl    10×连接酶缓冲液、4μl    T4    DNA连接酶和86μl水中。得到的连接反应液于15℃保温过夜。连接的DNA构成了所需质粒pPS58。
用连接的DNA转化大肠杆菌K12    C600（ATCC    33524）。将转化细胞混合物的等分试样涂在含有15μg/ml四环素的L琼脂平皿上。平皿于30℃保温过夜。回收到若干TcR集落，用限制 性酶分析其质粒DNA，看是否没有具有质粒pPS60特征的两个小XbaI片段。基本上根据实例1的方法大规模制备质粒pPS58。在附图中，图27给出了质粒pPS58的限制位点和功能图谱。
实例14    质粒pPS59的构建
将约5μg质粒pPS58    DNA（实例13）溶于5μl    10×XbaI缓冲液和40μl水中。在此DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶XbaI，产生的反应液于37℃保温2小时。用缓冲的苯酚进行萃取以终止反应，然后用氯仿萃取。使XbaI消化的质粒pPS58    DNA沉淀，离心收集，再悬浮于5μl水中。
利用自动化DNA合成仪合成下述连接子的单链：
连接子的每条单链分别用T4    DNA激酶处理，然后退火形成完整的连接子。
将1μl    XbaI消化的质粒pPS58    DNA加至10μl退火连接子中。在此DNA混合物中加入大约4μl    10×连接酶缓冲液、2μl    T4    DNA连接酶和29μl水，得到的反应液于4℃保温过夜。连接的DNA构成所需质粒pPS59。
用连接的DNA转化大肠杆菌K12    C600（ATCC    33524）。将转化细胞混合物的等分试样涂在含有15μg/ml四环素的L琼脂平皿上。平皿于37℃保温过夜。用限制性酶分析其质粒DNA以检查是否存在连接子分子，从而将含有不带插段的质粒的集落（例如大肠杆菌K12    C600/pPS58），从含有带插段质粒的集落（例如 大肠杆菌K12    C600/pPS59）中分辨出来。根据实例1的方法，从含有质粒pPS59（带有正确定向的连接子）的转化体中大量制备质粒。在附图中，图28给出了质粒pPS59的限制位点和功能图谱。
实例15    质粒pPS61的构建
将约5μg    HindⅢ消化的质粒pPS51    DNA（实例8）溶于25μl反应混合物中，其中含有Klenow反应缓冲液，所有四种dNTP（dATP、TTP、dGTP和dCTP）和2单位DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段。此反应混合物于22℃保温30分钟。用缓冲的苯酚进行萃取以终止反应，然后用氯仿萃取。使HindⅢ消化并经Klenow处理的DNA沉淀，离心收集，再悬浮于5μl水中。
将约5μg质粒pPS59（实例14）溶于5μl    10×BamHI缓冲液和40μl水中。在此DNA溶液中加入大约5μl（～50单位）限制性酶BamHI，得到的反应液于37℃保温2小时。用BamHI消化质粒pPS59    DNA产生单一的～8.0kb线性片段。用缓冲的苯酚进行萃取以终止反应，然后用氯仿萃取。沉淀BamHI消化的质粒pPS59    DNA并离心收集。
将BamHI消化的质粒pPS59    DNA溶于25μl反应混合物中，其中含有Klenow反应缓冲液，所有四种dNTP（dATP、TTP、dGTP和dCTP）和2单位DNA聚合酶I的Klenow片段。反应混合物于22℃保温30分钟。用缓冲的苯酚进行萃取以终止反应，然后用氯仿萃取。沉淀经BamHI消化和Klenow处理的质粒pPS    59    DNA，离心收集，再悬浮于5μl水中。
