KR100648480B1

KR100648480B1 - 세팔로스포린의 개선된 생체내 생산

Info

Publication number: KR100648480B1
Application number: KR1020007012957A
Authority: KR
Inventors: 니에보에르마아르텐; 보벤베르그로엘로프아리란스
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 1998-05-19
Filing date: 1999-05-19
Publication date: 2006-11-24
Also published as: ID27054A; RU2230790C2; EP1078069B1; ATE386123T1; DE69938129D1; MXPA00011223A; US6995003B1; AU4144999A; CN1301303A; PL344863A1; CN100390285C; US20060127972A1; CN101353660A; JP2003527069A; ZA200006308B; BR9910532A; WO1999060102A2; EP1078069A2; EP1953230A1; ES2302379T3

Abstract

본 발명은, 보다 높은 생산량으로 아실화된 세팔로스포린의 개선된 생체내 생산을 위한, DNA, 상기 DNA를 전사, 번역 또는 발현할 수 있는 이형 숙주세포 및 그러한 숙주세포와 그것의 배양물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 숙주세포의 세포질에 주로 국소화되는(퍼옥시좀 또는 미소체안에 또는 그것과 함께 주로 국소화되는 것과는 반대로) 익스팬다제 활성을 가지는 효소를 포함하는 숙주세포가 제공된다.

세팔로스포린, 페니실린, 퍼옥시좀, 미소체, 국소화, 익스팬다제, 확장, 세포질

Description

세팔로스포린의 개선된 생체내 생산{IMPROVED IN VIVO PRODUCTION OF CEPHALOSPORINS}

본 발명은 재조합 DNA 기술의 분야에 속한다. 보다 상세히, 본 발명은, 유전학적으로 변형된 숙주 유기체, 그렇게 변형된 숙주 유기체는 물론, 그안에서의 사용을 위한 DNA를 이용하는, 세팔로스포린의 생산의 분야에 속한다. 게다가, 본 발명은 상기 숙주세포안에서 재조합 DNA로부터 발현된 변형된 효소에 관계한다.

β-락탐 항생물질은, 임상사용의 긴 역사를 가진 가장 중요한 군의 항생 화합물이다. 이 군중에서, 두드러진 것들은 페니실린과 세팔로스포린이다. 이 화합물들은 각각 Penicillium chrysogenum과 Acremonium chrysogenum과 같은 사상균류에 의하여 자연적으로 생산된다.

고전적인 균주 개선기술의 결과로, P. chrysogenum과 A. chrysogenum에서의 항생물질의 생산수준이 과거 몇십년에 걸쳐 극적으로 증가해왔다. 페니실린과 세팔로스포린으로 이끄는 생합성 경로에 대한 지식이 증가하고 재조합 DNA 기술이 도래함에 따라, 생산 균주의 개선 및 이 화합물들의 생체내 유도체화를 위한 새로운 도구가 이용가능해졌다.

Ingolia와 Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245-264 (생합성 루트와 효 소) 및 Aharonowitz, Cohen, 및 Martin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461-495(유전자 클로닝)에서 찾아질 수 있는 것과 같이, β-락탐 생합성에 수반되는 대부분의 효소가 확인되었고 그것의 상응하는 유전자가 클로닝되었다.

P. chrysogenum에서의 페니실린의 생합성에서 처음 두 단계는 세 아미노산 L-5-아미노-5-카르복시펜타노산(L-α-아미노아디프산)(A), L-시스테인(C) 및 L-발린(V)이 트리펩티드 LLD-ACV로 농축되는 것과, 뒤이어 이 트리펩티드가 고리화되어 이소페니실린 N을 형성하는 것이다. 이 화합물은 전형적인 β-락탐구조를 포함한다.

세번째 단계는, 효소 아실트랜스퍼라제의 작용에 의하여 L-5-아미노-5-카르복시펜타노산의 친수성 측쇄가 소수성 측쇄에 의하여 교환되는 것을 수반한다. 아실트랜스퍼라제에 의해 매개되는 효소적 교환반응은, EP-A-0 448 180에서 기술된 바와 같이, 세포상의 세포소기관인 미소체내에서 일어난다.

세팔로스포린은 페니실린보다 훨씬 더 고가이다. 한 이유는 어떤 세팔로스포린(예를 들어, 세팔렉신)이 많은 화학적 전환에 의하여 페니실린으로부터 만들어진다는 것이다. 또하나의 이유는, 지금까지 D-5-아미노-5-카르복시펜타노일 측쇄를 가진 세팔로스포린만이 발효성 전환될 수 있었다는 것이다. 이 점에서 지금까지 가장 중요한 출발물질인 세팔로스포린 C는 어떤 pH에서건 물에 매우 용해성이어서, 성가시고 고가인 칼럼기술을 이용한 길고 비싼 분리과정들을 암시한다. 이 방법으로 얻어진 세팔로스포린 C는 많은 화학적 및 효소적 전환에 의하여 치료상 사용되는 세팔로스포린으로 전환되어야 한다.

중간물질 7-ADCA를 제조하기 위해 공업에서 지금 장려되는 방법은 페니실린 G의 확장(expansion)과 유도체화로 이끄는 복잡한 화학적 단계들을 수반한다. 7-ADCA를 생산하기 위해 필수적인 화학적 단계들중 하나는 5-원 페니실린 고리구조의 6-원 세팔로스포린 고리구조로의 확장을 수반한다(예를 들어, US 4,003,894를 참조). 이 복잡한 화학적 가공은 고가이고 환경에 유해하다.

결과적으로, 그러한 화학적 과정들을, 바람직하게는 생체내 과정에서의 효소적 촉매작용과 같은 효소적 반응으로 대체하려는 많은 욕구가 있다. 효소적 및 생체내 과정에 의한 화학적 확장과정의 대체로의 열쇠는 세팔로스포린 생합성 경로에서의 중심적인 효소, "익스팬다제(expandase)"라고도 불리는 데사세톡시세팔로스포린 C 합성효소(DAOCS)이다.

박테리아 Streptomyces clavuligerus로부터의 익스팬다제 효소는, 어떤 경우에 페니실린 고리확장을 수행하는 것으로 알려졌다. P. chrysogenum으로 도입될 때, Cantwell 등, Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283-289에서 기술된 대로, 그것은 생체내에서 페니실린 고리구조를 세팔로스포린 고리구조로 전환시킬 수 있다. 익스팬다제 효소는 생화학적으로 그리고 기능적으로 잘 특성지워져 왔고(EP-A-0 366 354), 그것의 상응하는 유전자 cefE도 그러하다. cefE 유전자의 물리적 지도(EP-A-0 341 892), DNA 서열 및 cefE를 이용한 P. chrysogenum에서의 형질전환 연구가 둘다 기술되어 왔다.

