CN107429273A - 用于在厌氧条件下生产衣康酸的方法 - Google Patents

用于在厌氧条件下生产衣康酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107429273A
CN107429273A CN201680010220.XA CN201680010220A CN107429273A CN 107429273 A CN107429273 A CN 107429273A CN 201680010220 A CN201680010220 A CN 201680010220A CN 107429273 A CN107429273 A CN 107429273A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ester
itaconic acid
acid
recombinant cell
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680010220.XA
Other languages
English (en)
Inventor
鲁德·威斯塞伊斯
基拉·沃利斯托
格里特·埃格英克
约翰·皮耶特·马里努斯·桑德斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DSM IP Assets BV
Original Assignee
DSM IP Assets BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DSM IP Assets BV filed Critical DSM IP Assets BV
Publication of CN107429273A publication Critical patent/CN107429273A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01006—Aconitate decarboxylase (4.1.1.6)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于产生衣康酸的方法，所述方法包括在适合的发酵培养基中发酵能够产生衣康酸的重组细胞，从而产生衣康酸，其中：(a)所述重组细胞：(i)过度表达顺式乌头酸脱羧酶；并且(ii)过度表达柠檬酸循环的一部分和/或到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的活性减小；以及任选地，(b)所述发酵在厌氧条件下进行。

Description

用于在厌氧条件下生产衣康酸的方法
发明领域
本发明涉及一种用于通过发酵产生衣康酸的方法。本发明还涉及一种能够通过此方法获得的包含衣康酸的发酵液，并且涉及一种使用通过产生衣康酸的方法能够获得的衣康酸来产生药物、化妆品、食物、饲料或化学产品的方法。本发明还涉及一种能够产生衣康酸的重组细胞。
发明背景
衣康酸是通过多种微生物产生的不饱和C5二羧酸，其在化学和制药工业中可用作许多工业上相关的化合物的前体。由于其作为用于产生塑料的丙烯酸和甲基丙烯酸的替代物的可能性，将其用于产生聚合物是尤其令人感兴趣的。丙烯酸和甲基丙烯酸严重刺激和腐蚀皮肤和呼吸道。另一方面，衣康酸是无毒的且容易生物降解，并且出于这些原因，在上述产生中对衣康酸的需要预期将有所增加。
用于由糖产生衣康酸的当前发酵方法是使用氧作为最终电子受体来需氧地执行。需氧方法的产生率通常较低(＜1g/l/h)，并且取决于氧转移速率和/或消散所生成的热所需要的冷却能力。需氧方法的产率是受限的，因为底物可以通过呼吸作用完全氧化。此外，呼吸生成许多代谢能量，从而导致底物转化为微生物生物质，这也降低了产物产率。
因此，需要进一步改进衣康酸的产生方法，以使得在工业生物反应器中可以实现经济上可行的大规模产生。
发明概述
本领域已知衣康酸可以通过大肠杆菌过度表达来自土曲霉(Aspergillusterreus)的顺式乌头酸脱羧酶(cadA)来需氧地产生。在本文中，已证实由大肠杆菌进行的衣康酸产生通过以下来改进：经由过度表达柠檬酸循环的第一部分(柠檬酸合酶和乌头酸酶，例如来自谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的柠檬酸合酶(gltA)和乌头酸酶(acnA))，即经由过度表达编码参与柠檬酸循环的第一部分的酶的基因，从而增强前体的可得性；以及经由失活编码磷酸乙酰基转移酶(pta))和乳糖脱氢酶(ldhA)的基因来消除到乙酸和乳酸的天然代谢路径。
葡萄糖到衣康酸酯的转化是氧化反应，其导致NAD辅因子的净还原。使用呼吸作用在需氧条件下再生NAD。在厌氧条件下，必须采用替代方法来进行辅因子再生。
还证明了在衣康酸盐/酯在大肠杆菌中的厌氧发酵生产中通过共同产生乙醇和甲酸盐/酯或H2和CO2来改进的衣康酸盐/酯产生。出乎意料的是，当引入衣康酸盐/酯路径时，菌株在厌氧条件下开始产生大量的谷氨酸盐/酯。因此，消除谷氨酸盐/酯形成的策略可以用于进一步增加衣康酸盐/酯的产生。
因此，本发明涉及一种用于产生衣康酸或包含衣康酸的发酵液的方法，所述方法包括在适合的发酵培养基中，在例如导致衣康酸产生的条件下，发酵能够产生衣康酸的重组细胞，从而产生衣康酸，其中：
(a)重组细胞：(i)过度表达顺式乌头酸脱羧酶；并且(ii)过度表达柠檬酸循环的一部分和/或到乙酸(acetate)和/或乳酸(lactate)的天然代谢路径的活性减小；以及任选地，
(b)发酵在厌氧条件下进行。
此方法可任选地包括回收衣康酸。
本发明还涉及通过本发明的方法能够获得的包含衣康酸的发酵液。所述发酵液可包含衣康酸，其为由本发明的重组细胞分泌到发酵液中的衣康酸形式和/或包含在本发明的重组细胞内的衣康酸形式。发酵液可包含本发明的重组细胞或者可以是已去除此类细胞的发酵液。
另外，本发明涉及一种用于生产药物、化妆品、食品、饲料或化学产品的方法，所述方法包括：(a)通过本发明的方法制备衣康酸；和(b)使用所述衣康酸制备药物、化妆品或化学产品。
另外，本发明涉及能够产生衣康酸的重组细胞，其中所述重组细胞：(i)过度表达顺式乌头酸脱羧酶；并且(ii)过度表达柠檬酸循环的一部分和/或到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的活性减小。
附图简述
图1示出了在生物反应器中在30℃(圆形)或37℃(正方形)下培养的大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-C)的CFE中顺式乌头酸盐/酯到衣康酸盐/酯的转化。在测定混合物中的蛋白质浓度分别为5.8和4.3mg/mL。CadA的活性来源于线的斜率。
图2示出了在含有pEV、pKV-C或pKV-CGA的大肠杆菌BW25113(DE3)的CFE中顺式乌头酸脱羧酶(阴影线)、柠檬酸合酶(水平线)和乌头酸酶(对角线)的酶比活性(U/mg)。菌株在生物反应器中在30℃下在MM培养基上培养。给出了一式两份的平行研究的平均值和标准偏差(SD)。
图3示出了在pH控制的生物反应器中在MM上在30℃下含有pEV(左图)、pKV-C(中图)和pKV-CGA(右图)的大肠杆菌BW25113(DE3)的分批培养。指示了OD600(菱形)以及葡萄糖(正方形)、乙酸盐/酯(三角形)和衣康酸盐/酯(圆形)的浓度。
图4示出了在pH控制的生物反应器中在MM上在30℃下含有pEV(左图)、pKV-C(中图)和pKV-CGA(右图)的大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA的分批培养。指示了OD600(菱形)以及葡萄糖(正方形)、乙酸盐/酯(三角形)、丙酮酸盐/酯(十字形)和衣康酸盐/酯(圆形)的浓度。
图5示出了在pH控制的生物反应器中在MM上在30℃下含有pEV(菱形)、pKV-C(正方形)、pKV-CGA(三角形)或pKV-GA(圆形)的大肠杆菌BW25113(DE3)的分批培养。
图6示出了在pH控制的生物反应器中在MM上在30℃下含有pEV(菱形)、pKV-C(正方形)、pKV-CGA(三角形)或pKV-GA(圆形)的大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA的分批培养。
图7示出了在48小时之后在厌氧血清瓶中在无氮磷酸盐缓冲液中含有pKV-C、pKV-CGA和pKV-GA的大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA中作为％Cmol的产物形成。衣康酸盐/酯(实心)、丙酮酸盐/酯(向上斜条纹)、乙醇(向下斜条纹)、琥珀酸盐/酯(横条纹)以及其他产物(竖条纹)。
序列表描述
SEQ ID NO：1示出用于ldhA缺失的ldhA侧翼F引物的序列。
