ES2302379T3 - Produccion in vivo mejorada de cefalosporina. - Google Patents
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Abstract
Un fragmento de ADN aislado que codifica para una expandasa, donde una secuencia de nucleótido que codifica una señal de localización de microcuerpo C-terminal comprendiendo una secuencia de tripéptido terminal X1 - X2 - X3, donde X1 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente de Serina, Cisteína y Alanina, X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo consistente en Lisina, Histidina y Arginina y X3 es Leucina o Alanina ha sido modificada de forma que en la expandasa modificada X2 es un residuo no positivamente cargado y/o X3 es un residuo no hidrofóbico, el cual modificó la expandasa, después que la expresión de dicho fragmento de ADN en un hospedero de Penicillium chrysogenum, es encontrada en el citosol de dicho hospedero.
Description
Producción in vivo mejorada de
cefalosporina.
La presente invención queda en el campo de las
técnicas del ADN recombinante. Más en particular, la invención está
en el campo de la producción de cefalosporinas utilizando organismos
hospederos genéticamente modificados, organismos hospederos así
modificados, así como ADN para su uso en ello. La invención además
concierne a las enzimas modificadas expresadas por el ADN
recombinante en dichos organismos hospederos.
Los antibióticos
\beta-lactámicos constituyen el grupo más
importante de compuestos antibióticos, con una larga historia de
uso clínico. Entre este grupo, los prominentes son las penicilinas y
las cefalosporinas. Estos compuestos son naturalmente producidos
por los hongos filamentosos tales como Penicillium
chrysogenum y Acremonium chrysogenum,
respectivamente.
Como resultado de las técnicas clásicas de
mejoramiento de cepas, los niveles de producción de los antibióticos
en P. chrysogenum y A. chrysogenum se han
incrementado dramáticamente a través de las décadas pasadas. Con el
conocimiento creciente de los mecanismos biosintéticos que conducen
a las penicilinas y cefalosporinas, y el advenimiento de la
tecnología del ADN recombinante, nuevas herramientas para el
mejoramiento de cepas de producción y para la derivatización in
vivo de los compuestos se han hecho disponibles.
La mayoría de las enzimas involucradas en la
biosíntesis de \beta-lactama han sido
identificadas y sus correspondientes genes han sido clonados, como
puede ser encontrado en Ingolia y Queener, Med. Res. Rev. 9
(1989), 245-264 (biosynthesis route and enzymes), y
Aharonowitz, Cohen, y Martin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992),
461-495 (gene cloning).
Los dos primeros pasos en la biosíntesis de
penicilina en P. chrysogenum son la condensación de los tres
aminoácidos ácido
L-5-amino-5-carboxilopentanoico
(ácido L-\alpha-aminoadípico) (A),
L-cisteína (C) y L-valina (V) en el
tripéptido LLD-ACV, seguido por la ciclización de
este tripéptido para formar isopenicilina N. Este compuesto
contiene la típica estructura de la
\beta-lactama.
El tercer paso involucra el intercambio de la
cadena lateral hidrófila del ácido
L-5-amino-5-carboxilopentanoico
por una cadena lateral hidrofóbica por la acción de la enzima
aciltransferasa. La reacción de intercambio enzimático mediada por
la aciltransferasa tiene lugar dentro de un organelo celular, el
microcuerpo, como ha sido descrito en
EP-A-0 448 180.
Las cefalosporinas son mucho más caras que las
penicilinas. Una razón es que algunas cefalosporinas (por ejemplo
la cefalexina) son hechas a partir de penicilinas por un número de
conversiones químicas. Otra razón es que, hasta el momento, sólo
las cefalosporinas con una cadena lateral
D-5-amino-5-carboxipentanoil
podrían ser sometidas a conversión fermentativa. La cefalosporina
C, por lejos el más importante material de partida a este respecto,
es muy soluble en agua a cualquier pH, implicando así procesos de
aislamiento bastante largos y costosos usando tecnologías de
columna engorrosas y caras. La cefalosporina C obtenida de esta
manera tiene que ser convertida en cefalosporinas de uso
terapéutico por un número de conversiones químicas y
enzimáticas.
Los métodos actualmente favorecidos por la
industria para preparar el intermedio 7-ADCA
involucran pasos químicos complejos que conducen a la expansión y
derivatización de penicilina G. Uno de los pasos químicos necesarios
para producir 7-ADCA involucra la expansión de la
estructura del anillo de 5 miembros de la penicilina a la
estructura del anillo de 6 miembros de la cefalosporina (ver por
ejemplo US 4, 003,864). Este procesamiento químico complejo es
tanto costoso como nocivo para el ambiente.
Consecuentemente, existe un gran deseo de
reemplazar dichos procesos químicos con reacciones enzimáticas tales
como la catálisis enzimática, preferiblemente en un proceso in
vivo. Una clave para la sustitución de los procesos de
expansión química por procesos enzimáticos e in vivo es la
enzima central en el mecanismo biosintético de la cefalosporina, la
sintetasa desacetoxicefalosporina C (DAOCS), también llamada
"expandasa".
La enzima expandasa de la bacteria
Streptomyces clavuligerus se encontró con capacidad de
conducir, en algunos casos, expansiones del anillo de la
penicilina. Cuando es introducida en P. chrysogenum, puede
convertir la estructura del anillo de la penicilina en la estructura
del anillo de la cefalosporina in vivo, como se describe en
Cantwell y otros, Proc. R. Soc. Lond. B. 248 (1992),
283-289. La enzima expandasa ha sido bien
caracterizada (EP-A-0 366 354) tanto
bioquímica como funcionalmente, como también su correspondiente
gen, cefE. Ambos mapas físicos del gen cefE
(EP-A-0 341 892), la secuencia de
ADN y los estudios de transformación en P. chrysogenum con
cefE han sido descritos.
Otra fuente de enzima para la expansión del
anillo es por ejemplo la bacteria Nocardia lactamdurans
(anteriormente Streptomyces lactamdurans) y el hongo
Acremonium chrysogenum (anteriormente Cephalosporium
acremonium). La expandasa de Cephalosporium es una
enzima bifuncional, que tiene tanto actividad expandasa (expansión
del anillo) así como 3-hidroxilante. Ambas, las
propiedades bioquímicas de la enzima y la secuencia de ADN del gen
han sido descritas (Cortés y otros, J. Gen. Microbiol. 133
(1987), 3165-3174; y Coque y otros, Mol. Gen.
