CN1034578A - 编码构巢曲霉中异青霉素n合成酶的重组dna表达载体和dna化合物 - Google Patents

Abstract

编码并促使在构巢曲霉异青霉素N合成酶活性 的重组宿主细胞中表达的DNA化合物和重组 DNA表达载体可用于产生异青霉素N合成酶和从 产抗菌素生物中提高含β-内酰胺抗菌素的产量。构 巢曲霉异青霉素N合成酶基因可从质粒POG04中 分离得到，该质粒体可从美国北方研究中心(North- ern Regional Research Center)获得，保藏号为 NRRL B-18171(保藏日：1987年2月6日)。

Description

本发明涉及编码构巢曲霉（Aspergillus    nidulans）中异青霉素N合成酶活性的DNA序列。异青霉素N合成酶催化由δ-（L-d-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸形成异青霉素N的反应。在重要的抗菌素生物合成中，这一反应是关键的一步，例如：由构巢曲霉，产黄青霉（Penicillium    chrysogenum），枝顶孢子菌（Cephalosporium    acremonium），clavuligerus链霉菌合成青霉素，由枝顶孢子菌合成头孢菌素;由clavuligerus链霉菌合成7    α-甲氧基头孢菌素。

这一新的编码异青霉素N合成酶活性的DNA序列是从构巢曲霉中分离的，并且可用于构建表达活性的重组DNA表达载体。本发明包括能高水平表达大肠杆菌（E.coli）异青霉素N合成酶活性的载体。

大肠杆菌产生的异青霉素N合成酶活性催化由δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸形成异青霉素N的反应。本发明所述用大肠杆菌载体转化的大肠杆菌细胞提取物粗品，不经任何预活化处理，即具有异青霉素N合成酶活性。因此，本发明所述大肠杆菌载体提供了一种大量获得活性异青霉素N合成酶的有效方法。异青霉素N合成酶不仅用于生产异青霉素N，也用于缩合与δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸不同的三肽，借以形成新的抗菌素。

编码异青霉素N合成酶的DNA化合物很容易被修饰，以便构建表达载体，这类载体可用于增加含有其他微生物（例如，构巢曲霉，枝顶孢子菌，产黄青霉，clavuligerns链霉菌抗菌素发酵的效率和产量。尽管本发明所述编码异青霉素N合成酶的DNA是从构巢曲霉中分离的，但本发明DNA化合物可用于构建促使在各种宿主细胞中表达异青霉素N合成酶活性的载体，例如，本发明所列举的大肠杆菌载体。能够产生青霉素和头孢菌素的所有有机体均利用共同的前体δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸和异青霉素N。因此，本发明所述编码异青霉素N合成酶的DNA化合物可用于产生用于下述目的的载体，即提高包括产青霉素和头孢素抗菌素的所有生物有机体的发酵效率和产量。

本发明所述编码异青霉素N合成酶的DNA化合物是由构巢曲霉基因组DNA衍生而成，并与转录和转译控制编码异青霉素N合成酶基因组DNA表达的活性序列一起分离得到。本发明包括这一新的转录和转译活性序列。可用于控制构巢曲霉和有关生物中的基因表达。

本发明还包括位于基因编码区密码链3′端的异青霉素N合成酶基因的调节信号。这些3′端调节序列编码构巢曲霉异青霉素N合成酶基因的转录末端、mRNA多腺苷酸化以及执行信号。在表达载体的合适位置上存在的这些信号令加速由该载体编码的产物的表达。所述合适位置是指欲表达基因编码区的密码链的3′末端。

下列章节对本发明作了更详细的描述。为了更清楚地了解，并有助于理解本发明和本文公开的内容及权利要求，将下列术语定义如下：αIPNS-编码构巢曲霉异青霉素N合成酶的DNA。

抗菌素-天然的或者是经过有限化学改性的由微生物产生的物质，该物质抑制或杀死另一微生物或其核细胞的生长。

抗菌素生物合成基因-编码在初级代谢产物转化成抗菌素过程中反应所需活性的DNA片段。

产抗菌素有机体-包括但不限于曲霉属，链霉菌属，杆菌属，单孢菌属，头孢菌属，青霉菌属，诺卡氏菌属的任何有机体，所述有机体或者产生抗菌素或者含有通过表达即可产生抗菌素的基因。

给予抗菌素性的基因-编码给予抗菌素抗性活性的DNA片段。

ApR-给予氨苄青霉素抗性的基因。

AsP    DNA-构巢曲霉中的DNA。

cI    857-λ噬菌体中cI阻遏物基因的热敏突变等位基因。

克隆-将某一DNA片段插入重组DNA克隆载体的方法。

COS-λ噬菌体粘性末端序列。

基因库-已将DNA片段克隆进入其中的一组重组DNA克隆载体，所述DNA片段基本上代表具体有机体的整个基因组。

HmR-给予潮霉素B抗性的基因。

杂交-将两个等同单链DNA分子对合，形成双链DNA分子，其可以是完全碱基对，或者不是完全碱基对。

IPS或IPNS-异青霉素N合成酶;根据成份，可归类为蛋白质或者编码蛋白质DNA。

异青霉素N合成酶-一种酶，也就是公知的环化酶，该酶催化由δ-（L-α氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸形成异青霉素N。

mRNA-信使核糖核酸。

Pen    DNA-产黄青霉中的DNA。

pIPS-编码产黄青霉异青霉素N合成酶的DNA。

pL或λpL-λ噬菌体左向启动子。

重组DNA克隆载体-包括但不限于质粒的任何自动复制或整合剂，所述复制或整合剂含有一个DNA分子，该DNA分子可加入或已加入一个或多个其他DNA分子。

重组DNA表达载体-包括但不限于质粒的任何自动复制或整合剂，所述复制或整合剂含有排列合适的转录和/或转译活性序列，该序列控制编码有研究或商业价值的多肽或RNA的DNA片段表达。

重组DNA载体-任何重组DNA克隆或表达载体。

限制片段-由一种或多种酶的作用所产生的任何线状DNA分子。

rRNA-核糖核蛋白体RNA。

敏感宿主细胞-一种宿主细胞，即在给定的抗菌素存在下，不加入给予该抗菌素抗性的DNA片段，不能生长的一种宿主细胞。

TcR-给予四环素抗性的基因。

转录活性序列-一种DNA序列，例如，启动DNA转录的启动子。

转化株-经过转化的受体宿主细胞。

转化-将DNA引入受体宿主细胞，以此改变基因型并导致受体细胞的转变。

转译活性序列-一种DNA序列，例如，核蛋白体结合部位编码序列，当转译成RNA时，该序列启动mRNA转译成蛋白质。

附图中图1-4所示的限制位点和功能图近似地描述了本文所讨论的重组DNA载体。图中的限制位点间隔与载体上限制位点的实际间隔成正比，但观察到的限制位点距离可能与图中计算的距离稍有差异。限制位点信息并不完全;因此，载体上给定型的限制位点多于图上具体所示的位点。

图1    质粒pLC2的限制位点和功能图。

图2    质粒pOG04的限制位点和功能图。

图3    质粒pOG0216的限制位点和功能图。

图4    质粒pCZR    111的限制位点和功能图。

本发明包括编码构巢曲霉中异青霉素N合成酶活性的DNA化合物和重组DNA克隆和表达载体。在质粒pOG04的-2Kb    HindⅢ-BgⅢ限制片段上可以分离构巢曲霉中异青霉素N合成酶基因的密码序列。通过分析DNA序列已进一步确定了这一限制片段和密码序列。与位于构巢曲霉基因中密码区3′末端侧面的DNA部分一起，将编码构巢曲霉中异青霉素N合成酶序列DNA描述如下。就该描述而言，只标出了双链DNA分子的有义”或密码链，并且是以5′→3′方向从左到右描述该DNA。将该核苷酸序列编号，号码出现于该DNA序列的上面。紧挨着每一条DNA线下面，以氨基末端→羧基末端的方向，从左向右列出了由DNA编码的异青霉素N合成酶氨基酸残基序列。每一氨基酸残基出现于将其编码的DNA下面。将该氨基酸残基序列编号;号码出现于该氨基酸残基序列的下面。

编码构巢曲霉异青霉素N合成酶的DNA序列和相应的氨基酸序列

10    20    30    40

5′-ATG    GGT    TCA    GTC    AGC    AAA    GCC    AAT    GTT    CCA    AAG    ATC    GAT    GTT    TCT    CCC    MET    GLY    SER    VAL    SER    LYS    ALA    ASN    VAL    PRO    LYS    ILE    ASP    VAL    SER    PRO

5    10    15

50    60    70    80    90

CTG    TTT    GGA    GAC    GAC    CAA    GCC    AAA    ATG    AGA    GTA    GCC    CAG    CAA    ATC    LEU    PHE    GLY    ASP    ASP    GLN    ALA    ALA    LYS    MET    ARG    VAL    ALA    GLN    GLN    ILE