SEQ ID NO：2示出用于ldhA缺失的ldhA侧翼R引物的序列。
SEQ ID NO：3示出用于PCR验证的ldhA检查F引物的序列。
SEQ ID NO：4示出用于PCR验证的ldhA检查R引物的序列。
表2中也列出了序列的描述。
发明详述
在整个说明书和所附的权利要求书中，词语“包含”、“包括”和“具有”以及其变形将解释为包含性的。即，这些词语旨在表明在上下文允许时可包含未明确陈述的其他要素或整体。
本文中不使用数量词修饰时是指一个/种或多于一个/种(即一个/种或至少一个/种)的语法对象。作为实例，“元素”可意指一个/种元素或多于一个/种元素。
本发明涉及一种用于产生衣康酸以及任选地谷氨酸盐/酯的方法，或者涉及一种用于产生包含衣康酸以及任选地谷氨酸盐/酯的发酵液的方法，其中能够产生衣康酸的重组细胞在适合的发酵培养基中发酵。所述重组细胞的发酵可在导致衣康酸产生的条件下执行。本发明还涉及能够自己产生衣康酸的重组细胞。
在本文中，“重组”细胞指细胞已通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质来修饰，或者细胞来源于如此修饰的细胞。
因此，例如，本发明的重组细胞可表达天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因，或者表达以其他方式异常表达、低表达(under-express)的天然基因或完全不表达的天然基因。与非重组形式的细胞相比，重组细胞可低表达或完全不表达某天然基因，例如使得它在给定的代谢路径中具有减小的活性。即，与非重组形式的细胞相比，由所述天然基因编码的酶可以以更少量产生、完全不产生和/或可具有更低的生物活性或没有生物活性。因此，本发明的重组细胞/适用于本发明方法中的细胞可过度表达非天然或天然基因和/或低表达天然基因。
本发明的重组细胞/用于本发明的方法中的细胞是以下细胞，其：
(i)过度表达顺式乌头酸脱羧酶；并且
(ii)过度表达柠檬酸循环的一部分和/或到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的活性减小。
柠檬酸循环的一部分的过度表达表明编码参与柠檬酸循环的一部分的酶的基因中的一种或多种被过度表达。到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的活性减小表明此天然代谢路径是下调的。
在本发明的上下文中，当参与代谢路径的至少一种基因异常表达、低表达或完全不表达，以使得与非重组形式的细胞相比，在给定代谢路径中由所述基因编码的酶以更少量产生、完全不产生和/或具有更少的生物活性或没有生物活性时，天然代谢路径在重组宿主细胞中是下调的。
因此，本发明的重组细胞/用于本发明的方法中的细胞可以是以下细胞：
(i)过度表达顺式乌头酸脱羧酶；并且
(iia)过度表达柠檬酸循环的一部分；或者
(iib)到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的活性减小；或者
(iic)过度表达柠檬酸循环的一部分并且到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的活性减小。
在本发明的上下文中，“过度表达”指给定的核酸序列和/或氨基酸序列在本发明的重组细胞中的表达程度比在非重组形式的细胞中更大，所述非重组形式的细胞通常可以是相应的野生型细胞(即，相同物种的野生型细胞)。核酸和/或多肽可在以下意义上过度表达：参考细胞中表达的核酸和/或多肽在本发明的重组细胞中的表达程度更大(参考细胞可完全不表达所述核酸和/或多肽)。过度表达可例如通过过度表达对参考细胞内源性(或同源性)的核酸和/或多肽来发生。过度表达可例如通过过度表达对参考细胞外源性(或异源性)的核酸和/或多肽来发生。即，过度表达可例如通过过度表达参考细胞中天然存在的核酸和/或多肽来发生。过度表达可例如通过过度表达参考细胞中不存在或完全不表达的核酸和/或多肽来发生。
本发明的重组细胞/用于本发明的方法中的重组细胞可过度表达至少一种外源性核酸和/或多肽，以及过度表达至少一种内源性核酸和/或多肽。
为了增加引入的酶以活性形式表达在本发明的真核细胞中的可能性，相应的编码核苷酸序列可被改造以根据所选真核宿主细胞的密码子使用将其密码子使用优化。用于密码子优化的若干种方法是本领域已知的。将核苷酸序列的密码子使用根据真核细胞的密码子使用优化的一种优选方法是如WO2008/000632中所公开的密码子对优化技术。密码子对优化是一种用于在宿主细胞中产生多肽的方法，其中编码所述多肽的核苷酸序列已相对于其密码子使用、特别是所使用的密码子对进行修饰，以获得改进的编码多肽的核苷酸序列的表达和/或改进的多肽产生。密码子对被定义为编码序列中一组两个连续的三联体(密码子)。
在本发明的重组细胞/用于本发明的方法中的重组细胞中，顺式乌头酸脱羧酶通常过度表达。顺式乌头酸脱羧酶(EC 4.1.1.6)是催化以下化学反应的任何酶：
顺式乌头酸盐/酯衣康酸盐/酯+CO2
适合的顺式乌头酸脱羧酶可以是能够从土曲霉获得(即可来源于土曲霉的或可见于土曲霉中)的顺式乌头酸脱羧酶(Dwiarti等，J.Bioscience and Bioengineering，94(1)：29-33，2002和WO 2009/014437)。
在本发明的重组细胞/用于本发明的方法中的重组细胞中，柠檬酸循环的一部分的过度表达可以是柠檬酸合酶的过度表达和/或乌头酸酶的过度表达。
适合的柠檬酸合酶(E.C.2.3.3.1[先前的4.1.3.7])可以是催化来自乙酰辅酶A的两个碳乙酸盐/酯残基与一分子的四碳草酰乙酸盐/酯的缩合反应以形成六碳柠檬酸盐/酯的任何酶：
乙酰-CoA+草酰乙酸盐/酯+H2O→柠檬酸盐/酯+CoA-SH
适合的柠檬酸合酶可以是由来自谷氨酸棒状杆菌的gltA基因编码的柠檬酸合酶(例如，GenBank NP_600058.1)。
乌头酸酶(乌头酸水合酶；EC 4.2.1.3)是三羧酸循环中催化经由顺式乌头酸盐/酯的柠檬酸盐/酯到异柠檬酸盐/酯的立体特异性异构化的酶，其为非氧化还原活性过程。
适合的乌头酸酶可以是由来自谷氨酸棒状杆菌的acnA基因编码的乌头酸酶(例如，GenBank NP_600755.1)。
本发明的重组细胞/用于本发明的方法中的重组细胞可具有减小的到乙酸和/或乳酸天然代谢路径的活性。“减小的活性”指重组细胞被修饰，以使得与非重组形式的细胞相比重组细胞中产生更少的乙酸盐/酯和/或乳酸盐/酯。
此类减小的活性可通过减小参与到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的一种或多种酶的活性来实现。“减小的活性”在此含义上指重组细胞已被修饰，优选在其基因组中被修饰，以导致参与到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的一种或多种酶的产生出现缺陷。此重组细胞可被修饰，优选在其基因组中被修饰，以产生以下表型性状，其中所述细胞：与未修饰形式的重组细胞相比，a)产生更少的酶或基本上不产生酶，和/或b)产生具有降低的活性或降低的比活性的酶或者不具有活性或不具有比活性的酶以及这些可能性中的一种或多种的组合。
在本发明的重组细胞/用于本发明的方法中的重组细胞中，到乙酸的天然代谢路径的活性减小可以是磷酸乙酰转移酶的活性减小的结果，例如这是根据重组细胞的种类通过缺失、破坏或失活编码该酶的基因诸如pta基因或该基因的同源物(homolog)/直系同源物(ortholog)来进行的。
在本发明的重组细胞/用于本发明的方法中的重组细胞中，到乳酸的天然代谢路径的活性减小可以是乳酸脱氢酶的活性减小的结果，例如这是根据重组细胞的种类通过缺失、破坏或失活编码该酶的基因诸如ldhA基因或该基因的同源物/直向同源物来进行的。
在本发明的方法中，衣康酸的产生可伴随：乙醇和甲酸盐/酯(或氢气和CO2)产生；或者琥珀酸盐/酯。
在本发明的方法中，谷氨酸盐/酯产生可得到抑制。谷氨酸盐/酯的“抑制”指采取步骤以使得谷氨酸盐/酯的产生在本发明的方法中发生的程度比所述步骤不存在的情况下更低。此类步骤可以是对重组细胞的修饰或者可以是在所述方法自身中采取特定步骤来抑制谷氨酸盐/酯产生。例如，谷氨酸盐/酯产生的抑制可通过在无氮条件下进行发酵来进行。
本发明的重组细胞/用于本发明的方法中的重组细胞可以是原核细胞、古细菌细胞或真核宿主细胞。