Genet. 236 (1993), 453-458,
respectivamente)
Ya que la expandasa cataliza la expansión del
anillo de tiazolidina de 5 miembros de la penicilina N al anillo de
dihidrotiazina de 6 miembros de DAOC esta enzima sería un candidato
lógico para reemplazar los pasos de expansión del anillo del
proceso químico. Desafortunadamente, la enzima trabaja en el
intermedio de la penicilina N del mecanismo biosintético de la
cefalosporina, pero no, o relativamente de forma ineficaz, en las
penicilinas fácilmente disponibles y poco costosas como las
producidas por P. chrysogenum, como la penicilina V o la
penicilina G. La penicilina N no es comercialmente disponible y aún
cuando está expandida, su cadena lateral
D-5-amino-5-carboxipentanoil
no puede ser fácilmente removida por las penicilina cilasas.
Ha sido recientemente encontrado que la enzima
expandasa es capaz de expandir penicilinas con cadenas laterales de
ocurrencia no natural a los correspondientes derivados
7-ADCA. Estas cadenas laterales incluyen
adipato(ácido
5-carboxil-pentanoico) y varios
otros compuestos. Esta característica de la expandasa ha sido
explotada en un proceso para la producción in vivo de
adipoil-7-ADCA en Penicillium
chrysogenum como se revela en
EP-A-0 532 341. Cepas de
Penicillium chrysogenum son transformadas con la expandasa de
Streptomyces clavuligerus para producir ácido
adipoil-6-aminopenicilánico
(adipoil-6-APA) cuando estos
transformantes son alimentados con ácido adípico. Posteriormente,
el adipoil-6-APA es "expandido"
a adipol-7-ADCA. La producción de
otras varias cefalosporinas 7-aciladas ha sido
reveladas en WO 95/04148 y WO95/04149. En WO95/04148 y WO95/04149
ha sido revelado que la adición de ácido
3'-carboximetil tiopropiónico y ácido
3,3'-tiodipropiónico al medio produce penicilinas
que son sustratos para la expandasa, conduciendo a la síntesis de
2-(carboxietiltio)acetil-7-ADCA
y 3-(carboximetiltio)
propionil-7-ADCA,
respectivamente.
Aunque la expandasa muestra actividad sobre
penicilinas con diferentes cadenas laterales, la expansión de estas
novedosas penicilinas ocurre con menos eficiencia comparada con la
expansión del sustrato natural, penicilina N. Esta noción ha sido
la base para la modificación de la expandasa, apuntando a modificar
la actividad sobre el ácido adipoil-penicilánico.
La aplicación de expandasa mutagenizada ha sido revelada en
WO98/02551.
El paso final en la síntesis de penicilinas, el
intercambio de la cadena lateral \alpha-amino
adipoil de IPN por una cadena lateral alternativa, ocurre en el
microcuerpo, donde se localiza la aciltransferasa. Para la
expansión óptima de la penicilina, la localización preferida de la
expandasa se cree por consiguiente que sea en el microcuerpo. Esto
se basa no sólo en el hecho de que se crea que el sustrato para la
expandasa sea producido en el microcuerpo, sino también en la
suposición de que en el microcuerpo, la expandasa debe estar mejor
protegida de la desintegración por proteasas, lo cual es una
desventaja conocida del uso de P. chrysogenum para la
producción de enzimas (ver por ejemplo, Theilgaard y otros, 1997;
Purification and characterisation of
\delta-(L-\alpha-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine
synthetase from Penicillium chrysogenum; Biochem. J. 327,
185-191).
La modificación de la localización celular de
las enzimas involucradas en la producción de antibióticos
beta-lactámicos ha sido sugerida en EP 0 448 180.
Por ejemplo en la página 7, penúltimo párrafo, se sugiere localizar
epimerasa y preferiblemente las posteriores enzimas biosintéticas
de la cefalosporina como expandasa/hidroxilasa del Acremonium
chrysogenum o la expandasa del Streptomyces spec. en los
microcuerpos, para mejorar la eficiencia de la producción de
cefalosporina o intermedios en Penicillium chrysogenum.
También se mostró con ello, que la remoción de la señal de
localización del microcuerpo de aciltransferasa, una enzima
involucrada en la remoción de la cadena lateral de
acil-6-APA destruye la producción de
penicilina completamente. Esto sugiere fuertemente, que las enzimas
involucradas en la producción de beta-lactama deben
estar localizadas en los microcuerpos, si no por razones de
localización de sustrato entonces al menos por razones de
estabilidad.
La invención provee ADN, células hospederas
heterólogas capaces de transcribir, traducir o expresar dicho ADN y
métodos que emplean dichas células hospederas y cultivos de estas
para la producción in vivo mejorada de cefalosporinas
aciladas con mayor rendimiento. De acuerdo a la invención, una
célula hospedera es provista comprendiendo una enzima que posee
actividad expandasa la que está predominantemente localizada en el
citosol (como lo opuesto a estar localizada principalmente en o con
los peroxisomas o microcuerpos) de la célula hospedera.
La invención además provee un fragmento de ADN
aislado que codifica para una expandasa, donde una secuencia de
nucleótidos que codifica para una señal de localización del
microcuerpo C-terminal que comprende una secuencia
de tripéptido terminal X1-X2-X3,
donde X1 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo
consistente de Serina, Cisteína y Alanina, X2 es un residuo de
aminoácido seleccionado del grupo consistente en Lisina, Histidina
y Arginina y X3 es Leucina o Alanina ha sido modificada de forma que
en la expandasa modificada X2 es un residuo no positivamente
cargado y/o X3 es un residuo no hidrofóbico, el cual modificó la
expandasa, después que la expresión de dicho fragmento de ADN en un
hospedero de Penicillium chrysogenum, es encontrada en el
citosol de dicho hospedero.
En una realización preferida, la invención
provee un fragmento de ADN aislado que codifica para una expandasa
modificada, expandasa que, después de la expresión de dicho
fragmento de ADN en un hospedero de Penicillium chrysogenum,
es encontrada predominantemente en el citosol de dicho hospedero de
Penicillium. Dicho fragmento de ADN que codifica para una expandasa
modificada puede por ejemplo ser obtenido modificando el ADN que
codifica una expandasa como la encontrada con Nocardia
lactamdurans (anteriormente Streptomyces lactamdurans) y
el hongo Acremonium chrysogenum, y otros microorganismos
relacionados (por ejemplo los productores de
cefalosporina/cefamicina).