将上述经BamHI消化和Klenow处理的质粒pPS59    DNA加至5μl    10×NruI缓冲液和35μl水中。在此DNA溶液中加 入大约5μl（～50单位）限制性酶NruI，得到的反应液于37℃保温2小时。用NruI消化此DNA产生两种限制片段，一个～2.1kb片段和一个～5.9kb片段。反应混合物加至0.8%制备型琼脂糖凝胶中，分离出～2.1kb的片段。此～2.1kb片段含有DACS/DAOCS编码顺序，此顺序在产黄青霉异青霉素N合成酶基因启动子和翻译活化顺序的调控下。回收到大约1μg片段，溶于5μl水中。
将1μl经HindⅢ消化和Klenow处理的质粒pPS51    DNA加至5μl上述分离的～2.1片段中。在此DNA混合物中加入大约2μl    10×连接酶缓冲液、2μl    T4    DNA连接酶和12μl水，得到的反应液于15℃保温过夜。连接的DNA构成所需质粒pPS61。
用连接的DNA转化大肠杆菌K12    C600（ATCC    33524）。将转化细胞混合物的等分试样涂在含有25μg/ml氯霉素的L琼脂平皿上。平皿于37℃保温过夜。基本上根据Eckardt的方法，从含有带插段质粒的集落（如大肠杆菌K12    C600/pPS61）中，分辨出含有无插段质粒的集落（如大肠杆菌K12    C600/pPS51）。鉴别出若干含有带插段质粒的集落。通过限制性酶分析筛选这些带插段的质粒，看是否存在所需的～2.1kb限制片段。基本上根据实例1的方法大规模制备质粒pPS61。在附图中，图30给出了质粒pPS61的限制位点和功能图谱。
实例16    质粒pPS62的构建
将约5μg质粒pPS57（实例11）溶于5μl    10×HindⅢ缓冲液和40μl水中。在此DNA溶液中加入大约5μl（～50 单位）限制性酶HindⅢ，得到的反应液于37℃保温2小时。然后，用缓冲的苯酚和氯仿萃取反应混合物。用HindⅢ消化质粒pPS57产生单一的～5.3kb线性片段。沉淀HindⅢ消化的质粒pPS57    DNA并离心收集。
将HindⅢ消化的质粒pPS57    DNA溶于25μl反应混合物中。其中含有Klenow反应缓冲液，所有四种dNTP（dATP、TTP、dGTP和dCTP）和2单位DNA聚合酶1的Klenow片段。反应混合物于22℃保温30分钟。然后用缓冲的苯酚萃取反应混合物，然后用氯仿萃取。沉淀经HindⅢ消化和Klenow处理的质粒pPS57    DNA，离心收集，再悬浮于5μl水中。
将1μl经HindⅢ消化和Klenow处理的质粒pPS57DNA加至5μl如上面实例15所述由pPS59分离的～2.1kb片段中。在此DNA混合物中加入大约2μl    10×连接酶缓冲液、2μl    T4    DNA连接酶和12μl水，得到的反应液于15℃保温过夜。连接的DNA构成所需的质粒pPS62。
用连接的DNA转化大肠杆菌K12    C600（ATCC    33524）。将转化细胞混合物的等分试样涂在含有25μg/ml氯霉素的L琼脂平皿上。平皿于37℃保温过夜。基本上根据Eckardt的方法，从含有带插段质粒的集落（如大肠杆菌K12    C600/pPS62）中，辨别出含有无插段质粒的集落（如大肠杆菌K12    C600/pPS57）。鉴别出若干含有带插段质粒的集落。通过限制性分析筛选这些带插段的质粒，看是否存在含有所需～2.1kb插段的限制片段。基本上按照实例1的方法大规模制备质粒pPS62。在附图中，图31给出了质粒pPS62的限制位点和功能图谱。
实例17    用质粒p3SR2、pPS52和pPS54进行产黄青霉的基因转化
A.产黄青霉菌株
用于转化的较好的青霉菌株以寄存号ATCC    9480得自ATCC（Rockville，MD    20852）。其他产黄青霉菌株，或任何为了改善青霉素G或青霉素V的生产而通过突变、选择或遗传育种由ATCC    9480衍生的商业菌株，也适用于用本发明的载体和质粒制备转化体。
B.制备用于细胞培养的均一接种物
为了有效地转化产黄青霉细胞，必须去掉细胞壁以形成稳定的原生质体。制备这种原生质体最好以均一的接种物开始。不然，通过培养而制备细胞就无法重复，如果企图从不合适的或数量不足的细胞中制备产黄青霉原生质体则会浪费时间。