本发明的重组细胞/用于本发明的方法中的重组细胞可以是原核细胞。优选地，所述原核细胞为细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰阴性和革兰阳性微生物。适合的细菌可选自例如埃希氏杆菌属(Escherichia)、鱼腥藻属(Anabaena)、柄杆菌属(Caulobactert)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、红杆菌属(Rhodobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、副球菌属(Paracoccus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)(中华根瘤菌属(Sinorhizobium))、黄杆菌属(Flavobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)或链霉菌属(Streptomyces)。优选地，细菌细胞选自：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、B.puntis、巨大芽胞杆菌(B.megaterium)、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽胞杆菌(B.pumilus)、氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)、新月柄杆菌(Caulobactert crescentus)CB 15、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、Pseudomonas zeaxanthinifaciens、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummelioti)以及放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)。
本发明的重组细胞/用于本发明的方法中的重组细胞可以是真核细胞。优选地，所述真核细胞为真菌或藻类细胞。
适合的真菌细胞可以是酵母细胞或丝状真菌细胞。
适合的酵母细胞包括诸如假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)菌株的那些，更优选地为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或丝状真菌细胞。
适合的丝状真菌细胞包括真菌亚门和卵菌亚门的所有丝状形式(如通过Hawksworth等，在Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK所定义的)。丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长进行的。丝状真菌菌株包括但不限于，枝顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、金孢属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰刀菌属(Fusarium)、Geosmithia、腐质霉属(Humicola)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、平革菌属(Panerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、Rasamsonia、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热真菌属(Thermomyces)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)以及木霉属(Trichoderma)。例如，物种黑曲霉(Aspergillus niger)、亚拉巴马枝顶孢(Acremonium alabamense)、顶头孢霉(Acremoniumchrysogenum)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、嗜热栖热菌(Thermoascus thermophilus)、嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)、Thermoascus crustaceus、Rasamsonia emersonii、Rasamsonia byssochlamyoides、Rasamsonia argillacea、Rasamsonia brevistipitata、Rasamsonia cylindrospora、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Chrysosporiumlucknowense、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)或产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)。最优选的物种是黑曲霉或产黄青霉菌。
丝状真菌的几种菌株是易于在许多培养物保藏中心公开获得的，诸如美国模式培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、荷兰真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及农业研究机构保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)北方地区研究中心(Northern Regional Research Center，NRRL)。黑曲霉CBS 513.88、米曲霉ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、小环藻(P.chrysogenum)CBS 455.95、桔青霉(Penicillium citrinum)ATCC 38065、产黄青霉P2、埃默森篮状菌CBS 124.902、顶头孢霉ATCC 36225或ATCC 48272、里氏木霉ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC 26921、酱油曲霉ATCC11906、鲁克文金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)C1、Garg 27K、VKM-F 3500D、ATCC44006及其衍生菌。
本发明用于制备衣康酸的或用于制备包含衣康酸的发酵液的方法包括在厌氧条件下在适合的发酵培养基存在下如本文所述发酵重组细胞，例如重组原核细胞或重组真核细胞。适合的发酵培养基为本领域技术人员已知的。重组细胞的发酵可在导致衣康酸产生的条件下执行。本发明的方法可在氧气存在或不存在条件下进行。通常，所述方法在厌氧条件下进行。
出于本发明的目的，厌氧发酵过程在本文中可被定义为在氧气不存在条件下运行的或者其中基本上不消耗氧气，优选为小于5、2.5或1mmol/L/h的发酵过程，并且其中有机分子充当电子供体和电子受体二者。根据本发明的发酵过程也可首先在需氧条件下运行并且随后在厌氧条件下运行。厌氧条件通常用于产生阶段(衣康酸产生)。
本发明的发酵过程也可以在限氧或微量需氧的条件下运行，出于本发明的目的，所述过程被认为是厌氧过程。或者，发酵过程可首先在需氧条件下运行并且随后在限氧的条件下运行。限氧的发酵过程是其中氧消耗通过从气体到液体的氧传递而受到限制的过程。限氧程度由进入气流的量和成分以及所使用的发酵设备的实际混合/质量传递特性来决定。
用于产生根据本发明的衣康酸的过程可以在1与9之间的任何适合的pH下进行。优选地，发酵液中的pH是2与7之间。有利的是能够在低pH下，例如在等于或低于衣康酸的pKa(通常为最低pKa)的pH下进行根据本发明的过程，因为这可有助于防止细菌污染。另外，由于在衣康酸产生过程中pH下降，所以需要较低量的滴定剂来将pH保持在期望水平。
根据本发明的过程可进行的适合温度是5℃与60℃之间，优选为10℃与50℃之间，更优选为15℃与35℃之间，更优选为18℃与30℃之间。本领域技术人员已知哪个最佳温度适用于发酵特定酵母细胞。
在本发明用于产生衣康酸的方法中，酸可以分泌到发酵液中和/或存在于本发明所用的重组细胞中。因此，本发明还提供了一种通过根据本发明的方法能够获得的包含衣康酸的发酵液。发酵液可包含：已由重组细胞分泌的衣康酸：本发明的重组细胞内包含的衣康酸；在处理细胞以引起细胞破坏和衣康酸释放之后已从重组细胞中释放的衣康酸；或者其任何混合物。
优选地，在本发明的方法中，衣康酸通过本领域中已知的适合方法，例如通过提取或结晶，从发酵液中回收。本发明的重组细胞可需要破坏以允许释放衣康酸。
优选地，在根据本发明的方法中制备的衣康酸或衣康酸酯被进一步转化为期望产品，诸如药物、化妆品、食品、饲料或化学产品。特别地，衣康酸可被进一步转化为聚合物。
因此，本发明提供了一种用于生产药物、化妆品、食品、饲料或化学产品的方法，所述方法包括：(a)通过根据本发明的方法制备衣康酸；和(b)使用所述衣康酸制备药物、化妆品、食品、饲料或化学产品。