20    25    30

100    110    120    130    140

GAC    GCC    GCT    TCG    CGT    GAT    ACT    GGG    TTT    TTC    TAC    GCC    GTC    AAC    CAT    GGG    ASP    ALA    ALA    SER    ARG    ASP    THR    GLY    PHE    PHE    TYR    ALA    VAL    ASN    HIS    GLY

35    40    45

150    160    170    180    190

ATC    AAT    GTG    CAG    CGA    CTC    TCG    CAG    AAG    ACC    AAG    GAG    TTT    CAT    ATG    TCT    ILE    ASN    VAL    GLN    ARG    LEU    SER    GLN    LYS    THR    LYS    GLU    PHE    HIS    MET    SER

50    55    60

200    210    220    230    240

ATC    ACA    CCT    GAG    GAA    AAG    TGG    GAC    CTT    GCG    ATT    CGT    GCC    TAC    AAC    AAA    ILE    THR    PRO    GLU    GLU    LYS    TRP    ASP    LEU    ALA    ILE    ARG    ALA    TYR    ASN    LYS

65    70    75    80

250    260    270    280

GAG    CAC    CAG    GAC    CAA    GTC    CGT    GCC    GGA    TAC    TAC    CTG    TCC    ATC    CCC    GGG    GLU    HIS    GLN    ASP    GLN    VAL    ARG    ALA    GLY    TYR    TYR    LEU    SER    ILE    PRO    GLY

85    90    95

290    300    310    320    330

AAA    AAG    GCA    GTC    GAG    TCC    TTC    TGC    TAC    CTT    AAC    CCG    AAC    TTC    ACG    CCC    LYS    LYS    ALA    VAL    GLU    SER    PHE    CYS    TYR    LEU    ASN    PRO    ASN    PHE    THR    PRO

100    105    110

340    350    360    370    380

GAT    CAT    CCC    CGT    ATC    CAG    GCC    AAG    ACT    CCC    ACT    CAC    GAG    GTA    AAC    GTG    ASP    HIS    PRO    ARG    ILE    GLN    ALA    LYS    THR    PRO    THR    HIS    GLU    VAL    ASN    VAL

115    120    125

390    400    410    420    430

TGG    CCA    GAC    GAG    ACC    AAG    CAC    CCT    GGT    TTC    CAA    GAC    TTT    GCC    GAG    CAG    TRP    PRO    ASP    GLU    THR    LYS    HIS    PRO    GLY    PHE    GLN    ASP    PHE    ALA    GLU    GLN

130    135    140

440    450    460    470    480

TAT    TAC    TGG    GAT    GTT    TTC    GGT    CTC    TCT    TCT    GCA    CTG    CTC    AAG    GGC    TAC    TYR    TYR    TRP    ASP    VAL    PHE    GLY    LEU    SER    SER    ALA    LEU    LEU    LYS    GLY    TYR

145    150    155    160

490    500    510    520

GCC    TTG    GCA    TTA    GGC    AAA    GAG    GAG    AAT    TTC    TTC    GCT    CGC    CAC    TTC    AAG    ALA    LEU    ALA    LEU    GLY    LYS    GLU    GLU    ASN    PHE    PHE    ALA    ARG    HIS    PHE    LYS

165    170    175

530    540    550    560    570

CCA    GAC    GAT    ACT    CTT    GCC    TCG    GTT    GTG    CTG    ATC    CGC    TAC    CCT    TAC    CTG    PRO    ASP    ASP    THR    LEU    ALA    SER    VAL    VAL    LEU    ILE    ARG    TYR    PRO    TYR    LEU

180    185    190

580    590    600    610    620

GAT    CCC    TAC    CCC    GAG    GCT    GCT    ATC    AAG    ACG    GCG    GCC    GAC    GGC    ACC    AAA    ASP    PRO    TYP    PRO    GLU    ALA    ALA    ILE    LYS    THR    ALA    ALA    ASP    GLY    THR    LYS

195    200    205

630    640    650    660    670

CTG    AGT    TTT    GAG    TGG    CAT    GAG    GAT    GTA    TCC    CTA    ATC    ACT    GTG    CTT    TAC    LEU    SER    PHE    GLU    TRP    HIS    GLU    ASP    VAL    SER    LEU    ILE    THR    VAL    LEU    TYR

210    215    220

680    690    700    710    720

CAG    TCC    AAC    GTG    CAG    AAC    CTG    CAG    GTA    GAA    ACT    GCT    GCC    GGG    TAT    CAA    GLN    SER    ASN    VAL    GLN    ASN    LEU    GLN    VAL    GLU    THR    ALA    ALA    GLY    TYR    GLN

225    230    235    240

730    740    750    760

GAT    ATC    GAG    GCC    GAC    GAT    ACT    GGC    TAC    TTG    ATC    AAC    TGC    GGC    AGT    TAC    ASP    ILE    GLU    ALA    ASP    ASP    THR    GLY    TYR    LEU    ILE    ASN    CYS    GLY    SER    TYR

245    250    255

770    780    790    800    810

ATG    GCA    CAT    CTC    ACA    AAC    AAC    TAC    TAT    AAA    GCG    CCC    ATC    CAT    CGG    GTG    MET    ALA    HIS    LEU    THR    ASN    ASN    TYR    TYR    LYS    ALA    PRO    ILE    HIS    ARG    VAL

260    265    270

820    830    840    850    860

AAA    TGG    GTT    AAT    GCA    GAG    CGC    CAG    TCC    CTG    CCA    TTC    TTC    GTC    AAC    CTG    LYS    TRP    VAL    ASN    ALA    GLU    ARG    GLN    SER    LEU    PRO    PHE    PHE    VAL    ASN    LEU

275    280    285

870    880    890    900    910

GGA    TAC    GAC    AGC    GTG    ATT    GAT    CCA    TTT    GAT    CCC    CGA    GAA    CCC    AAT    GGC    GLY    TYR    ASP    SER    VAL    ILE    ASP    PRO    PHE    ASP    PRO    ARG    GLU    PRO    ASN    GLY

290    295    300

920    930    940    950    960

AAG    TCT    GAT    CGG    GAG    CCA    CTC    TCC    TAC    GGC    GAC    TAT    TTG    CAA    AAC    GGG    LYS    SER    ASP    ARG    GLU    PRO    LEU    SER    TYR    GLY    ASP    TYR    LEU    GLN    ASN    GLY

305    310    315    320

970    980    990    1000

CTG    GTG    AGT    TTG    ATC    AAC    AAG    AAC    GGC    CAG    ACC    TAG    AAGCGAGGGG    LEU    VAL    SER    LEU    ILE    ASN    LYS    ASN    GLY    GLN    THR

325    330

1010    1020    1030    1040    1050

TGTGGAACTA    GCAGATAGCA    CCTGTGGACG    GCGGTTACGT    TGTCCTTTAG

1060    1070    1080    1090    1100

GAATTGAGAC    TGAGAAGAAG    CGAGTCGAGA    AATTAGAGAG    GCGCTACACC

1110    1120    1130    1140    1150

ATTTTAGCTA    GTTTAATTCT    TCTACATTTT    GTTCTTTCCA    CTCCACTATT

1160    1170    1180    1190    1200

CGATCGTAGC    AACGGAATTG    AAGCAGTTCG    ATCATATACA    GTGTTAAGAT

1210    1220    1230    1240    1250

CACCAGAGAA    TACCCAAATT    CCTCCGCGCT    ATTTGTTTTC    TAATTTTCTG

1260    1270    1280    1290    1300

TTACTAATGA    TAACTGTGAG    AACGAAACAG    TAATCCCTCC    CAAAAGCCAT

1310    1320    1330    1340    1350

CACCATATGG    CGTGGAGAAC    TGCGAGGG    TCTCTCAGAA    CGAGTCATTC

1360    1370    1380    1390    1400

GAGCTGCAGA    ATTGCACAGG    CCCTTTTCGC    TCCACCCGCA    GCGCCACGAA

1410    1420    1430    1440    1450

TCCGGTTGGC    ATCGGCGCGA    TGTCACCTGC    AATGGAACGG    CGATAGGATC

1460    1470    1480    1490    1500

TTGATGCTCA    CCAGCCAATC    ACAGGTTCTC    CAAGAAGCAC    TCGGGATCC-3′

其中A是脱氧腺苷基，G是脱氧乌苷基，C是脱氧胞苷基，T是胸苷基，ALA是丙氨酸残基，ARC是精氨酸残基，ASN是天门冬酰胺残基，ASP是天冬氨酸残基，CYS是半胱氨酸残基，GLN是谷氨酸胺残基，GLU是谷氨酸残基，GLY是甘氨酸残基，HIS是组氨酸残基，ILE是异亮氨酸残基，LEU是亮氨酸残基，LYS是赖氨酸残基，MET是甲硫氨酸残基，PHE是苯丙氨酸残基，PRO是脯氨酸残基，SER是丝氨酸残基，THR是苏氨酸残基，TRP是色氨酸残基，TYR是酪氨酸残基，VAL是缬氨酸残基。

本领域普通工作人员应该承认上文所描述的DNA序列是本发明的一个重要部分。由于遗传密码的简并性质（这是由于大多数氨基酸残基和终止信号的密码子不止一个所造成的），因此，上文描述的异青霉素N合成酶的氨基酸残基序列可由众多的各种DNA序列编码，由于这些交替DNA序列能够编码本发明所述的相同氨基酸残基序列，因此本发明还包括这些交替序列。

通过采用全保护的脱氧核苷酸建筑积木的改良磷酸三酯法，可以方便地合成这些IPNS编码序列。这类合成法在本领域中是众所周知的，并且基本上可按下列文献所述方法进行：Itakura    et.al.，1977，Science198：1056和Crea    et    al.，1978，Proc.Nat.Acad.Sci.USA    75：5765。在下列文献中公开了合成DNA特别优选的方法：Hsiung    et    al.，1983，Nucleic    Acid    Research    11：3227和Narang    et    al.，1980，Methods    in    Enzymology    68：90。除上述引用的手工方法外，采用自动DNA合成仪，例如，Systec    1450    A或ABS    380A    DNA合成仪，也可合成该DNA序列。

除上文所讨论的编码IPNS-的DNA序列外，还可以有本发明所述编码异青霉素N合成酶的DNA的遗传突变体。这些遗传突变体代表天然出现的遗传差异，它们具有与本发明化合物基本相同的DNA和氨基酸序列。如果不相同，则活性也相似。但核苷酸序列与本发明化合物稍有差异。这些遗传突变体与本发明化合物相当，并可借助于与本发明编码IPNS的DNA序列相同的方法得到。

从构巢曲霉中分离得到本发明所述编码异青霉素N合成酶活性的DNA化合物。构建了构巢曲霉中所有基因DNA的基因库，并将该基因库用于测定是否存在等同于在质粒PLC2上编码的产黄青霉异青霉素N合成酶基因的序列。所说质粒PLC2是一种从美国典型培养物保藏中心（American    Type    Culture    Collection，Rockville，MD    20852）获得的一种质粒，其保藏号为ATTC    53334（保藏日：1985年11月20日）。在欧洲专利申请书86309075.9号，1987年6月10日出版的欧洲专利出版物0225128号中公开了质粒PLC2附图1中所示的限制位点和功能图，并对此提出了权利要求。基因库的各种载体含有等同于产黄青霉异青霉素N合成酶基因的DNA和编排与编码构巢曲霉异青霉素N合成酶的那些载体中至少一种有关的DNA。然后将构巢曲霉异青霉素N合成酶基因克隆到另一载体中，得到质粒POG04，将该质粒转入大肠杆菌K12    JM109宿主细胞。已将大肠杆菌K12    JM109/pOG04转化株保藏在美国农业部农业研究服务处北方研究室（NRRL）原种培养物保藏中心;（Northern    Regional    Research    Laboratoriez（NRRL），Agricultural    Research    Service，U.S.Department    of    Agriculture，Peoria，Illinois    61604），保藏号为NRRL    B-18171（保藏日期：1987年2月6日）。附图2代表质粒pOG04的限制位点和功能图。

按照实施例1所述方法，可以从大肠杆菌K12    JM109/pOG04中分离得到质粒pOG04。从质粒pOG04中可得到有用的限制片段，这些片段包括约4.5kb    Hin    dⅢ片段，该片段包括完整的IPNS基因和约1.55kb    ClaⅠ-BglⅡ限制片段，该片段编码除IPNS氨基末端之外的所有氨基末端。在构建质粒pOG0216中质粒pOG04可用作起始原料，该质粒控制大肠杆菌中异青霉素N合成酶的高水平表达。将构巢曲霉IPNS密码序列插入类质粒pCZR111表达载体，由此构成质粒pOGO216，所述表达载体包括λpL启动子，CI857热敏阻遏物基因，给予四环素抗性的基因，和DNA序列编码载体复制功能。在本文引为参照文献的欧洲专利申请书86306452.3号，出版物0217529号（1978年4月8日出版）中描述并公开了一种存在于质粒pCZR111上的温度诱导表达系统的应用。实际上，在约30℃的低温下，CI857基因产物阻遏由PL启动子操纵的转录，但是，当温度升至约42℃时，CI857基因产物灭活，而PL启动子活化。质粒pCZR111可从NRRL得到，保藏号为NRRL    B-18249（保藏日期：1987年8月11日）。附图3表示质粒pCZR111的限制位点和功能图。

质粒pOG0216含有λpL启动子和排列合适的2-顺反子转译活性序列，以此操纵质粒pOG04中构巢曲霉异青霉素N合成酶基因的蛋白密码序列的表达。在下列文献中对2-顺反子构建作了概述：Schoner    et    al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.81：5403-5407和Schoner    et    al.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.83：8506-8510。质粒pOG04的约1.6kb    ClaⅠ-BgⅡ限制片段几乎包括用于构巢曲霉异青霉素N合成酶的蛋白密码序列中约前36bp。在质粒pOG0216上的异青霉素N合成酶密码序列中前36bp在具有下列序列的合成DNA片段上编码：

存在于质粒pOG0216上的异青霉素N合成酶密码序列的其余部分直接由质粒pOG04得到。在实施例2中更详尽地描述了质粒pOG0216的构建方案。

在约42℃时，含有质粒pOG0216的大肠杆菌K12    RV    308（NRRL    B-15624）（保藏日：1983年9月28日）细胞以高水平（接近总细胞蛋白约10%）表达异青霉素N合成酶。这些大肠杆菌K12    RV    308/pOG0216转化株的粗制细胞提取物能够催化δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸转化成异青霉素N，反之，大肠杆菌K12    RV    308细胞提取物不能催化这一转化。实施例3介绍了对该能转化反应的测定方法。

质粒pOG0216提供了一种大量生产大肠杆菌中异青霉素N合成酶的有效手段。由于含质粒pOG0216的大肠杆菌转化株以接近10%总细胞蛋白的水平表达异青霉素N合成酶，并且也是由于培养大肠杆菌比培养天然产生异青霉素N合成酶的有机体更简单，因此，与非重组体或“天然”异青霉素N合成酶产体相比，大肠杆菌/pOG0216转化株可以更经济有效地产生重组异青霉素N合成酶。本发明所述大肠杆菌K12/pOG0216转化，由于生产异青霉素N合成酶的水平如此之高，因此可以以基本纯净的形式分离在构巢曲霉基因组上编码的异青霉素N合成酶。在Pang    et    al.，Biochom.J.222，789-795（1984）中可查到IPNS的方法的实例。

如实施例3所述，异青霉素N合成酶可用于无细胞系统中由δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸生产异青霉素N。该酶需要辅助因子Fe²⁺，抗坏血酸盐和氧。如美国专利4，307，192号所述，异青霉素N不仅可用于抗菌素，也可用作生产像青霉素N，先锋霉素和其他头孢菌素之类重要抗菌素的起始原料。异青霉素N合成酶的另一重要用途是将与δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸不同的三肽缩合成新的β-内酰胺衍生物。

产生青霉素有机体的非细胞提取物可用于合成非天然（不是自然产生的）β-内酰胺。本发明所述大肠杆菌表达载体提供了一种以粗制细胞提取物和基本纯化形式获得异青霉素N合成酶的便宜而有效的方法，该酶可用于体外缩合在自然界不能自动缩合的三肽，以此形成新的抗菌素或抗菌素核心结构。

质粒pOG0216之所以特别适用于可在大肠司蠭PNS的表达，一方面是由于当采用该质粒时可收到高水平表达之效果，另一方面是由于在该质粒上存在着可选择标记基因。许多重组DNA载体编码β-内酰胺，以致于在某些β-内酰胺抗菌素（如氨苄青霉素）存在下，由载体转化的细胞可以生长。但是，如果为了组成β-内酰胺而想采用含IPNS的非细胞提取物，那么就不要让该提取物含有β-内酰胺酶活性。因此，对可选择标记基因而言，质粒pOG0216不编码β-内酰胺酶，而是编码给予四环素抗性基因，该基因产物不与β-内酰胺反应。

本发明所述IPNS表达载体并不限于具体的可选择标记基因。本领域的普通工作人员认为许多可选择标记基因在IPNS表达载体上是适用的。这类可选择标记基因包括：给予卡那霉素抗性的基因，即，TN903上的可选择标记基因;给予氯霉素抗性的基因，即，质粒PACYC    184和pBR    325上的可选择标记基因。

本发明所述载体包括控制产β-内酰胺有机体中IPNS表达的载体。β-内酰胺酶基因不能用作产β-内酰胺微生物中的可选择标记基因。由于β-内酰胺酶基因在大肠杆菌中具有可选择标记基因的功能，因此它可以存在于为产β-内酰胺有机体而简单设计的本发明所述载体上。为了便于在大肠杆菌内复制质粒的制备，还构建了产β-内酰胺有机体而设计的许多载体。某些产β-内酰胺有机体（如：枝顶孢子菌）是真核细胞，但尽管如此，由质粒pBR    322衍生的原核β-内酰胺酶基因似乎在某些真核宿主细胞中起作用。参见：Marczynski和Jaehning，1985，Nuc.Acids    Res.13（23）：8487-8506和Breunig    et    al.，1982，Gene    20：1-10。为了避免引入β-内酰胺酶基因（该引入极有可能在转化后的有机体内表达，以使产β-内酰胺的能力提高）的可能性，本发明还包括利用与β-内酰胺酶基因不同的可选择标记基因，例如，氯霉素乙酰基转化酶编码基因。

如上所述，β-内酰胺酶基因不能用作枝顶子孢子菌，产黄青霉，clavuligerus链球菌或构巢曲霉中的可选择标记基因，这些有机体也不能编码内源性β-内酰胺酶。但是许多大肠杆菌菌株，甚至对β-内酰胺敏感的菌株，确能编码和低水平表达内源性β-内酰胺酶，即，大肠杆菌amp.C基因产物。参见：Juarin    et    al，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.78（8）：4897-4901和Grundstrom    et    al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci，79：1111-1115。在含有IPNS表达载体的重组大肠杆菌细胞的粗制细胞提取物中加入amp    C基因产物，能够导致采用这一提取物制得的β-内酰胺的降解。为了避免这一降解，使大肠杆菌K12    RV    308突变，得到一种名为大肠杆菌K12    A85892的菌株，它不能表达β-内酰胺酶活性（除非在存在于细胞内的重组载体上编码这一活性）。从美国北方研究中心可以得到大肠杆菌K12    A85892，其保藏号为NRRL-18096（保藏日期：1986年8月8日）。

寻找能用作异青霉素N合成酶底物的非天然三肽可以通过寻找能接受非天然三肽作为底物的突变异青霉素N合成酶来加以补充。本发明提供了用于寻找突变异青霉素N合成酶的起始原料。大肠杆菌是用于突变克隆实验的最好宿主，并且采用本领域公知的方法，例如，用辐射（X-射线或UV）或化学诱变剂（如：甲磺酸乙酯，亚硝基胍，或甲磺酸甲酯）或位点特异性致突变法处理本发明所述大肠杆菌表达载体，可以很容易将其突变，由此获得识别出作为底物的非天然三肽并催化将这些非天然三肽缩合成非天然β-内酰胺的突变酶。

本发明并不限于本文所例举的具体载体。本发明所述DNA化合物能编码构巢曲霉异青霉素N合成酶活性，并且可用于从其他曲霉属菌株分离能编码本发明所述异青霉素N合成酶基因变异体同源DNA化合物。因此，本发明包括与编码异青霉素N合成酶活性的质粒pOG04和pOG0216上编码异青霉素N合成酶的DNA相同的DNA化合物。本发明所述DNA化合物可以用来构建控制在任何宿主细胞中异青霉素N合成的酶表达的表达载体，在该宿主细胞中表达载体复制或整合，并且在该宿主细胞中转录和转译活性序列以表达异青霉素N合成酶活性功能。

本发明所述大肠杆菌表达载体并不限于本文所列举的特异性载体。本发明包括控制大肠杆菌中异青霉素N合成酶表达的任何大肠杆泶镏柿；蛟靥濉Ｒ虼耍痉⒚靼刂埔烨嗝顾豊合成酶表达并利用大肠杆菌功能性复制子的表达载体。所说复制子包括来自像pBR    322，pACYC    184，F，ColV-K94，R1，R6-5或R100这类质粒的逃逸复制子（runaway    replico）或复制子。鉴于本发明还包括表达异青霉素N合成酶活性和利用整合或病毒复制来为宿主细胞的复制和保持作准备的表达载体，因此，本发明决不仅限于质粒载体。

本发明不限于控制编码异青霉素N合成酶活性DNA表达的具体转录和转译活性序列。本发明包括能够表达大肠杆菌异青霉素N合成酶的任何转录和转译活性序列的用途。许多在大肠杆菌中起功能作用的转录和转译活性序列是已知的，并且适用于控制大肠杆菌中异青霉素N合成酶活性的表达。这些转录和转译活性序列包括，但不限于lpp，lac，trp，tac，λPL和λPR转录和转译活性序列。

除前文列举的各种大肠杆菌复制子和转录及转译活性序列外，还可以将来自其他有机体的复制子和转录及转译活性序列连接于本发明所述编码异青霉素N合成酶的DNA化合物，形成控制在宿主细胞中表达异青霉素活性的表达载体。在宿主细胞中，该复制子和活性序列执行其功能。尽管就体外生产异青霉素N合成酶并进一步使之纯化而言，大肠杆菌是最适宜的宿主，但除大肠杆菌之外的其他宿主细胞中促使异青霉素N合成酶活性表达的载体也是有用的，尤其是可用于提高给定有机体产β-内酰胺抗菌素的能力和效率。

许多有机体产生β-内酰胺抗菌素。下表列出了产β-内酰胺抗菌素的有机体，但没有包括所有的这类生物。

表Ⅰ

产β-内酰胺抗菌素的有机体有机体

抗菌素

植物肥大病菌属（Agro    bacterium）    各种β-内酰胺类

构巢曲霉    各种β-内酰胺类

枝顶子孢菌（Cephalosporium    acremo-    青霉素类和头孢菌素类

nium）

色素杆菌属chromobacterium    各种β-内酰胺类

葡糖杆菌属（Gluconobacter）    各种β-内酰胺类

诺卡氏菌属（Nocarelin）

lactamdurans    先锋霉素C.

uniformis    诺卡地素

产黄青霉菌    各种青霉素类和其他β-内酰

胺类

沙雷菌属（Serratia）    各种β-内酰胺类

链霉菌属（Streptomyces）

抗菌素链霉菌    棒酸

argenteolus    arparenomycin    A，

MM    4550和MM    13902

cattleya    thienamycin

chartreusis    SF    1623和先锋霉素A和B

clavuligorus    PA-32413-I，先锋霉素C，

A16886A，青霉素类，头孢菌素

类，棒酸和其他clavams

伞戳疵咕╢imbriatus）    先锋霉素A和B

黄绿色链霉菌（flavovirens）    MM    4450和MM13902.

fulvoviridis    MM    4550和MM13902.

灰色链霉菌（griseus）    先锋霉素A和B，和carpetimy-

cin    A和B.

霍耳斯特德氏链霉菌（halstedi）    先锋霉素A和B，

异形链霉菌（heteromorphus）    C    2081X和先锋霉素A和B.

（hygrosocopicus）    deacetoxycephlosporinc

lipmanii    先锋霉素，青霉素N，7-甲氧基

头孢菌素C，A    16884，MM4550，

MM    13902，

olivaceus    epithienamycim    F，MM4550和

MM13902，

panayensis    C    2081X和先锋霉素A和B.

pluracidomyceticus    pluracidomycin    A.

rochei    先锋霉素A和B.

sioyaensis    MM    4550和MM    13902.

sp.OA-6129.    OA-6129A.

sp.KC-6643    carpetimycin    A.

tokunomen    sis    asphamycin    A.

产绿色链霉菌（viridochsomyrnens）    先锋霉素A和B.

Wadayameusis    WS-3442-D.

许多前述产β-内酰胺抗菌素的有机体在制药工业中用于生产抗菌素。通过在发酵期间增加细胞内抗菌生物合成限速酶的浓度，可以提高这些有机体的产抗菌素能力，使其效率更高。本发明所述编码异青霉素N合成酶活性的DNA化合物可用于构建表达载体。当把这些IPNS表达载体转移到能够通过包括异青霉素N合成酶活性的中间反应产生β-内酰胺抗菌素的宿主细胞内时，该细胞内异青霉素N合成酶活性浓度增加。如果在未经转移的细胞中IPNS活性是β-内酰胺生物合成的限速因子，含有这些IPNS表达载体的宿主细胞与其未转移的宿主细胞相比，可以产生更多的β-内酰胺抗菌素。

转移到某一给定的宿主细胞并能使该细胞内异青霉素N合成酶活性浓度增加的载体需要下列成份：1）编码异青霉素N合成酶活性的DNA化合物;2）转录和转译活性序列，该序列不仅在宿主细胞内起转化细胞的作用，还对控制编码异青霉素N合成酶活性表达起矫正方向和位置的作用;3）供给宿主细胞内载体生长的复制或整合功能。某一DNA载体的整合频率往往完全取决于该宿主细胞编码的活性;但是，经常看到的是：某些DNA序列（即，来自病毒和噬菌体的能加速整合作用的序列和与宿主基因组DNA相同的序列），存在于重组DNA载体时，加速整合作用。当然，IPNS表达载体也可以包括某种给予抗菌素抗性的基因或者是为含有该载体的宿主细胞提供选择手段的某种其他成份，但是，当该载体整合进入宿主细胞的染色体DNA中时，这种选择性成份既不是必要的，也不是有益的。

本发明中的许多质粒可用于增加产β-内酰胺抗菌素细胞中异青霉素N合成酶活性的细胞浓度。质粒pOG04含有构巢曲霉中的完整异青霉素N合成基因，因此，构巢曲霉通过质粒pOG04的染色体整合作用转化，使得异青霉素N合成酶基因复制数目增加，因此导致该酶的细胞内浓度增加。本文引为参照文献的欧洲专利出版物0191221号介绍了各种转化方法，可用于用重组DNA载体转化曲霉属。也可以认为构巢曲霉异青霉素N合成酶基因在枝顶子孢菌和产黄青霉菌中起功能性作用。因此，产黄青霉菌或枝顶子孢菌通过质粒pOG04染色体整合作用转化，导致异青霉素N合成酶基因复制数目的增加，从而导致该酶细胞内浓度增加。

但是，本发明中构巢曲霉IPNS密码序列还受来自青霉属和头孢菌属的转录和转译活性序列的控制，构建未用于这些有机体的重组基因。本文引为参照文献的1986年12月10日出版的欧洲专利申请书，序列号86302873.4，出版物0200425号中公开了枝顶子孢菌IPNS基因的转录和转译活性序列，可以将所述序列融合到本发明所述的构巢曲霉IPNS密码序列，创造控制头孢菌属IPNS表达（当插入表达载体并将该载体引入头孢菌属时）的重组IPNS基因。同样，本文引为参照文献的：1987年6月10日出版的欧洲专利申请书序列号86309075.9，出版物号0225128中公开了产黄青霉IPNS基因的转录和转译活性序列，如前所述，该序列可用构建控制构巢曲霉IPNS表达的青霉属载体。

本发明是克隆完整的起功能作用的构巢曲霉DNA序列的结果，该序列不仅编码异青霉素N合成酶的氨基酸序列，而且也编码控制构巢曲霉中异青霉素N合成酶表达所必须的转录和转译活性序列。同样，本发明的异青霉素N合成酶基因含有位于密码区下游的序列，该序列控制终止转录并提供mRNA多腺甘酸化和执行信号。这些5′和3′调节成份是本发明的一个重要方面。

由于质粒pOG04含有约0.45kb基因组DNA，该基因组DNA位于构巢曲霉基因组中编码异青霉素N合成酶的DNA的下游。因此，质粒pOG04必然含有构巢曲霉异青霉素N合成酶基因的转录和转译活性序列。尽管某些编码核糖核蛋白RNA的DNA序列是由非密码区上游的转录活性序列致活的、但大多数转录和转译活性序列是DNA上游编码致活的。在本文中“上游”意指从编码异青霉素N合成酶的DNA密码链的5′端，以5′取向的DNA。

将以质粒pOG04编码的构巢曲霉转录和转译活性序列正确排列，借以控制编码异青霉素N合成酶活性的DNA表达。就质粒pOG04的构建而言，在位于编码异青霉素N合成酶活性DNA中密码链5′端侧面的DNA中，没有造成转录和转译活性序列缺失或插入。由于位于质粒pOG04上的构巢曲霉转录和转译活性序列可用于控制各种各样的DNA序列表达，因此，该活性序列是本发明的一个重要部分。紧接在质粒pOG04上编码异青霉素N合成酶活性的DNA上游并与其相邻的约450bp    Hind111-ClaⅠ限制片段可以分离得到构巢曲霉异青霉素N合成酶基因的活性序列。ClaⅠ位点编码异青霉素N合成酶蛋白中的氨基酸残基12和13，因此，该HindⅢ-ClaⅠ片段上也可含有异青霉素N合成酶的氨基末端密码区。含有前文所述约450bp    Hind111-ClaⅠ限制片段的任何限制片段必然含有本发明所述构巢曲霉转录和转译活性序列。

下面列出了由质粒pOG04编码的构巢曲霉转录和转译活性序列的DNA序列。这一序列可由化学方法合成，或者从质粒pOG04中分离获得。为了说明在质粒pOG04中该活性序列是如何取向的，用限制酶Hind111中的单链DNA重叠特征解释该限制片段并包括该转译起始密码子。

构巢曲霉DNA序列    由质粒pOG04编码的转录和转译活性序列

素N合成酶密码区的起始。“TAC”补充于5′-ATC-3′，后者编码异青霉素N合成酶中氨基末端甲硫氨酸残基。

构巢曲霉转录和转译活性序列可用于控制构巢曲霉和其他曲霉属中任何DNA序列的表达。可以以几种有用的方法将构巢曲霉异青霉素N合成酶基因的转录启动子与蛋白密码区融合。例如，可以以约400bp    Hind111-Bam    HI片段从pOG04中分离得到5′无密码信息的部分。通过采用合成联结子，尤其是在实施例2中所述的联结子，可愿郊由显?′-ATG转译起始密码子前的其余约55bp5′非密码信息。合成联结子在转译起始位点（如：NdeⅠ或NcoⅠ）可以掺入有用的限制位点，借以加速构巢曲霉启动子与有意义的蛋白密码区融合。为了便于联结，可以采用各种方法将蛋白密码区作类似改编，使之含有多个可相容的末端。对不同的蛋白密码区可采用不同的方法，但在实施例2中所归纳的具体方法，描述了将构巢曲霉异青霉素N合成酶蛋白密码区与大肠杆菌转录启动子和质粒pCZR111上的转译活性序列融合的方法。

类似的方法可以将构巢曲霉异青霉素N合成酶蛋白密码区联结到任何有意义的有机体中的转录启动子和转译活性序列上。例如，可以从有意义有机体中从新构建某一转录启动子，使5′-ATG转译启动位点置于NcoⅠ限制位点5′-ccATGG-3′中。如实施例2所述，可以简单地将在转译启动位点含有NcoⅠ限制位点的构巢曲霉异青霉素N合成酶蛋白密码区联接到有意义的有机体的启动子上，由此产生杂种基因，这种基因控制活性序列起功能作用的任何有机体中构巢曲霉异青霉素N合成酶的表达。与此相似，可以改变该杂种基因的侧末端，以便能够插入适用于有意义有机体的载体内。

质粒pOG04还含有构巢曲霉异青霉素N合成酶基因的3′调节序列。一般在基因密码区的终止密码子的下游约500bp区域内，可编码转录末端，mRNA多腺甘酸化，mRNA执行序列。因此，含有异青霉素N合成酶羧基-末端-编码DNA和下游序列的约0.65kb    HincⅡ-BamHI限制片段也含有构巢曲霉异青霉素N合成酶基因的转录末端、mRNA多腺甘酸化和执行信号。

可以将质粒pOG04中转录末端序列附加到其他重组基因结构中，以简化在那些基因结构的转录终止。例如，HincⅡ限制位点（位于构巢曲霉异青霉素N合成酶氨基酸残基286和287的密码子附近）有利分离转录末端序列，这是由于HincⅡ卵割位点靠近转译末端位点转译在氨基酸残基331之后终止）以及HincⅡ卵割产生加速联接于各种基因结构上的平端之故。位于转译末端位点下游约510bp处的Bam    HI限制酶识别位点提供了方便的远侧末端或下游末端，因此，能够用约650    bp    HincⅡ-Bam    HI限制片段从质粒pOG04分离转录终止子。通过在欲表达密码区的密码链3′末端安置转录末端、mRNA多腺甘酸化和执行信号，可以增加在重组DNA表达载体上某一给定DNA序列的表达。本发明提供了转录末端、mRNA多腺甘酸化和执行信号，该信号可用于增加曲霉菌中重组DNA载体和有关宿主细胞的任何基因产物的表达。

本发明提供了用于构巢曲霉异青霉素N合成酶基因的密码序列，以及提供了许多控制宿主细胞（如：大肠杆菌）中该基因表达的表达载体。以大肠杆菌生产异青霉素N合成酶便于高水平表达并易于该酶的分离，所以该酶可用于体外催化将新的三肽缩合成新的抗菌素核心结构。用控制所述有意义宿主细胞中表达异青霉素N合成酶的本发明所述表达载体转化构巢曲霉，枝顶孢子菌，产黄青霉和其他产β-内酰胺抗菌素宿主细胞，可收到更高水平表达异青霉素N合成酶的效果，因此，在经过转化的细胞中得到更高水平的抗菌素。

下例实施例仅对本发明作出进一步说明和举例，并不对本发明的范围构成任何限制。

实施例1

大肠杆菌k12    JM109/pOG04的培养和质粒pOG04的分离

A.大肠杆菌k12    JM109/pOG04的培养

从美国北方研究室（Peoria，IL    61604）得到大肠杆菌k12    JM109/pOG04的冻干体，其保藏号为NRRL    B-18171（保藏日期：1987年2月6日）。在下述方法中，该冻干体可直接作为“培养物”使用。

用大肠杆菌k12    JM109/pOG04培养物接种一升含有50μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤（每升中含有10g    fryptone-一种胰蛋白酶水解产生的胨，10g    NaCl，5g酵母膏，并于37℃气化保温，直到在590nm（O.D.590）时光密度约为1吸收单位为止，此时，向该培养物中加入150mg氯霉素。连续保温约16小时，加入氯霉素抑制蛋白合成，因此，进一步抑制细胞分裂，但使质粒复制得以连续进行。

B.分离质粒pOG04

在Sorvall    GSA回旋器（DuPont    Co.，Instrument    Products，Biomedical    Division，Newtown，CN    06470）中，于4℃，将实施例1A中制得的培养物以6000rpm离心5分钟。弃去所得上清液，在40ml    TES缓冲液（10mM    Tris-HCl，pH＝7.5;10mM    NaCl;1mM    EDTA）中洗涤细胞片状沉淀物，然后再使其呈片状物。再次弃去上清液，将细胞片状物冰冻在干冰-乙醇浴中，然后融化。将融化后的细胞片状物再悬浮于10ml含25%蔗糖和50mM    EDTA的溶液中。加入约1ml浓度为5mg/ml的溶菌酶溶液;3m    10.25M的EDTA.pH＝8.0;和100μl浓度为10mg/ml的RNA酶A，并与前述溶液混合，然后在冰中将其保温15分钟。向该用溶菌酶处理过的细胞中加入3ml溶菌酶溶液（将3ml    10%的Triton-X100;75ml    0.25M的EDTA，pH＝8.0;15ml    1M的Tris-HCl，pH＝8.0;和7ml水混合），混合后将所得溶液在冰中再保温15分钟。在干冰-乙醇浴中将该溶菌细胞冻结，然后融化。

通过在SW27回旋器（Beckman，7360    N，Lincoln    Ave，Lincoln    wood，IL    60646）中，以25000rpm离心40分钟，并用缓冲酚提取，从上述溶液中除去细胞碎片。向该溶液加入约30.44g    CsCl和约1ml浓度为5mg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溶液;然后将体积调至40ml，并将其倒入一支VTi50超速离心管（Beckman）中，将该管密封，并将该溶液在VTi50回旋器中以42000rpm离心约16小时。分离紫外光下可见的所得质粒染色带，然后将其置于Ti75管（用含有0.761g/ml    CsCl的TES进行体积调整）和回旋器（Beckman）中，并以50，000rpm离心16小时。再次分离质粒染色带，用盐饱和的异丙醇提取，借以除去溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶，并按1∶3用TES缓冲液稀释。然后向在-20℃保温过夜该溶液中加入2倍体积的乙醇。通过在SS34回旋器（Sorvall，DuPont，Co.，Newton，CT    06470）中，以10，000rpm将该溶液离心15分钟使质粒DNA成片状。

将由此方法得到的约1mg质粒pOG04    DNA悬浮于1ml    TE缓冲液（10mM    Tris-HCl，pH＝8.0和1mM    EDTA）中，并于-20℃保存。附图2描述了质粒pOG04的限制位点和功能图。

实施例2

质粒pOGO216的构建

通过将下列四个DNA片段连接在一起构建质粒pOGO216：质粒pOG04    DNA中约1.6kb    Cia    I-Bg1    Ⅱ限制片段，该片段含有几乎与构巢曲霉IPNS密码序列中IPNS氨基-末端-编码部分一样的成份;Nco    Ⅰ-CiaⅠ双链DNA联结子，该联结子组成用于构巢曲霉IPNS氨基末端的密码序列;pCZR111衍生物的质粒DNA中约5.3kbEco    RI-Bam    HI限制片段，该片段含有用全cI857阻遏物、质粒的复制起点，给予四环素抗性基因的DNA序列密码;前述pCZR111衍生物表达载体的质粒DNA中约500bp    Eco    RI-NcoI限制片段。该pCZR111衍生物仅在转译活性序列和下游蛋白密码序列方面不同于母体质粒pCZR111。本领域中的普通工作人员都认为，不同的质粒可以含有编码启动子的共同的DNA序列，转译活性序列，复制起点和给予抗菌素抗性的基因。与其硬行选择DNA序列源还不如设计往往更为方便，例如，制备质粒并使之使用方便。为了便于描述，采用质粒pCZR111    DNA描述质粒pOGO216的构建，前者用作编码λpl启动子的DNA序列，质粒复制起点，cI857基因，给予四环素抗性基因的来源;质粒pOG04作为几乎所有构巢曲霉IPNS密码序列中氨基末端编码部分的源质粒;双链合成DNA联结子作为双顺反子转译活性序列和构巢曲霉IPNS密码序列的氨基末端编码部分的DNA密码源。

A.大肠杆菌k12    RV    308/pCZR111的培养和质粒pCZR111的分离

大肠杆菌k12    RV    308/pCZR111冻干体从NRRL获得，保藏号为NRRL    B-18249（保藏日期：1987年8月11日）。在L肉汤中重建该冻干体;按基本上与实施例1中所述相同方法，将所得培养物用于制备质粒pCZR111    DNA。但是，由于在质粒pCZR111上的可选择标记基因是给予四环素抗性基因，所以培养基中含有10μg/ml四环素，而不含氨苄青霉素。另外，在25-30℃，而不是37℃，将该培养物保温，以防止λpl启动子转录。用这一方法获得的约1mg质粒pCZR111    DNA，并将其溶于约1ml    0.1X    TE缓冲液中。附图4描述了质粒pCZR111的限制位点和功能图。

B.质粒pCZR111约5.8kb    XbaⅠ-Bam    HI限制片段的分离

将由实施例2A中制得的大约25μg（在25μ10.1X    TE缓冲液中）质粒pCZR111    DNA加到40μl    10X    XbaⅠ缓冲液（500mM    Tris-HCl，pH＝8.0;500mM    NaCl;100mM    NaCl;100mM    MgCl），335μl水，2μl（50单位）限制酶Bam    HI和3μl（60单位）限制酶XbaⅠ中，并使之混合。除另有说明，本文所述限制酶均可从New    England，Biolabs，32    Tozer    Road，Beverly，MA    01915获得。本文单位的定义与具体制造商的单位定义相符。将所得反应物在37℃保温90分钟，通过用乙醇和NaOAc沉淀浓缩DNA，并离心收集。将该DNA片状物再悬浮于约80μl水和约20μl    5X负载缓冲液（70%甘油，50mM    EDTA，1mg/ml溴酚蓝）中，在约1.0%琼脂糖硅胶上进行电脉，直到从其他消化产物（约600bp    XbaⅠ-Bam    HI限制片段）中清楚地分离出所期望的约5.8    kb    XbaⅠ-Bam    HI限制片段。在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶稀溶液中（约1μg/μl）将该胶染色，并将其暴露于长波紫外光下，使电脉后的DNA显现。

将所期望的片段定位，从该胶中切割，并用与制造商说明书基本一致的方法，用D-Gel    DNA电子洗脱器（Epigene，Box    4817，Baltimore，MD，21211）回收约5.8    kb    XbaⅠ-Bam    HI限制片段。将两倍体积的乙醇加到DNA中，并用500μl    1M的NaCl从洗脱器中回收。所得溶液在-20℃保温约5小时，然后以15，000rpm离心20分钟。该DNA片状物先用70%乙醇，然后用100%乙醇漂洗，干燥，再悬浮于20μl    0.1X的TE缓冲液体中。这一溶液组成约2μg所期望约5.8    kb    XbaⅠ-Bam    HI限制片段，并于-20℃保存。

C.从大肠杆菌k12    GM48中制备质粒pOG04    DNA

用dam⁺大肠杆菌菌株将位于构巢曲霉异青霉素N合成酶密码序列中氨基酸残基13和14的密码子附近的ClaⅠ限制位点甲基化，其原因在于前面所述ClaⅠ识别序列的“G”残基产生5′-GATC-3′序列，用dam基因产物在“A”残基将该序列甲基化。由于当识别序列中无论哪一个“A”残基被甲基化时ClaⅠ限制酶不会断裂，因此，必须从大肠杆菌（如：大肠杆菌k12 GM48）的dam^-突变菌株中制备质粒pOG04 DNA，由此分离用于构建质粒pOGO    216的质粒pOG04的约1.6kb    ClaⅠ-BglⅡ限制片段。

从美国北方研究室获得大肠杆菌k12    GM    48，保藏号为NRRL    B-15725（保藏日：1983年11月23日）。将大肠杆菌k12    GM48细胞冻干体接种到约100ml    L肉汤中，在37℃将该培养物保温，直到在600nm处吸收值约为0.5-0.7为止。常压已有各种方法制备用醋母惺芴蟪Ω司赴Ｏ挛慕樯芤恢终饫喾椒ā＝孟赴?000xg离心5分钟，在50ml冷却的无菌10mM    NaCl中清洗，再离心。然后将该细胞小心地再悬浮于2-5ml冷却的无菌75mM    CaCl中，使其处于可转化的感受态。将实施例1A中制得的约100ng质粒pOG04    DNA加到200μl大肠杆菌GM    48细胞中，将该混合物用冰保温1小时，再在42℃保温2分钟，接着用2ml    L肉汤稀释，并在无振荡下，于37℃保温1小时。将上述整部分铺在含100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂平皿上，并将该平皿于37℃保温过夜。长出单个的耐氨苄青霉素菌落，并基本按照实施例1中所述方法从大肠杆菌GM48/pOG04转化株中制得质粒pOG04    DNA。

D.编码异青霉素N合成酶的质粒pOG04约1.6kb    ClaⅠ-BglⅡ限制片段的分离

将约25μg（于25μl    TE缓冲液中）在实施例2C中制得的质粒pOG04    DNA溶于10μl    X    ClaⅠ缓冲液（0.5M    NaCl;0.06M    Tris-HCl，pH＝7.9，0.06M    Mg    Cl;1mg/ml    BSA）和60μl水中。将约5μl（50单位）限制酶ClaⅠ加到上述质粒pOG04    DNA溶液中，将所得反应物在37℃保温2小时，然后将约5μl（50单位）限制酶BglⅡ加到该反应混合物中，将所得反应物在37℃再保温2小时。将所得CalⅠ-BglⅡ消化的DNA装载在1%琼脂糖硅胶上，分离所期望的约1.6kb    NcoⅠ-BglⅡ限制片段，纯化，准备联接。获得约2μg所期望的片段，悬浮于20μl    TE缓冲液中，并于-20℃保存。

E.XbaⅠ-CalⅠ联结子的构建

用DNA自动合成仪可以合成两条互补单链DNA片段，随后退火形成双链片段。许多DNA合成仪器在本领域是公知的，并适于制备该片段。这种仪器之一是ABS    380ADNA合成仪（Applied    Biosystems，Inc.850    Lincoln    Centre    Dr.，Forter    City，CA    94404）。另外，基本上按下列文献所述方法也很容易制备该片段：Itakura    et    al.，1977，Science，198：1056和Crea    et    al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：5765。

合成了下列联结子：

5′-CTAGAGGGTATTAATAATGTATCGCGATTTAAATAAGGAGGAATAAACCATGGGTTCAGTCAGCAAAGCCAATGTTCCAAAGAT-3′

5′-CGATCTTTGGAACATTGGCTTTGCTGACTGAACCCATGGTTTATTCCTCCTTATTTAAATCGCGATACATTATTAATACCCT-3′

在彼此分开的50μl含有下列成份的反应物中，将约100pmols的每条单链DNA片段激酶化，上述反应物中含有：单链DNA片段，5μl    10X连接酶缓冲液，5μl    5mM    ATP，水（用以将最后反应物体积调至50μl），1μl（约10Richardson单位）T4多核苷酸激酶。在37℃，将该反应物保温30分钟。然后将两个反应物合并，将所得100μl反应混合物加热到90℃，然后缓慢冷却至4℃，使互补单链DNA片段获得最佳退火。所得双链DNA片段，即联结子为：

这一联结子将pCZR111-衍生片段的XbaⅠ末端连接到质粒pOG04-衍生物片段的ClaⅠ末端，重新构建构巢曲霉异青霉素N合成酶的氨基末端密码序列，并且还编码转译活性DNA序列。

F.最后构建质粒pOGO    216

将1μl质粒pCZR111的约5.8kb XbaⅠ-Bam HI限制片段，1μl质粒pOG04的约1.6kb ClaⅠ-BglⅡ限制片段和约1μl（约1pmole）经过嘶鸬暮铣闪嶙恿釉谝黄穑纬芍柿OGO 216。整个反应物体积为20μl，并含有DNA片段，2μl 10X的连接酶缓冲液（0.5M Tris-HCl，pH＝7.5，100μM MgCl₂），2μl 5mM，ATP，1μl的6μg/μl BSA溶液，9μl水，1μl（1Weiss单位）T4 DNA连接酶（Boehringer-Mannheim Biochemicals（BMB），P.O.Box 50816，Indianapolis，IN 46250）。将该反应物在15℃保温约18小时。联结的DNA组成所期望的质粒pOGO 216。附图3说明了质粒pOGO216的限制位点和功能图。

实施例3

大肠杆菌k12    RV308/pOGO216的构建和

大肠杆菌产异青霉素N合成酶的测定

A.用质粒pOGO216转化大肠杆菌k12    RV308

按下述方法可以制得用于转化的感受态大肠杆菌k12 RV308细胞。50ml大肠杆菌k12，RV308的培养物（NRRL B-15624）（保藏日期：1983年11月23日）在L-肉汤中生长到O.D.590约为0.5吸收单位。用冰将该培养物冷却10分钟，离心收集细胞。将该细胞片状物再悬浮于25ml冷的100mM CaCl₂中，用冰保温25分钟。通过离心再次将细胞制成片状，将其再悬浮于2.5ml冷的100mM CaCl₂中，用冰保温过夜。

将200μl该细胞悬浮液与实施例2F中制得的联结DNA相混合，然后用冰保温20分钟。离心收集细胞，再悬浮于约1ml    L肉汤中，然后在30℃保温1小时。将该细胞混合物等分铺在含10μg/ml四环素的L-琼脂（L-肉汤加15g/L琼脂）板上。将该板在30℃保温。通过对四环素抗性的选择作用和转化株质粒DNA的限制酶分析，鉴定为大肠杆菌K12    RV308/pOGO216转化株。基本按实施例1B的方法（但规模更小），从用于限制酶分析大肠杆菌K12    RV308/pOGO216转化株中得到质粒DNA，并且省去了CsCl梯度步骤。

B.用于表达异青霉素N合成酶活性的大肠杆菌K12    RV308/pOGO216培养物

逐个将大肠杆菌K12    RV308/pOGO216转化株的几个分离体接种到5ml等份含10μg/ml四环素的L肉汤中，将这些培养物在气振保温器中于30℃保温，直到O.D.590约为0.2吸收单位为止。然后将该培养物转移到42℃的气振保温器中，并于42℃保温约6小时。

在42℃保温6小时后，每种培养物收集1毫升，通过离心将细胞制成片状。用1ml 10mM NaCl逐个洗涤细胞片状物，然后再悬浮于1.0ml IPNS提取缓冲液（0.05M Tris-HCl，pH＝8.0;0.01M KCl;0.01M MgSO₄）中。采用微型喷嘴和细胞声破碎器（Sonifier Cell Disrupfor，ModelW185，Heat-Systems-Ultrasonics，Inc.，Plainview.Long Island，NY，）释放六，五秒超声脉冲将细胞超声粉碎。超声脉冲间的时间为60秒，在该过程中，将该混合物保持在冰-乙醇浴中，超声粉碎后，将该细胞混合物离心除去碎片，然后直接进行分析。

C.异青霉素N合成酶活性的测定

下列测定方法来自于Shen等在“J.of    Antibiotics    37（9）：1044-1048，1984”中所述的方法。以总体积500μl进行异青霉素N合成酶的测定反应。为引发反应，加入1.0ml    1.4mM    δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-缬氨酸和3.75mM DTT的溶液，在室温下反应30-60分钟，以便将任何二聚三肽还原到单聚合体。将下列等份的每种原种溶液50μl加到每一测试管（无菌，玻璃，可使用13×100mm管）：500mM Tris-HCl，pH＝7.4;100mM KCl;100mM MgSO₄;2.0mM FeSO₄;6.7mM抗坏血酸。随之改变提取物的量，加水稀释至150μl。然后将等份的约100μl该三肽溶液加到每一支管子中;加入三肽便开始反应。加入底物使每只管子形成旋涡。然后将该反应混合物容器置于250rpm旋转振荡浴中，并于25℃保温。反应时间为45分钟。

反应45分钟后，取出每份100μl的两份试样，并分散于生物测试板的各个井中，在剩余的样品中加入100单位的青霉素酶A。该酶从Riker′s    Laboratories，Inc.获得，以每瓶100，000单位的包装出售，用水化处理过的青霉素酶A加到每一剩余反应混合物中，于室温下反应5分钟，然后将100μl每份经青霉素酶A处理过的提取物分布于生物测试板井中。经用青霉素酶A处理测得生物测定板上的区带是由于青霉素而不是头孢菌素或其他污染所致。

通过在生物测定中加入0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μg青霉素N得到青霉素N标准曲线。通过将5μl酶制剂加到约200μl    0.2μg/ml青霉素N中，还测得青霉素酶A活性。

该生物测定板由K131营养琼脂组成，该琼脂的制备方法为：将30.5g    BBL抗菌素培养基＃11（Becton    Dickinson    &    Company，Coclseysville，MD）溶于1升去离子水中，将该溶液煮沸，冷却至70℃，然后在121℃，15psi的高压釜中灭菌35分钟。该板以每700ml琼脂用4ml藤黄细球菌（Micrococcusluleus）（ATCC    9341）新鲜过夜培养物接种。M.luteus在k544营养肉汤中生长，该肉汤的组成为：在1升去离子水中加入：Difco蛋白胨5.0g;Difco酵母膏1.5g;氯化钠3.5g;磷酸氢二甲（无水）3.7g;磷酸二氢钾1.3g;Difco牛肉膏1.5g。将该溶液煮沸，冷却至25℃，用1NHCl或1N    NaOH调至pH＝7.0，然后使用前在121℃和15psi灭菌20分钟。接种后的琼脂分布在100×15mm板中，每板15ml接种琼脂。采用可移动5ml液管通过抽气制备井;每一井直径为10mm。

制得板并把样品分布于井中后，将板在37℃保温器中放置18小时。通过测定每一样品井周围的清洁面积的直径获得测定结果，即有青霉素存在时，M.luteus不能生长。

测定结果表明：大肠杆菌K12    RV308/pOGO216转化株表达异青霉素N合成酶活性。

表Ⅱ

菌株    溶菌区带（mm）

RV308    0

RV308/pOGO216    25

（-青霉素酶A）

RV308/pOGO216    9

（+青霉素酶A）

单用青霉素酶A    0

采用Pang    et    al.，“Biochem.J.222，789-785（1984）”所述方法可纯化该酶。

勘误表

Claims (8)

1、一种在重组体宿主细胞中表达曲霉属异青霉素N合成酶活性的方法，该方法包括：

(1)用重组DNA表达载体转化宿主细胞，该载体包括：

(a)在宿主细胞中起功能作用的启动子和转译活性序列；和

(b)编码曲霉属异青霉素N合成酶活性的DNA序列，所述序列的排例适用于从启动子和转译活性序列表达；和

(2)在允许曲霉属异青霉素N合成霉活性表达的条件下培养在步骤(1)中经过转化的宿主细胞。

2、权利要求1所述方法，其中编码曲霉属异青霉素N合成酶活性的重组DNA序列包括氨基酸残基序列：

H₂N-MET GLY SER VAL SER LYS ALA ASN VAL PRO LYS ILE ASP VAL SER PRO LEU PHE GLY ASP ASP GLN ALA ALA LYS MET ARG VAL ALA GLN GLN ILE ASP ALA ALA SER ARG ASP THR GLY PHE PHE TYR ALA VAL ASN HIS GLY ILE ASN VAL GLN ARG LEU SER GLN LYS THR LYS GLU PHE HIS MET SER ILE THR PRO GLU GLU LYS TRP ASP LEU ALA ILE ARG ALA TYR ASN LYS GLU HIS GLN ASP GLN VAL ARG ALA GLY TYR TYR LEU SER ILE PRO GLY LYS LYS ALA VAL GLU SER PHE CYS TYR LEU ASN PRO ASN PHE THR PRO ASP HIS PRO ARG ILE GLN ALA LYS THR PRO THR HIS GLU VAL ASN VAL TRP PRO ASP GLU THR LYS HIS PRO GLY PHE GLN ASP PHE ALA GLU GLN TYR TYR TRP ASP VAL PHE GLY LEU SER SER ALA LEU LEU LYS GLY TYR ALA LEU ALA LEU GLY LYS GLU GLU ASN PHE PHE ALA ARG HIS PHE LYS PRO ASP ASP THR LEU ALA SER VAL VAL LEU ILE ARG TYR PRO TYR LEU ASP PRO TYR PRO GLU ALA ALA ILE LYS THR ALA ALA ASP GLY THR LYS LEU SER PHE GLU TRP HIS GLU ASP VAL SER LEU ILE THR VAL LEU TYR GLN SER ASN VAL GLN ASN LEU GLN VAL GLU THR ALA ALA GLY TYR GLN ASP ILE GLU ALA ASP ASP THR GLY TYR LEU ILE ASN CYS GLY SER TYR MET ALA HIS LEU THR ASN ASN TYR TYR LYS ALA PRO ILE HIS ARG VAL LYS TRP VAL ASN ALA GLU ARG GLN SER LEU PRO PHE PHE VAL ASN LEU GLY TYR ASP SER VAL ILE ASP PRO PHE ASP PRO ARG GLU PRO ASN GLY LYS SER ASP ARG GLU PRO LEU SER TYR GLY ASP TYR LEU GLN ASN GLY LEU VAL SER LEU ILE ASN LYS ASN GLY GLN THR-COOH

其中ALA是丙氨酸残基，ARG是精氨酸残基，ASN是天门冬酰胺残基，ASP是天冬氨酸残基，-COOH是羧基末端，CYS是半胱氨酸残基，GLN是谷氨酰胺残基，GLU是谷氨酸残基，GLY是甘氨酸残基，HIS是组氨酸残基，H₂N-是氨基末端，ILE是异亮氨酸残基，LEU是亮氨酸残基，LYS是赖氨酸残基，MET是甲硫氨酸残基，PHE是苯丙氨酸残基，PRO是脯氨酸残基，PHE是苯丙氨酸残基，PRO是脯氨酸残基，SER是丝氨酸残基，THR是苏氨酸残基，TRP是色氨酸残基，TYR是酪氨酸残基，VAL是缬氨酸残基。

3、权利要求1或2所述方法，其中编码异青霉素N合成酶活性的重组DNA序列包括DNA序列：

5′-ATG  GGT  TCA  GTC  AGC  AAA  GCC  AAT  GTT  CCA  AAG  ATC  GAT  GTT  TCT  CCC  CTG  TTT  GGA  GAC  GAC  CAA  GCA  GCC  AAA  ATG  AGA  GTA  GCC  CAG  CAA  ATC  GAC  GCC  GCT  TCG  CGT  GAT  ACT  GGG  TTT  TTC  TAC  GCC  GTC  AAC  CAT  GGG  ATC  AAT  GTG  CAG  CGA  CTC  TCG  CAG  AAG  ACC  AAG  GAG  TTT  CAT  ATG  TCT  ATC  ACA  CCT  GAG  GAA  AAG  TGG  GAC  CTT  GCG  ATT  CGT  GCC  TAC  AAC  AAA  GAG  CAC  CAG  GAC  CAA  GTC  CGT  GCC  GGA  TAC  TAC  CTG  TCC  ATC  CCC  GGG  AAA  AAG  GCA  GTC  GAG  TCC  TTC  TGC  TAC  CTT  AAC  CCG  AAC  TTC  ACG  CCC  GAT  CAT  CCC  CGT  ATC  CAG  GCC  AAG  ACT  CCC  ACT  CAC  GAG  GTA  AAC  GTG  TGG  CCA  GAC  GAG  ACC  AAG  CAC  CCT  GGT  TTC  CAA  GAC  TTT  GCC  GAG  CAG  TAT  TAC  TGG  GAT  GTT  TTC  GGT  CTC  TCT  TCT  GCA  CTG  CTC  AAG  GGC  TAC  GCC  TTG  GCA  TTA  GGC  AAA  GAG  GAG  AAT  TTC  TTC  GCT  CGC  CAC  TTC  AAG  CCA  GAC  GAT  ACT  CTT  GCC  TCG  GTT  GTG  CTG  ATC  CGC  TAC  CCT  TAC  CTG  GAT  CCC  TAC  CCC  GAG  GCT  GCT  ATC  AAG  ACG  GCG  GCC  GAC  GGC  ACC  AAA  CTG  AGT  TTT  GAG  TGG  CAT  GAG  GAT  GTA  TCC  CTA  ATC  ACT  GTG  CTT  TAC  CAG  TCC  AAC  GTG  CAG  AAC  CTG  CAG  GTA  GAA  ACT  GCT  GCC  GGG  TAT  CAA  GAT  ATC  GAC  GCC  GAC  GAT  ACT  GGC  TAC  TTG  ATC  AAC  TGC  GGC  AGT  TAC  ATG  GCA  CAT  CTC  ACA  AAC  AAC  TAC  TAT  AAA  GCG  CCC  ATC  CAT  CGG  GTG  AAA  TGG  GTT  AAT  GCA  GGC  CAG  TCC  CTG  CCA  TTC  TTC  GTC  AAC  CTG  GGA  TAC  GAC  AGC  GTG  ATT  GAT  CCA  TTT  GAT  CCC  GGA  GAA  CCC  AAT  GGC  AAG  TCT  GAT  CGG  GAG  CCA  CTC  TCC  TAC  GGC  GAC  TAT  TTG  CAA  AAC  GGC  CTG  GTG  AGT  TTG  ATC  AAC  AAG  AAC  GGC  CAG  ACC-3′

其中A是脱氧腺苷基，G是脱氧乌苷基，C是脱氧胞苷基，T是胸苷基。

4、权利要求1或2所述方法，其中包括重组DNA载体质粒POG04或POG0216。

5、权利要求1所述方法，其中重组宿主细胞是大肠杆菌、曲霉属、头孢菌属，或青霉菌属。

6、权利要求1所述方法，其中在步骤（2）中培养的重组宿主细胞是大肠杆菌K12  JM  109/POG0216。

7、制备重组DNA载体的方法，包括将编码曲霉异青霉素N合成酶活性序列的DNA序列联接在一起。

8、用质粒POG0216转化的微生物大肠杆菌K12  JM109。

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