La invención provee un fragmento aislado de ADN
que codifica una expandasa modificada que preferiblemente se
localiza predominantemente en el citosol en lugar de en el
microcuerpo del hospedero heterólogo. En una realización preferida
de la invención dicho fragmento de ADN es obtenible del ADN de
Streptomyces clavuligerus que codifica una expandasa, y
modificado para obtener un fragmento de ADN que codifica una
expandasa que, cuando se expresa en un hospedero de Penicillium
chrysogenum, es encontrada predominantemente en el citosol de
dicho hospedero de Penicillium.
Tal modificación comprende la clonación mediante
técnicas recombinantes de una secuencia de nucleótidos que codifica
dicha expandasa, pero preferiblemente comprende la modificación por
técnicas recombinantes de una secuencia que codifica para una señal
de localización del peroxisoma o microcuerpo en dicha expandasa. La
modificación puede comprender una mutación sencilla o múltiple
(tales como supresión, inserción o reversión) de una secuencia de
ácido nucleico que codifica una expandasa, preferiblemente de una
secuencia que codifica una secuencia del aminoácido
carboxi-terminal de dicha expandasa.
Entre los organismos eucariotas, la localización
de proteínas a peroxisomas o microcuerpos ha sido relativamente
bien estudiada en levaduras no filamentosas. En estos organismos,
las proteínas destinadas para el peroxisoma o microcuerpo
generalmente contienen una secuencia de localización
C-terminal, cuya secuencia de aminoácidos es
generalmente S (serina) K (lisina) L (leucina), o más generalmente
S/C/A/ - K/H/R - L. Dicha secuencia de localización, al menos en un
contexto homólogo, provee la señal necesaria para una proteína tal
como una enzima para ser dirigida hacia el microcuerpo, donde esta
encuentra su localización final.
Para hongos filamentosos, tal como para
Penicillium chrysogenum, la localización de proteínas para
peroxisomas o microcuerpos ha sido relativamente poco estudiada, y
sólo muy poco es conocido sobre la localización de proteínas en un
contexto heterólogo, cuando un organismo tal como una levadura u
hongo es usado como una célula hospedera para traducir y aún
expresar una proteína heteróloga. Este es especialmente el caso
cuando una proteína heteróloga es derivada de un organismo
procariota tal como una bacteria, ya que la bacteria no posee
organelos como peroxisomas o microcuerpos, y por lo tanto no
utiliza la señal de localización peroxisomal en un contexto
homólogo. Se cree generalmente que, para que una proteína o enzima
expresada de manera heteróloga funcione bien en su hospedero, las
respectivas señales de localización deben al menos parecerse a
aquellas usadas por el hospedero para encontrar la localización
subcelular comparativa.
La expandasa de la bacteria S.
clavuligerus generalmente comprende una secuencia
C-terminal, SKA
(Serina-Lisina-Alanina), que
aparentemente funciona como una secuencia de señalización
peroxisomal cuando dicha proteína es expresada en un contexto
heterólogo en un hospedero eucariota. Por ejemplo, las cepas de
Penicillium chrysogenum transformadas con expandasa de S.
clavuligerus (como por ejemplo se discute en EP 0532 341 A1)
muestran localización de la expandasa respectiva dentro del
peroxisoma.
Ha sido encontrado, que la expandasa tipo
salvaje de Streptomyces clavuligerus, cuando se produce de
manera recombinante en Penicillium chrysogenum,
predominantemente se acumula en los microcuerpos. Dicha secuencia
de tres aminoácidos, Ser-Lis-Ala,
aparentemente sirve como señal de localización del microcuerpo en
Penicillium chrysogenum, aunque es algo divergente de las
secuencias de consenso para las señales de localización de
microcuerpos en levadura.
Cuando las señales de localización peroxisomal,
así como las señales que deben prevenir la localización dentro de
peroxisomas, fueron diseñadas sobre el terminal carboxil de la
expandasa de S. clavuligerus, o por el mismo motivo sobre el
terminal carboxi de la expandasa/hidrolasa de Cephalosporium
acremonium, esta tendencia a localizarse dentro del peroxisoma
no modificó, a pesar de las diferentes secuencias de aminoácido
carboxi terminal que fueron adicionadas (Verburg y otros, P.35, page
108. In: 7^{th} Int. Symp. Gen. Industr. Microorg. 26 Junio - 1
Julio 1994, Montreal Canadá).
Aparentemente, la enzima conduce una señal de
localización efectiva, causando que se localice, al menos
predominantemente, dentro del microcuerpo de la célula hospedera
heteróloga de Penicillium chrysogenum. Sin embargo, en una
realización de la invención, la invención ahora provee una
modificación efectiva de una expandasa, modificando la tendencia a
localizarse dentro del microcuerpo y conduciendo a una localización
predominante de dicha expandas en el citosol de un hospedero.
La tendencia a la localización en el microcuerpo
o peroxisoma está gobernada por señales de localización peroxisomal
N-terminal o C-terminal (PTSs),
previniendo sustancialmente la modificación de las mencionadas PTS
(sean N-terminales o C-terminales)
dicha localización en los microcuerpos. Un ejemplo de dicha
modificación es la modificación en una secuencia de nucleótido que
codifica para un tripéptido carboxi terminal
X1-X2-X3, por ejemplo donde X1 es
un residuo aminoácido seleccionado del grupo compuesto de Serina,
Cisteína y Alanina, X2 es un residuo aminoácido seleccionado del
grupo compuesto de Lisina, Histidina y Arginina y X3 es Leucina o
Alanina. Dichas secuencias de tripéptidos son también llamados
péptidos tipo SKL, y la secuencia esencial de la señal puede ser un
pequeño aminoácido en el primero, un residuo básico en el penúltimo
y un gran residuo no polar en la posición
C-terminal. La invención provee un fragmento de ADN
que codifica una expandasa donde dicho fragmento que codifica un
tripéptido tipo SKL ha sido modificado o seleccionado de forma que
sustancialmente prevenga a la expandasa de ser localizada en los
microcuerpos y en consecuencia cause que la expandasa sea
localizada predominantemente en el citosol de la célula hospedera
con expresión en dicha célula heteróloga.