标准遗传技术诸如酶在宿主细胞中的过度表达、宿主细胞的遗传修饰或者杂交技术为本领域中已知的方法，诸如描述于Sambrook和Russel(2001)″Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，或者F.Ausubel等编辑，″Current protocols in molecularbiology″，Green Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)中的方法。用于对真菌宿主细胞进行转化、遗传修饰等的方法从例如EP-A-0 635 574、WO 98/46772、WO99/60102和WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635 574以及US 6,265,186中已知。因此，适用于本发明中的重组细胞的制备为本领域技术人员已熟知的。
本发明的一些实施方式：
1.一种用于产生衣康酸的方法，所述方法包括在适合的发酵培养基中发酵能够产生衣康酸的重组细胞，从而产生衣康酸，其中：
(a)重组细胞：(i)过度表达顺式乌头酸脱羧酶；以及(ii)过度表达柠檬酸循环的一部分和/或具有减小的到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的活性；以及任选地
(b)发酵在厌氧条件下进行。
2.根据实施方式1所述的方法，其中顺式乌头酸脱羧酶是能够从土曲霉中获得的，诸如可来源于土曲霉或见于土曲霉或从土曲霉中分离的顺式乌头酸脱羧酶。
3.根据实施方式1或2所述的方法，其中柠檬酸循环的一部分的过度表达为柠檬酸合酶的过度表达和/或乌头酸酶的过度表达。
4.根据实施方式1至3中任一项所述的方法，其中减小的到乙酸天然代谢路径的活性是减小的磷酸乙酰转移酶的活性。
5.根据实施方式1至4中任一项所述的方法，其中减小的到乳酸的天然代谢路径的活性是减小的乳酸脱氢酶的活性。
6.根据实施方式1至5中任一项所述的方法，其中衣康酸的产生伴随乙醇和甲酸盐/酯(或氢气和CO2)的产生。
7.根据实施方式1至6中任一项所述的方法，其中谷氨酸盐/酯的产生受到抑制，优选地其中谷氨酸盐/酯产生的抑制通过采取步骤以使得所述方法中发生的谷氨酸盐/酯产生程度比所述步骤不存在的情况下的产生程度更低来实现，更优选地其中谷氨酸盐/酯产生的抑制通过在无氮条件下进行发酵来进行。
8.根据实施方式1至7中任一项所述的方法，其中所述重组细胞为原核细胞或真核细胞。
9.根据实施方式8所述的方法，其中所述细胞为细菌细胞，诸如大肠杆菌，或者酵母细胞，诸如酿酒酵母。
10.根据前述实施方式中任一项所述的方法，其包括回收所述衣康酸。
11.能够通过根据实施方式1至10中任一项所述的方法获得的包含衣康酸的发酵液。
12.一种用于生产药物、化妆品、食品、饲料或化学产品的方法，所述方法包括：(a)通过根据实施方式1至10中任一项所述的方法制备衣康酸；和(b)使用所述衣康酸制备所述药物、化妆品、食品、饲料或化学产品。
13.能够产生衣康酸的重组细胞，其中所述重组细胞：(i)过度表达顺式乌头酸脱羧酶；并且(ii)过度表达柠檬酸循环的一部分和/或具有减小的到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的活性。
14.根据实施方式13所述的重组细胞，其如实施方式1至5、8或9中任一项所定义。
15.一种用于产生衣康酸的方法，所述方法包括在适合的发酵培养基中发酵能够产生衣康酸的重组细胞，从而产生衣康酸，其中所述重组细胞是根据实施方式13或14所述的重组细胞。
16.根据实施方式例15所述的方法，其中所述发酵在厌氧条件下进行，优选地其中在厌氧条件下进行的发酵意指在氧不存在条件下运行的或者其中基本上不消耗氧的发酵过程或者在限氧或微需氧条件下运行的发酵过程。
本文中引用专利文件或作为现有技术给出的其他文献并不认为是承认该文件或文献为已知的或者它所含有的信息是任何权利要求书的优先权日期时的公知常识的一部分。
本文所列出的每份参考文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。
本发明通过以下实施例进一步说明：
实施例
方法
细菌菌株和质粒
此研究中所使用的细菌菌株和质粒列出在表1中。
磷酸乙酰转移酶基因(pta)和乳酸脱氢酶基因(ldhA)的缺失
编码乳酸脱氢酶的基因(ldhA)在大肠杆菌BW25113Δpta中通过使用λ红介导的基因替换方法来失活，所述方法在(Datsenko和Wanner(2000)，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 97(12)：6640-6645)中进行描述。简言之，将大肠杆菌BW25113Δpta用pKD46转化并且在L-阿拉伯醣存在的条件下培养，以诱导λ-红重组酶表达，其为重组的诱导物。靶基因ldhA被侧接翻转酶识别靶标(FRT)位点的卡那霉素抗性基因替换。对于这种情况，通过使用Phusion高保真性DNA聚合酶(Thermo Scientific)和含有靶向基因组中ldhA区域侧翼的50bp的引物(表2)，由pKD4扩增含有具有FRT位点的卡那霉素抗性基因的缺失盒，并且将所述缺失盒转化到大肠杆菌BW25113Δpta(pKD46)中。通过卡那霉素抗性选择和使用侧接靶基因的引物进行的菌落PCR(GoTaq Green聚合酶，Promega)筛选具有适当基因型的转化株。在液体培养中验证表型。随后通过使用编码翻转酶(FLP)的温度敏感性辅助质粒pCP20，接着通过将菌株在42℃下培养16小时来固化温度敏感性质粒，从而消除卡那霉素抗性基因。
λDE3前噬菌体的位点特异性整合
使用λDE3溶原化试剂盒(Novagen)将λDE3前噬菌体位点特异性整合到大肠杆菌BW25113及其衍生菌大肠杆菌BW25113ΔptaΔldhA中。根据试剂盒中的方案验证菌株中λDE3前噬菌体的整合和T7聚合酶的表达。此外，通过用pET101/D/lacZ转化菌株来证实T7聚合酶的功能性表达。转化株在用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导之后能够裂解5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)。
pACYC表达载体的构建
使用表达载体pACYCDuet-1(Novagen)以在T7启动子的转录控制下表达基因cad4(NCBI参考序列ID：BAG49047.1)、acnA(ID：NP_600755.1)和gltA(ID：NP_600058.1)。所有基因均根据OptimumGeneTM(GenScript)的算法进行密码子优化并通过GenScript，USA进行合成。密码子优化的cadA、acnA和gltA的序列可从GenBank中检索(分别为ID：KM464677、ID：KM464678、ID：KM464679。cadA连接在pACYCDuet-1的MCS1中的NcoI-HindIII限制性位点之间，从而产生pKV-C。acnA和gltA分别连接在pKV-C的MCS2中的NdeI-XhoI位点和XhoI-PacI位点之间，从而产生pKV-CGA，表1。另外的核糖体结合位点(rbs)与pACYCDuet-1中的相同，将其引入到gltA基因的上游。通过克隆pACYC-Duet-1中的pKV-CGA的含有acnA和gltA的部分，表达载体pKV-GA来源于pKV-CGA。
培养条件
培养基
对于质粒构建和基因表达分析而言，在Luria-Bertani(LB)琼脂板上或在LB液体培养基中在30℃或37℃下培养大肠杆菌菌株。在用于培养的30℃或用于固化选择标志物的42℃下培养具有温度敏感性质粒的重组体。通过琼脂板中的蓝/白筛选检测lacZ的表达，在琼脂板顶部铺40μl 20mg/ml X-gal的二甲亚砜并且在所述板顶部铺40μl 1M IPTG。需要时，用氨苄西林(50μg/mL)或氯霉素(35μg/mL)补充培养基和板。当培养物在600nm处的光密度(OD600)达到大约0.4时，通过添加1mM IPTG开始诱导液体培养物中的基因表达。
在M9基础培养基(MM)中进行其他培养，所述培养基每1升含有：200mL 5×M9低盐(BD Difco)，其补充有50mmol葡萄糖、2mmol MgSO4、0.1mmol CaCl2、15mg硫胺素以及0.30mg亚硒酸盐。用0.1M3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)缓冲培养基并且将pH用NaOH调节至6.9。
生物反应器中的培养(需氧)