고리확장 효소를 위한 또하나의 공급원은 예를 들어, 박테리아 Nocardia lactamdurans(형식적으로 Streptomyces lactamdurans) 및 균류 Acremonium chrysogenum (형식적으로 Cephalosporium acremonium)이다. Cephalosporium으로부터의 익스팬다제는 익스팬다제(고리-확장)는 물론 3-히드록실화 활성을 가지는 이기능 효소이다. 이 효소의 생화학적 성질과 유전자의 DNA 서열이 둘다 기술되어 있다(각각, Cortes et al., J. Gen. Microbiol. 133 (1987), 3165-3174; 및 Coque et al., Mol. Gen. Genet. 236 (1993), 453-458).

이 익스팬다제는 페니실린 N의 5-원 티아졸리딘 고리의, DAOC의 6-원 디히드로티아진 고리로의 확장을 촉매하기 때문에, 이 효소는 화학적 과정의 고리확장 단계를 대체할 논리적인 후보일 것이다. 불행하게도, 이 효소는 세팔로스포린 생합성 경로의 페니실린 N 중간물질상에 작용하지만, 페니실린 V 또는 페니실린 G와 같은, P. chrysogenum에 의하여 생산되어 쉽게 이용가능한 저렴한 페니실린상에는 작용하지 않거나 비교적 비효율적으로 작용한다. 페니실린 N은 상업적으로 이용가능하지 않고, 확장될 때조차 그것의 D-5-아미노-5-카르복시펜타노일 측쇄는 페니실린 아실라제에 의하여 쉽게 제거될 수 없다.

최근에, 이 익스팬다제 효소가, 비-자연적으로 발생하는 측쇄를 가진 페니실린을 상응하는 7-ADCA 유도체로 확장시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 측쇄는 아디프산염(5-카르복시-펜타노산)과 다양한 다른 화합물들을 포함한다. 이 익스팬다제의 이 특질은, EP-A-0 532 341에서 개시된 바와 같이, Penicillium chrysogenum에서의 아디포일-7-ADCA의 생체내 생산을 위한 과정에서 개발되어 왔다. Penicillium chrysogenum 균주를 Streptomyces clavuligerus 익스팬다제로 형질전환시켜, 이 형질전환체들에 아디프산을 공급할 때 아디포일-6-아미노페니실란산(아 디포일-6-APA)을 생산하게 한다. 그다음에, 아디포일-6-APA는 아디포일-7-ADCA로 "확장"된다. 다양한 다른 7-아실화된 세팔로스포린의 생산은 WO95/04148과 WO95/04149에서 개시되어 있다. WO95/04148과 WO95/04149에서, 배지로의 3'-카르복시메틸 티오프로피온산과 3,3'-티오디프로피온산의 첨가는 익스팬다제를 위한 기질인 페니실린을 산출하여 각각 2-(카르복시에틸티오)아세틸-7-ADCA와 3-(카르복시메틸티오)프로피오닐-7-ADCA의 합성을 이끌어낸다.

익스팬다제가 상이한 측쇄를 가진 페니실린상에 활성을 보인다고 하더라도, 이 새로운 페니실린의 확장은 자연적인 기질인 페니실린 N의 확장에 비교하여 덜 효과적으로 발생한다. 이 개념은 아디포일-페니실란산에 대한 활성을 변경시키려는 목적으로 익스팬다제를 변형하기 위한 기초가 되어 왔다. 돌연변이 일으켜진 익스팬다제의 적용은 WO98/02551에서 개시되었다.

페니실린 합성에 있어서의 마지막 단계인 대안적인 측쇄에 의한 IPN의 α-아미노아디포일 측쇄의 교환은, 아실트랜스퍼라제가 국소화된 미소체에서 발생한다. 그러므로, 페니실린의 최적의 확장을 위하여, 익스팬다제의 바람직한 국소화가 미소체안이라고 믿어진다. 이것은, 익스팬다제를 위한 기질이 미소체안에서 생산된다고 믿어진다는 사실뿐 아니라, 미소체에서 익스팬다제가 프로테아제에 의한 분해로부터 더 잘 보호될 수 있을 것이라는 기대에 기초하는데, 프로테아제에 의한 분해는 효소의 생산을 위한 P. chrysogenum의 사용으로부터의 공지의 결점이다(예를 들어, Theilgaard et al., 1997; Purification and characterisation of δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase from Penicillium chrysogenum; Biochem. J. 327, 185-191).

베타-락탐 항생물질 생산에 수반된 효소들의 세포상 국소화의 변형은 EP 0 448 180에서 제안되어 왔다. 예를 들어 페이지 7, 끝에서 두번째 소절에서, Penicillium chrysogenum에서의 세팔로스포린 또는 중간물질의 생산의 효율을 개선하기 위하여, 에피머라제 및, 바람직하게는 Acremonium chrysogenum으로부터의 익스팬다제/히드록실라제와 같은 그다음의 세팔로스포린 생합성 효소 또는 Streptomyces spec.으로부터의 익스팬다제를 미소체안에 국소화하는 것이 제안된다. 거기에서 또한, 아실-6-APA의 측쇄의 제거에 수반되는 효소인 아실트랜스퍼라제의 미소체 표적화신호의 제거가 페니실린 생산을 완전히 파괴한다는 것이 보여졌다. 이것은, 기질 국소화 때문이 아니라면 적어도 안정성을 이유로, 베타-락탐 생산에 수반되는 효소들이 미소체에 국소화될 것을 강력하게 제안한다.

본 발명은, 보다 높은 생산량으로 아실화된 세팔로스포린의 개선된 생체내 생산을 위한, DNA, 상기 DNA를 전사, 번역 또는 발현할 수 있는 이형성 숙주세포 및 그러한 숙주세포와 그것의 배양물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 숙주세포의 세포질에 주로 국소화되는(퍼옥시좀 또는 미소체안에 또는 그것과 함께 주로 국소화되는 것과는 반대로) 익스팬다제 활성을 가지는 효소를 포함하는 숙주세포가 제공된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 변형된 익스팬다제를 코드하는 분리된 DNA 단편을 제공하는데, 이 익스팬다제는, Penicillium chrysogenum 숙주에서의 상기 DNA 단편의 발현후에 상기 Penicillium 숙주의 세포질에서 주로 발견된다. 변형된 익스팬다제를 코드하는 그러한 DNA 단편은, 예를 들어, Nocardia lactamdurans(형식적으로 Streptomyces lactamdurans) 및 균류 Acremonium chrysogenum 및 다른 관련된(즉 세팔로스포린/세파마이신 생산하는) 미생물과 함께 발견되는 대로의 익스팬다제를 코드화하는 DNA를 변형함으로써 얻어질 수 있다.

본 발명은, 바람직하게는 이형 숙주의 미소체안 대신에 세포질에 주로 국소화되는 변형된 익스팬다제를 코드화하는 분리된 DNA 단편을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 그러한 DNA 단편은 익스팬다제를 코드화하는 Streptomyces clavuligerus DNA로부터 얻어질 수 있고, Penicillium chrysogenum 숙주에서 발현될 때 상기 Penicillium 숙주의 세포질에서 주로 발견되는 익스팬다제를 코드화하는 DNA 단편을 얻기 위하여 변형된다.

그러한 변형은 상기 익스팬다제를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 재조합 기술에 의한 클로닝을 포함하지만, 바람직하게는, 상기 익스팬다제에서 미소체 또는 퍼옥시좀 표적화신호를 코드하는 서열을 재조합기술에 의하여 변형시키는 것을 포함한다. 변형은 익스팬다제를 코드화하는 핵산서열, 바람직하게는 상기 익스팬다제의 카르복시-말단 아미노산 서열을 코드화하는 서열의 단일 또는 다수의 돌연변이(결실, 삽입 또는 복귀와 같은)를 포함할 수 있다.

진핵세포성 유기체중에서, 퍼옥시좀 또는 미소체로의 단백질의 표적화는 비-사상 효모에서 비교적 잘 연구되어 왔다. 이 유기체에서, 퍼옥시좀이나 미소체로 향할 운명인 단백질은 일반적으로 C-말단 표적화 서열을 포함하고, 그것의 아미노산 서열은 일반적으로 S(세린)K(리신)L(루신)이거나, 보다 더 일반적으로는 S/C/A/ - K/H/R - L이다. 그러한 표적화 서열은, 적어도 동형 상황에서, 효소와 같은 단백질이, 그것이 그것의 최종 국소화를 찾는 미소체로 발송되기에 필수적인 신호를 제공한다.

Penicillium chrysogenum과 같은 사상균류를에 대하여, 퍼옥시좀이나 미소체로의 단백질의 표적화는 비교적 거의 연구되어 있지 않고, 효모 또는 균류와 같은 유기체가 이형 단백질을 번역 또는 심지어 발현하기 위한 숙주세포로서 이용되는 이형 상황에서의 단백질의 표적화에 대해서는 아주 조금만 알려져 있다. 이것은 특히, 이형 단백질이 박테리아와 같은 원핵세포성 유기체로부터 유도되는 경우인데, 왜냐하면 박테리아는 퍼옥시좀이나 미소체와 같은 세포소기관을 가지지 않아서 동형 상황에서 퍼옥시좀 표적화신호를 이용하지 않기 때문이다. 이형으로 발현된 단백질이나 효소가 그것의 숙주에서 잘 기능하기 위하여, 각각의 표적화신호가 비교가능한 세포하위 국소화를 찾기 위해 숙주에 의하여 사용되는 표적화신호를 닮아야 한다고 일반적으로 믿어진다.

박테리아 S. clavuligerus로부터의 익스팬다제는 일반적으로 C-말단 서열인 SKA(세린-리신-알라닌)를 포함하는데, 이것은, 상기 단백질이 진핵세포성 숙주에서 이형 상황에서 발현될 때 퍼옥시좀 표적화신호로서 기능하는것 같아 보인다. 예를 들어, S. clavuligerus 익스팬다제로 형질전환된 Penicillium chrysogenum 균주(예를 들어, EP 0532 341 A1에서 논의된 대로)는 퍼옥시좀내에서의 각각의 익스팬다제의 국소화를 보여준다.

Streptomyces clavuligerus로부터의 야생형 익스팬다제는, Penicillium chrysogenum에서 재조합적으로 생산될 때 미소체에 주로 축적된다는 것이 밝혀져 왔다. 세 아미노산의 상기 서열, Ser-Lys-Ala은, 효모에 있는 미소체 표적화신호를 위한 보존서열과 다소 다름에도 불구하고 Penicillium chrysogenum에서 미소체 표적화신호로 분명히 이바지한다.

퍼옥시좀내의 국소화를 막아야하는 신호는 물론 퍼옥시좀 표적화신호가 S. clavuligerus 익스팬다제의 카르복시 말단상으로, 또는 그것에 관해서는 Cephalosporium acremonium 익스팬다제/히드롤라제의 카르복시 말단상으로 설계되었을 때, 퍼옥시좀내에 국소화되는 경향은, 상이한 카르복시 말단 아미노산 서열들이 첨가되었음에도 불구하고 변경되지 않았다(Verburg et al., P.35, page 108. In: 7^th Int. Symp. Gen Industr. Microorg. 26 June - 1 July 1994, Montreal Canada).

분명히, 이 효소는 효과적인 표적화신호를 운반하여, 이형 Penicillium chrysogenum 숙주세포의 미소체내에 적어도 주로 국소화되게 된다. 그러나, 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명은 이제 익스팬다제의 효과적인 변형을 제공하여, 미소체내에 국소화되는 경향을 변경시키고 숙주의 세포질에서의 상기 익스팬다제의 주된 국소화를 이끌어낸다.

미소체 또는 퍼옥시좀내에 국소화되는 경향은 N-말단 또는 C-말단 퍼옥시좀 표적화신호(PTS)에 의하여 지배되고, 상기 PTS의 변형(N-말단적으로 또는 C-말단적으로)은 실질적으로 미소체내의 그러한 국소화를 막는다. 그러한 변형의 실예는 카르복시 말단 트리펩티드 X1-X2-X3를 코드하는 뉴클레오티드 서열에서의 변형인데, 이때 예를 들어 X1은 세린, 시스테인 및 알라닌으로 구성된 군으로부터 선택된 한 아미노산 잔기이고, X2는 리신, 히스티딘 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택된 한 아미노산 잔기이고, X3는 루신 또는 알라닌이다. 그러한 트리펩티드 서열은 또한 SKL-유사 펩티드라고도 불리고, 이 신호의 본질적인 서열은 첫번째에 있는 작은 아미노산, 끝에서 두번째에 있는 염기성 잔기 및 C-말단위치에 있는 큰 비-극성 잔기일 수 있다. 본 발명은 익스팬다제를 코드화하는 DNA 단편을 제공하는데, SKL-유사 트리펩티드를 코드화하는 상기 단편은, 익스팬다제가 미소체내에 국소화하는 것을 실질적으로 막아서 익스팬다제가 상기 이형 세포에서 발현되면 숙주세포의 세포질에 주로 국소화하도록 변형되거나 선택된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 DNA 단편은, 처음에는 카르복시-말단 트리펩티드 세린-리신-알라닌을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 S. clavuligerus 익스팬다제 코드화 DNA로부터 얻어지고, 이것은 이 익스팬다제가 숙주세포에서 발현되면 그 세포의 세포질에 주로 국소화하도록 변형된다. 그러한 변형은 특히 본 발명의 DNA 단편에 의하여 예증되는데, 이때 세린-리신-알라닌을 코드하는 뉴클레오티드 서열은 세린-리신-아스파르트산을 코드하는 서열로 변형되거나 또는 최종 위치에 있는 아미노산이 결실되거나 예를 들어 또다른 비-소수성 잔기에 의하여 치환된다.

또하나의 변형은 세린-세린-아스파르트산을 포함하거나, 또는 이때 끝에서 두번째 위치에 있는 아미노산이 결실되거나 비-양하전된 잔기에 의하여 치환된다.

또다른 변형은, 트리펩티드의 첫번째 위치에서 변형의 결실을 포함하는데, 이것은 이형 숙주내에서 그렇게 변형된 단백질의 발송절차(routing)를 변경하고 사용된 숙주세포의 세포질에 주로 국소화하게 한다.

또다른 변형은, 이 카르복시-말단 아미노산을 코드화하는 이 세개의 아미노산 또는 코돈의 조합중 어떤 것의 결실 또는 변형을 포함한다.

한편, 분명히 미소체 표적화신호로서 기능하는 트리펩티드 서열 SKA(또는 상기에서 설명된 것과 같은 그것의 기능적인 변이형)를 종래의 재조합 DNA 기술을 이용하여 신중하게 변형하는 것이, 이형으로 발현된 효소가 미소체보다는 숙주세포의 세포질에 주로 축적되도록 한다는 것이 놀랍게도 밝혀져 왔다.

그러나, 한편, 단백질의 변이형이 자연에 풍부하고, 효소가 이형 숙주에서 발현될 때 상기 숙주의 세포질에 주로 국소화될 익스팬다제와 같은 효소를 포함하는 미생물을 찾는 것이 이제 가능하다. 특히, 위에서 확인된 표적화 서열에서 벗어난 C-말단서열을 가지는 단백질 또는 효소는 세포질 국소화에 대하여ㅌ세팔로스포린 생산의 생산량을 개선하는데 있어서의 더이상의 사용을 위하여 선택될 후보임직 하다. 특별한 구체예에서, 본 발명은, Penicillium chrysogenum 숙주세포에서 발현되면 주로 세포질에 국소화함으로써 미소체내 또는 미소체에서 비교가능한 효소를 발현하는 숙주세포의 세팔로스포린 생산량을 넘게 세팔로스포린 생산량을 개선하는 익스팬다제를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

기대에 꽤 대조적으로, 본 발명에 의하여 제공되는 대로의 효소는 미소체 밖 에서 안정한 것으로 보인다. 본 발명에 의하여 제공되는 대로의 익스팬다제는 페니실린, 비-자연발생적인 측쇄를 가진 페니실린(예를 들어, EP 97201196.9 및 EP 97201197.7)조차도 여전히, 상응하는 7-ADCA 유도체로 확장시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 의하여 제공되는 대로의 변형되거나 선택된 효소를 코드화하는 분리된 DNA 단편을 제공하는데, 상기 단편은 진핵세포성 숙주세포에서의 상기 DNA의 발현을 위한 조절영역을 더 포함한다. 예를 들어, 동물 또는 식물 또는 효모 또는 균류와 같은 다양한 유기체 기원의 하나이상의 숙주세포에서 기능적인 조절영역을 가진 DNA 단편을 제공하는 것은 당업자의 기술범위내이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은, 효모 또는 균류와 같은 미생물로부터 유도된 숙주세포에서의 발현을 조절하는데 적당한 조절영역을 포함하는, 본 발명에 의하여 제공되는 대로의 변형된 효소를 코드화하는 DNA 단편을 제공한다.

놀랍게도, 미소체에서의 축적과는 반대로 세포질에서 주로 축적되는 익스팬다제로 형질전환된 숙주세포(예를 들어, Penicillium chrysogenum)에서, 세팔로스포린 항생물질(예를 들어, 아디필-7-ADCA)의 생산이 감소하기 보다는 증가한다는 것이 밝혀져 왔다. 모든 다른 양태에서 비교가능하지만 미소체-국소화되는 익스팬다제를 코드하는 DNA로 형질전환되어진 숙주세포에 비교될 때조차 이것은 사실이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 의하여 제공된 대로의 세포질-국소화 효소를 코드화하는 변형되거나 선택된 재조합 DNA 단편으로 제공되어진 숙주세포 또는 숙주 유기체(또는 그것의 자손)를 제공한다. 예를 들어, 그러한 숙주 유기체는, 예를 들 어 상기 숙주 유기체 또는 상기 숙주 유기체의 선조의 형질전환의 결과, 임의로 조절영역 또는 서열을 포함하는 DNA 단편을 통합시켜, 본 발명에 의하여 제공된 대로의 변형된 효소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러한 숙주는 바람직하게는 식물과 미생물로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는, Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans 또는 A. niger 및 Cephalosporium acremonium으로 구성된 군으로부터 선택된 균류이다.

본 발명은 또한, 본 발명에서 제공된 대로의 숙주세포 또는 숙주 유기체의 배양물을 제공한다. 그러한 배양물은, (비-자연발생적인) 측쇄를 가지는 페니실린을 상응하는 7-ADCA 유도체로 확장시킬수 있는 기능적인 익스팬다제가 주로 세포질에서 발견되는 세포를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 대규모 발효를 위한 배양물을 제공하는데, 이 배양물에서, 세포질안에 국소화된 변형된 익스팬다제는 비교가능한 기원의 야생형 익스팬다제를 이용하는 비교가능한 규모의 발효 배양물에서보다 더 높은 생산수준의 아디포일-7-ADCA에 기여한다.