En una realización preferida de la invención,
dicho fragmento de ADN es obtenido de ADN que codifica expandasa de
S. clavuligerus inicialmente comprendiendo una secuencia de
nucleótidos que codifica un tripéptido
carboxi-terminal Serina - Lisina - Alanina, el cual
es modificado para causar que la expandasa sea localizada
predominantemente en el citosol de la célula hospedera con expresión
en esta. Dicha modificación se ejemplifica particularmente por un
fragmento de ADN de la invención donde una secuencia de nucleótidos
que codifica para Serina - Lisina - Alanina ha sido modificada en
una secuencia que codifica para Serina - Lisina -Ácido aspártico, o
donde el aminoácido en la última posición ha sido suprimido o
reemplazado por ejemplo con otro residuo no hidrofóbico.
Aún otra modificación comprende Serina - Serina
- Ácido aspártico, o donde el aminoácido de la penúltima posición
ha sido suprimido o reemplazado por un residuo no positivamente
cargado.
Aún otras modificaciones comprenden supresiones
o modificaciones en la primera posición del tripéptido que
modifican la ruta de una proteína así modificada en un hospedero
heterólogo y causan que esta sea predominantemente localizada en el
citosol de la célula hospedera usada.
Aún otras modificaciones comprenden supresiones
o modificaciones de cualquier combinación de estos tres aminoácidos
o codones que codifican estos aminoácidos
carboxi-terminales.
Por un lado, ha sido sorpresivamente encontrado
que la modificación deliberada, usando técnicas convencionales de
ADN recombinante, de la secuencia tripeptídica SKA (o variantes
funcionales de estas como se explica arriba) la cual aparentemente
funciona como una señal de localización del microcuerpo, causa que
la enzima expresada de manera heteróloga se acumule
predominantemente en el citosol de la célula hospedera, en lugar de
en los microcuerpos.
Sin embargo, por otro lado, las variaciones de
las proteínas en la naturaleza son abundantes, y ahora es posible
encontrar microorganismos que comprendan una enzima tal como una
expandasa, que, cuando dicha enzima estuviese expresada en un
hospedero heterólogo, estaría predominantemente localizada en el
citosol de dicho hospedero. Especialmente proteínas o enzimas que
tengan una secuencia C-terminal que se desvía de la
secuencias de señalización identificada anteriormente son probables
candidatas para ser probadas para la localización citosólica y
seleccionadas para su uso posterior en el mejoramiento de los
rendimientos en la producción de cefalosporina. En una realización
particular, la invención provee una secuencia de nucleótidos que
codifica para una expandasa la cual con expresión en una célula
hospedera de Penicillium chrysogenum es localizada
predominantemente en el citosol, mejorando de esta forma el
rendimiento de la cefalosporina por sobre aquellos de una célula
hospedera que expresa una enzima comparable dentro o en los
microcuerpos.
De forma bastante contraria a lo esperado, una
enzima como la provista por la invención parece ser estable fuera
de los microcuerpos. Una expandasa, como la provista por la
invención, es aún capaz de expandir penicilinas, incluso aquellas
con cadenas laterales de ocurrencia no natural (ver por ejemplo EP
97201196.9 y EP 97201197.7) a sus correspondientes derivados
7-ADCA.
La invención también provee un fragmento de ADN
aislado que codifica una enzima modificada o seleccionada como es
provisto por la invención, dicho fragmento adicionalmente
conteniendo regiones reguladoras para la expresión de dicho ADN en
una célula hospedera eucariota. Está, por ejemplo, dentro de la
pericia del especialista, proveer un fragmento de ADN con regiones
reguladoras funcionales en una o más células hospederas de origen
en varios organismos, tales como animales o plantas o una levadura u
hongo. En una realización preferida, la invención provee un
fragmento de ADN que codifica una enzima modificada como la provista
por la invención comprendiendo regiones reguladoras apropiadas para
la regulación de la expresión en una célula hospedera derivada de
un microorganismo tal como una levadura u hongo.
Sorpresivamente, ha sido encontrado que en una
célula hospedera (por ejemplo Penicillium chrysogenum)
transformada con una expandasa principalmente acumulada en el
citosol como lo opuesto a dentro de los microcuerpos la producción
de antibióticos de cefalosporina (por ejemplo
adipil-7-ADCA), es incrementada, en
lugar de decrecida. Esto es incluso cierto cuando se compara con
una célula hospedera que ha sido transformada con ADN que codifica
para una expandasa comparable en todos los otros aspectos pero
localizada en el microcuerpo.
La invención también provee una célula hospedera
u organismo hospedero (o descendiente del mismo) que ha sido
provisto con un fragmento de ADN recombinante modificado o
seleccionado que codifica una enzima localizada en el citosol como
es provisto por la invención. Dicho organismo hospedero está por
ejemplo incorporando, por ejemplo como resultado de la
transformación de dicho organismo hospedero o antecesor de dicho
organismo hospedero, un fragmento de ADN, que opcionalmente
comprende regiones o secuencias reguladoras, que comprenden una
secuencia de nucleótidos que codifica una enzima modificada como la
provista por la invención. Dicho hospedero es preferiblemente
seleccionado del grupo consistente en plantas y microorganismos,
preferiblemente siendo un hongo seleccionado
del grupo consistente en Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans o A. niger y Cephalosporium acremonium.
del grupo consistente en Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans o A. niger y Cephalosporium acremonium.
La invención también provee cultivos de células
hospederas u organismos hospederos como los provistos por la
invención. Dichos cultivos contienen células en las que una
expandasa funcional capaz de expandir penicilinas con cadenas
laterales (de ocurrencia no natural) a los derivados
7-ADCA correspondientes es predominantemente
encontrada en el citosol. En una realización preferida, la invención
provee un cultivo para fermentación a gran escala donde una
expandasa modificada localizada en el citosol contribuye a mayores
niveles de producción de
adipoil-7-ADCA que en un cultivo de
fermentación a escala comparable utilizando expandasa tipo salvaje
de origen comparable.
Todavía en otra realización, la invención provee
una célula hospedera, y cultivos de la misma, que han sido
provistos por técnicas recombinantes con una expandasa seleccionada
entre otras por su capacidad o tendencia para predominantemente
localizarse en el citosol de un hospedero heterólogo, ya sea que
dicha expandasa se localice en un contexto homólogo en un
microcuerpo o no. Dicha célula hospedera puede ser seleccionada
proveyendo una célula hospedera con un fragmento de ADN que
codifica una expandasa, y comprobando si dicha expandasa se
localiza predominantemente en el citosol. En una realización
preferida, la comprobación para la localización de dicha enzima es
ejecutada por un microscopio electrónico, como se explica en la
parte experimental de la descripción.