在30℃下在连接至myControl控制器单元(Applikon，荷兰)且具有400ml工作体积的0.5L微型生物反应器中，培养含有pEV、pKV-C或pKV-CGA的大肠杆菌BW25113(DE3)和大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA。通过自动添加2M NaOH，将pH维持在6.9处。将培养物在1200rpm下连续搅拌并且用医用空气以400mL/min的速率进行鼓泡。用5％(v/v)预培养物接种生物反应器，所述预培养物在250rpm和30℃下在具有50mL MM的250mL锥形烧瓶中生长24小时。定期取出2mL样品以测定培养物的OD600和底物与产物的浓度。
生物反应器中的培养(厌氧)
在30℃下在连接至myControl控制器单元(Applikon，荷兰)且具有400ml工作体积的0.5L微型生物反应器中，培养含有pEV、pKV-C或pKV-CGA的大肠杆菌BW25113(DE3)和大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA。通过自动添加2M NaOH，将pH维持在6.9处。将培养物在400rpm下搅拌并用氮气以16mL/min的速率鼓泡17小时，之后将搅拌速率增加至800rpm并且将鼓泡速率增加至35mL/min。用5％(v/v)预培养物接种生物反应器，所述预培养物在30℃下在250rpm下在具有50mLMM的250mL锥形烧瓶中生长24小时。定期取出2mL样品以测定培养物的OD600和底物与产物的浓度。
酶测定
对于酶测定而言，在IPTG存在下培养17小时之后通过离心(5min，7745×g)收获50mL生物反应器培养物并用MM洗涤。根据Y-PER酵母蛋白质提取试剂盒说明书(ThermoScientific)进行无细胞提取(CFE)。通过使用总蛋白试剂盒、Micro Lowry、Peterson’s修订(Sigma Aldrich)测定蛋白质浓度。
通过使用改编自(Dwiarti等(2002)Journal of Bioscience andBioengineering 94(1)：29-33)和(Li等(2011)Fungal genetics and biology 48(6))的方法测量顺式乌头酸脱羧酶(CadA)的活性：在30℃下将CFE用200mM磷酸钠缓冲液(pH 6.2)中的17mM顺式乌头酸酯孵育10分钟。通过添加1M HCl来终止反应。通过HPLC分析用于衣康酸盐/酯形成的上清液。
通过在UV-Vis分光光度计(UV-1650PC SHIMADZU)中使用3.5mM-1cm-1的顺式乌头酸盐/酯消光系数在240nm处监测顺式乌头酸盐/酯的形成来测量乌头酸酶活性(Baumgart和Bott 2011)。在30℃下在100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和20mM作为底物的柠檬酸三钠中进行测定。
通过监测乙酰辅酶A(乙酰-CoA)的硫酯的水解来确定柠檬酸合酶活性，所述水解导致形成CoA。在反应混合物中，CoA的硫醇基团与5，5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸(DTNB)反应，以形成5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)。根据具有微小调整的(Morgunov和Srere 1998)在30℃下通过使用13.6mM-1cm-1作为消光系数在412nm处测量TNB的形成。反应混合物含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)中的0.31mM乙酰-CoA、0.5mM草酰乙酸酯、0.1mM DTNB以及约0.25％Triton X-100。
分析方法
通过经由使用分光光度计(Lange博士XION 500)测量OD600来测定细胞密度。
通过使用HPLC通过使用装备有RI检测器(Shodex，RI-101)和UV检测器(Dionex，3400RS，在210nm处)的Dionex Ultimate 3000(Thermo Fisher)测定葡萄糖和有机酸的浓度。在35℃下在Micro Guard Cation H前置柱(30x4.6mm，Biorad)和Aminex HPX-87H柱(300x7.8mm，Biorad)上使用0.6mL/min的5mM H2SO4作为洗脱剂分离样品。
通过使用具有UltiMate 3000快速分离泵的UPLC Dionex RSLC系统测定谷氨酸盐/酯和丙氨酸的浓度，如Meussen等(2014，Food Analytical Methods，7：1047-1055)所述的。
通过使用BlueSens出口气传感器(气敏传感器，GmbH)测定CO2和H2在生物反应器的出口气中的浓度。
在铵不存在条件下的衣康酸盐/酯的产生
为了监测在铵不存在条件下的衣康酸盐/酯的产生，在IPTG存在的条件下培养32小时之后通过离心(5min，7745×g)收获50mL生物反应器培养物。洗涤培养物并将其重悬于40mL无氮磷酸盐缓冲液(NF-PB)中，所述缓冲液由50mM磷酸钠(pH 7.0)以及100mM MOPS和60mM葡萄糖组成。洗涤对照样品并将其重悬于具有50mM葡萄糖的40mL MM中。将培养物转移到厌氧血清瓶中并在150rpm和30℃下培养24小时。定期取出2mL样品以测定培养物的OD600和底物与产物的浓度。
实施例1.cadA、acnA和gltA的异源表达
将来自土曲霉的基因cadA密码子优化并在大肠杆菌中表达，以能够产生衣康酸盐/酯。当在37℃下在摇瓶培养中在LB中培养大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-C)时产生少量的衣康酸盐/酯(低于10mg/L)，但是在这些培养物的CFE中未发现可检测的CadA活性。SDS-PAGE分析显示几乎所有CadA均以内含体的形式存在(数据未示出)。由于内含体往往与异源蛋白的快速且高水平的表达相关联(Jurgen等，2010Microbial Cell Factories 9(1))，进行两种方式以减小这些比率：在MM中而非LB中的培养和在较低温度下的培养。当大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-C)在MM中在pH受控的生物反应器中在37℃下生长时，可在CFE中检测CadA，其具有0.03U/mg的比活性。当培养温度降低至30℃时所述活性进一步增加至0.38U/mg(图1)。SDS-PAGE分析显示通过这些方式可溶性蛋白质的量已增加(数据未示出)。
为了引导更多乙酰-CoA至衣康酸盐/酯，在大肠杆菌中过度表达编码来自谷氨酸棒状杆菌的柠檬酸合酶(gltA)和乌头酸酶(acnA)的密码子优化基因以及cadA，从而产生大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-CGA)。通过测量在含有pEV、pKV-C或pKV-CGA的大肠杆菌BW25113(DE3)菌株的CFE中相应酶的活性来测定异源基因的表达水平。与大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-C)中测量的天然活性相比，在大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-CGA)的CFE中的柠檬酸合酶和乌头酸酶的活性分别增加了4倍和40倍(图2)。看来cadA的表达增加了大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-C)中的天然柠檬酸合酶和乌头酸酶活性，因为这些酶的活性在大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-EV)中较低，这可以是由于衣康酸盐/酯的活化作用。与大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-C)相比，gltA和acnA连同cadA的同时表达导致CadA比活性降低，这可能是由于两种另外的基因过度表达引起的稀释作用。
实施例2.大肠杆菌BW25113(DE3)中的衣康酸盐/酯产生
在pH-受控生物反应器中在MM中在30℃下72小时监控由含有pEV、pKV-C或pKV-CGA的大肠杆菌BW25113(DE3)进行的衣康酸盐/酯产生。在使用大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-C)和BW25113(DE3)(pKV-CGA)的情况下衣康酸盐/酯产生高达1.9mM，而在对照菌株中则不是(图3)。gltA和acnA连同cadA的过度表达在这些条件下对衣康酸盐/酯的产生不具有显著影响，因为产生谱与pKV-C和pKV-CGA质粒类似。这表明前体的可得性限制了衣康酸盐/酯的产生。