将冷冻干燥或液体 贮存的1安瓿营养细胞（在1.0ml贮存溶媒中～109集落形成单位：5%乳糖、10%甘油和0.1%吐温80）于室温下融化，稀释至1.0ml无菌盐溶液中。大约10个孢子形成培养基斜面每个用大约0.1ml此悬浮液接种，培养基组成为：乳糖，15.0g/L;玉米浸液，2.5g/L;蛋白胨，5.0g/L;NaCl，4.0g/L;MgSO4·7H2O，0.5g/L;KH2PO4，0.6g/L;FeCl3·6H2O，0.005g/L;CuSO4·5H2O，0.002g/L;调pH至7.0;琼脂，30.0g/L;以120磅/吋2高温灭菌20分钟。
每个斜面（15cm×2.5cm）含有25ml固化培养基。接种物均匀地涂布于琼脂斜面的表面，使之于25℃生长，直至出现一片绒状的菌丝体并形成孢子为止（大多数菌株为1周）。将来自一 个斜面的生长物悬浮于10ml无菌培养液中，悬浮液转移至106ml培养液中，将含有悬浮细胞的培养瓶置于旋转摇床上，于25℃下以258rpm培养18小时，偏心距为1英寸。
培养液制备如下：将100ml溶液A（蔗糖，36g/L;L-门冬酰胺，7.5g/L;KH2PO4，15g/L;K2HPO4，21g/L;NaSO4，0.75g/L;MgSO4·7H2O，0.18g/L;CaCl2，0.06g/L;盐溶液，1ml/L;自然pH）倒入500ml摇瓶中;瓶子用市售盖子盖住，于121℃下高温灭菌20分钟。然后，在溶液A中加入2ml溶液B（葡萄糖，108g/L）和4ml溶液C（蔗糖，25g/L;玉米浸液（4%W/V氮），12.5ml;乙酸铵，5.5g/L;CaCO3，5g/L;pH用KOH调至6.5;121℃高温灭菌20分钟），这样便制得了液体培养基。
C.青霉原生质体的制备
通过吸滤收集来自24小时培养物的细胞（Whatman 1号滤纸，在布氏漏斗中），悬浮于缓冲液中（0，01M三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐;0.01M MgSO4;0.01M二硫苏糖醇;1.00M KCl;pH7.0，用HCl调节）。加入足够的缓冲液使最终的细胞浓度为每50ml缓冲液1g细胞量。将细胞悬浮液装在250ml摇瓶中，将它置于旋转式水浴摇床中于29-30℃以140rpm培养10分钟，偏心距为1英寸。离心收集二硫苏糖醇处理的细胞，然后再悬浮在250ml摇瓶中的50ml酶液中（10mg/ml Novozym，Novo industri A/B.Bagsvaerd，Denmark;0.01M三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐;0.01M MgSO4;0.01M二硫苏糖醇;1.00M KCl;pH5.8，用HCl调节）。将此细胞悬浮液置 于旋转式水浴摇床中于29-30℃以140rpm培养15分钟。偏心距为1英寸。将酶处理的细胞以1240×g离心6分钟，产生的沉淀再悬浮于缓冲液中（0.01M三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐;0.01M MgSO4;1.00M KCl;pH7.0，用HCl调节）。悬浮液首先以950×g离心6分钟。产生的沉淀再悬浮于同样的缓冲液中，悬浮液以700×g离心6分钟。产生的沉淀再悬浮于5ml同样的缓冲液中。此悬浮液主要含有大原生质体和存留某些细胞壁结构的渗透脆性细胞。与通过上述程序去掉的小原生质体相比较，对于最终悬浮液中的大原生质体和渗透脆性细胞来说，能再生细胞壁的原生质体的百分比和能存活的渗透稳定性细胞的百分比要更高。细胞悬浮液用缓冲液稀释至浓度为～2×108细胞/ml。
D.转化方法