La invención también provee un método para hacer
un organismo o célula hospedera provista con un fragmento de ADN
modificado o seleccionado que codifica una enzima modificada o
seleccionada como la provista por la invención que comprende
contactar las células bajo condiciones de transformación con un
fragmento de ADN como el provisto por la invención y seleccionar
células que hayan obtenido dicho ADN. La transformación de células
hospederas, por ejemplo de P. chrysogenum u otro hongo puede,
en general, ser lograda por diferentes medios de entrega de ADN,
como la captación de protoplasto mediada por PEG-Ca,
electroporación o técnicas de pistola de partículas, y selección de
transformantes. Ver por ejemplo Van den Hondel en Punt, Gene and
Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in: Applied
Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.),
Cambridge University Press (1991). La aplicación de marcadores de
selección dominantes y no dominantes ha sido descrita (Van den
Hondel, supra). Los marcadores de selección tanto de origen
homólogo (derivados de P. chrysogenum) como heterólogo
(derivados no-P. chrysogenum) han sido descritos (Gouka y
otros, J. Biotechnol. 20 (1991) 189-200).
La aplicación de los diferentes marcadores de
selección transformantes, homólogos o heterólogos, en presencia o
ausencia de secuencias de vector, físicamente vinculados o no al ADN
no seleccionable, en la selección de transformantes son bien
conocidos en el oficio.
La invención también provee un método para
expresar un fragmento de ADN que codifica una expandasa en una
célula hospedera, donde dicho fragmento de ADN codifica para una
expandasa causando que la expandasa sea producida y localizada
predominantemente en el citosol. En una realización preferida de la
invención dicho método comprende la provisión de dicho fragmento de
ADN con una modificación en una secuencia de nucleótidos que
codifica una secuencia de aminoácidos
carboxi-terminal, preferiblemente una secuencia de
tripéptido tal como la de SKA encontrada con la expandasa de
Streptomyces clavuligerus. Tal método provisto por la
invención es preferiblemente usado con Penicillium
chrysogenum como célula hospedera.
La invención también provee un método para
expandir el anillo de 5 miembros de un compuesto
beta-lactámico para formar un compuesto cephem de 6
miembros, comprendiendo los pasos de cultivar un hospedero capaz de
producir dicho compuesto beta-lactámico bajo
condiciones conducentes a ello y permitir que dicho hospedero
exprese una expandasa heteróloga derivada por medios recombinantes
y capaz de expandir el anillo de 5 miembros de dicho compuesto
beta-lactámico a partir de un fragmento de ADN que
lo codifica, para formar dicho compuesto cephem de 6 miembros,
caracterizado porque dicha expandasa es expresada a partir de un
fragmento de ADN que ha sido modificado o seleccionado para
codificar para una expandasa que es producida o al menos está
localizada predominantemente en el citosol de la célula
hospedera.
En una realización preferida la invención provee
un método para expandir el anillo de 5 miembros de un compuesto
beta-lactámico por una expandasa modificada donde
dicha expandasa esta localizada en el citosol de un célula
hospedera debido a una modificación en el fragmento de ADN que la
codifica, con lo que una señal de localización de un microcuerpo ha
sido modificada, preferiblemente donde una señal de localización que
comprende una secuencia de aminoácido de tripéptido tal como la
obtenible de una expandasa de Streptomyces clavuligerus ha
sido modificada.
En la parte experimental de esta descripción un
ejemplo de un método como el provisto por la invención es dado
donde dicha célula hospedera es Penicillium chrysogenum.
En una realización preferida de la invención un
método es provisto donde dicho compuesto
beta-lactámico es seleccionado del grupo
consistente en fenilacetil-6-APA,
fenoxiacetil-6-APA,
alfa-aminoadipoil-6-APA,
adipoil-6-APA,
glutaril-6-APA, o de
suberil-6-APA,
pimelil-6-APA,
trans-\beta-hidromuconil-6-APA
o compuestos comparables. Además, la invención provee un método
para hacer un compuesto cephem comprendiendo los pasos de expandir
el anillo de 5 miembros (penam) de dicho compuesto
beta-lactámico en un proceso o método de acuerdo a
la invención y recuperar el compuesto cephem así formado. En una
realización preferida, la invención provee un método para hacer un
compuesto cephem en un cultivo de célula hospedera para fermentación
a gran escala donde la expandasa que está predominantemente
localizada en el citosol de dicha célula hospedera contribuye a
niveles de producción superiores de
adipoil-7-ADCA que en un método para
hacer un compuesto cephem vía fermentación a escala comparable de
un cultivo utilizando una expandasa (en forma modificada o tipo
salvaje o) de origen comparable que esté predominantemente
localizada en un microcuerpo.
La invención está ilustrada con más detalle en
las 4 Figuras siguientes.
Fig. 1. Representación esquemática del plásmido
pISEWA.
Fig. 2. Representación esquemática del plásmido
ISEWA-SKD.
Fig. 3. Productividades de
Adipoil-7-ADCA de un gran número
(alrededor de 80) de transformantes derivados de transformaciones
con plásmidos pISEWA (barras abiertas) y pISEWA-SKD
(barras enteras). Eje de las X: clases de productividad (Unidades
arbitrarias); eje de las Y: % de transformantes por clase.
Fig. 4. Fotografías EM de un transformante
expresando la expandasa de tipo salvaje (panel A) y de un
transformante que expresa la expandasa con una señal de no
localización (SKA-> SKD, Panel B). Las partículas doradas
indican la presencia de expandasa. N: núcleo, M: mitocondrion, P:
peroxisoma (microcuerpo).
La transformación de células hospederas, por
ejemplo de P. chrysogenum u otro hongo puede, en general,
ser lograda mediante diferentes medios de entrega de ADN, como
captación de protoplasto mediada por PEG-Ca,
electroporación o técnicas de pistola de partículas, y selección de
transformantes. Ver por ejemplo Van den Hondel en Punt, Gene and
Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in: Applied
Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.),
Cambridge University Press (1991). La aplicación de marcadores de
selección dominantes y no dominantes ha sido descrita (Van den
Hondel, supra). Los marcadores de selección tanto de origen
homólogo (derivados de P. chrysogenum) como heterólogo
(derivados no-P. chrysogenum) han sido descritos (Gouka y
otros, J. Biotechnol. 20 (1991) 189-200).
La aplicación de los diferentes marcadores de
selección transformantes, homólogos o heterólogos, en presencia o
ausencia de secuencias de vector, físicamente vinculados o no al ADN
no seleccionable, en la selección de transformantes son bien
conocidos.
La reacción de la expansión de anillo, mediada
por la enzima expandasa modificada o seleccionada es introducida y
expresada de esta manera en P. chrysogenum, por ejemplo en la
cepa Wisconsin 54-1255 (depositada en ATCC con
número de acceso 28089). Otras cepas de P. chrysogenum,
incluyendo mutantes de la cepa Wisconsin 54-1255,
que posee un rendimiento de beta-lactama mejorado,
también son apropiadas.
Además, el gen cefE modificado es
colocado bajo el control transcripcional y transduccional de los
elementos de control del gen del hongo. Estos elementos pueden ser
obtenidos de genes de hongos clonados como el gen pcbC o
IPNS de P.chrysogenum, el gen b-tubulin, el
gen gpdA de Aspergillus nidulans, o el gen
glcA de Aspergillus niger.
De acuerdo con la presente invención el
intermedio \beta-lactámico
adipoil-7-ADCA es producido en los
transformantes de P. chrysogenum expresando expandasa por
adición de ácido adípico o una sal o un éster del mismo al medio.
Sales apropiadas son por ejemplo aquellas de sodio o potasio.
Adipoil-7-ADCA es eficientemente
recuperado del medio mediante una extracción por solvente sencilla,
por ejemplo, como sigue:
El caldo es filtrado y un solvente orgánico
inmiscible en agua es adicionado al filtrado. El pH es ajustado
para extraer la cefalosporina de la capa acuoso. El rango de pH
tiene que ser menor de 4.5; preferiblemente entre 4 y 1, más
preferiblemente entre 2 y 1. De esta manera la cefalosporina es
separada de muchas otras impurezas presentes en el caldo de
fermentación. Preferiblemente un pequeño volumen de solvente
orgánico es usado, dando una solución más concentrada de la
cefalosporina, logrando así reducción de las tasas de flujo
volumétrico. Una segunda posibilidad es la extracción del caldo
completo con un pH de 4 o menor. Preferiblemente el caldo es
extraído entre 4 y 1 con un solvente orgánico inmiscible con
agua.
Cualquier solvente que no interfiera con la
molécula de cefalosporina puede ser usado. Solventes apropiados
son, por ejemplo, butil acetato, etil acetato, metil isobutil
cetona, alcoholes como butanol, etc. Preferiblemente son usados
1-butanol o isobutanol.
De aquí en adelante la cefalosporina es de
vuelta extraída con agua a un pH entre 4 y 10, preferiblemente
entre 6 y 9. Otra vez el volumen final puede ser reducido. La
recuperación puede ser llevada a cabo a temperaturas entre 0 y
50ºC, y preferiblemente a temperatura ambiente.
La solución de cefalosporina acuosa así obtenida
es tratada con una enzima apropiada para remover la cadena lateral
de adipoil y obtener el 7-ADCA deseado.
Preferiblemente, una enzima inmovilizada es
usada, para poder usar la enzima repetidamente. La metodología para
la preparación de dichas partículas y la inmovilización de las
enzimas han sido descritas ampliamente en
EP-A-0222462. El pH de la solución
acuosa tiene un valor de, por ejemplo pH 4 a pH 9, al cual la
reacción de degradación de la cefalosporina es minimizada y la
conversión deseada con la enzima es optimizada. Así, la enzima es
adicionada a la solución de cefalosporina acuosa mientras se
mantiene el pH en el nivel apropiado mediante, por ejemplo, la
adición de una base inorgánica, como una solución de hidróxido de
potasio, o aplicando una resina intercambiadora de cationes.
Cuando la reacción es completada la enzima inmovilizada es eliminada
mediante filtración. Otra posibilidad es la aplicación de la enzima
inmovilizada en una columna de lecho fluidizado fija, o usando la
enzima en solución y eliminando los productos mediante filtración de
membrana. Posteriormente, la mezcla de reacción es acidificada en
presencia de un solvente orgánico inmiscible con agua.
Las enzimas apropiadas son, por ejemplo,
derivadas de un microorganismo Pseudomonas SY77 teniendo una
mutación en una o más de las posiciones 62, 177, 178 y 179. También
pueden usarse enzimas de otros microorganismos Pseudomonas,
preferiblemente Pseudomonas SE83, opcionalmente presentando
una mutación en una o más de las posiciones correspondientes a las
posiciones 62, 177, 178 y 179 en Pseudomonas SY77.
Después de ajustar el pH de alrededor de 0.1 a
1.5, las capas son separadas y el pH de la capa acuosa es ajustado
entre 2 y 5, más preferiblemente entre 3 y 4. El
7-ADCA cristalino es entonces filtrado fuera.
La deacilación también puede ser llevada a cabo
químicamente como es conocido en el arte, por ejemplo, vía
formación de una cadena lateral de iminocloruro, por adición de
pentacloruro de fósforo a una temperatura inferior a 10ºC y
posteriormente isobutanol a temperatura ambiente o menor.
Los siguientes ejemplos son ofrecidos a manera
de ilustración y no a manera de limitación. La aproximación total
establece i) la identificación de residuos de expandasa involucrados
en especificidad de localización, ii) la selección de proteínas de
expandasa o construcción de proteínas de expandasa mutantes, iii)
subclonacion de genes de expandasa mutantes o seleccionados en
vectores de expresión de P. chrysogenum y expresión de la
expandasa en P. chrysogenum, iv) la determinación de la
producción de adipoil-7-ADCA contra
la producción de
\alpha-D-aminoadipoil-7-ADCA
y adipoil-6-APA.
De manera similar a como ha sido descrito para
la cadena lateral de adipoil una persona versada en el arte también
podría usar la enzima de expandasa modificada en procesos revelados
en WO95/04148 y WO95/04149 los cuales usan ácido
3'-carboxilometiltiopropiónico y ácido 3,3'-
tiodipropiónico como cadenas laterales, produciendo
2-(carboxiloetiltio)acetil-7-ADCA
y una mezcla de
3-(carboxilometiltio)propionil-7-ADCA
y
2-(carboxiloetiltio)acetil-7-ADCA
respectivamente.