在葡萄糖上生长期间，在培养1天之后在所有培养物中均观察到乙酸盐/酯，其累积至55mM。当葡萄糖从培养基中消耗时，细胞开始消耗乙酸盐/酯。另外，在所有菌株培养期间在培养基中检测到低浓度(低于5mM)的乙醇、柠檬酸盐/酯、丙酮酸盐/酯、乳酸盐/酯、琥珀酸盐/酯以及甲酸盐/酯，并且通过大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-C)和BW25113(DE3)(pKV-CGA)形成一些顺式乌头酸盐/酯(＜5mM)(数据未示出)。大部分这些化合物仅是中间产物并且随着时间消失。
实施例3.大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA中的衣康酸盐/酯产生
为了增加前体的可用性，使大肠杆菌BW25113(DE3)出现乙酸和乳酸产生缺陷。已知编码磷酸乙酰转移酶的pta的缺失导致丙酮酸盐/酯在细胞内累积，所述丙酮酸盐/酯可重新定向到衣康酸盐/酯。由于已报道Δpta菌株将丙酮酸盐/酯转化成乳酸盐/酯(Castano-Cerezo等，2009Microbial Cell Factories 8doi：54 10.1186/1475-2859-8-54)，这种转化也通过缺失ldhA来消除。为了测试这些消除的作用，在pH受控的生物反应器中在MM中在30℃下培养含有pEV、pKV-C或pKV-CGA的所得菌株大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA。
大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA(pKV-CGA)产生为其野生型等效物三倍的衣康酸盐/酯。gltA和acnA的过度表达为改进衣康酸盐/酯产生所必需的，因为产生在大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA(pKV-C)中并未增强(图4)。在所有大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA培养中，丙酮酸盐/酯累积至30mM，随后其被消耗。在双敲除菌株中仍产生乙酸盐/酯，但具有显著延迟。也观察到柠檬酸盐/酯和/或顺式乌头酸盐/酯，但是处于痕量水平下而与菌株和生长条件无明显的相关性(结果未示出)。
结果显示pta和ldhA的同时消除以及gltA和acnA的异源表达增加了通过CadA的通量，从而获得高达690mg/L的更高衣康酸盐/酯滴度，这对应于由0.09mol/mol葡萄糖获得的衣康酸盐/酯产率。
实施例4：Δpta-ΔldhA对在厌氧条件下的生长的作用
在厌氧条件下在MM上在pH受控生物反应器中使用葡萄糖作为碳源来生长大肠杆菌BW25113(DE3)(pEV)和大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA(pEV)。大肠杆菌BW25113(DE3)(pEV)的主要发酵产物是乳酸盐/酯、乙醇、甲酸盐/酯和乙酸盐/酯(图5)，它们占添加到培养物中的碳的74％(表3)。由于在大肠杆菌BW25113(DE3)(pEV)中形成大量甲酸盐/酯(16％Cmol)，仅产生少量的CO2(3mM/L，＜1％Cmol)和H2(12mM/L)。乙酸盐/酯的形成与乙醇和琥珀酸盐/酯的共同产生形成氧化还原平衡。
其中编码磷酸乙酰转移酶的pta和编码乳酸脱氢酶的ldhA被消除的大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA(pEV)仍产生与大肠杆菌BW25113(DE3)(pEV)相当量的乙酸盐/酯，但不再形成乳酸盐/酯(图6；表3)。大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA(pEV)不产生甲酸盐/酯。相反，CO2(30mM/L，14％Cmol)和H2(＞100mM/L)的产生为使用大肠杆菌BW25113(DE3)(pEV)观察到的产生的多于10倍。而且培养物中累积的丙酮酸盐/酯和琥珀酸盐/酯和乙醇的量也加倍。另外，检测到一些柠檬酸盐/酯。
实施例5：在厌氧条件下的衣康酸盐/酯产生
在MM上在pH受控生物反应器中在厌氧条件下生长含有pKV-C或pKV-CGA的大肠杆菌BW25113(DE3)和大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA。pKV-C和pKV-CGA二者均表达密码子优化的cadA，其编码来自土曲霉的顺式乌头酸脱羧酶，所述酶先前已显示能够在大肠杆菌中产生衣康酸盐/酯。pKV-CGA也表达来自谷氨酸棒状杆菌的柠檬酸合酶(gltA)和乌头酸酶(acnA)。这些基因在需氧条件下增强了衣康酸盐/酯在大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA中的产生(参见实施例1至4)。
cadA的表达未导致大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-C)中的衣康酸盐/酯产生(图5)，但是大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA(pKV-C)产生了0.08mM衣康酸盐/酯(图6)。大肠杆菌BW25113(DE3)(pKV-CGA)形成类似量的衣康酸盐/酯(图5)。大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA(pKV-CGA)产生了为八倍的衣康酸盐/酯(图6)，这显示gltA和acnA的表达以及pta和ldhA的消除刺激了在厌氧条件下在大肠杆菌中的衣康酸盐/酯产生。
由携带pKV-C或pKV-CGA的菌株形成的发酵产物类似于由携带pEV的菌株形成的产物。然而，对于菌株大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA(pKV-CGA)的碳回收最初远低于(84％)对于其他菌株的碳回收，这表明形成未鉴定的产物。培养物上清液的氨基酸分析显示这种菌株累积大量的谷氨酸盐/酯和丙氨酸。所有其他菌株也产生丙氨酸，但是仅在菌株大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA(pKV-CGA)中产生大量的谷氨酸盐/酯。这表明gltA和acnA的表达增加了通过柠檬酸循环的通量，从而导致更多衣康酸盐/酯和谷氨酸盐/酯的累积(图6)。当考虑到谷氨酸盐/酯和丙氨酸产生时，所有菌株的碳平衡均得以满足(90％-110％)(表3)。
实施例6：在厌氧条件下的谷氨酸盐/酯产生
为了进一步研究在厌氧条件下的谷氨酸盐/酯产生，在大肠杆菌BW25113(DE3)和大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA中表达gltA和acnA而不表达cadA。后一种菌株产生为前一种菌株八倍的谷氨酸盐/酯，从而导致产生8.6mM的谷氨酸盐/酯。这占添加到培养物中的碳的19.5％。
实施例7：在无氮条件下的衣康酸盐/酯产生
防止谷氨酸盐/酯形成的选项是限制铵的可用性，因为它是谷氨酸盐/酯合成所需要的。出于此原因，在MM上在生物反应器中将含有pKV-C、pKV-CGA或pKV-GA的大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA预培养48小时。洗涤培养物并在厌氧血清瓶中在含有60mM葡萄糖的无氮磷酸盐缓冲液(NF-PB)中孵育所述培养物。实时监控葡萄糖的消耗和发酵产物的形成。在所有菌株中完全不存在谷氨酸盐/酯产物，这导致衣康酸盐/酯产生在大肠杆菌BW25113(DE3)Δpta-ΔldhA pKV-CGA中增加至5.4mM(图7)。这对应于来自葡萄糖的10.8％Cmol的衣康酸盐/酯产率，这类似于需氧获得的产率(9％Cmol-参见实施例1至4)。在所有菌株中乙醇和丙酮酸盐/酯一起占产物的70％-80％Cmol，并且在pKV-C菌株中丙酮酸盐/酯累积最高。另外，所有菌株在这些条件下均产生5％-10％Cmol的琥珀酸盐/酯和低浓度的甲酸盐/酯、乳酸盐/酯、柠檬酸盐/酯和乙酸盐/酯。
序列表
<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司
<120> 用于在厌氧条件下生产衣康酸的方法
<130> 31104-WO-PCT
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ldhA侧翼F引物
<400> 1
aaatattttt agtagcttaa atgtgattca acatcactgg agaaagtctt gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ldhA侧翼R引物
<400> 2