또하나의 구체예에서, 본 발명은, 익스팬다제가 동형 상황에서 미소체에 국소화되건 아니건, 이형 숙주의 세포질에 주로 국소화되는 능력이나 경향에 대하여 다른 것들중에서 선택된 익스팬다제로 재조합기술에 의하여 제공되어 있는 숙주세포 및 그것의 배양물을 제공한다. 그러한 숙주세포는, 익스팬다제를 코드화하는 DNA 단편을 숙주세포에 제공하고 상기 익스팬다제가 세포질에 주로 국소화되는지 여부를 시험함으로써 선택될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 효소의 국소화에 대한 시험은, 설명의 실험부분에서 설명된 바와 같이 전자현미경법에 의하여 수행된다.

본 발명은 또한, 본 발명에 의하여 제공된 대로의 변형되거나 선택된 효소를 코드화하는 변형되거나 선택된 DNA 단편이 제공된 숙주세포 또는 유기체를 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, 형질전환 조건하에서 본 발명에 의하여 제공된 대로의 DNA 단편과 세포를 접촉시키는 단계와 상기 DNA를 획득한 세포를 선택하는 단계로 이루어진다. 숙주세포, 예를 들어 P.chrysogenum 또는 다른 균류의 형질전환은, 일반적으로, PEG-Ca 매개된 원형질체 섭취(uptake), 일렉트로포레이션 또는 입자총 기술과 같은 상이한 수단의 DNA 송달, 및 형질전환체의 선택에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, Van der Hondel en Punt, Gene and Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi(Pederby, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991)을 참조하라. 우성 및 비-우성 선택마커의 적용이 기술되어 왔다(상기 Van der Hondel). 동형(P. chrysogenum 유도된) 및 이형(비-P. chrysogenum 유도된) 기원 둘다의 선택마커가 기술되어 왔다(Gouka et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 189-200).

형질전환체의 선택에 있어서, 동형 또는 이형인, 벡터서열의 존재 또는 부재하의, 비-선택가능한 DNA에 물리적으로 연결되거나 연결되지 않은 상이한 형질전환체 선택마커를 적용하는 것이 당업계에서 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한, 숙주세포에서 익스팬다제를 코드화하는 DNA 단편을 발현시키는 방법을 제공하는데, 이때 상기 DNA 단편은 세포질에서 생산되거나 주로 국소 화하도록 되는 익스팬다제를 코드한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 그러한 방법은, 카르복시-말단 아미노산 서열을 코드화하는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 Streptomyces clavuligerus의 익스팬다제에서 발견되는 SKA와 같은 트리펩티드 서열에 있어서의 변형을 상기 DNA 단편에 제공하는 것을 포함한다. 본 발명에 의하여 제공되는 그러한 방법은 바람직하게는 숙주로서 Penicillium chrysogenum 세포와 함께 사용된다.

본 발명은 또한, 베타-락탐 화합물의 5-원 고리구조를 확장시켜 6-원 세펨 화합물을 형성하는 방법을 제공하는데, 이 방법은, 상기 베타-락탐 화합물을 생산할 수 있는 숙주를 거기에 도움이 되는 조건하에서 성장시키는 단계, 및 상기 숙주로 하여금 재조합 수단에 의하여 유도되고 상기 베타-락탐 화합물의 5-원 고리를 확장시킬 수 있는 이형 익스팬다제를 그것을 코드화하는 DNA 단편으로부터 발현하게 하여 상기 6-원 세펨 화합물을 형성시키는 단계로 이루어지며, 상기 익스팬다제는, 숙주세포의 세포질에서 생산되거나 적어도 주로 국소화되는 익스팬다제를 코드하도록 변형되거나 선택되어진 DNA 단편으로부터 발현되는 것을 특징으로 한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 변형된 익스팬다제에 의하여 베타-락탐 화합물의 5-원 고리를 확장시키는 방법을 제공하는데, 이때 상기 익스팬다제는 그것을 코드화하는 DNA 단편내의 변형때문에 숙주세포의 세포질에 국소화되고, 이 변형에 의하여 미소체 표적화신호가 변형되는데, 바람직하게는 Streptomyces clavuligerus로부터의 익스팬다제로부터 얻어질 수 있는 것과 같은 트리펩티드 아 미노산 서열을 포함하는 표적화신호가 변형되어 졌다.

본 설명의 실험 부분에서, 본 발명에 의하여 제공된 대로의 방법의 실예가 주어지고, 이때, 상기 숙주세포는 Penicillium chrysogenum이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 베타-락탐 화합물이 페닐아세틸-6-APA, 페녹시아세틸-6-APA, 알파-아미노아디포일-6-APA, 아디포일-6-APA, 글루타릴-6-APA로 구성된 군, 또는 수베릴-6-APA, 피멜릴-6-APA, 트랜스-β-히드로뮤코닐-6-APA 또는 비교가능한 화합물들로부터 선택되는 방법이 제공된다. 더욱이, 본 발명은, 본 발명에 따른 과정 또는 방법으로 상기 베타-락탐 화합물의 5-원 (페남) 고리를 확장시키는 단계와 그렇게 형성된 세펨 화합물을 회수하는 단계로 이루어지는, 세펨 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 대규모 발효를 위한 숙주세포 배양물에서 세펨 화합물을 제조하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 숙주세포의 세포질에 주로 국소화되는 익스팬다제는, 미소체에 주로 국소화되는 비교가능한 기원의 익스팬다제(야생형 또는 변형된 형태인)를 이용하여 비교가능한 규모의 발효에 의하여 세펨 화합물을 제조하는 방법에서보다, 더 높은 생산 수준의 아디포일-7-ADCA에 기여한다.

본 발명은 다음의 4개의 도에서 보다 상세히 예시된다.

도 1은 플라스미드 pISEWA의 도식적인 표현이다.

도 2는 플라스미드 ISEWA-SKD의 도식적인 표현이다.

도 3은 플라스미드 pISEWA(빈 막대) 및 pISEWA-SKD(채워진 막대)로의 형질전 환으로부터 유도된 많은 수(약 80개)의 형질전환체의 아디포일-7-ADCA 생산성.

X-축: 생산성 클래스(임의적인 유니트); Y-축: 클래스당 형질전환체의 %.

도 4는 야생형 익스팬다제(패널 A)를 발현하는 형질전환체 및 비-표적화신호를 가진 익스팬다제(SKA -> SKD, 패널B)를 발현하는 형질전환체의 EM 사진. 금 입자는 익스팬다제의 존재를 나타낸다. N: 핵, M: 미토콘드리아, P: 퍼옥시좀(미소체).

실험 부분

숙주세포, 예를 들어 P. chrysogenum 또는 다른 균류의 형질전환은 일반적으로 PEG-Ca 매개된 원형질체 섭취, 일렉트로포레이션 또는 입자총 기술과 같은 상이한 수단의 DNA 송달 및 형질전환체의 선택에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, Van der Hondel en Punt, Gene and Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi(Pederby, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991)을 참조하라. 우성 및 비-우성 선택마커의 적용이 기술되어 왔다(상기 Van der Hondel). 동형(P. chrysogenum 유도된) 및 이형(비-P. chrysogenum 유도된) 기원 둘다의 선택마커가 기술되어 왔다(Gouka et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 189-200).

형질전환체의 선택에 있어서, 동형 또는 이형인, 벡터서열의 존재 또는 부재하의, 비-선택가능한 DNA에 물리적으로 연결되거나 연결되지 않은 상이한 형질전환체 선택마커를 적용하는 것이 잘 알려져 있다.

변형되고 선택된 익스팬다제 효소에 의하여 매개되는 고리-확장 반응이, P. chrysogenum 예를 들어 균주 Wisconsin 54-1255(기탁번호 28089하에서 ATCC에 기탁됨)에 이 방식으로 도입되고 발현된다. 균주 Wisconsin 54-1255의 돌연변이체를 포함하고 개선된 베타-락탐 생산량을 가지는 P. chrysogenum의 다른 균주도 또한 적당하다.

더욱이, 변형된 cefE 유전자는 균류 유전자 제어요소의 전사 및 번역 제어하에 배치된다. 이 요소들은 P. chrysogenum IPNS 또는 pcbC 유전자, b-튜불린 유전자, Aspergillus nidulans gpdA 유전자, 또는 Aspergillus niger glcA 유전자와 같은 클로닝된 균류 유전자들로부터 얻어질 수 있다.

본 발명에 따라, β-락탐 중간물질 아디포일-7-ADCA가, 아디프산 또는 그것의 염이나 에스테르를 배지에 첨가함으로써, 익스팬다제를 발현하는 P. chrysogenum 형질전환체에서 생산된다. 적당한 염은 예를 들어 나트륨이나 칼륨의 염이다. 아디포일-7-ADCA는, 예를 들어 다음과 같은 간단한 용매 추출을 통하여 배지로부터 효과적으로 회수된다.

액체배지를 여과하고 물과 혼합될 수 없는 유기용매를 여과액에 첨가한다. 수성층으로부터 세팔로스포린을 추출하기 위하여 pH를 조정한다. pH 범위는 4.5보다 낮아야하고; 바람직하게는 4와 1사이이고, 보다 바람직하게는 2와 1사이이다. 이 방법으로, 세팔로스포린은 발효액체배지안에 존재하는 많은 다른 불순물로부터 분별된다. 바람직하게는 작은 부피의 유기용매가 사용되어 보다 농축된 세팔로스포린의 용액을 얻고, 그래서 부피측정 유속의 감소를 달성한다. 두번째 가능성은 4이 하의 pH에서의 전체 액체배지 추출이다. 바람직하게는, 이 액체배지는 물과 혼합될 수 없는 유기용매를 이용하여 4와 1사이에서 추출된다.

세팔로스포린 분자를 방해하지 않는 어떤 용매라도 사용될 수 있다. 적당한 용매는, 예를 들어 부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 메틸 이소부틸 케톤, 부탄올과 같은 알콜 등이다. 바람직하게는, 1-부탄올 또는 이소부탄올이 사용된다.

이후로, 세팔로스포린은 4와 10사이, 바람직하게는 6과 9사이의 pH에서 물을 이용하여 역추출된다. 다시, 최종부피는 감소될 수 있다. 회수는, 0과 50℃사이의 온도에서, 그리고 바람직하게는 주변온도에서 수행될 수 있다.

그렇게 얻어진 수성의 세팔로스포린 용액을, 아디포일 측쇄를 제거하고 원하는 7-ADCA를 얻기 위하여 적당한 효소로 처리한다.

바람직하게는, 효소를 반복적으로 사용할 수 있기 위하여 부동화된 효소를 사용한다. 그러한 입자의 제조 및 효소의 부동화를 위한 방법론은 EP-A-0222462에서 광범위하게 기술되어 왔다. 수성 용액의 pH는, 예를 들어 pH 4 내지 pH 9의 값을 가지는데, 이 pH에서, 세팔로스포린의 분해반응이 최소화되고 그 효소를 이용한 원하는 전환이 최적화된다. 그러므로, 이 효소는, 예를 들어 수산화칼륨 용액과 같은 무기염기를 첨가하거나 양이온 교환수지를 적용함으로써 pH가 적절한 수준에서 유지되는 동안 수성의 세팔로스포린 용액에 첨가된다. 이 반응이 완결될 때, 부동화된 효소는 여과에 의하여 제거된다. 또하나의 가능성은, 고정되거나 유체화된 베드칼럼에서 부동화된 효소를 적용하는 것, 또는 용액내의 효소를 이용하고 막여과에 의하여 생성물을 제거하는 것이다. 그다음에, 반응혼합물을, 물과 혼합될 수 없 는 유기용매의 존재하에서 산성화한다.

적당한 효소는, 예를 들어, 위치 62, 177, 178 및 179중의 하나이상에 돌연변이를 가지는 Pseudomonas SY77 미생물로부터 유도된다. 또한, 다른 Pseudomonas 미생물, 바람직하게는, Pseudomonas SY77내의 62, 177, 178 및 179 위치에 상응하는 위치중 하나이상에서 임의로 돌연변이를 가지는 Pseudomonas SE83으로부터의 효소들이 사용될 수 있다.

pH를 약 0.1 내지 1.5로 조정한 후에, 층을 분별하고 수성층의 pH를 2와 5사이, 보다 바람직하게는 3과 4사이로 조정한다. 그리고나서, 결정질 7-ADCA를 여과해낸다.

탈아실화는 또한, 당업계에서 알려진 대로, 예를 들어, 이미노클로리드 측쇄의 형성을 거쳐서, 10aC보다 낮은 온도에서 인 펜타클로리드를 첨가하고 그다음에 주변온도이하에서 이소부탄올을 첨가함으로써, 화학적으로 수행될 수 있다.

다음의 실시예들은 예시로 제공되는 것이지 한정으로 제공되는 것은 아니다. 전체적 접근방법은 i)표적화 특이성에 수반되는 익스팬다제의 잔기의 확인, ii)익스팬다제 단백질의 선택 또는 돌연변이체 익스팬다제 단백질의 구성, iii)P. chrysogenum 발현벡터내에 돌연변이체 또는 선택된 익스팬다제 유전자의 하위클로닝 및 P. chrysogenum에서 익스팬다제의 발현, iv)아디포일-7-ADCA 생산 대 α-D-아미노아디포일-7-ADCA와 아디포일-6-APA의 생산의 결정을 수반한다.

아디포일 측쇄에 대하여 기술된 것과 유사한 방법으로, 당업자는 또한, 3'-카르복시메틸티오프로피온산과 3,3'-티오디프로피온산을 측쇄로서 이용하는 WO95/04148과 WO95/04149에서 개시된 과정에서 변형된 익스팬다제 효소를 사용하여, 각각 2-(카르복시에틸티오)아세틸-7-ADCA 및 3-(카르복시메틸티오)프로피오닐-7-ADCA와 2-(카르복시에틸티오)아세틸-7-ADCA의 혼합물을 얻을 수 있다.

(실시예 1)

S. clavuligerus cefE 유전자의 특정부위 돌연변이유발

익스팬다제 유전자의 유전학적 조작에 수반되는 기술들이 잘 설명되어 있다. PCR 반응에서 주형으로서 이용될 수 있는 공급원에는, 공공으로 이용가능한 Streptomyces clavuligerus_균주(ATCC 27064와 같은)로부터의 염색체 DNA 제조물, 또는 pZEx(PCT/EP97/03879에서 기술됨)와 pISEWA(EP-02812P에서 기술됨)와 같은 발현카세트가 포함된다. 익스팬다제 발현카세트 pISEWA(도 1)는, IPNS 프로모터와 AT 종결인자를 포함하는 야생형 Streptomyces clavuligerus 익스팬다제 유전자를 포함한다. 익스팬다제의 퍼옥시좀 표적화를 혼란시키기 위하여, CefE의 C-말단 서열이 SKA에서 SKD로 돌연변이된다. 이 목적을 위하여 주형으로서 pISEWA를 이용하고, 프라이머 1과 2(표1을 참조)를 이용하여 PCR 반응을 수행한다. PCR은 교정하는(proof-reading) 중합효소로 수행한다. 변성단계(98℃ 2분)후, cefE 유전자의 일부를 25주기로 증폭하고(94℃ 1.15분, 55℃ 45초, 72℃ 1분), 후에 신장단계(72℃ 8분)가 이어진다. 이 반응의 생성물은 cefE내의 StuI 부위(번역의 개시로부터 약 450bp; Kovacevic et al.: Cloning, characterisation, and expression in Escherichia coli of the Streptomyces clavuligerus gene encoding desacetoxycephalosporin C synthetase, J. Bacteriol., 171, 754-760, 1989)로부 터 종결코돈으로부터 하류인 NsiI 부위까지 걸쳐있다. 뉴클레오티드 서열분석에 의하여 서열을 검증한 후에, StuI-NsiI 단편을 사용하여 pISEWA내의 '야생형' cefE 단편을 교환한다. 그렇게, 플라스미드 pISEWA-SKD가 생성된다(도 2).

돌연변이체 익스팬다제의 구성에 사용된 프라이머들. 프라이머 1내의 Stu I 부위, 및 프라이머 2내의 Nsi I 부위에 밑줄그어져 있다.

프라이머	서열(5' -> 3')
1	GAGGCCTTCCTCGACTGCGAGCCG
2	CAAAGATGCATATGCTCGTCATGAAGAGCCT ACTAGTCCTTGGATGTGCGGCG

(실시예 2)

P.chrysogenum 균주의 형질전환

P.chrysogenum의 원형질체로의 DNA 전달에 수반되는 기술들은 당업계에서 잘 알려져 있고, 많은 참고문헌에서 기술된다(Finkelstein and Ball (eds.), Biotechnology of filamentous fungi, technology and products, Butterworth-Heinemann (1992); Bennett and Lasure (eds.) More Gene Manipulations in fungi, Academic Press (1991); Turner, in: Puhler (ed), Biotechnology, second completely revised edition, VHC (1992)를 포함하여). Ca-PEG 매개된 원형질체 형질전환은 EP635574에서 기술된 대로 사용된다. 구조물 pISEWA 및 pISEWA-SKD는, 유일한 질소원으로서 아세트아미드를 함유하는 선택배지상에서 P. chrysogenum 형질전환체가 성장하는 것을 가능하게 하는 GBGLA28(EP635574)과 함께 공동-형질전환에 의하여, 그렇게 P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATC 28089)로 도입된다. 보다 바람직하게는, 페니실린을 생산하는 보다 명백한 능력을 가진 균주가 이용된다. 실예는 CBS 455.95와 같은 균주들이다.

(실시예 3)

선택; 액체 배양물

형질전환체는 선택배지상에서의 반복된 배양에 의하여 정제된다. 단일의 안정한 콜로니들을, 익스팬다제 유전자의 존재상에서 생검정에 의하여 더 스크리닝하는데에 이용한다. 형질전환체를 한천배지상에서 성장시킨다. E. coli ESS2231을 한천 오버레이에서 지표 박테리아로서 이용하는데, 이것은 또한, 당업계에서 잘알려지고 예를 들어 Guttierez 등, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 56-64에서 기술된 방법에 따라 페니실린과 세팔로스포린 생산을 구별할 수 있게 하기 위하여 박토 페나제(Bacto penase)를 포함한다. 이 형질전환체내의 cefE 유전자의 존재는, 예를 들어 WO 95/04149에서 기술된 대로 염색체 DNA상에서 프라이머 1과 2(표)를 이용하여 PCR함으로써 확인된다. 익스팬다제-양성 형질전환체는, 예를들어 WO 95/04149에서 기술된 대로 세팔로스포린을 생산하는 능력에 대한 더이상의 스크리닝을 위하여 선택된다. 예를 들어 WO 95/04149에서 기술된 대로 형질전환체를 사용하여 액체배지가 들어있는 진탕플라스크를 접종한다. 형질전환체는, 예를 들어 (g/l):글루코스, 30:(NH₄)₂SO₄, 10: KH₂PO₄, 10, 미량원소용액 I(MgSO ₄ㆍ7H₂O, 25; FeSO₄ㆍ7H₂O, 10; CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.5; ZnSO₄ㆍ7H₂O, 2; Na₂SO₄, 50; MnSO₄ㆍH₂O, 2; CaCl₂ㆍ2H₂O, 5) 10 (ml/l) (멸균하기전 pH 6.5)로 구성된 종자배지로 2*10⁶ 분생자/ml로 접종된다.

종자배지를 48-72시간동안 25-30℃에서 인큐베이션한 다음, (g/l) 락토스, 80; CaSO₄, 4; 요소, 3; MgSO₄ㆍ7H₂O, 2; KH₂PO₄, 7, NaCl, 0.5; (NH₄)₂SO₄, 6; FeSO₄ㆍ7H₂O, 0.1; 아디프산, 2 내지 5; 미량원소용액 II(CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.5; ZnSO₄ㆍ7H₂O, 2; MnSO₄ㆍH₂O, 2; Na₂SO₄, 50), 10 (ml/l) (멸균하기전 pH 5.5-6.0)를 포함하는 10-20 부피의 생산배지를 접종하는데 사용한다. 그리고나서, 또다른 96-120시간동안 인큐베이션을 계속한다. 잘 성장된 배양물의 여과액을, 아디포일-7-ADCA의 생산에 대하여 HPLC와 NMR에 의하여 분석한다. 도 3이 보여주듯이, 주로 세포질에 국소화되는 익스팬다제로의 형질전환체는 미소체에 국소화되는 익스팬다제로의 형질전환체보다 유의하게 더 잘 수행한다.

(실시예 4)

익스팬다제의 국소화

익스팬다제의 C-말단의 돌연변이의 결과 퍼옥시좀으로의 익스팬다제의 수송이 차단된다는 것을 평가하기 위하여, 전자현미경법이 사용된다. Waterham 등., J. Cell Biol. 127: 737-749(1994)에 의하여 기술된 절차에 따라, 샘플은 글루타르알데히드를 이용하여 고정된다. 국소화 연구는, 항-익스팬다제 폴리클로날 항체와 함께 면역-조직화학을 이용하여 수행된다. 도 4는 익스팬다제가 세포질 또는 미소체에 주로 축적되는 것을 보여준다.

(실시예 5)

보다 대규모로 익스팬다제 돌연변이체의 성능

보다 대규모의 발효에서, 돌연변이된 익스팬다제를 가진 형질전환체의 성능을 측정하기 위하여, 두 형질전환 다로부터 그이상의 분석을 위하여 균주들을 선택한다. 그렇게, 야생형 익스팬다제 유전자를 이용한 형질전환으로부터 선택된 형질전환체보다 10% 많은 아디포일-7-ADCA를 생산하는 돌연변이체 익스팬다제 형질전환체를 선택된다. 균주가 10L 발효기안에서 성장될 때, 세포질에 주로 국소화되는 익스팬다제를 가진 배양물안의 아디포일-7-ADCA의 양은 미소체에 주로 국소화되는 익스팬다제를 가진 발효에서보다 더 높다. 그러므로, 세포질에 주로 국소화되는 익스팬다제는, 장기간 또는 대규모 발효에서 안정한 생산성과 개선된 생산량을 유지하기에 충분할 정도로 분명히 안정하다.

Claims

익스팬다제를 코드하는 분리된 DNA 단편으로서, C-말단 트리펩티드 서열 세린-리신-알라닌을 코드하는 뉴클레오티드 서열이, 트리펩티드 서열 세린-리신-아스파르트산을 코드하는 뉴클레오티드 서열로 변형되어지고, Penicillium chrysogenum 숙주에서의 상기 DNA 단편의 발현 후에 익스팬다제가 상기 숙주의 세포질에서 주로 발견되는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA 단편.
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형질전환의 결과로서 제 1 항에 따른 DNA 단편을 포함하는 숙주세포.
제 10 항에 있어서, 미생물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 11 항에 있어서, 미생물은 Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans, A. niger 및 Acremonium chrysogenum으로 구성된 군으로부터 선택된 균류인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포질에 주로 국소화되는 익스팬다제를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
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제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 숙주세포를 제조하는 방법으로서, 상기 숙주의 형질전환 조건하에서 세포를 제 1 항에 따른 DNA와 접촉시키는 단계 및 상기 DNA로 형질전환된 세포를 선택하는 단계로 이루어지는 방법.
제 15 항에 있어서, 익스팬다제가 세포질에 주로 국소화되는 세포를 선택하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주세포를 제조하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 숙주세포가 Penicillium chrysogenum 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
베타-락탐 화합물의 5-원 고리를 확장시켜 6-원 세펨 화합물을 형성하는 방법으로서, 상기 베타-락탐 화합물을 생산할 수 있는 숙주를 상기 화합물의 생산을 유도하는 조건하에서 성장시키는 단계, 및 상기 숙주로 하여금 상기 베타-락탐 화합물의 5-원 고리를 확장시킬 수 있는 이형 익스팬다제를 그것을 코드화하는 DNA 단편으로부터 발현하게 하여 상기 6-원 세펨 화합물을 형성시키는 단계로 이루어지며, 상기 익스팬다제는 C-말단 트리펩티드 서열 세린-리신-알라닌을 코드하는 뉴클레오티드 서열이, 트리펩티드 서열 세린-리신-아스파르트산을 코드하는 뉴클레오티드 서열로 변형되어 미소체 표적화 신호가 변형되어 있기 때문에 숙주세포의 세포질에 주로 국소화되는 익스팬다제를 코드하는 DNA 단편으로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 18 항에 있어서, 상기 익스팬다제를 코드화하는 DNA 단편이 Streptomyces clavuligerus로부터 얻어질 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 숙주가 Penicillium chrysogenum인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 베타-락탐 화합물이 페닐아세틸-6-아미노페니실란산(APA), 페녹시아세틸-6-아미노페니실란산(APA), 알파-아미노아디포일-6-아미노페니실란산(APA), 아디포일-6-아미노페니실란산(APA), 글루타릴-6-아미노페니실란산(APA), 수베릴-6-아미노페니실란산(APA), 피멜릴-6-아미노페니실란산(APA), 또는 트랜스-b-히드로뮤코닐-6-아미노페니실란산(APA)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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