Las técnicas involucradas en la manipulación
genética del gen de la expandasa están bien descritas. Las fuentes
que pueden ser usadas como plantilla en reacciones PCR incluyen
preparaciones de ADN cromosomal de cepas de Streptomyces
clavuligerus disponibles públicamente (tal como ATCC 27064), o
casetes de expresión tales como pZEx (descrito en PCT/EP97/03879) y
pISEWA (descrito en EP-02812P). El casete de
expresión de la expandasa pISEWA (Fig. 1) contiene el gen de la
expandasa de Streptomyces clavuligerus tipo salvaje
incluyendo el promotor IPNS y el terminador AT. Para romper la
localización peroxisomal de la expandasa, la secuencia del
C-terminal de CefE es mutada de SKA a SKD. Para ese
fin, con pISEWA como plantilla, una reacción PCR es ejecutada,
usando cebadores 1 y 2 (ver tabla I). La PCR es ejecutada con una
polimerasa correctora. Después de un paso de desnaturalización (2
min 98ºC), parte del gen cefE es amplificado en 25 ciclos
(1,15 min 94ºC, 45 sec 55ºC, 1 min 72ºC) seguido por un paso de
extensión (8 min, 72ºC). El producto de esta reacción pasa del
sitio StuI en cefE (alrededor de 450 bp del inicio de
traducción; ver Kovacevic y otros: Cloning,
characterisation, and expression in Escherichia coli of the
Streptomyces clavuligerus gene encoding
desacetoxycephalosporin C synthetase, J. Bacteriol., 171,
754-760, 1989) a un sitio NsiI aguas abajo
del codón de parada. Después de la verificación de la secuencia
mediante secuenciación nucleotídica, el fragmento
StuI-NsiI es usado para intercambiar el fragmento
cefE "tipo salvaje" en pISEWA. Así, es generado el
plásmido pISEWA-SKD (Fig. 2).
Las técnicas involucradas en la transferencia de
ADN a los protoplastos de P.chrysogenum son bien conocidas
en el arte y descritas en muchas referencias, incluyendo Finkelstein
and Ball (eds.), Biotechnology of filamentous fungi, technology and
products, Butterworth-Heinemann (1992); Bennett and
Lasure (eds.) More Gene Manipulations in fungi, Academic Press
(1991); Turner, in: Pühler (ed), Biotecnnology, second completely
revised edition, VHC (1992). La transformación del protoplasto
mediada por Ca-PEG es usada como se describe en
EP635574. Las construcciones pISEWA y pISEWA-SKD
son así introducidas en P. chrysogenum Wisconsin
54-1255 (ATC 28089) por
co-transformación con GBGLA28 (EP635574), las cuales
facilitan el crecimiento de los transformantes de
P.chrysogenum en un medio de selección que contiene acetamida
como única fuente de nitrógeno. Más preferiblemente, es utilizada
una cepa que tenga una capacidad más pronunciada para producir
penicilinas. Ejemplos son las cepas como CBS 455.95.
Los transformantes son purificados por cultivo
repetido en un medio selectivo. Colonias individuales estables son
usadas para tamizado adicional en presencia del gen de expandasa por
bioensayo. Los transformantes son cultivados en un medio de agar.
E. coli ESS2231 es usado como bacteria indicadora en una
cubierta de agar, que también contiene Bacto penasa para permitir
discriminar entre la producción de penicilina y cefalosporina de
acuerdo a métodos bien conocidos en el arte y descritos por ejemplo
en Guttiérez y otros, Mol. Gen. Genet. 225 (1991),
56-64. La presencia del gen cefE en los
transformantes es confirmada por PCR como se describe por ejemplo
en WO 95/04149 en ADN cromosomal, usando cebadores 1 y 2 (Tabla).
Los transformantes expandasa positivos son seleccionados para
tamizado adicional sobre la capacidad de producir cefalosporinas
como se describe por ejemplo en WO 95/04149. Los transformantes son
usados para inocular frascos de agitación con medio líquido como se
describe por ejemplo en WO 95/04149. Los transformantes son
inoculados a 2 * 10^{6} conidia/ml en un medio de siembra que
consiste por ejemplo en (g/l): glucosa, 30:
(NH4)_{2}SO_{4}, 10: KH_{2}PO_{4}, 10, solución I de
elemento traza (MgSO_{4} 7H_{2}O, 25; FeSO_{4} 7H_{2}O, 10;
CuSO_{4} 5H_{2}O, 0.5; ZnSO_{4} 7H_{2}O, 2;
Na_{2}SO_{4}, 50; MnSO_{4} H_{2}O, 2; CaCl_{2} 2H_{2}O,
5) 10 (ml/l) (pH 6,5 antes de la esterilización).
El medio de siembra es incubado por
48-72 horas a 25-30ºC y
posteriormente usado para inocular 10-20 volúmenes
de un medio de producción que conteniendo (g/l) lactosa, 80;
CaSO_{4}, 4; urea, 3; MgSO_{4} 7H_{2}O, 2; KH_{2}PO_{4},
7, NaCl, 0,5; (NH_{4})_{2}SO_{4}, 6; FeSO_{4}
7H_{2}O, 0,1; ácido adípico, 2 a 5; solución II de elemento traza
(CuSO_{4} 5 H_{2}O, 0.5; ZnSO_{4} 7H_{2}O, 2; MnSO_{4}
H_{2}O, 2; Na_{2}SO_{4}, 50), 10 (ml/l) (pH 5,5 a 6.0 antes
de la esterilización). La incubación es entonces prolongada por
otras 96-120 horas. Los filtrados de cultivos bien
desarrollados son analizados por HPLC y NMR para la producción de
adipoil-7-ADCA. Como muestra la
figura 3, los transformantes con la expandasa predominantemente
localizada en el citosol se desempeñan significativamente mejor que
los transformantes con la expandasa localizada en el
microcuerpo.
Con la finalidad de evaluar que la mutación del
C-terminal de la expandasa resulte en un bloque en
el transporte de expandasa al peroxisoma, es utilizado el
microscopio electrónico. Las muestras son fijadas utilizando
glutaraldehido, de acuerdo a un procedimiento descrito por Waterham
y otros, J. Cell Biol. 127: 737-749 (1994). Los
estudios de localización son ejecutados utilizando
inmuno-citoquímica con un anticuerpo policlonal
ant-expandasa. La Figura 4 muestra la expandasa
acumulándose predominantemente en el citosol o en el
microcuerpo.