attggggatt atctgaatca gctcccctgg aatgcagggg agcggcaaga atgggaatta 60
gccatggtcc 70
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ldhA检查F引物
<400> 3
aaatattttt agtagcttaa atgtg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ldhA检查R引物
<400> 4
attggggatt atctgaatca gctcc 25

Claims (12)

1.一种用于产生衣康酸的方法，所述方法包括在适合的发酵培养基中发酵能够产生衣康酸的重组细胞，从而产生衣康酸，其中：
(a)所述重组细胞：(i)过度表达顺式乌头酸脱羧酶；并且(ii)过度表达柠檬酸循环的一部分和/或到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的活性减小，其中所述柠檬酸循环的一部分的过度表达是柠檬酸合酶的过度表达和/或乌头酸酶的过度表达，并且其中到乙酸的天然代谢路径的活性减小是磷酸乙酰转移酶的活性减小，和/或其中到乳酸的天然代谢路径的活性减小是乳酸脱氢酶的活性减小；以及任选地，
(b)所述发酵在厌氧条件下进行，其中在厌氧条件下进行发酵意指在不存在氧的条件下运行的或者其中基本上不消耗氧的发酵过程或者在限氧或微需氧条件下运行的发酵过程；以及任选地
(c)其中谷氨酸盐/酯的产生被抑制，优选地其中谷氨酸盐/酯产生的抑制通过在无氮条件下进行所述发酵来进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述顺式乌头酸脱羧酶是可来源于或见于土曲霉(Aspergillus terreus)的顺式乌头酸脱羧酶。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中衣康酸的产生伴随着乙醇和甲酸盐/酯的产生或者H2和CO2的产生。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中谷氨酸盐/酯的产生被抑制。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组细胞为原核细胞或真核细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞为细菌细胞，优选为大肠杆菌(E.coli)，或者酵母细胞，优选为酿酒酵母(S.cerevisiae)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括回收所述衣康酸。
8.一种用于生产药物、化妆品、食品、饲料或化学产品的方法，所述方法包括：(a)通过根据权利要求1至7中任一项所述的方法制备衣康酸；(b)使用所述衣康酸制备所述药物、化妆品、食品、饲料或化学产品。
9.能够产生衣康酸的重组细胞，其中所述重组细胞：(i)过度表达顺式乌头酸脱羧酶；并且(ii)过度表达柠檬酸循环的一部分和/或到乙酸和/或乳酸的天然代谢路径的活性减小。
10.根据权利要求9所述的重组细胞，其为权利要求1或2、5或6中任一项所定义的。
11.一种用于产生衣康酸的方法，所述方法包括在适合的发酵培养基中发酵能够产生衣康酸的重组细胞，从而产生衣康酸，其中所述重组细胞是根据权利要求9或10所述的重组细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述发酵在厌氧条件下进行。
CN201680010220.XA 2015-02-16 2016-02-16 用于在厌氧条件下生产衣康酸的方法 Pending CN107429273A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562116657P 2015-02-16 2015-02-16
US62/116,657 2015-02-16
EP15164702 2015-04-22
EP15164702.1 2015-04-22
PCT/EP2016/053249 WO2016131818A1 (en) 2015-02-16 2016-02-16 Process for producing itaconic acid under anaerobic conditions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107429273A true CN107429273A (zh) 2017-12-01

Family

ID=52997948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680010220.XA Pending CN107429273A (zh) 2015-02-16 2016-02-16 用于在厌氧条件下生产衣康酸的方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10443077B2 (zh)
EP (1) EP3259361A1 (zh)
CN (1) CN107429273A (zh)
WO (1) WO2016131818A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108384815A (zh) * 2018-05-22 2018-08-10 中国林业科学研究院林产化学工业研究所 一种利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法
CN114657075A (zh) * 2022-02-10 2022-06-24 天津科技大学 一种生产衣康酸的黑曲霉菌株、方法及应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3447043A1 (en) * 2017-08-24 2019-02-27 Vito NV Method of recovering organic acids from aqueous solutions

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014178717A1 (en) * 2013-05-02 2014-11-06 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Novel organic acid pathway

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990014423A1 (en) 1989-05-18 1990-11-29 The Infergene Company Microorganism transformation
DE69033633T2 (de) 1989-07-07 2001-05-03 Unilever Nv Verfahren zur Herstellung eines Proteins mittels eines durch Mehrfachkopie-Integrierung eines Expressionsvektors tranformierten Pilzes
ATE238425T1 (de) 1993-07-23 2003-05-15 Dsm Nv Selektionmarker-genfreie rekombinante stämme: verfahren zur ihrer herstellung und die verwendung dieser stämme
US6265186B1 (en) 1997-04-11 2001-07-24 Dsm N.V. Yeast cells comprising at least two copies of a desired gene integrated into the chromosomal genome at more than one non-ribosomal RNA encoding domain, particularly with Kluyveromyces
WO1998046772A2 (en) 1997-04-11 1998-10-22 Dsm N.V. Gene conversion as a tool for the construction of recombinant industrial filamentous fungi
MXPA00011223A (es) 1998-05-19 2002-04-17 Dsm Nv Produccion mejorada in vivo de cefalosporinas.