对于每一种转化质粒，在～0.1ml渗透脆性的产黄青霉细胞悬浮液（约2×107细胞）中加入10μl 50mM CaCl2，25μg在5-15μl TE缓冲液中的质粒DNA、0.9ml新溶解的聚乙二醇4000溶液（Baker，40%重量/体积，在渗透稳定的缓冲液中）。搅动混合物，室温下放置10分钟，以700×g离心2分钟，再次搅动。然后，将每份0.5ml的两份试样涂于渗透稳定的乙酰胺培养基表面（1.7g/L没有氨基酸和硫酸铵的Yeast Nitrogen Base;125g/L蔗糖，0.738g/L乙酰胺;1.27g/L CaCl2，22g/L Noble琼脂）。为了测量转化混合物中存活细胞的总数，将转化混合物的等分试样涂布于用等摩尔硫酸铵取代乙酰胺的培养基上。转化7至10天后，在乙酰胺培养基上出现了其大小足以进行继代培养的转化体集落。流产转化体很容易从稳 定转化体中分辨出来，因为流产转化体在继代培养时不能在新鲜乙酰胺培养基上生长。转化后四至五天内，用含有乙酰胺酶基因的质粒转化的细胞形成可见的集落。
E.产黄青霉/p3SR2、产黄青霉/pPS52和产黄青霉pPS54转化体的分析
产黄青霉/p3SR2、产黄青霉/pPS52和产黄青霉/pPS54转化体表达乙酰胺酶活性，此活性在未转化的产黄青霉受体菌株（如ATCC    9480）的提取物中检测不到。没有其他氮源时，此活性使转化菌株能够利用乙酰胺水解释放的氨生长。转化体以乙酰胺作为唯一氮原生长的能力表明，构巢曲霉的乙酰胺酶基因在产黄青霉中能够行使功能。
稳定的转化体在其高分子量DNA中携有转化DNA。探针如质粒pBR322或含有乙酰胺酶基因的曲霉DNA片段，可与来自这些转化体的高分子量DNA杂交，即使在非选择性培养基（以氨作为氮源）中多次传代后也是这样。在非选择性培养基上传代以后，转化体还保留其转化表型（以乙酰胺作为唯一氮源而生长的能力）。
含有乙酰胺酶基因的质粒特别适于作为将基因插入产黄青霉中的载体，因为无需构建特别的受体菌株，例如营养缺陷型，这是由于产黄青霉天然不能以乙酰胺作为唯一氮源而生长。以转化质粒中的基因作为营养缺陷型补偿性标记的转化系统不具有这一优点。通常，在高度开发的生产青霉素的产黄青霉菌株中导入营养缺陷型标记时伴有多向性突变。这种突变通常导致降低青霉素的生产（MacDonald    et    al.，1963，J.Gen.Microbiol.33：365-374）。
质粒pPS54含有产黄青霉IPS基因。质粒pPS54及质粒 pPS54的衍生物（不同之处在于用产黄青霉IPS基因启动子取代构巢曲霉乙酰胺酶基因启动子）能用来产生比其未转化亲本具有更高青霉素V效价的青霉菌株，因为转化体产生更多的IPS。IPS在青霉素V的生物合成途径中起作用。质粒在构建IPS和青霉素V过量生产株中的相对有效性依赖于亲本质粒：质粒pPS54的衍生物与质粒pPS54的不同之处在于，前者用产黄青霉IPS基因启动子取代了构巢曲霉乙酰胺酶基因启动子，而衍生质粒能比质粒pPS54以更高频率产生转化体。
实例18    用质粒pPS55和pPS57进行产黄青霉基因转化
A.青霉原生质体的制备
产黄青霉原生质体的制备与实例17所述相同。
B.转化方法
对于每一种转化质粒，在～0.1ml渗透脆性的产黄青霉细胞悬浮液（大约2×107细胞）中加入10μl 50mM CaCl2;25μg在5-15μl TE缓冲液中的质粒DNA，以及新溶解的聚乙二醇4000溶液（Baker，40%重量/体积，在渗透稳定的缓冲液中）。搅动混合物，于室温下放置10分钟，以700×g离心2分钟，再次搅动。然后，将每份0.5ml的两份试样取出并涂布于渗透稳定的基本培养基表面（没有氨基酸的reast Nitrogen Base（Difco），1.7g/L;硫酸铵，2g/L;蔗糖，125g/L;CdCl2，3mM;trifluoroperizine，250-500μM;Noble琼脂，22g/L）。培养皿于15℃保温24小时后，每个培养皿中加入4ml液化的Noble琼脂（0.50%W/V，42℃），其中含有1.0M KCl和足够的潮霉素B，使其在平皿中 的最终浓度达到250-500μg/ml。在上层琼脂固化后，培养皿在潮湿培养箱中于25℃下保温。为了测量转化混合物中的存活细胞总数，将转化混合物的等分试样涂在没有覆盖的基本培养基上。转化14至21天后，在选择培养基（覆盖有潮霉素B的基本培养基）上出现其大小足以进行继代培养的转化体集落。流产转化体很容易从稳定转化体中分辨出来，因为流产转化体在继代培养时不能在加有250-500μg/ml潮霉素B的基本培养基上生长。转化7至10天后，用含有杂交的HmR基因（利用pIPSp启动子）的质粒转化的细胞形成可见的集落。基本培养基中fluoroperizine和氯化镉的存在可提高产黄青霉细胞对潮霉素B的敏感性。
C.产黄青霉/pPS55和产黄青霉/pPS57转化体的分析
产黄青霉/pPS55和产黄青霉/pPS57表达潮霉素B磷酸转移酶活性，此活性在未转化的产黄青霉（如ATCC    9480）提取物中未检测到。此活性使得转化菌株能够在有毒浓度的潮霉素B的存在下生长（用镉离子和trifluoro    perizine（TEP）促进潮霉素B进入真菌细胞中）。转化体在有毒浓度潮霉素B（并由镉和TFP加强）存在下生长的能力表明，杂交的HmR基因在产黄青霉中起作用。与质粒pPS55相比，用质粒pPS57得到更高的转化频率，这表明在产黄青霉中，产黄青霉IPS的启动子和5′调控顺序比存在于质粒pPS55所携的杂交HmR基因中的顶头孢霉IPS基因的启动子和5′调控顺序更为有效。
稳定的产黄青霉/pPS55和产黄青霉/pPS57转化体在其高分子量DNA中携带转化的DNA。不含产黄青霉DNA但含有与质粒pPS55和pPS57的转化DNA相同顺序的探针，与产黄青霉/ pPS55和产黄青霉/pPS57转化体的高分子量DNA杂交，即使在用非选择性培养基（没有潮霉素B存在）培养转化体后再分析DNA也是这样。在非选择性培养基上传代以后仍保留有转化表型（在杀死未转化产黄青霉受体菌株的潮霉素B浓度下生长的能力）。
含有杂交的HmR基因的质粒特别适于用作将基因插入青霉（尤其是产黄青霉）中的载体，因为不必构建特殊的受体菌株，例如营养缺陷型，这是由于青霉天然不能在潮霉素B和促进青霉对潮霉素B敏感性的化合物存在下生长，所述化合物即如上面所述的镉离子和TFP。
含有产黄青霉IPS基因的质粒pPS55和pPS57的衍生物能用来产生比其未转化亲本具有更高青霉素V效价的菌株，这是由于转化体中生产的IPS更多。
实例19    用质粒pPS62和pPS61进行产黄青霉基因转化
A.转化方法
制备用于细胞培养的接种物，制备产黄青霉原生质体及用质粒pPS62或pPS61转化产黄青霉的转化方法与实例17和18所述相同。质粒pPS62含有HmR基因作为可选择标记;质粒pPS61含有amdS基因作为可选择标记。
B.产黄青霉/pPS62和产黄青霉pPS61转化体的分析
稳定的产黄青霉/pPS62和产黄青霉/pPS61转化体在其高分子量DNA中携带转化的DNA。在非选择性培养基上传代以后仍保留有转化表型。
质粒pPS62和pPS61含有杂交的DACS/DAOCS基因。这是通过将产黄青霉IPS基因的启动子拼接到顶头孢霉DACS/DAOCS基因的编码顺序上而构建的。天然的和杂交的基因都编码脱乙酸基头 孢菌素C合成酶（扩展酶）和脱乙酰头孢菌素C合成酶（羟化酶）二者的合成。酶活性分别定义为催化青霉素N形成脱乙酸基头孢菌素C（扩展酶）和催化脱乙酸基头孢菌素C形成脱乙酰头孢菌素C（羟化酶）。产黄青霉/pPS61和产黄青霉/pPS62转化体的提取物表现出扩展酶和羟化酶活性。这些活性不存在于未转化的产黄青霉菌株的提取物中。在质粒pPS61和pPS62的杂交DACS/DAOCS基因中存在的产黄青霉IPS基因的启动子和翻译活化顺序能在产黄青霉中起作用，以使扩展酶和羟化酶活性在产黄青霉中表达。
产黄青霉/pPS61和产黄青霉/pPS62转化体可用作构建生产头孢菌素的产黄青霉菌株的中间株。可用诱变剂处理生产扩展酶或扩展酶和羟化酶的产黄青霉中间株，选择能产生头孢菌素的诱变细胞。另外，也可以产生质粒pPS61或pPS62的含有修饰的扩展酶/羟化酶基因的衍生物，它们编码将青霉素V转化为头孢菌素V的扩展酶，但缺乏编码羟化酶所必需的信息。修饰基因是通过克隆于大肠杆菌中的顶头孢霉扩展酶/羟化酶编码顺序的体外诱变而产生的。如上述用携有修饰的DACS/DAOCS基因的衍生质粒来转化产黄青霉。这种转化体如果加苯氧乙酸作为前体则产生头孢菌素V，它们以较高的产率生产头孢菌素V，因而是有用的。头孢菌素V很容易在低pH下廉价地用有机溶剂萃取，从而促进其分离。这样产生的头孢菌素V代表了一种有用的中间产物，它可转化成廉价而优质的7-ACA，用于半合成头孢菌素的生产中。
实例20    用质粒pPS56进行顶头孢霉基因转化
A.顶头孢霉菌株
用于转化的较好的头孢霉菌株以ATCC    11550的寄存号得自 ATCC。其他的头孢霉菌株，或任何为了改善头孢菌素C的生产而通过突变、选择或遗传育种由ATCC    11550产生的商业菌株，都适用于用本发明的载体和质粒制备转化体。
B.制备用于细胞培养的接种物
为了有效地转化顶头孢霉细胞，必须去掉细胞壁以形成稳定的原生质体。制备这种原生质体最好以均一的接种物开始。不然，通过培养而制备细胞就无法重复，如果企图从不合适的或数量不足的细胞中制备顶头孢霉原生质体则会很浪费时间。
C.制备用于细胞培养的均一接种物
将冷冻干燥或液氮贮存的1安瓿孢子（约109个分生孢子，在1.5ml贮存溶媒中：5%乳糖，10%甘油，0.1%吐温80）于室温下融化，稀释至5ml无菌盐溶液中。大约50个含有20ml Trypticase Soy Agar（BBL）培养基的斜面每个用大约0.1ml此悬浮液接种。接种前，使培养基干燥至表面看不见水分为止。接种的斜面于25℃保温大约4天。在覆盖每个斜面培养基表面的菌丝体生长物上加入大约10ml贮存溶媒。搅动斜面以悬浮分生孢子，合并每个斜面的分生孢子悬浮液，以10ml的等分试样冰冻于-80℃下。冰冻的分生孢子悬浮液缓慢丧失其存活力，在-80℃下贮存大约3月以后即不应再使用。
D.用于制备原生质体的细胞的生长
大约106ml在500ml摇瓶中的培养液用来自10ml冰冻分生孢子悬浮液的细胞接种。离心（10分钟×2600rpm）得到细胞，然后直接悬浮于液体培养基中。悬浮之前必须倾出上清液，因为乳糖和甘油对细胞生长有不利影响。将含有悬浮细胞的培养瓶置于旋转水浴摇床上，以285rpm于29-30℃保温24小时，偏心距为1英寸。在培养步骤中推荐的29-30℃温度尤其适用于制备转化用的原生质体，但大约25℃的较低温度也适用。本领域专业人员将认识到，29-30℃不同于为生产抗生素而培养顶头孢霉所优选的温度（25℃）。
E.原生质体的制备
吸滤收集24小时培养物的细胞（Whatman1号滤纸，在布氏漏斗中），悬浮于渗透稳定的缓冲液中（0.8M NaCl;0.1M MgSO4;10mM NaH2PO4，pH7.0），其中加有浓度为0.05M的还原剂二硫苏糖醇。加入足够的缓冲液使最终的细胞浓度为每20ml缓冲液1g（吸滤之后称量）细胞量。将装在50ml摇瓶中的细胞悬浮液置于旋转水浴摇床中，以140rpm于29-30℃保温10分钟，偏心距为1英寸。另外，也可使用最终浓度为140mM的2-巯基乙醇作为还原剂。离心收集二硫苏糖醇处理的细胞，悬浮于250ml三角瓶中的酶溶液中（10mg/ml Novozym 234，得自Novo Biolabs，Bagsvaerd，Denmark;0.8M NaCl;0.1M MgSO4;10mM NaH2PO4;pH5.8）。最终的细胞浓度为每10ml酶液1g经处理细胞量。然后，将细胞悬浮液置于旋转水浴摇床中，以120rpm于29-30℃保温15-30分钟， 偏心距为1英寸。此阶段结束后，将原生质体悬浮液转移至一次性使用的离心管中，旋转搅动2-3秒以使仍与菌丝片结合的原生质体释放出来。以大小而论，此消化过程产生不均一的原生质体群落。最大的原生质体再生细胞壁并比较小的原生质体以更高的频率进行转化。利用医用台式离心机以100×g离心2分钟收集富含大原生质体的原生质体群落。弃去上清液，通过再悬浮于渗透稳定的缓冲液（pH7.0）中洗涤原生质体沉淀，然后离心收集（550×g，6分钟）。洗涤步骤重复2次。将洗涤过的原生质体再悬浮于足量的0.8M NaCl中，产生每毫升2-3×109原生质体的浓度，用血细胞计数器计数。
F.转化方法
对每一种转化质粒，使用0.1ml在0.8M NaCl和80mMCaCl2中的含有1～5×107头孢霉原生质体的悬浮液。如实例17所述，在原生质体悬浮液中加入大约20μg质粒和聚乙二醇4000，使转化混合物体积达到1.1ml。混合物于室温下保温10分钟，然后以100×g离心5分钟。原生质体再通过搅动而悬浮在同样的液体中。将等分试样（0.1ml）加至Trypticase-Soy琼脂培养基（BBL）表面，其中加有10.8%的蔗糖以使原生质体保持渗透稳定性。在培养皿中于15℃保温24小时后，在每个培养皿中加入4ml液化琼脂（0.41%w/v，42℃），其中含有0.8M NaCl和足以使最终浓度达到100μg/ml的潮霉素B。由于充分诱变而表现出缓慢的生长速率的顶头孢霉菌株在选择过程中给予低水平的潮霉素B（即10μg/ml的最终浓度）。覆盖层固化以后，使培养皿在潮湿培养箱中于25℃保温。保温4～ 5天以后出现其大小足以进行继代培养的转化体集落，但生长较慢的转化体的发育可能需要长至8天的时间。流产转化体很容易从稳定转化体中分辨出来，因为流产转化体在继代培养时不能在含有原初选择水平的潮霉素B的新鲜培养基上生长。
G.顶头孢霉/pPS56转化体的分析
稳定的顶头孢霉/pPS56转化体在其高分子量DNA中携带转化DNA。这种转化体在非选择性培养基上生长以后仍保留转化表型（在杀死未转化的顶头孢霉受体菌株的潮霉素B浓度下生长的能力）。
用质粒pPS56将多拷贝DACS/DAOCS基因插入顶头孢霉高分子量DNA中特别有效，因为它含有在顶头孢霉中作为显性选择标记起作用的杂交的HmR基因。使用pPS56进行转化时不必用特殊的受体菌株（例如营养缺陷型）作为亲本菌株，因为顶头孢霉天然不能在如上所述的潮霉素B的存在下生长。不必加入添加剂（例如镉离子或TFP）来提高顶头孢霉对潮霉素B的敏感性。
可用质粒pPS56来产生具有比未转化菌株更高的头孢菌素C效价的顶头孢霉菌株，因为它具有额外的DAOCS/DACS基因的拷贝。额外的基因拷贝产生更高的DAOCS/DACS活性，促进头孢菌素C合成的增加。用质粒pPS56进行转化时，大量产生头孢菌素C和青霉素N的顶头孢霉菌株是特别有用的亲本菌株，可得到更有效地将青霉素N转化为头孢菌素C的转化体。所需的顶头孢霉/pPS56转化体在对于生长和抗生素生产是中性的区域中携有转化DNA插段，因此只表现出增加的DAOCS和DACS对头孢菌素C合成的影响。改进了头孢菌素C生产的顶头孢霉/pPS56转化体可用于具有临床意义的头孢菌素抗生素，例如头孢金素钠、头孢羟唑钠甲酯和 cefazolin钠的生产。
在通过转化产生具有更高的头孢菌素C生产力的菌株的过程中，质粒pPS56上的CAT基因是质粒pPS56的实用性的一个重要方面。从用质粒pPS56转化的大肠杆菌中可方便地得到大量质粒，并选择具有氯霉素抗性的质粒。此外，CAT基因产物适于用来获取过量生产β-内酰胺抗生素的顶头孢霉转化体。虽然细菌调控信号通常不在真核细胞中表达，但有报道指出，某些细菌基因（尤其是β-内酰胺酶基因）在真核细胞中有低水平的表达。与β-内酰胺酶不同，CAT基因产物不破坏β-内酰胺抗生素。因此优选使用CAT基因作为可选择标记。

Claims (2)

1、一种在从大肠杆菌、头孢霉菌和青霉菌组成的一组中选出的重组宿主细胞中表达脱乙酰基头孢霉素C合成酶(简称：DACS)/脱乙酸基头孢霉素C合成酶(简称：DAOCS)活性的方法，该方法包括：
(1)用一个重组体DNA表达载体转化该宿主细胞，其中包括：
(a)一个在宿主细胞中起作用的启动子和翻译的活化顺序；
和
(b)一个编码DACS/DAOCS活性的并处于由启动子表达的位置的如下DNA顺序：
                    5′-ATG ACT TCC AAG GTC CCC GTC TTT CGT CTC
GAC GAC CTC AAG AGC GGC AAG GTC CTC ACC GAG CTC GCC GAG GCC GTC
ACC ACC AAG GGT ATC TTC TAC TTG ACC GAG AGC GGC CTG GTC GAC GAC
GAC CAC ACC TCG GCG CGT GAG ACG TGC GTT GAC TTT TTC AAG AAC GGA
AGC GAG GAG GAG AAG AGG GCC GTG ACG CTC GCC GAC CGT AAC GCC CGC
CGC GGC TTC TCT GCC CTC GAG TGG GAG AGC ACC GCC GTC GTC ACC GAG
ACG GGC AAG TAC TCG GAC TAC TCG ACG TGC TAC TCC ATG GGC ATC GGC
GGC AAC CTG TTC CCG AAC CGG GGC TTC GAG GAC GTC TGG CAG GAC TAC
TTC GAC CGC ATG TAC GGC GCA GCC AAG GAT GTC GCG CGC GCC GTT CTC
AAC TCT GTG GGC GCC CCG CTC GCC GGG GAG GAC ATT GAT GAC TTC GTC
GAG TGC GAT CCC CTC CTC CGC CTA CGG TAC TTC CCC GAA GTG CCG GAG
GAC CGC GTC GCC GAA GAG GAA CCC CTC CGC ATG GGA CCC CAC TAC GAC
CTA TCG ACC ATC ACG CTC GTG CAC CAG ACA GCC TGC GCC AAC GGC TTC
GTG AGC CTG CAG TGC GAG GTG GAC GGA GAA TTC GTC GAC CTC CCG ACG
CTC CCC GGC GCC ATG GTC GTC TTC TGC GGC GCG GTC GGC ACC CTG GCC
ACG GGC GGC AAG GTC AAG GCG CCC AAG CAC CGG GTC AAG TCT CCC GGG
CGC GAC CAG CGC GTC GGC AGC AGC CGC ACG TCG AGC GTC TTC TTC CTG
CGG CCC GAA GCC CGA CTT CAG CTT CAA CGT GCA GCA GTC GAG GGA GTG
GGT TTC AAC GTC CGC ATG CCG TCG GAG CGC ACG ACG TTC AGG GAG TGG
CTT GGC GGG AAC TAT GTC AAC ATG CGG AGG GAT AAG CCG GCG GCA GCG
GAG GCG GCT GTC CCC GCG GCT GCC CCT GTC TCT ACC GCA GCT CCT ATA
GCC ACT-3′
其中，A是脱氧腺苷基，G是脱氧鸟苷基，C是脱氧胞苷基，T是胸苷基；以及
(2)在能够表达DACS/DAOCS活性的条件下培养在步骤(1)中转化的宿主细胞。
2、根据权利要求1的方法，其中步骤（2）所培养的重组体宿主细胞是大肠杆菌K12  JM109/pIT507、大肠杆菌K12  JM109/pIT511、产黄青霉/pPS59、产黄青霉/pPS61、产黄青霉/pPS62、顶头孢霉/pIT503、顶头孢霉/pPS52、顶头孢霉/pPS56、大肠杆菌K12/pIT507或大肠杆菌K12/pIT511。
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