Para determinar el desempeño de los
transformantes con expandasa mutada en fermentaciones a gran
escala, son seleccionadas ambas cepas de transformaciones para
análisis posteriores. Así, es escogido un transformante de
expandasa mutante que produce un 10% más de
adipoil-7-ADCA que el transformante
que es seleccionado de la transformación con el gen de expandasa
tipo salvaje. Cuando las cepas se cultivan en un fermentador de 10
L la cantidad de adipoil-7-ADCA en
el cultivo con la expandasa localizada predominantemente en el
citosol es mayor que en la fermentación con expandasa localizada
predominantemente en el microcuerpo. Así, la expandasa
predominantemente localizada en el citosol es en apariencia
suficientemente estable para mantener una productividad estable y
un rendimiento mejorado a largo plazo o en fermentación a gran
escala.
<110> DSM N.V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Producción mejorada in vivo
de cefalosporinas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> expandasa citosólica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP99/03455
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-05-19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggccttcc tcgactgcga gccg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaagatgca tatgctcgtc atgaagagcc tactagtcct tggatgtgcg gcg
\hfill53
Claims (19)
1. Un fragmento de ADN aislado que codifica para
una expandasa, donde una secuencia de nucleótido que codifica una
señal de localización de microcuerpo C-terminal
comprendiendo una secuencia de tripéptido terminal
X1-X2-X3, donde X1 es un residuo de
aminoácido seleccionado del grupo consistente de Serina, Cisteína y
Alanina, X2 es un residuo de aminoácido seleccionado del grupo
consistente en Lisina, Histidina y Arginina y X3 es Leucina o
Alanina ha sido modificada de forma que en la expandasa modificada
X2 es un residuo no positivamente cargado y/o X3 es un residuo no
hidrofóbico, el cual modificó la expandasa, después que la expresión
de dicho fragmento de ADN en un hospedero de Penicillium
chrysogenum, es encontrada en el citosol de dicho hospedero.
2. Un fragmento de ADN de acuerdo a la
reivindicación 1, donde el fragmento de ADN aislado que no ha sido
modificado y el cual codifica la expandasa tipo salvaje es obtenible
de Streptomyces clavuligerus
3. Un fragmento de ADN de acuerdo a la
reivindicación 2, donde una secuencia de nucleótido que codifica una
secuencia de tripéptido C-terminal
Serina-Lisina-Alanina ha sido
modificada para prevenir que la expandasa se localice en los
microcuerpos de la célula hospedera de expresión allí.
4. Un fragmento de ADN de acuerdo a la
reivindicación 3, donde la secuencia de nucleótidos que codifica
para la secuencia de tripéptido C-terminal
Serina-Lisina-Alanina ha sido
modificada en una secuencia de nucleótidos que codifica para la
secuencia de tripéptido Serina-Lisina-Ácido
aspártico.
5. Un fragmento de ADN de acuerdo a cualquiera
de las reivindicaciones previas, que comprende adicionalmente
regiones reguladoras para la expresión de dicho ADN en la célula
hospedera.
6. Un fragmento de ADN de acuerdo a la
reivindicación 5, donde dicha célula hospedera es seleccionada de un
microorganismo tal como una levadura u hongo.
7. Un fragmento de ADN de acuerdo a la
reivindicación 6, donde dicha célula hospedera es Penicillium
chrysogenum.
8. Una célula hospedera que incorpora como
resultado de una transformación, opcionalmente de un antecesor, y
en forma expresable un fragmento de ADN de acuerdo a cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7.
9. Una célula hospedera de acuerdo a la
reivindicación 8, seleccionada del grupo consistente en
microorganismos, preferiblemente un hongo seleccionado del grupo
consistente en Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans, A.
niger y Acremonium chrysogenum.
10. Una célula hospedera de acuerdo a la
reivindicación 9, donde el hospedero es una cepa de Penicillium
chrysogenum.
11. Una célula hospedera de acuerdo a cualquiera
de las reivindicaciones 8 a 10 que comprende una expandasa
funcional que es localizada en el citosol.
12. Un cultivo que comprendiendo una célula de
acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
13. Un método para hacer una célula hospedera de
acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende
los pasos de contactar células bajo las condiciones de
transformación de dichos hospederos con ADN de acuerdo a cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 7 y seleccionar una célula que ha
obtenido dicho ADN.
14. Un método para hacer una célula hospedera de
acuerdo a la reivindicación 13, que comprende adicionalmente la
selección de una célula donde una expandasa está localizada en el
citosol.
15. Un método de acuerdo a la reivindicación 14,
donde dicha célula hospedera es una célula de Penicillium
chrysogenum.
16. Un método para expandir el anillo de 5
miembros de un compuesto beta-lactámico para formar
un compuesto cephem de 6 miembros, que comprende los pasos de
cultivar un hospedero capaz de producir dicho compuesto
beta-lactámico bajo condiciones conducentes a ello
y permitir que dicho hospedero exprese una expandasa heteróloga
capaz de expandir el anillo de 5 miembros de dicho compuesto
beta-lactámico desde un fragmento de ADN que lo
codifica, de modo que forme el mencionado compuesto cephem de 6
miembros, caracterizado porque dicha expandasa es expresada
a partir de un fragmento de ADN de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
17. Un método de acuerdo a la reivindicación 16,
donde el compuesto beta-lactámico es seleccionado
del grupo consistente en
fenilacetil-6-APA,
fenoxiacetil-6-APA,
alfaaminoadipoil-6-APA,
adipoil-6-APA,
glutaril-6-APA,
suberil-6-APA,
pimelil-6-APA, o
trans-\beta-hidromuconil-6-APA.
\newpage
18. Un método para hacer un compuesto cephem que
comprende los pasos de expandir del anillo penam de un compuesto
beta-lactámico en un proceso de acuerdo a la
reivindicación 16 o 17 y recuperar el compuesto cephem así
formado.
19. Un método de acuerdo a las reivindicaciones
16 a 18, que comprende adicionalmente el tratamiento del compuesto
cephem con una enzima apropiada o químicamente para remover la
cadena lateral para obtener el compuesto cephem
7-ADCA.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98201655 | 1998-05-19 | ||
| EP98201655 | 1998-05-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2302379T3 true ES2302379T3 (es) | 2008-07-01 |
Family
ID=8233737
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99925015T Expired - Lifetime ES2302379T3 (es) | 1998-05-19 | 1999-05-19 | Produccion in vivo mejorada de cefalosporina. |
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|---|---|
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