WO2000037671A2 (en) 1998-12-22 2000-06-29 Dsm N.V. Improved in vivo production of cephalosporins
ES2534282T3 (es) 2006-06-29 2015-04-21 Dsm Ip Assets B.V. Un método para lograr la expresión polipeptídica mejorada
EP2017344A1 (en) 2007-07-20 2009-01-21 Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk onderzoek TNO Production of itaconic acid
US8143036B2 (en) 2009-05-11 2012-03-27 Industrial Technology Research Institute Genetically modified microorganisms for producing itaconic acid with high yields
US8192965B2 (en) 2009-08-25 2012-06-05 Industrial Technology Research Institute Producing Itaconic acid in yeast using glycerol as the substrate

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014178717A1 (en) * 2013-05-02 2014-11-06 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Novel organic acid pathway

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIIRA S. VUORISTO 等: "Metabolic engineering of itaconate production in Escherichia coli", 《BIOTECHNOLOGY》 *
WILLIAM E.LEVINSON 等: "Production of itaconic acid by Pseudozyma antarctica NRRL Y-7808 under nitrogen-limited growth conditions", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 *
徐建春 等: "衣康酸发酵过程工艺研究", 《发酵科技通讯》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108384815A (zh) * 2018-05-22 2018-08-10 中国林业科学研究院林产化学工业研究所 一种利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法
CN108384815B (zh) * 2018-05-22 2022-03-04 中国林业科学研究院林产化学工业研究所 一种利用木质纤维素原料制备衣康酸的方法
CN114657075A (zh) * 2022-02-10 2022-06-24 天津科技大学 一种生产衣康酸的黑曲霉菌株、方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
US10443077B2 (en) 2019-10-15
WO2016131818A1 (en) 2016-08-25
US20180016604A1 (en) 2018-01-18
EP3259361A1 (en) 2017-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20080069678A (ko) 재조합 효모에서 말산 생산
CN103981157A (zh) 黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶
CN101389752A (zh) 能够产生有机酸的细菌以及产生有机酸的方法
RU2636467C2 (ru) Микроорганизм, имеющий повышенную продуктивность в отношении молочной кислоты, и способ получения молочной кислоты с использованием данного микроорганизма
CN110494560A (zh) 通过发酵产生酪胺的经改造的生物合成途径
CN105255849B (zh) 一种酶活提高的谷氨酸脱羧酶突变体构建及其应用
CN107429273A (zh) 用于在厌氧条件下生产衣康酸的方法
Fiedurek et al. Screening and mutagenesis of molds for improvement of the simultaneous production of catalase and glucose oxidase
Basar et al. Enhanced production of thermophilic xylanase by recombinant Escherichia coli DH5α through optimization of medium and dissolved oxygen level.
Demirci et al. Fermentation and enzyme technologies in food processing
KR20210145206A (ko) 온실가스 개선된 발효
CN107429282A (zh) 谷胱甘肽的制造方法
JP5245060B2 (ja) 改善された発現特性を示す改変型ペルオキシダーゼ酵素遺伝子、及びそれを使用したペルオキシダーゼの生産方法
CN110079516A (zh) 改良型腈水合酶
Lau et al. Production and optimization of alkalostable lipase by alkalophilic Burkholderia cenocepacia ST8
JP5277482B2 (ja) フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法
Sugimoto et al. Importance of malate synthase in the glyoxylate cycle of Ashbya gossypii for the efficient production of riboflavin
JP6392534B2 (ja) ロイシン酸生産活性を有するタンパク質及びその利用
JP4618033B2 (ja) γ−アミノ酪酸豊富な食品の製造法及びγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタスＫＭ１４株
Ghezelbash et al. Study of polyols production by Yarrowia lipolytica in batch culture and optimization of growth condition for maximum production
KR100773075B1 (ko) 클루이베로마이세스 푸레질리스 변이주 및 이로부터 생산된락타아제
Padma et al. Isolation, screening, and selection of an L-glutaminase producer from soil and media optimization using a statistical approach
Chaikaew et al. Enhanced production of histamine dehydrogenase by Natrinema gari BCC 24369 in a non-sterile condition
KR101686899B1 (ko) 신규한 클루이베로마이세스 막시아누스 mj1 및 이의 용도
JP6656919B2 (ja) ５−オキソプロリナーゼ、５−オキソプロリナーゼ遺伝子、および５−オキソプロリナーゼの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20171201

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication