CN114657075A - 一种生产衣康酸的黑曲霉菌株、方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产衣康酸的黑曲霉(Aspergillusniger)菌株，所述菌株是在出发黑曲霉中同时或单独强化表达顺乌头酸脱羧酶基因cadA、线粒体三羧酸转运蛋白编码基因mttA和一个主要促进者超家族转运蛋白编码基因mfsA获得的。本发明以黑曲霉为底盘细胞，通过增强衣康酸前体供给，强化合成途径，阻断副产物合成途径等多个维度提高黑曲霉合成衣康酸水平。

Description

一种生产衣康酸的黑曲霉菌株、方法及应用
技术领域
本发明属于微生物育种技术领域，尤其是一种生产衣康酸的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)、方法及应用。
背景技术
衣康酸分子中有一个不饱和双键和两个活泼的羧基，其在轻工业、医疗产业、农业、食品等领域均具有十分广泛的应用。衣康酸已被美国能源部评为生物质附加值最高的12种产品之一，是目前具有发展前景较好的有机酸之一。在医疗方面，衣康酸及其衍生物可作为药物主要成分，与甲苯胺发生酯化反应，对中老年人常见的疾病进行预防和治疗；在美容行业，衣康酸参与高级化妆品的制备，主要是因为其可以与月桂酸-氨乙基乙醇胺的缩合物进行反应形成味唑啉衍生物。在农业方面，衣康酸作为农药中间体也可制成除草剂；在轻工业方面，主要是衣康酸可以制成润滑剂并作为羧基化剂形成丁苯乳胶，用于纸张涂布。因此，在国内外市场上对衣康酸的需求量与日俱增。
目前，衣康酸的合成方法有两种，分别是化学合成法和微生物发酵法。化学合成法包括柠檬酸合成法和石油化工产品合成法。柠檬酸合成法是以柠檬酸为原料在高温减压条件下，经磷酸盐催化形成衣康酸和柠康酸，然后进行异构化合成衣康酸(Mattey.etal.Critical Reviews in Biotechnology.1992,12(1-2):87-132；Willke T.etal.Applied Microbiology&Biotechnology.2001,56(3-4):289-295)。乌头酸、异柠檬酸和其酸酐经过热解可以替代柠檬酸形成衣康酸(A Kuenz A.et al.Applied Microbiology&Biotechnology.2018,102(9):3901-3914)。石油化工产品合成法是以石油化工产品为原料，包括丁二酸酐、丁二酸二甲酯、顺丁烯二酸酐等原料分别在硫酸钍、Al2O5-SiO2、烯土/分子筛等催化剂作用下，经过高温反应形成衣康酸。化学合成法要求较高的温度、多相的催化剂和复杂的纯化分离过程加大了衣康酸合成难度，是无法与微生物发酵法抗衡的(KlementT.et al.Bioresource Technology.2013,135:422-431)。目前，微生物发酵法是工业生产上最常用的合成方法，其发酵工艺简单，生产成本低。利用土曲霉(Aspergillus terreus)菌株发酵合成衣康酸，是研究历史最长且工业生产最广泛的菌株，虽然衣康酸产量能够达到160g/L，但是由于该菌株对培养基中的杂质比较敏感，以及对氧气供应要求比较严格，这就加大了工业生产的成本(Krull S.et al.Applied Microbiology&Biotechnology.2017,101(10):1-10；Karaffa L.et al.Applied Microbiology and Biotechnology.2019,103(7):2889-2902.)。目前，玉米黑粉菌(Ustilago maydis)菌株发酵480h衣康酸的滴度为220g/L，不仅发酵强度低，而且发酵液中还存在相当水平苹果酸和碳酸钙等其它物质，大大增加了下游分离纯化的难度和成本(Tehrani H H.et al.Biotechnology forBiofuels.2019,12(1).)。此外，玉米黑粉菌菌株对pH要求比较严格：当pH大于5时，有利于衣康酸合成；当pH低于5时，有机酸将被转化成其它物质，例如糖脂和多元醇等，这就使得发酵过程控制难度加大(GeiserE.et al.Fungal Biology&Biotechnology.2014,1(1):1-10.)。
黑曲霉作为一种GRAS菌株，生产所需营养成分要求简单，具有较强耐酸性，在pH低于2的条件下仍可正常生长。黑曲霉可以利用多种廉价的碳源，具有很高的碳源转化效率，这些特点使其发展成为出色的有机酸发酵细胞工厂。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种生产衣康酸的黑曲霉菌株、方法及应用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种生产衣康酸的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，所述菌株是在出发黑曲霉中同时或单独强化表达顺乌头酸脱羧酶基因cadA、线粒体三羧酸转运蛋白编码基因mttA和一个超家族转运蛋白编码基因mfsA获得的。
进一步地，所述顺乌头酸脱羧酶基因cadA的DNA序列为SEQ ID NO.1以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2以及相似性80％以上的氨基酸序列；
或者，所述线粒体三羧酸转运蛋白编码基因mttA的DNA序列为SEQ ID NO.3以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4以及相似性80％以上的氨基酸序列。
或者，所述超家族转运蛋白编码基因mfsA的DNA序列为SEQ ID NO.5以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.6以及相似性80％以上的氨基酸序列。
进一步地，单独或者组合强化表达玉米黑粉菌胞质乌头酸-D-异构酶基因adi1、反式-乌头酸脱羧酶基因tad1和衣康酸转运蛋白编码基因itp1。
进一步地，所述玉米黑粉菌胞质乌头酸-D-异构酶基因adi1的DNA序列为SEQ IDNO.7以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.8以及相似性80％以上的氨基酸序列；
或者，所述反式-乌头酸脱羧酶基因tad1的DNA序列为SEQ ID NO.9以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.10以及相似性80％以上的氨基酸序列；
或者，所述衣康酸转运蛋白编码基因itp1的DNA序列为SEQ ID NO.11以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.12以及相似性80％以上的氨基酸序列。
进一步地，通过敲除衣康酰辅酶A转移酶基因ictA，可进一步提高衣康酸合成水平。
进一步地，所述敲除衣康酰辅酶A转移酶基因ictA的DNA序列为SEQ ID NO.13以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.14以及相似性80％以上的氨基酸序列。
进一步地，所述出发黑曲霉菌株的编号为S575(该菌株已经公开在授权专利：ZL2019102839945中)；
或者，所述控制基因强化表达的启动子为黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA，丙酮酸激酶基因启动子PpkiA，黑曲霉乙醇脱氢酶基因启动子PadhA，泡盛曲霉和黑曲霉谷氨酸脱氢酶基因启动子PgdhA，构巢曲霉ATP合成酶基因启动子PoliC，米曲霉磷酸甘油酸激酶基因启动子PpgkA，构巢曲霉磷酸丙糖异构酶基因启动子PtpiA，黑曲霉多蛋白桥接因子1启动子PmbfA,黑曲霉苹果酸脱氢酶基因PmdhA，黑曲霉细胞色素c氧化酶亚基4启动子PcoxA，黑曲霉蛋白质sip5启动子PsrpB等也可实现使上述基因表达上调的目的。
如上所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株在生产衣康酸中的应用。
利用如上所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株发酵高产衣康酸的方法，步骤如下：
首先，将黑曲霉菌株接种在PDA培养平板上，在0～28℃培养0～10天，直至产生分生孢子；然后，将孢子接种至衣康酸发酵培养基中，孢子的终浓度为1×104～2×106个孢子/mL，在0～40℃、0～300rpm条件下发酵0～15天，可得衣康酸。
进一步地，所述衣康酸发酵培养基的具体成分为：0～200g/L葡萄糖，0～5g/L柠檬酸钠×2H2O，0～10g/L KH2PO4，0～5g/L NH4NO3，0～2g/L MgSO4×7H2O，0～2g/L CaCl2×H2O，0～2g/L柠檬酸×H2O，0～2g/L ZnSO4×7H2O，0～1g/L Fe(NH4)2(SO4)2×7H2O，0～1mg/LCuSO4×5H2O，0～1mg/L MnSO4×H2O，0～2mg/L H3BO3，0～2g/L Na2MoO4×2H2O，0～2mg/L生物素和0～400g/L吗啉乙磺酸，初始pH＝2～8；
或者，所述发酵的条件为：35℃，250rpm条件下，发酵第6天，衣康酸滴度达到20g/L，糖酸转化率为0.34mol/mol。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明以黑曲霉为底盘细胞，通过增强衣康酸前体供给，可显著提高黑曲霉合成衣康酸水平。
2、本发明以黑曲霉为底盘细胞，通过强化衣康酸，可进一步提高黑曲霉合成衣康酸水平。
3、本发明以黑曲霉为底盘细胞，通过阻断副产物合成，可进一步提高黑曲霉合成衣康酸水平。4、本发明黑曲霉菌株在最优35℃，250rpm条件下，在250mL的三角瓶中发酵6天，衣康酸滴度达到20g/L，糖酸转化率为0.34mol/mol。
5、本发明使用的黑曲霉菌种已达到GRAS安全级别，易于工程化，pH适应范围广，发酵生产衣康酸成本较低。黑曲霉中衣康酸生产的代谢途径比较新颖，具有进一步研发价值。
6、本发明建立了一种黑曲霉发酵生产衣康酸的发酵工艺，此工艺条件简单，无需加入碳酸钙，简化了后续分离精制过程。
附图说明
图1为本发明中构建基因cadA表达质粒pLH786图谱；
图2为本发明中对基因cadA表达质粒pLH786双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，1为BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切验证正确质粒；
图3为本发明中构建基因mttA表达质粒pLH850图谱；
图4为本发明中对基因mttA表达质粒pLH850双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，1为SpeⅠ和XbaⅠ双酶切验证正确质粒；
图5为本发明中构建基因mfsA表达质粒pLH862图谱；
图6为本发明中对基因mfsA表达质粒pLH862双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，1为SalⅠ和SpeⅠ双酶切验证正确质粒；
图7为本发明中构建基因adi1表达质粒pLH894图谱；
图8为本发明中对基因adi1表达质粒pLH894双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，1为SpeⅠ和BamHⅠ双酶切验证正确质粒；
图9为本发明中构建基因tad1表达质粒pLH941图谱；
图10为本发明中对基因tad1表达质粒pLH941双酶切验证图；其中，M为DNAMarker，1为EcoRⅠ和HindⅢ双酶切验证正确质粒；
图11为本发明中构建基因adi1和tad1共过表达质粒pLH942图谱；
图12为本发明中对基因adi1和tad1共过表达质粒pLH942双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，1为EcoRⅤ和SnaBⅠ双酶切验证正确质粒；
图13为本发明中构建基因itp1表达质粒pLH991图谱；
图14为本发明中对基因itp1表达质粒pLH991双酶切验证图；其中，M为DNAMarker，1为EcoRⅠ和SacⅠ双酶切验证正确质粒；
图15为本发明中构建基因ictA敲除上游同源臂质粒pLH1007图谱；
图16为本发明中对基因ictA敲除上游同源臂质粒pLH1007双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照(模板为水，其它组成成分与实验组相同)，P为阳性对照，1为KpnⅠ和SalⅠ双酶切验证正确质粒；
图17为本发明中构建基因ictA敲除下游同源臂质粒pLH1008图谱；
图18为本发明中对基因ictA敲除下游同源臂质粒pLH1008双酶切验证图；其中，M为DNA Marker，N为阴性对照(模板为水，其它组成成分与实验组相同)，P为阳性对照，1为KpnⅠ和SalⅠ双酶切验证正确质粒；
图19为本发明中黑曲霉出发菌株S575和最高衣康酸生产菌株S2的高效液相色谱分析图；箭头标注的峰图为衣康酸峰图；
图20为本发明中第6天各菌株的衣康酸产量图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种生产衣康酸的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，所述菌株是在出发黑曲霉中同时或单独强化表达顺乌头酸脱羧酶基因cadA、线粒体三羧酸转运蛋白编码基因mttA和一个超家族转运蛋白编码基因mfsA获得的。
较优地，所述顺乌头酸脱羧酶基因cadA的DNA序列为SEQ ID NO.1以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2以及相似性80％以上的氨基酸序列；
或者，所述线粒体三羧酸转运蛋白编码基因mttA的DNA序列为SEQ ID NO.3以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4以及相似性80％以上的氨基酸序列。
或者，所述超家族转运蛋白编码基因mfsA的DNA序列为SEQ ID NO.5以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.6以及相似性80％以上的氨基酸序列。
较优地，单独或者组合强化表达玉米黑粉菌胞质乌头酸-D-异构酶基因adi1、反式-乌头酸脱羧酶基因tad1和衣康酸转运蛋白编码基因itp1。
较优地，所述玉米黑粉菌胞质乌头酸-D-异构酶基因adi1的DNA序列为SEQ IDNO.7以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.8以及相似性80％以上的氨基酸序列；
或者，所述反式-乌头酸脱羧酶基因tad1的DNA序列为SEQ ID NO.9以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.10以及相似性80％以上的氨基酸序列；
或者，所述衣康酸转运蛋白编码基因itp1的DNA序列为SEQ ID NO.11以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.12以及相似性80％以上的氨基酸序列。
较优地，通过敲除衣康酰辅酶A转移酶基因ictA，可进一步提高衣康酸合成水平。
较优地，所述敲除衣康酰辅酶A转移酶基因ictA的DNA序列为SEQ ID NO.13以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.14以及相似性80％以上的氨基酸序列。
较优地，所述出发黑曲霉菌株的编号为S575(该菌株已经公开在授权专利：ZL2019102839945中)；
或者，所述控制基因强化表达的启动子为黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA，丙酮酸激酶基因启动子PpkiA，黑曲霉乙醇脱氢酶基因启动子PadhA，泡盛曲霉和黑曲霉谷氨酸脱氢酶基因启动子PgdhA，构巢曲霉ATP合成酶基因启动子PoliC，米曲霉磷酸甘油酸激酶基因启动子PpgkA，构巢曲霉磷酸丙糖异构酶基因启动子PtpiA，黑曲霉多蛋白桥接因子1启动子PmbfA,黑曲霉苹果酸脱氢酶基因PmdhA，黑曲霉细胞色素c氧化酶亚基4启动子PcoxA，黑曲霉蛋白质sip5启动子PsrpB等也可实现使上述基因表达上调的目的。
如上所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株在生产衣康酸中的应用。
利用如上所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株发酵高产衣康酸的方法，步骤如下：
首先，将黑曲霉菌株接种在PDA培养平板上，在0～28℃培养0～10天，直至产生分生孢子；然后，将孢子接种至衣康酸发酵培养基中，孢子的终浓度为1×104～2×106个孢子/mL，在0～40℃、0～300rpm条件下发酵0～15天，可得衣康酸。
较优地，所述衣康酸发酵培养基的具体成分为：0～200g/L葡萄糖，0～5g/L柠檬酸钠×2H2O，0～10g/L KH2PO4，0～5g/L NH4NO3，0～2g/L MgSO4×7H2O，0～2g/L CaCl2×H2O，0～2g/L柠檬酸×H2O，0～2g/L ZnSO4×7H2O，0～1g/L Fe(NH4)2(SO4)2×7H2O，0～1mg/LCuSO4×5H2O，0～1mg/L MnSO4×H2O，0～2mg/L H3BO3，0～2g/L Na2MoO4×2H2O，0～2mg/L生物素和0～400g/L吗啉乙磺酸，初始pH＝2～8；
或者，所述发酵的条件为：35℃，250rpm条件下，发酵第6天，衣康酸滴度达到20g/L，糖酸转化率为0.34mol/mol。
具体地，相关的制备及检测如下：
实施例1：构建cadA强化表达质粒pLH780(图1)。以pLH454(发明人前期授权专利，专利号：ZL20180985901.9)为出发质粒，将由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制基因cadA的转录。
具体构建过程如下：基因cadA序列经过密码子优化，所述基因cadA序列片段的核苷酸序列为SEQID NO.1，长度为1468bp，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2，长度为490aa。采用引物(Primer1/2)扩增基因cadA序列片段，应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS OneStep Cloning Kit试剂盒将cadA基因序列片段与经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，构建强启动子PgpdA::cadA::TtrpC基因表达盒。连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图2)获得正确质粒pLH786。扩增cadA基因序列片段设计引物为Primer1/2(表1)。
实施例2：基因cadA过表达黑曲霉菌株的构建：将质粒pLH786中包含PgpdA::cadA::TtrpC的DNA片段经原生质体转化到黑曲霉菌株中，挑取单克隆，转接于含有250μg/mL潮霉素B的PDA平板，挑取潮霉素B抗性转化子并提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上重组切除，获得潮霉素敏感的cadA基因过表达菌株cadA/OE，该菌株命名并编号为S3。
实施例3：构建mttA强化表达质粒pLH850(图3)。以pLH454(发明人前期授权专利，专利号：ZL20180985901.9)为出发质粒，将由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制基因mttA的转录。
具体构建过程如下：基因mttA序列经过密码子优化，所述基因mttA序列片段的核苷酸序列为SEQID NO.3，长度为906bp，氨基酸序列为SEQ ID NO.4，长度为301aa。采用引物(Primer3/4)扩增基因mttA序列片段，应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One StepCloning Kit试剂盒将mttA基因序列片段与经过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，构建强启动子PgpdA::mttA::TtrpC基因表达盒。连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图4)获得质粒pLH850。扩增mttA基因序列片段设计引物为Primer3/4(表1)。
实施例4：基因mttA过表达黑曲霉菌株的构建：将质粒pLH850中包含PgpdA::mttA::TtrpC的DNA片段经原生质体转化到实施例2中黑曲霉cadA/OE菌株中，挑取单克隆，转接于含有250μg/mL潮霉素B的PDA平板，挑取潮霉素B抗性转化子并提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上重组切除，获得潮霉素敏感的cadA,mttA基因共过表达菌株[cadA,mttA]/OE。
实施例5：构建mfsA强化表达质粒pLH862(图5)。以pLH454(发明人前期授权专利，专利号：ZL20180985901.9)为出发质粒。将由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA控制基因mfsA转录。
具体构建过程如下：基因mfsA序列经过密码子优化，所述基因mfsA序列片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，长度为1212bp，氨基酸序列为SEQ ID NO.6，长度为403aa。采用引物(Primer5/6)扩增基因mfsA序列片段，应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One StepCloning Kit试剂盒将mfsA基因序列片段与经过SacⅠ单酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，构建强启动子PgpdA::mfsA::TtrpC基因表达盒。连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图6)获得正确质粒pLH862。扩增mfsA基因序列片段设计引物为Primer5/6(表1)。
实施例6：基因mfsA过表达黑曲霉菌株的构建：将质粒pLH862中包含PgpdA::mfsA::TtrpC的DNA片段经原生质体转化到实施例4中黑曲霉[cadA,mttA]/OE菌株中，挑取单克隆，转接于含有250μg/mL潮霉素B的PDA平板，挑取潮霉素B抗性转化子并提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上重组切除，获得潮霉素敏感的mfsA基因过表达菌株[cadA,mttA,mfsA]/OE。
实施例7：
构建tad1强化表达质粒pLH941(图9)。以pLH509为出发质粒(发明人前期授权专利，专利号：ZL202010069216.9)，将丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制基因tad1转录。
具体构建过程如下：基因tad1序列经过密码子优化，所述基因tad1序列片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，长度为1482bp，氨基酸序列为SEQ ID NO.10，长度为493aa。采用引物(Primer9/10)扩增基因tad1序列片段，应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS OneStep Cloning Kit试剂盒将tad1基因序列片段与经过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切线性化后的出发载体pLH509进行连接，构建强启动子PpkiA::tad1::TtrpC基因表达盒。连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图10)获得正确质粒pLH941。扩增基因tad1序列片段设计引物为Primer9/10(表1)。
实施例8：基因tad1强化表达黑曲霉菌株的构建：将质粒pLH941中包含PpkiA::tad1::TtrpC的DNA片段经原生质体转化到黑曲霉菌株中，挑取单克隆，转接于含有250μg/mL潮霉素B的PDA平板，挑取潮霉素B抗性转化子并提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上重组切除，获得潮霉素敏感的tad1基因过表达菌株tad1/OE，该菌株命名并编号为S4。
实施例9：
构建adi1和tad1强化表达质粒pLH942(图11)。分别以pLH454(发明人前期授权专利，专利号：ZL20180985901.9)和pLH509为出发质粒，将由黑曲霉3-磷酸甘油脱氢酶基因启动子PgpdA和丙酮酸激酶基因启动子PpkiA分别控制基因adi1和tad1转录。
具体构建过程如下：基因adi1和tad1序列经过密码子优化，所述基因adi1序列片段的核苷酸序列分别为为SEQ ID NO.7，长度为1332bp，氨基酸序列为SEQ ID NO.8，长度为443aa。采用引物(Primer7/8)扩增基因adi1序列片段，应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将adi1基因序列片段与经过KpnⅠ和BamHⅠ双酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，构建强启动子PgpdA::adi1::TtrpC基因表达盒。连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图8)获得正确质粒pLH894。基因tad1序列片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，长度为1482bp，氨基酸序列为SEQ IDNO.10，长度为493aa。采用引物(Primer9/10)扩增基因tad1序列片段，应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiSOne Step Cloning Kit试剂盒将tad1基因序列片段与经过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，构建强启动子PpkiA::tad1::TtrpC基因表达盒。连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图10)获得正确质粒pLH941。以pLH894为模板，采用引物Primer11/12扩增PgpdA::adi1::TtrpC基因表达盒，利用HindⅢ单酶切回收克隆到载体pLH941，经双酶切验证(图12)获得正确质粒pLH942(图11)。扩增基因adi1序列片段设计引物为Primer7/8，扩增基因tad1序列片段设计引物为Primer9/10，扩增PgpdA::adi1::TtrpC基因表达盒序列片段设计引物为Primer11/12(表1)。
实施例10：基因adi1和tad1共过表达黑曲霉菌株的构建：将质粒pLH942中包含PgpdA::adi1::TtrpC和PpkiA::tad1::TtrpC的DNA片段经原生质体转化到实施例6中黑曲霉[cadA,mttA,mfsA]/OE菌株中，挑取单克隆，转接于含有250μg/mL潮霉素B的PDA平板，挑取潮霉素B抗性转化子并提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上重组切除，获得潮霉素敏感的adi1和tad1基因共过表达菌株[cadA,mttA,mfsA,adi1,tad1]/OE。
实施例11：构建itp1强化表达基因质粒pLH991(图13)。以pLH509为出发质粒。将由黑曲霉丙酮酸激酶基因启动子PpkiA控制基因itp1的转录。
具体构建过程如下：基因itp1序列经过密码子优化，所述基因itp1序列片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.11，长度为1476bp，氨基酸序列为SEQ ID NO.12，长度为491aa。采用引物(Primer13/14)扩增基因itp1序列片段，应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS OneStep Cloning Kit试剂盒将itp1基因序列片段与经过EcoRⅠ和SacⅠ双酶切线性化后的出发载体pLH454进行连接，构建强启动子PpkiA::itp1::TtrpC基因表达盒。连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图14)获得正确质粒pLH991。扩增itp1基因序列片段设计引物为Primer13/14(表1)。
实施例12：基因itp1过表达黑曲霉菌株的构建：将质粒pLH991中包含PpkiA::itp1::TtrpC的DNA片段经原生质体转化到实施例10中黑曲霉[cadA,mttA,mfsA,adi1,tad1]/OE菌株中，挑取单克隆，转接于含有250μg/mL潮霉素B的PDA平板，挑取潮霉素B抗性转化子并提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上重组切除，获得潮霉素敏感的itp1基因过表达菌株[cadA,mttA,mfsA,adi1,tad1,itp1]/OE。
实施例13：构建ictA敲除质粒pLH1008(图17)。以pL1007为出发质粒。
具体构建过程如下：基因ictA上游同源臂序列片段，该核苷酸序列为SEQ IDNO.13，长度为875bp，以野生型黑曲霉ATCC 1015基因组为模板，采用引物(Primer15/16)扩增基因ictA上游同源臂序列片段，应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One StepCloning Kit试剂盒将ictA上游同源臂序列片段与经过SacⅠ和BamHⅠ双酶切线性化后的出发载体pLH594进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图16)获得正确质粒pLH1007。基因ictA下游同源臂序列片段，该核苷酸序列为SEQ ID NO.14，长度为896bp，采用引物(Primer17/18)为引物进行PCR扩增ictA基因下游同源臂序列片段，应用诺唯赞C113-ClonExpress-MultiS One Step Cloning Kit试剂盒将ictA基因下游同源臂序列片段与经SpeⅠ单酶切线性化后的出发载体pLH1007进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，并均匀涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB培养皿中，37℃过夜培养，挑取单克隆，经双酶切验证(图18)获得正确质粒pLH1008。扩增ictA基因上下游同源臂序列片段设计引物分别为Primer15/16和Primer17/18(表1)。
实施例14：基因ictA敲除黑曲霉菌株的构建：将质粒pLH1008中包含ictA上游同源臂、loxP::hph::loxP和ictA下游同源臂的DNA片段经原生质体转化到实施例12中黑曲霉[cadA,mttA,mfsA,adi1,tad1，itp1]/OE菌株中，挑取单克隆，转接于含有250μg/mL潮霉素B的PDA平板，挑取潮霉素B抗性转化子并提取基因组验证，收集正确转化子孢子接种于含有30μg/mL多西环素平板上，诱导hph抗性筛选标记从基因组上重组切除，获得潮霉素敏感的ictA基因敲除菌株[cadA,mttA,mfsA,adi1,tad1,itp1]/OE-ΔictA，该菌株命名并编号为S2。
实施例15：本发明在含有50mL衣康酸发酵培养基的250mL的三角瓶中，在35℃，250rpm条件下发酵6天，充分混匀摇瓶中的发酵液，立即取1～20mL置于EP管中，0～15000rpm离心0～60min，取上清，稀释0～50倍经0.22μm孔径水系滤膜过滤，得到滤液用高效液相色谱(HPLC)紫外检测法测定，使用的色谱柱为伯乐Aminex HPX-87H色谱柱。流动相为0～20mM硫酸，柱温为0～100℃，流动相流速为0～2mL/min，波长为0～400nm。S3中在保留时间13.5min出的峰为衣康酸峰面积图，S575在保留时间13.5min未检测到衣康酸的峰。本发明生产衣康酸的黑曲霉菌株在摇瓶发酵6天衣康酸滴度达到6g/L，糖酸转化率为0.31mol/mol。有研究表明黑曲霉、大肠杆菌以及解脂氏酵母等微生物通过代谢工程改造也能形成衣康酸，但是存在衣康酸滴度低，生产率低等问题。因此，本发明基于黑曲霉天然生产有机酸特性，获得了一株高产衣康酸菌株。
实施例16：本发明在含有50mL衣康酸发酵培养基的250mL的三角瓶中，在35℃，250rpm条件下发酵6天，充分混匀摇瓶中的发酵液，立即取1～20mL置于EP管中，0～15000rpm离心0～60min，取上清，稀释0～50倍经0.22μm孔径水系滤膜过滤，得到滤液用高效液相色谱(HPLC)紫外检测法测定，使用的色谱柱为伯乐Aminex HPX-87H色谱柱。流动相为0～20mM硫酸，柱温为0～100℃，流动相流速为0～2mL/min，波长为0～400nm。S4中在保留时间13.5min出的峰为衣康酸峰面积图，S575在保留时间13.5min未检测到衣康酸的峰。本发明生产衣康酸的黑曲霉菌株在摇瓶发酵6天衣康酸滴度达到4.3g/L，糖酸转化率为0.16mol/mol。Geiser等人在酿酒酵母中过表达adi1和tad1这两个基因只得到了50mg/L的衣康酸。因此，本发明基于黑曲霉能够生产各种有机酸和蛋白质等优势被选为发酵生产衣康酸的候选菌株，并获得了一株高产衣康酸菌株。
实施例17：本发明在含有50mL衣康酸发酵培养基的250mL的三角瓶中，在35℃，250rpm条件下发酵6天，充分混匀摇瓶中的发酵液，立即取1～20mL置于EP管中，0～15000rpm离心0～60min，取上清，稀释0～50倍经0.22μm孔径水系滤膜过滤，得到滤液用高效液相色谱(HPLC)紫外检测法测定，使用的色谱柱为伯乐Aminex HPX-87H色谱柱。流动相为0～20mM硫酸，柱温为0～100℃，流动相流速为0～2mL/min，波长为0～400nm。S2中在保留时间13.5min出的峰为衣康酸峰面积图，S575在保留时间13.5min未检测到衣康酸的峰。本发明生产衣康酸的黑曲霉菌株在摇瓶发酵6天衣康酸滴度达到20g/L，糖酸转化率为0.34mol/mol。HossainAH等人以黑曲霉为出发菌经过遗传改造，在摇瓶5天衣康酸产量为2g/L。随后XianY等人发现黑曲霉在发酵6天可形成4.92g/L衣康酸。在大肠杆菌和酿酒酵母中，通过代谢改造也可以形成衣康酸，但产量相对较低。因此，本发明基于黑曲霉天然生产有机酸特性，获得了一株高产衣康酸菌株。
上述衣康酸发酵培养基组成成分为：0～500mL 50％葡萄糖，0～50mL Vogel’s 50×salts，0～150μL生物素溶液，0～150μL微量元素，0～1.5L 2M MES，调节pH为2～8，115℃，20min。
所述衣康酸发酵培养基中所需试剂的配制：
(1)50％葡萄糖：50g葡萄糖，加入ddH2O定容至100mL。
(2)Vogel’s 50×salts：125g/L柠檬酸钠×2H2O，250g/L KH2PO4，67g/L NH4Cl，10g/L MgSO4×7H2O，5g/L CaCl2×2H2O，室温下保存。
(3)微量元素：50g/L柠檬酸×H2O，50g/L ZnSO4×7H2O，10g/L Fe(NH4)2(SO4)2×6H2O，2.5g/L CuSO4×5H2O，0.5g/L H3BO3，0.5g/L Na2MoO4×2H2O，室温下保存。
(4)生物素溶液：0.1g Biotin，加入ddH2O定容至1L，-20℃保存。
(5)0～2M MES(吗啉乙磺酸)：390.5g MES，加入ddH2O定容至1L。
表1 实施例中所用引物序列
Figure BDA0003499407780000071
注：斜体核苷酸序列为克隆的同源臂序列；下划线的核苷酸序列为限制酶识别位点。
本专利申请中所使用到的序列如下：
SEQ ID NO.1：基因cadA密码子优化后的核苷酸序列1468bp
ATGACCAAACAATCTGCGGACAGCAACGCAAAGTCAGGAGTTACGTCCGAAATATGTCATTGGGCATCCAACCTGGCCACTGACGACATCCCTTCGGACGTATTAGAAAGAGCAAAATACCTTATTCTCGACGGTATTGCATGTGCCTGGGTTGGTGCAAGAGTGCCTTGGTCAGAGAAGTATGTTCAGGCAACGATGAGCTTTGAGCCGCCGGGGGCCTGCAGGGTGATTGGATATGGACAGAAACTGGGGCCTGTTGCAGCAGCCATGACCAATTCCGCTTTCATACAGGCTACGGAGCTTGACGACTACCACAGCGAAGCCCCCCTACACTCTGCAAGCATTGTCCTTCCTGCGGTCTTTGCAGCAAGTGAGGTCTTAGCCGAGCAGGGCAAAACAATTTCCGGTATAGATGTTATTCTAGCCGCCATTGTGGGGTTTGAATCTGGCCCACGGATCGGCAAAGCAATCTACGGATCGGACCTCTTGAACAACGGCTGGCATTGTGGAGCTGTGTATGGCGCTCCAGCCGGTGCGCTGGCCACAGGAAAGCTCCTCGGTCTAACTCCAGACTCCATGGAAGATGCTCTCGGAATTGCGTGCACGCAAGCCTGTGGTTTAATGTCGGCGCAATACGGAGGCATGGTAAAGCGTGTGCAACACGGATTCGCAGCGCGTAATGGTCTTCTTGGGGGACTGTTGGCCCATGGTGGGTACGAGGCAATGAAAGGTGTCCTGGAGAGATCTTACGGCGGTTTCCTCAAGATGTTCACCAAGGGCAACGGCAGAGAGCCTCCCTACAAAGAGGAGGAAGTGGTGGCTGGTCTCGGTTCATTCTGGCATACCTTTACTATTCGCATCAAGCTCTATGCCTGCTGCGGACTTGTCCATGGTCCAGTCGAGGCTATCGAAAACCTTCAGGGGAGATACCCCGAGCTCTTGAATAGAGCCAACCTCAGCAACATTCGCCATGTTCATGTACAGCTTTCAACGGCCTCGAACAGTCACTGTGGATGGATACCAGAGGAGAGACCCATCAGTTCAATCGCAGGGCAGATGAGTGTCGCATACATTCTCGCCGTCCAGCTGGTCGACCAGCAATGTCTTTTGTCCCAGTTTTCTGAGTTTGATGACAACCTGGAGAGGCCAGAAGTTTGGGATCTGGCCAGGAAGGTTACTTCATCTCAAAGCGAAGAGTTTGATCAAGACGGCAACTGTCTCAGTGCGGGTCGCGTGAGGATTGAGTTCAACGATGGTTCTTCTATTACGGAAAGTGTCGAGAAGCCTCTTGGTGTCAAAGAGCCCATGCCAAACGAACGGATTCTCCACAAATACCGAACCCTTGCTGGTAGCGTGACGGACGAATCCCGGGTGAAAGAGATTGAGGATCTTGTCCTCGGCCTGGACAGGCTCACCGACATTAGCCCATTGCTGGAGCTGCTGAATTGCCCCGTGAAATCGCCACTGGTATAA
SEQ ID NO.2：基因cadA氨基酸序列490aa
MTKQSADSNAKSGVTAEICHWASNLATDDIPSDVLERAKYLILDGIACAWVGARVPWSEKYVQATMSFEPPGACRVIGYGQKLGPVAAAMTNSAFIQATELDDYHSEAPLHSASIVLPAVFAASEVLAEQGKTISGIDVILAAIVGFESGPRIGKAIYGSDLLNNGWHCGAVYGAPAGALATGKLLGLTPDSMEDALGIACTQACGLMSAQYGGMVKRVQHGFAARNGLLGGLLAYGGYEA MKGVLERSYGGFLKMFTKGNGREPPYKEEEVVAGLGSFWHTFTIRIKLYACCGLVHGPVEAIEKLQRRYPELLNRANLSNIRHVYVQLSTASNSHCGWIPEERPISSIAGQMSVAYILAVQLVDQQCLLAQFSEFDDNLERPEVWDLARKVTPSHSEEFDQDGNCLSAGRVRIEFNDGSSVTETVEKPLGVKEPMPNERILHKYRTLAGSVTDESRVKEIEDLVLSLDRLTDITPLLELLNCPVKSPLV
SEQ ID NO.3：基因mttA密码子优化后的核苷酸序列918bp
ATGGACTCCAAGATTCAGACCAATGTCCCCCTGCCCAAGGCCCCCCTGATCCAAAAGGCTAGAGGCAAGAGAACCAAGGGCATCCCTGCACTGGTAGCTGGTGCCTGTGCTGGTGCTGTGGAGATCTCCATCACCTACCCCTTTGAGTCTGCCAAGACTAGAGCTCAGCTCAAAAGAAGAAATCATGATGTGGCTGCTATCAAGCCTGGCATCAGAGGCTGGTATGCTGGCTATGGTGCCACTCTGGTGGGCACCACTGTCAAGGCCTCTGTGCAGTTTGCCTCCTTCAACATTTATAGATCTGCCCTTTCTGGGCCTAATGGTGAGCTGTCCACTGGTGCCTCTGTCCTTGCTGGCTTTGGTGCTGGTGTCACTGAGGCTGTCCTTGCTGTCACCCCTGCTGAGGCCATCAAGACCAAGATCATTGATGCTAGAAAGGTGGGCAATGCTGAGCTGAGTACCACCTTTGGTGCCATTGCTGGCATCTTAAGAGACAGAGGCCCCCTGGGCTTCTTTTCTGCTGTGGGCCCCACCATCCTGAGACAGTCCTCCAATGCTGCTGTCAAGTTCACTGTCTACAATGAGCTGATTGGCCTGGCTAGAAAGTACAGCAAGAATGGTGAGGATGTCCACCCCCTGGCTTCCACCCTGGTGGGCTCTGTCACTGGTGTCTGCTGTGCCTGGTCCACTCAGCCCCTGGATGTCATCAAGACTAGAATGCAGTCCCTGCAAGCTAGACAGCTGTATGGCAACACCTTCAACTGTGTCAAGACCCTGCTGAGATCTGAGGGCATTGGTGTCTTCTGGTCTGGTGTCTGGTTCAGAACTGGCAGACTGTCCCTGACCTCTGCCATCATGTTCCCTGTCTATGAGAAGGTCTACAAGTTCCTGACTCAGCCCAACTGA
SEQ ID NO.4：基因mttA氨基酸序列301aa
MDSKIQTNVPLPKAPLIQKARGKRTKGIPALVAGACAGAVEISITYPFESAKTRAQLKRRNHDVAAIKPGIRGWYAGYGATLVGTTVKASVQFASFNIYRSALSGPNGELSTGASVLAGFGAGVTEAVLAVTPAEAIKTKIIDARKVGNAELSTTFGAIAGILRDRGPLGFFSAVGPTILRQSSNAAVKFTVYNELIGLARKYSKNGEDVHPLASTLVGSVTGVCCAWSTQPLDVIKTRMQSLQARQLYGNTFNCVKTLLRSEGIGVFWSGVWFRTGRLSLTSAIMFPVYEKVYKFLTQPN
SEQ ID NO.5：基因mfsA密码子优化后核苷酸序列1212bp
ATGGGCCACGGTGACACTGAGTCCCCGAACCCAACGACGACCACGGAAGGTAGCGGACAAAACGAGCCAGAGAAAAAGGGCCGTGATATTCCATTATGGAGAAAATGTGTCATTACGTTTGTTGTTAGTTGGATGACTCTAGTCGTTACTTTCTCCAGTACTTGTCTTCTTCCTGCCGCCCCTGAAATCGCGAATGAATTTGATATGACTGTCGAGACTATCAACATCTCCAATGCTGGTGTCCTAGTTGCCATGGGATATTCATCCCTCATATGGGGTCCCATGAACAAGTTAGTCGGCCGGCGGACATCATACAATCTGGCCATTTCAATGCTTTGTGCATGCTCCGCTGGAACGGCAGCGGCGATAAACGAGGAAATGTTCATAGCGTTCAGAGTGTTGAGCGGCTTAACCGGAACCTCGTTCATGGTCTCAGGCCAAACTGTTCTTGCAGATATCTTTGAGCCTGTTTACCGTGGGACGGCCGTAGGTTTCTTCATGGCCGGGACTCTTTCTGGCCCTGCAATAGGCCCCTGCGTGGGAGGGGTCATCGTCACTTTCACGAGTTGGCGTGTTATCTTCTGGCTTCAACTAGGTATGAGCGGGCTGGGGCTCGTGCTTTCTCTGCTATTTTTCCCGAAAATCGAAGGAAATTCTGAGAAGGTCTCAACGGCGTTTAAACCGACCACACTTGTCACAATCATATCGAAATTCTCCCCAACGGATGTGCTCAAGCAGTGGGTGTATCCAAATGTCTTTCTTGCCGACTTATGCTGTGGCCTCCTGGCAATCACGCAATATTCGATCCTGACTTCAGCTCGTGCCATATTCAACTCACGATTTCATTTAACGACTGCCCTAGTATCGGGTCTCTTCTACCTCGCTCCAGGTGCCGGGTTCCTGATAGGCAGTCTCGTCGGCGGTAAACTTTCGGATCGCACCGTTCGGAGATACATAGTAAAGCGCGGATTCCGTCTCCCTCAGGATCGACTCCACAGCGGGCTCATCACATTGTTCGCCGTGCTGCCCGCAGGAACGCTCATTTACGGGTGGACACTCCAAGAGGATAAGGGTGATATGGTAGTGCCCATAATCGCGGCGTTCTTCGCGGGCTGGGGGCTCATGGGCAGTTTTAACTGCCTGAACACTTACGTGGCTGGTTTGTTCCACACCCTCATTTATCTATTCCCTTTGTGTACATGCCCACAATAA
SEQ ID NO.6：基因mfsA氨基酸序列403aa
MGHGDTESPNPTTTTEGSGQNEPEKKGRDIPLWRKCVITFVVSWMTLVVTFSSTCLLPAAPEIANEFDMTVETINISNAGVLVAMGYSSLIWGPMNKLVGRRTSYNLAISMLCACSAGTAAAINEEMFIAFRVLSGLTGTSFMVSGQTVLADIFEPVYRGTAVGFFMAGTLSGPAIGPCVGGVIVTFTSWRVIFWLQLGMSGLGLVLSLLFFPKIEGNSEKVSTAFKPTTLVTIISKFSPTDVLKQWVYPNVFLADLCCGLLAITQYSILTSARAIFNSRFHLTTALVSGLFYLAPGAGFLIGSLVGGKLSDRTVRRYIVKRGFRLPQDRLHSGLITLFAVLPAGTLIYGWTLQEDKGDMVVPIIAAFFAGWGLMGSFNCLNTYVAGLFHTLIYLFPLCTCPQ
SEQ ID NO.7：基因adi1密码子优化后的核苷酸序列1332bp
ATGCTGCACCCCATTGACACCACAATATACCGGGCCGGTACTTCCCGGGGACTGTACTTCTTAGCTTCCGACCTGCCCGCCGAACCCTCCGAGCGTGACGCCGCCCTGATCTCCATCATGGGCTCCGGCCACCCCCTGCAGATCGACGGCATGGGCGGCGGCAACTCCCTGACCTCCAAGGTCGCCATCGTCTCCGCCTCCACTCAGCGCTCCGAGTTCGACGTCGACTACCTGTTCTGCCAAGTCGGCATCACCGAGCGCTTCGTCGACACCGCCCCCAACTGCGGCAATCTCATGTCCGGCGTCGCAGCGTTTGCTATCGAGCGCGGCCTGGTTCAGCCGCACCCGTCCGATACCACATGTCTGGTCCGCATCTTCAACCTGAACTCCCGCCAAGCCTCCGAGCTGGTCATCCCCGTCTACAACGGCCGCGTCCACTACGACGACATCGATGACATGCACATGCAACGCCCATCCGCCCGCGTCGGCCTGCGCTTCCTGGACACCGTCGGCTCCTGCACCGGCAAGCTGCTGCCCACCGGCAACGCCTCCGACTGGATCGACGGCCTGAAGGTCTCCATCATCGACTCCGCCGTCCCCGTCGTCTTCATCCGGCAGCACGACGTGGGCATAACCGGCTCCGAAGCCCCCGCAACCCTGAATGCCAACACCGCCCTATTGGATCGCCTGGAACGCGTGCGGCTGGAAGCCGGTCGACGCATGGGCTTAGGCGACGTCTCCGGCAGCGTCGTCCCCAAGCTGTCCCTGATCGGCCCCGGCACCGAGACCACCACCTTCACCGCCCGCTACTTTACACCCAAGGCCTGTCACAACGCCCATGCCGTAACGGGCGCCATCTGCACCGCCGGCGCCGCCTACATCGACGGCTCCGTTGTCTGCGAGATCCTGAGCTCCCGCGCTTCCGCCTGCTCCGCCTCCCAACGCCGCATCTCCATCGAGCACCCATCCGGTGTCCTGGAAGTCGGCCTGGTCCCCCCCGAAAACGCCGCTCAGAGCCTGGTCGACGTCGCCGTCGTCGAGCGCTCCATCGCCCTGATCGCCCACGCCCGCGTCTATTACACTACCCCCGATCGCCGCCGCTCGTATGATTCTCCCCTGACATCCCCCTCCACCCCCGCCGACACCCACAACCTGTTCGACGCCGCCTACCGCCCCGTCATTCAGCCCTCCGACACCGATGTAGAGGCCCCCCACATGCTGGCCCTGGAGAACAAGGAGCAGTGCGTGTCACGGTGCGACACCGCCCTGCATCACATCGTCGCGTCCTACGGCGCCTCCGACGCCCACGCCTCCGACCGCTCCCTGTCCTGA
SEQ ID NO.8：基因adi1氨基酸序列443bp
MLHPIDTTIYRAGTSRGLYFLASDLPAEPSERDAALISIMGSGHPLQIDGMGGGNSLTSKVAIVSASTQRSEFDVDYLFCQVGITERFVDTAPNCGNLMSGVAAFAIERGLVQPHPSDTTCLVRIFNLNSRQASELVIPVYNGRVHYDDIDDMHMQRPSARVGLRFLDTVGSCTGKLLPTGNASDWIDGLKVSIIDSAVPVVFIRQHDVGITGSEAPATLNANTALLDRLERVRLEAGRRMGLGDVSGSVVPKLSLIGPGTETTTFTARYFTPKACHNAHAVTGAICTAGAAYIDGSVVCEILSSRASACSASQRRISIEHPSGVLEVGLVPPENAAQSLVDVAVVERSIALIAHARVYYTTPDRRRSYDSPLTSPSTPADTHNLFDAAYRPVIQPSDTDVEAPHMLALENKEQCVSRCDTALHHIVASYGASDAHASDRSLS
SEQ ID NO.9：基因tad1密码子优化后的核苷酸序列1482bp
ATGGCCCCCGCCCTGAATGCCAATCCTACCACCAAGAGGGATGAGCTGTCCGCCCCCTCGGCCTCCCATAAACTGGGTATGAGCTCCATGGCTTCCCGGGCCGCCGGTGGGGGGCTCAAGCTCACCGGCTTGCCGGATCTGTCCGACTCCGCCGGCACCCTGTCCGACATCTTCGGCACCCCTCAGATGCGCGAGATCTGGTCCGATCAGAACCGCGTCGCCTGCTACCTGGAGATCGAGGCCGCCCTGGCCATCGTCCAAGCCGACCTGGGCATCATCCCCAAGAACGCCGCCCACGAGATCGTCGAGCACTGCCGCGTCCAAGAGATCGACTGGGCCCTGTACAAGCAGAAGACCGAGCTGATCGGCTACCCCGTCCTGGGCATCGTGCAGCAGCTGGTCGCCAACTGCAAGGACGGCCTGGGCGAGTACTGCCACTGGGGCGCCACCACCCAAGACATCACCGACACCGCCACCGTCATGCAGATCCGGCAGTCCCTGACCCTGGTCAAACAGCGGCTGGATTCTATCGTCTCCTCCCTGGAGCACCTGGCCGAGCAGCACCGCAACGTCCCCATGGCCGCCCGCTCCAACCTGAAGCAAGCCGTCCCCATCACCTTCGGCTTCAAGATGGCCCGCTTCCTGGCCACCTTCCGCCGCCATCAGCAGCGCCTGGTGGAGCTCGAGAAACGCGTCTACACCTTAGAGTTCGGCGGCGCGGCCGGCAATTTGTCCTCCCTAGGCGATCAAGGCATCGCCACCCACGACGCCCTGGCCAAGATGCTGGACCTGGCCCCCGCCGAGATCGCCTGGCACACCGAGCATGACCGCTTCGCAGAGGTCGGAACCTTCTTGGGCCTGCTGACCGGCACCCTGGCCAAGCTGGCCACCGACATCAAGCTGATGTCTCAGACCGAGGTAGGCGAGGTCGGCGAGCCCTTCATCTCCAACCGCGGCTCCTCCTCCACCATGCCTCAGAAGAACAACCCCATCTCCTGCGTTTATATCCACGCCTGCGCAGCCAACGTTCGCCAAGGCGCCGCCGCCCTGCTGGATGCGATGCAGTCCGATCACGAACGCGGCACCGGACCCTGGGAGATCATCTGGGTGCAGCTGCCCCTGATGATGAACTGGACCTCCGCCGCCCTGAACAACGCCGACTTCGTCCTGCGCGGCCTGCAAGTCTTCCCCGATGCGATGCAACATAATCTGGACCTGTCCAAGGGCCTGATCGTCTCCGAGGCCGTCATGATGGGCCTAGGCAACACCCTGGGCCGGCAGTACGCCCACGACGCCGTCTACGAGTGCTGCCGCACCGCCTTCGTCCAAGACCGCCCCCTCCTGGACGTCCTGCTGGAGAACCACGAGATCGCCTCCAAGCTGGACCGCACCGAACTGGAGAAGCTGTGCGACCCCGCCAACTACCTGGGTCAGTGCTCTCAGTGGATCGACCGCGTCCTGTCCCGCCCCTCCTCCGCCTGA
SEQ ID NO.10：基因tad1氨基酸序列493aa
MAPALNANPTTKRDELSAPSASHKLGMSSMASRAAGGGLKLTGLPDLSDSAGTLSDIFGTPQMREIWSDQNRVACYLEIEAALAIVQADLGIIPKNAAHEIVEHCRVQEIDWALYKQKTELIGYPVLGIVQQLVANCKDGLGEYCHWGATTQDITDTATVMQIRQSLTLVKQRLDSIVSSLEHLAEQHRNVPMAARSNLKQAVPITFGFKMARFLATFRRHQQRLVELEKRVYTLEFGGAAGNLSSLGDQGIATHDALAKMLDLAPAEIAWHTEHDRFAEVGTFLGLLTGTLAKLATDIKLMSQTEVGEVGEPFISNRGSSSTMPQKNNPISCVYIHACAANVRQGAAALLDAMQSDHERGTGPWEIIWVQLPLMMNWTSAALNNADFVLRGLQVFPDAMQHNLDLSKGLIVSEAVMMGLGNTLGRQYAHDAVYECCRTAFVQDRPLLDVLLENHEIASKLDRTELEKLCDPANYLGQCSQWIDRVLSRPSSA
SEQ ID NO.11：基因itp1密码子优化后的核苷酸序列1482bp
ATGGACCAAGCCGATCATTCCGGCGTCCCAGACGACGCTGCGCTCGAGGAGGCGCCCAATACAGTACCGATTCAAGAAAAGAGCGCACAGCCTCACGACACGCAGCCGTACTGTGCATTCACGAAGCGGTCCAAGCTGTTTATCGTCCTCACCGTCTCTCTTGCCGGCTTTTTTTCGCCGTTTGCCATCAACATTTACATCCCTGCCCTGCCCCAGATCGCCGGTATGCTGCATACCTCTGAAGCCGCTACCAACGTCACGGTGACCGTCTACATGATTGCACAGGGACTTTCACCGGTTATCTGGGCTCCTCTCTCGGATGTGTTTGGGCGCCGACCGATCTACATCTTGACGTTTTTCATCTTTTTCATTGCCAACCTCGGGCTGTCGTTCACCAACGTCTACTGGCTCTTGGTGGTGCTGCGTATGGTGCAGGCTGCAGGCGCGTGCAGTGCGATTGCGATTGGCGCTGGTACGATTGGCGACGTTACTGAGCGCAAGGAACGAGGAAGTTACATGGGCTACTATGCGCTTGCGCAATACACGGGCCCCGCCATCGGACCGGTTGTCGGTGGCGCGCTTTCGCAGAGATGGGACTACCATGCTACGTTTTTCTTCTTGACGGCGATCTCGGGTCCGTTTTTGTTGTTCATGCTTCTCTTTCTCGTTGAAACGCTTCGAGTCATTGTTGGCAACGGCAGTGCAAAAACGTCGGGCATCTATCGCCCCTTGGTGGAGCCCAAGCTGCAACGCTCGATCGCCAATGCGCCTCGGCCTGGCATCAAGAACCCACTGCATGGCACGCTCGATTTCGGCTTCCACCGTCCGTTTTTGGTGTTTGCGCGCCCCGAGACCAGCCTAGCCATCCTGGCTTTTTCGATGGTATATGCGAGCTACTACTTGTCATCTGGTTCGCTGCCGTATCTGTTCAAGCAGGTGTACGGTCTGGACGAGCTCCTGATCGGCGTATGCTTTGTTCCGAGCGGTGTGGGGTGTGCGGTGGGCACAGTGCTCGCCGGCAAGATCCTCGACTGGGACTATCGTCGTGCGTTGGACAAGAGCAAGCTTGGTGTCAAGGTGACGCGCGCAAGGTTGCAGTCGGCGTGGATCTACCTGCCGTGCTACTGCGCTTCGCTTCTGGCGTACGGATGGTGTGTTCGTGCGCATACGCATATCGCCGCTCCGATCGTGTTTCAGTTTACACTGGGCATGTTTTCGACCATGTACTTTACCAATGTCAATACGCTCATTGTCGACCTGTATCCTGGCAAAGCGGCCAGCGCAACCGCAGCGGTCAACGTCGGACGGTGCTTGCTCGGCGCAGTAGCAGTCGCCGTGGTCCAGCCCATGATCGACGCAATGGGCGCCGGCTGGACTTTTACGCTCGGCGCACTACTCACACTGATCGTCGGTCTCATCTGCCAAGTTCTCATCTACCTCTACGGCGAAATGTGGGCAGCTCGCAAACACTCGTGA
SEQ ID NO.12：基因itp1氨基酸序列491aa
MDQADHSGVPDDAALEEAPNTVPIQEKSAQPHDTQPYCAFTKRSKLFIVLTVSLAGFFSPFAINIYIPALPQIAGMLHTSEAATNVTVTVYMIAQGLSPVIWAPLSDVFGRRPIYILTFFIFFIANLGLSFTNVYWLLVVLRMVQAAGACSAIAIGAGTIGDVTERKERGSYMGYYALAQYTGPAIGPVVGGALSQRWDYHATFFFLTAISGPFLLFMLLFLVETLRVIVGNGSAKTSGIYRPLVEPKLQRSIANAPRPGIKNPLHGTLDFGFHRPFLVFARPETSLAILAFSMVYASYYLSSGSLPYLFKQVYGLDELLIGVCFVPSGVGCAVGTVLAGKILDWDYRRALDKSKLGVKVTRARLQSAWIYLPCYCASLLAYGWCVRAHTHIAAPIVFQFTLGMFSTMYFTNVNTLIVDLYPGKAASATAAVNVGRCLLGAVAVAVVQPMIDAMGAGWTFTLGALLTLIVGLICQVLIYLYGEMWAARKHS
SEQ ID NO.13：基因ictA上游同源臂的核苷酸序列875bp
GATGATCGTCAAGCGAGTTCCCTGGACGATGCCGTCCTCCCCGATGGAACAGCCATTATCCATCTGCTGGATGGGAATACTAGCCCGTTGAACCGAGCTACTTCAGGAACAGATGTTCAAGTGTGACCTTCCCGTCTTTAAGTAGTATAGCTTCACAATTGGGGGTTAAGGCTGCTTGTGTCCCTTGTAAGTGACCGACATCAGCAATGGCCGTTATGACGACCCTCCGGTATTTGGTCGCATACGAGGTGCAGTAGTACAGCATATTAGACCAAAAGCCTCCAGGGTGCTTGCATTGGGATGAACATCGTCCAGGATCACCTCCGGCGGTATCCAGCAGGTGTTCAGCCGAATAGCCCCGTGGCTGTATTTGGCAGGGAGTATCCTTGTCGGTTTGCATATAGGTAGCTGTCTAGAACTTGTGAGTTCGAGCTGCGCAGTTATATGGGTGATCGTTTTCCAAGTGGCATGCTAGCGACGTGGCTGGAATAAGCTATGGTCACCAGGCCTCATAGCACATTGCTCCTTCGTAATGCGGCAATTCAATTCCTATATAACCTTTCTAAAGCCCTCGCTACGATCAGAAATAAGCAGGCCGTGATTGAATTCTGGTAGTAGACCTTATGCGACCGCGCGAAATTAGTAACCGAATCATTGATGGATTGACTGCGAGATGGAGATTCCAGTATCATTCCTACAACCATGCTCAAGCTGGGAAAAGCTGTGAATGAACAATTAGCAGAAGATAGGCCGTGATCAAGCCTTGAGATGCAATGAATAGCAAAAATGTTTCAATACCTGCTATCACAATCTTTGCAGACAGATTGTTACTAGGGTGGAAGGATATCTAGTTCTTTGGGAACAACACACTTTGC
SEQ ID NO.14：基因ictA下游同源臂的核苷酸序列896bp
AATCCAATTCAGGCAACCTACCCCTGCTGCCCCTAATATCACCCCGCGACGGTATCCAGCGTAAAGTGAATATCGGCGCAATATACCCATCGCCGAAGCAAGTGGATCGGGAAAACAGGCAAAAAGCCGACATGCCCGCCAAGACCGAGGCAGCATAAAGCCGCTTTATCCTCGACTACGGCTACTTGCATTCTGCCTGGCCACCTCTGAACTCCACTGTGGACGATCTCTTTCATTGGTAATTGGAGCTAATTCGAGGATCATGTCCAGTCAGGAGTCATCGGGCCACCGACAGGTAAGAACCAGGGCCAAGCAGGCTTGTCTCCACTGCAATAAGCGGCGAATCCGCTGCAATGTGCTACAGATGCGCCCATGCCAGAATTGTCTGGCATTGAATGTACCCTGTGAGATAGGCGTTTCAAAGCGAGGAAAGTATGTTTTCACGGTTTCGTCATTATGGTAGTTTGGCGTAGACTGATTCAATGGCTTAGGTATCCCCGTAAGAAGAGTGCTCGGCAACAAACCGACGGCAACTCGGTCCAATTGCCGGCATCATCTGCGAAGGGAGGGAACCATTCATTCACCGTGTCAGCAGGTGATAAATCCGACGCAAAAGAGTCGCATGTTCACCCGATACCAGGGGATGCTGCGAGTGCGCATCCAACAGTGTTCTTTGGTGAATCGAGTCCACTCACTGTAGTGATTGACGAAGGGCGCCGGTCGCCTGAAAAGGGAACTAATGAGATGCATATGACTCGCTTTCATTATGCCATTCCTGAGAAACTTGATGCCTTCAACACCCGTGATGAGGCTTTCCGAGCACACAAGATCAAGCAGGAAGGCCAGCTGAGAGCTGATGGGGCCTTCTCGTACCCGCCGCCAGAGACATGCGAAAC
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种生产衣康酸的黑曲霉菌株、方法及应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> 基因cadA密码子优化后的核苷酸序列(Unknown)
<400> 1
atgaccaaac aatctgcgga cagcaacgca aagtcaggag ttacgtccga aatatgtcat 60
tgggcatcca acctggccac tgacgacatc ccttcggacg tattagaaag agcaaaatac 120
cttattctcg acggtattgc atgtgcctgg gttggtgcaa gagtgccttg gtcagagaag 180
tatgttcagg caacgatgag ctttgagccg ccgggggcct gcagggtgat tggatatgga 240
cagaaactgg ggcctgttgc agcagccatg accaattccg ctttcataca ggctacggag 300
cttgacgact accacagcga agccccccta cactctgcaa gcattgtcct tcctgcggtc 360
tttgcagcaa gtgaggtctt agccgagcag ggcaaaacaa tttccggtat agatgttatt 420
ctagccgcca ttgtggggtt tgaatctggc ccacggatcg gcaaagcaat ctacggatcg 480
gacctcttga acaacggctg gcattgtgga gctgtgtatg gcgctccagc cggtgcgctg 540
gccacaggaa agctcctcgg tctaactcca gactccatgg aagatgctct cggaattgcg 600
tgcacgcaag cctgtggttt aatgtcggcg caatacggag gcatggtaaa gcgtgtgcaa 660
cacggattcg cagcgcgtaa tggtcttctt gggggactgt tggcccatgg tgggtacgag 720
gcaatgaaag gtgtcctgga gagatcttac ggcggtttcc tcaagatgtt caccaagggc 780
aacggcagag agcctcccta caaagaggag gaagtggtgg ctggtctcgg ttcattctgg 840
cataccttta ctattcgcat caagctctat gcctgctgcg gacttgtcca tggtccagtc 900
gaggctatcg aaaaccttca ggggagatac cccgagctct tgaatagagc caacctcagc 960
aacattcgcc atgttcatgt acagctttca acggcctcga acagtcactg tggatggata 1020
ccagaggaga gacccatcag ttcaatcgca gggcagatga gtgtcgcata cattctcgcc 1080
gtccagctgg tcgaccagca atgtcttttg tcccagtttt ctgagtttga tgacaacctg 1140
gagaggccag aagtttggga tctggccagg aaggttactt catctcaaag cgaagagttt 1200
gatcaagacg gcaactgtct cagtgcgggt cgcgtgagga ttgagttcaa cgatggttct 1260
tctattacgg aaagtgtcga gaagcctctt ggtgtcaaag agcccatgcc aaacgaacgg 1320
attctccaca aataccgaac ccttgctggt agcgtgacgg acgaatcccg ggtgaaagag 1380
attgaggatc ttgtcctcgg cctggacagg ctcaccgaca ttagcccatt gctggagctg 1440
ctgaattgcc ccgtgaaatc gccactggta taa 1473
<210> 2
<211> 490
<212> PRT
<213> 基因cadA氨基酸序列(Unknown)
<400> 2
Met Thr Lys Gln Ser Ala Asp Ser Asn Ala Lys Ser Gly Val Thr Ala
1 5 10 15
Glu Ile Cys His Trp Ala Ser Asn Leu Ala Thr Asp Asp Ile Pro Ser
20 25 30
Asp Val Leu Glu Arg Ala Lys Tyr Leu Ile Leu Asp Gly Ile Ala Cys
35 40 45
Ala Trp Val Gly Ala Arg Val Pro Trp Ser Glu Lys Tyr Val Gln Ala
50 55 60
Thr Met Ser Phe Glu Pro Pro Gly Ala Cys Arg Val Ile Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Gln Lys Leu Gly Pro Val Ala Ala Ala Met Thr Asn Ser Ala Phe Ile
85 90 95
Gln Ala Thr Glu Leu Asp Asp Tyr His Ser Glu Ala Pro Leu His Ser
100 105 110
Ala Ser Ile Val Leu Pro Ala Val Phe Ala Ala Ser Glu Val Leu Ala
115 120 125
Glu Gln Gly Lys Thr Ile Ser Gly Ile Asp Val Ile Leu Ala Ala Ile
130 135 140
Val Gly Phe Glu Ser Gly Pro Arg Ile Gly Lys Ala Ile Tyr Gly Ser
145 150 155 160
Asp Leu Leu Asn Asn Gly Trp His Cys Gly Ala Val Tyr Gly Ala Pro
165 170 175
Ala Gly Ala Leu Ala Thr Gly Lys Leu Leu Gly Leu Thr Pro Asp Ser
180 185 190
Met Glu Asp Ala Leu Gly Ile Ala Cys Thr Gln Ala Cys Gly Leu Met
195 200 205
Ser Ala Gln Tyr Gly Gly Met Val Lys Arg Val Gln His Gly Phe Ala
210 215 220
Ala Arg Asn Gly Leu Leu Gly Gly Leu Leu Ala Tyr Gly Gly Tyr Glu
225 230 235 240
Ala Met Lys Gly Val Leu Glu Arg Ser Tyr Gly Gly Phe Leu Lys Met
245 250 255
Phe Thr Lys Gly Asn Gly Arg Glu Pro Pro Tyr Lys Glu Glu Glu Val
260 265 270
Val Ala Gly Leu Gly Ser Phe Trp His Thr Phe Thr Ile Arg Ile Lys
275 280 285
Leu Tyr Ala Cys Cys Gly Leu Val His Gly Pro Val Glu Ala Ile Glu
290 295 300
Lys Leu Gln Arg Arg Tyr Pro Glu Leu Leu Asn Arg Ala Asn Leu Ser
305 310 315 320
Asn Ile Arg His Val Tyr Val Gln Leu Ser Thr Ala Ser Asn Ser His
325 330 335
Cys Gly Trp Ile Pro Glu Glu Arg Pro Ile Ser Ser Ile Ala Gly Gln
340 345 350
Met Ser Val Ala Tyr Ile Leu Ala Val Gln Leu Val Asp Gln Gln Cys
355 360 365
Leu Leu Ala Gln Phe Ser Glu Phe Asp Asp Asn Leu Glu Arg Pro Glu
370 375 380
Val Trp Asp Leu Ala Arg Lys Val Thr Pro Ser His Ser Glu Glu Phe
385 390 395 400
Asp Gln Asp Gly Asn Cys Leu Ser Ala Gly Arg Val Arg Ile Glu Phe
405 410 415
Asn Asp Gly Ser Ser Val Thr Glu Thr Val Glu Lys Pro Leu Gly Val
420 425 430
Lys Glu Pro Met Pro Asn Glu Arg Ile Leu His Lys Tyr Arg Thr Leu
435 440 445
Ala Gly Ser Val Thr Asp Glu Ser Arg Val Lys Glu Ile Glu Asp Leu
450 455 460
Val Leu Ser Leu Asp Arg Leu Thr Asp Ile Thr Pro Leu Leu Glu Leu
465 470 475 480
Leu Asn Cys Pro Val Lys Ser Pro Leu Val
485 490
<210> 3
<211> 906
<212> DNA
<213> 基因mttA密码子优化后的核苷酸序列(Unknown)
<400> 3
atggactcca agattcagac caatgtcccc ctgcccaagg cccccctgat ccaaaaggct 60
agaggcaaga gaaccaaggg catccctgca ctggtagctg gtgcctgtgc tggtgctgtg 120
gagatctcca tcacctaccc ctttgagtct gccaagacta gagctcagct caaaagaaga 180
aatcatgatg tggctgctat caagcctggc atcagaggct ggtatgctgg ctatggtgcc 240
actctggtgg gcaccactgt caaggcctct gtgcagtttg cctccttcaa catttataga 300
tctgcccttt ctgggcctaa tggtgagctg tccactggtg cctctgtcct tgctggcttt 360
ggtgctggtg tcactgaggc tgtccttgct gtcacccctg ctgaggccat caagaccaag 420
atcattgatg ctagaaaggt gggcaatgct gagctgagta ccacctttgg tgccattgct 480
ggcatcttaa gagacagagg ccccctgggc ttcttttctg ctgtgggccc caccatcctg 540
agacagtcct ccaatgctgc tgtcaagttc actgtctaca atgagctgat tggcctggct 600
agaaagtaca gcaagaatgg tgaggatgtc caccccctgg cttccaccct ggtgggctct 660
gtcactggtg tctgctgtgc ctggtccact cagcccctgg atgtcatcaa gactagaatg 720
cagtccctgc aagctagaca gctgtatggc aacaccttca actgtgtcaa gaccctgctg 780
agatctgagg gcattggtgt cttctggtct ggtgtctggt tcagaactgg cagactgtcc 840
ctgacctctg ccatcatgtt ccctgtctat gagaaggtct acaagttcct gactcagccc 900
aactga 906
<210> 4
<211> 301
<212> PRT
<213> 基因mttA氨基酸序列(Unknown)
<400> 4
Met Asp Ser Lys Ile Gln Thr Asn Val Pro Leu Pro Lys Ala Pro Leu
1 5 10 15
Ile Gln Lys Ala Arg Gly Lys Arg Thr Lys Gly Ile Pro Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Ala Cys Ala Gly Ala Val Glu Ile Ser Ile Thr Tyr Pro Phe
35 40 45
Glu Ser Ala Lys Thr Arg Ala Gln Leu Lys Arg Arg Asn His Asp Val
50 55 60
Ala Ala Ile Lys Pro Gly Ile Arg Gly Trp Tyr Ala Gly Tyr Gly Ala
65 70 75 80
Thr Leu Val Gly Thr Thr Val Lys Ala Ser Val Gln Phe Ala Ser Phe
85 90 95
Asn Ile Tyr Arg Ser Ala Leu Ser Gly Pro Asn Gly Glu Leu Ser Thr
100 105 110
Gly Ala Ser Val Leu Ala Gly Phe Gly Ala Gly Val Thr Glu Ala Val
115 120 125
Leu Ala Val Thr Pro Ala Glu Ala Ile Lys Thr Lys Ile Ile Asp Ala
130 135 140
Arg Lys Val Gly Asn Ala Glu Leu Ser Thr Thr Phe Gly Ala Ile Ala
145 150 155 160
Gly Ile Leu Arg Asp Arg Gly Pro Leu Gly Phe Phe Ser Ala Val Gly
165 170 175
Pro Thr Ile Leu Arg Gln Ser Ser Asn Ala Ala Val Lys Phe Thr Val
180 185 190
Tyr Asn Glu Leu Ile Gly Leu Ala Arg Lys Tyr Ser Lys Asn Gly Glu
195 200 205
Asp Val His Pro Leu Ala Ser Thr Leu Val Gly Ser Val Thr Gly Val
210 215 220
Cys Cys Ala Trp Ser Thr Gln Pro Leu Asp Val Ile Lys Thr Arg Met
225 230 235 240
Gln Ser Leu Gln Ala Arg Gln Leu Tyr Gly Asn Thr Phe Asn Cys Val
245 250 255
Lys Thr Leu Leu Arg Ser Glu Gly Ile Gly Val Phe Trp Ser Gly Val
260 265 270
Trp Phe Arg Thr Gly Arg Leu Ser Leu Thr Ser Ala Ile Met Phe Pro
275 280 285
Val Tyr Glu Lys Val Tyr Lys Phe Leu Thr Gln Pro Asn
290 295 300
<210> 5
<211> 1212
<212> DNA
<213> 基因mfsA密码子优化后核苷酸序列(Unknown)
<400> 5
atgggccacg gtgacactga gtccccgaac ccaacgacga ccacggaagg tagcggacaa 60
aacgagccag agaaaaaggg ccgtgatatt ccattatgga gaaaatgtgt cattacgttt 120
gttgttagtt ggatgactct agtcgttact ttctccagta cttgtcttct tcctgccgcc 180
cctgaaatcg cgaatgaatt tgatatgact gtcgagacta tcaacatctc caatgctggt 240
gtcctagttg ccatgggata ttcatccctc atatggggtc ccatgaacaa gttagtcggc 300
cggcggacat catacaatct ggccatttca atgctttgtg catgctccgc tggaacggca 360
gcggcgataa acgaggaaat gttcatagcg ttcagagtgt tgagcggctt aaccggaacc 420
tcgttcatgg tctcaggcca aactgttctt gcagatatct ttgagcctgt ttaccgtggg 480
acggccgtag gtttcttcat ggccgggact ctttctggcc ctgcaatagg cccctgcgtg 540
ggaggggtca tcgtcacttt cacgagttgg cgtgttatct tctggcttca actaggtatg 600
agcgggctgg ggctcgtgct ttctctgcta tttttcccga aaatcgaagg aaattctgag 660
aaggtctcaa cggcgtttaa accgaccaca cttgtcacaa tcatatcgaa attctcccca 720
acggatgtgc tcaagcagtg ggtgtatcca aatgtctttc ttgccgactt atgctgtggc 780
ctcctggcaa tcacgcaata ttcgatcctg acttcagctc gtgccatatt caactcacga 840
tttcatttaa cgactgccct agtatcgggt ctcttctacc tcgctccagg tgccgggttc 900
ctgataggca gtctcgtcgg cggtaaactt tcggatcgca ccgttcggag atacatagta 960
aagcgcggat tccgtctccc tcaggatcga ctccacagcg ggctcatcac attgttcgcc 1020
gtgctgcccg caggaacgct catttacggg tggacactcc aagaggataa gggtgatatg 1080
gtagtgccca taatcgcggc gttcttcgcg ggctgggggc tcatgggcag ttttaactgc 1140
ctgaacactt acgtggctgg tttgttccac accctcattt atctattccc tttgtgtaca 1200
tgcccacaat aa 1212
<210> 6
<211> 403
<212> PRT
<213> 基因mfsA氨基酸序列(Unknown)
<400> 6
Met Gly His Gly Asp Thr Glu Ser Pro Asn Pro Thr Thr Thr Thr Glu
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gln Asn Glu Pro Glu Lys Lys Gly Arg Asp Ile Pro Leu
20 25 30
Trp Arg Lys Cys Val Ile Thr Phe Val Val Ser Trp Met Thr Leu Val
35 40 45
Val Thr Phe Ser Ser Thr Cys Leu Leu Pro Ala Ala Pro Glu Ile Ala
50 55 60
Asn Glu Phe Asp Met Thr Val Glu Thr Ile Asn Ile Ser Asn Ala Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Ala Met Gly Tyr Ser Ser Leu Ile Trp Gly Pro Met Asn
85 90 95
Lys Leu Val Gly Arg Arg Thr Ser Tyr Asn Leu Ala Ile Ser Met Leu
100 105 110
Cys Ala Cys Ser Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ile Asn Glu Glu Met Phe
115 120 125
Ile Ala Phe Arg Val Leu Ser Gly Leu Thr Gly Thr Ser Phe Met Val
130 135 140
Ser Gly Gln Thr Val Leu Ala Asp Ile Phe Glu Pro Val Tyr Arg Gly
145 150 155 160
Thr Ala Val Gly Phe Phe Met Ala Gly Thr Leu Ser Gly Pro Ala Ile
165 170 175
Gly Pro Cys Val Gly Gly Val Ile Val Thr Phe Thr Ser Trp Arg Val
180 185 190
Ile Phe Trp Leu Gln Leu Gly Met Ser Gly Leu Gly Leu Val Leu Ser
195 200 205
Leu Leu Phe Phe Pro Lys Ile Glu Gly Asn Ser Glu Lys Val Ser Thr
210 215 220
Ala Phe Lys Pro Thr Thr Leu Val Thr Ile Ile Ser Lys Phe Ser Pro
225 230 235 240
Thr Asp Val Leu Lys Gln Trp Val Tyr Pro Asn Val Phe Leu Ala Asp
245 250 255
Leu Cys Cys Gly Leu Leu Ala Ile Thr Gln Tyr Ser Ile Leu Thr Ser
260 265 270
Ala Arg Ala Ile Phe Asn Ser Arg Phe His Leu Thr Thr Ala Leu Val
275 280 285
Ser Gly Leu Phe Tyr Leu Ala Pro Gly Ala Gly Phe Leu Ile Gly Ser
290 295 300
Leu Val Gly Gly Lys Leu Ser Asp Arg Thr Val Arg Arg Tyr Ile Val
305 310 315 320
Lys Arg Gly Phe Arg Leu Pro Gln Asp Arg Leu His Ser Gly Leu Ile
325 330 335
Thr Leu Phe Ala Val Leu Pro Ala Gly Thr Leu Ile Tyr Gly Trp Thr
340 345 350
Leu Gln Glu Asp Lys Gly Asp Met Val Val Pro Ile Ile Ala Ala Phe
355 360 365
Phe Ala Gly Trp Gly Leu Met Gly Ser Phe Asn Cys Leu Asn Thr Tyr
370 375 380
Val Ala Gly Leu Phe His Thr Leu Ile Tyr Leu Phe Pro Leu Cys Thr
385 390 395 400
Cys Pro Gln
<210> 7
<211> 1332
<212> DNA
<213> 基因adi1密码子优化后的核苷酸序列(Unknown)
<400> 7
atgctgcacc ccattgacac cacaatatac cgggccggta cttcccgggg actgtacttc 60
ttagcttccg acctgcccgc cgaaccctcc gagcgtgacg ccgccctgat ctccatcatg 120
ggctccggcc accccctgca gatcgacggc atgggcggcg gcaactccct gacctccaag 180
gtcgccatcg tctccgcctc cactcagcgc tccgagttcg acgtcgacta cctgttctgc 240
caagtcggca tcaccgagcg cttcgtcgac accgccccca actgcggcaa tctcatgtcc 300
ggcgtcgcag cgtttgctat cgagcgcggc ctggttcagc cgcacccgtc cgataccaca 360
tgtctggtcc gcatcttcaa cctgaactcc cgccaagcct ccgagctggt catccccgtc 420
tacaacggcc gcgtccacta cgacgacatc gatgacatgc acatgcaacg cccatccgcc 480
cgcgtcggcc tgcgcttcct ggacaccgtc ggctcctgca ccggcaagct gctgcccacc 540
ggcaacgcct ccgactggat cgacggcctg aaggtctcca tcatcgactc cgccgtcccc 600
gtcgtcttca tccggcagca cgacgtgggc ataaccggct ccgaagcccc cgcaaccctg 660
aatgccaaca ccgccctatt ggatcgcctg gaacgcgtgc ggctggaagc cggtcgacgc 720
atgggcttag gcgacgtctc cggcagcgtc gtccccaagc tgtccctgat cggccccggc 780
accgagacca ccaccttcac cgcccgctac tttacaccca aggcctgtca caacgcccat 840
gccgtaacgg gcgccatctg caccgccggc gccgcctaca tcgacggctc cgttgtctgc 900
gagatcctga gctcccgcgc ttccgcctgc tccgcctccc aacgccgcat ctccatcgag 960
cacccatccg gtgtcctgga agtcggcctg gtcccccccg aaaacgccgc tcagagcctg 1020
gtcgacgtcg ccgtcgtcga gcgctccatc gccctgatcg cccacgcccg cgtctattac 1080
actacccccg atcgccgccg ctcgtatgat tctcccctga catccccctc cacccccgcc 1140
gacacccaca acctgttcga cgccgcctac cgccccgtca ttcagccctc cgacaccgat 1200
gtagaggccc cccacatgct ggccctggag aacaaggagc agtgcgtgtc acggtgcgac 1260
accgccctgc atcacatcgt cgcgtcctac ggcgcctccg acgcccacgc ctccgaccgc 1320
tccctgtcct ga 1332
<210> 8
<211> 443
<212> PRT
<213> 基因adi1氨基酸序列(Unknown)
<400> 8
Met Leu His Pro Ile Asp Thr Thr Ile Tyr Arg Ala Gly Thr Ser Arg
1 5 10 15
Gly Leu Tyr Phe Leu Ala Ser Asp Leu Pro Ala Glu Pro Ser Glu Arg
20 25 30
Asp Ala Ala Leu Ile Ser Ile Met Gly Ser Gly His Pro Leu Gln Ile
35 40 45
Asp Gly Met Gly Gly Gly Asn Ser Leu Thr Ser Lys Val Ala Ile Val
50 55 60
Ser Ala Ser Thr Gln Arg Ser Glu Phe Asp Val Asp Tyr Leu Phe Cys
65 70 75 80
Gln Val Gly Ile Thr Glu Arg Phe Val Asp Thr Ala Pro Asn Cys Gly
85 90 95
Asn Leu Met Ser Gly Val Ala Ala Phe Ala Ile Glu Arg Gly Leu Val
100 105 110
Gln Pro His Pro Ser Asp Thr Thr Cys Leu Val Arg Ile Phe Asn Leu
115 120 125
Asn Ser Arg Gln Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Val Tyr Asn Gly Arg
130 135 140
Val His Tyr Asp Asp Ile Asp Asp Met His Met Gln Arg Pro Ser Ala
145 150 155 160
Arg Val Gly Leu Arg Phe Leu Asp Thr Val Gly Ser Cys Thr Gly Lys
165 170 175
Leu Leu Pro Thr Gly Asn Ala Ser Asp Trp Ile Asp Gly Leu Lys Val
180 185 190
Ser Ile Ile Asp Ser Ala Val Pro Val Val Phe Ile Arg Gln His Asp
195 200 205
Val Gly Ile Thr Gly Ser Glu Ala Pro Ala Thr Leu Asn Ala Asn Thr
210 215 220
Ala Leu Leu Asp Arg Leu Glu Arg Val Arg Leu Glu Ala Gly Arg Arg
225 230 235 240
Met Gly Leu Gly Asp Val Ser Gly Ser Val Val Pro Lys Leu Ser Leu
245 250 255
Ile Gly Pro Gly Thr Glu Thr Thr Thr Phe Thr Ala Arg Tyr Phe Thr
260 265 270
Pro Lys Ala Cys His Asn Ala His Ala Val Thr Gly Ala Ile Cys Thr
275 280 285
Ala Gly Ala Ala Tyr Ile Asp Gly Ser Val Val Cys Glu Ile Leu Ser
290 295 300
Ser Arg Ala Ser Ala Cys Ser Ala Ser Gln Arg Arg Ile Ser Ile Glu
305 310 315 320
His Pro Ser Gly Val Leu Glu Val Gly Leu Val Pro Pro Glu Asn Ala
325 330 335
Ala Gln Ser Leu Val Asp Val Ala Val Val Glu Arg Ser Ile Ala Leu
340 345 350
Ile Ala His Ala Arg Val Tyr Tyr Thr Thr Pro Asp Arg Arg Arg Ser
355 360 365
Tyr Asp Ser Pro Leu Thr Ser Pro Ser Thr Pro Ala Asp Thr His Asn
370 375 380
Leu Phe Asp Ala Ala Tyr Arg Pro Val Ile Gln Pro Ser Asp Thr Asp
385 390 395 400
Val Glu Ala Pro His Met Leu Ala Leu Glu Asn Lys Glu Gln Cys Val
405 410 415
Ser Arg Cys Asp Thr Ala Leu His His Ile Val Ala Ser Tyr Gly Ala
420 425 430
Ser Asp Ala His Ala Ser Asp Arg Ser Leu Ser
435 440
<210> 9
<211> 1482
<212> DNA
<213> 基因tad1密码子优化后的核苷酸序列(Unknown)
<400> 9
atggcccccg ccctgaatgc caatcctacc accaagaggg atgagctgtc cgccccctcg 60
gcctcccata aactgggtat gagctccatg gcttcccggg ccgccggtgg ggggctcaag 120
ctcaccggct tgccggatct gtccgactcc gccggcaccc tgtccgacat cttcggcacc 180
cctcagatgc gcgagatctg gtccgatcag aaccgcgtcg cctgctacct ggagatcgag 240
gccgccctgg ccatcgtcca agccgacctg ggcatcatcc ccaagaacgc cgcccacgag 300
atcgtcgagc actgccgcgt ccaagagatc gactgggccc tgtacaagca gaagaccgag 360
ctgatcggct accccgtcct gggcatcgtg cagcagctgg tcgccaactg caaggacggc 420
ctgggcgagt actgccactg gggcgccacc acccaagaca tcaccgacac cgccaccgtc 480
atgcagatcc ggcagtccct gaccctggtc aaacagcggc tggattctat cgtctcctcc 540
ctggagcacc tggccgagca gcaccgcaac gtccccatgg ccgcccgctc caacctgaag 600
caagccgtcc ccatcacctt cggcttcaag atggcccgct tcctggccac cttccgccgc 660
catcagcagc gcctggtgga gctcgagaaa cgcgtctaca ccttagagtt cggcggcgcg 720
gccggcaatt tgtcctccct aggcgatcaa ggcatcgcca cccacgacgc cctggccaag 780
atgctggacc tggcccccgc cgagatcgcc tggcacaccg agcatgaccg cttcgcagag 840
gtcggaacct tcttgggcct gctgaccggc accctggcca agctggccac cgacatcaag 900
ctgatgtctc agaccgaggt aggcgaggtc ggcgagccct tcatctccaa ccgcggctcc 960
tcctccacca tgcctcagaa gaacaacccc atctcctgcg tttatatcca cgcctgcgca 1020
gccaacgttc gccaaggcgc cgccgccctg ctggatgcga tgcagtccga tcacgaacgc 1080
ggcaccggac cctgggagat catctgggtg cagctgcccc tgatgatgaa ctggacctcc 1140
gccgccctga acaacgccga cttcgtcctg cgcggcctgc aagtcttccc cgatgcgatg 1200
caacataatc tggacctgtc caagggcctg atcgtctccg aggccgtcat gatgggccta 1260
ggcaacaccc tgggccggca gtacgcccac gacgccgtct acgagtgctg ccgcaccgcc 1320
ttcgtccaag accgccccct cctggacgtc ctgctggaga accacgagat cgcctccaag 1380
ctggaccgca ccgaactgga gaagctgtgc gaccccgcca actacctggg tcagtgctct 1440
cagtggatcg accgcgtcct gtcccgcccc tcctccgcct ga 1482
<210> 10
<211> 493
<212> PRT
<213> 基因tad1氨基酸序列(Unknown)
<400> 10
Met Ala Pro Ala Leu Asn Ala Asn Pro Thr Thr Lys Arg Asp Glu Leu
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ser Ala Ser His Lys Leu Gly Met Ser Ser Met Ala Ser
20 25 30
Arg Ala Ala Gly Gly Gly Leu Lys Leu Thr Gly Leu Pro Asp Leu Ser
35 40 45
Asp Ser Ala Gly Thr Leu Ser Asp Ile Phe Gly Thr Pro Gln Met Arg
50 55 60
Glu Ile Trp Ser Asp Gln Asn Arg Val Ala Cys Tyr Leu Glu Ile Glu
65 70 75 80
Ala Ala Leu Ala Ile Val Gln Ala Asp Leu Gly Ile Ile Pro Lys Asn
85 90 95
Ala Ala His Glu Ile Val Glu His Cys Arg Val Gln Glu Ile Asp Trp
100 105 110
Ala Leu Tyr Lys Gln Lys Thr Glu Leu Ile Gly Tyr Pro Val Leu Gly
115 120 125
Ile Val Gln Gln Leu Val Ala Asn Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr
130 135 140
Cys His Trp Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ile Thr Asp Thr Ala Thr Val
145 150 155 160
Met Gln Ile Arg Gln Ser Leu Thr Leu Val Lys Gln Arg Leu Asp Ser
165 170 175
Ile Val Ser Ser Leu Glu His Leu Ala Glu Gln His Arg Asn Val Pro
180 185 190
Met Ala Ala Arg Ser Asn Leu Lys Gln Ala Val Pro Ile Thr Phe Gly
195 200 205
Phe Lys Met Ala Arg Phe Leu Ala Thr Phe Arg Arg His Gln Gln Arg
210 215 220
Leu Val Glu Leu Glu Lys Arg Val Tyr Thr Leu Glu Phe Gly Gly Ala
225 230 235 240
Ala Gly Asn Leu Ser Ser Leu Gly Asp Gln Gly Ile Ala Thr His Asp
245 250 255
Ala Leu Ala Lys Met Leu Asp Leu Ala Pro Ala Glu Ile Ala Trp His
260 265 270
Thr Glu His Asp Arg Phe Ala Glu Val Gly Thr Phe Leu Gly Leu Leu
275 280 285
Thr Gly Thr Leu Ala Lys Leu Ala Thr Asp Ile Lys Leu Met Ser Gln
290 295 300
Thr Glu Val Gly Glu Val Gly Glu Pro Phe Ile Ser Asn Arg Gly Ser
305 310 315 320
Ser Ser Thr Met Pro Gln Lys Asn Asn Pro Ile Ser Cys Val Tyr Ile
325 330 335
His Ala Cys Ala Ala Asn Val Arg Gln Gly Ala Ala Ala Leu Leu Asp
340 345 350
Ala Met Gln Ser Asp His Glu Arg Gly Thr Gly Pro Trp Glu Ile Ile
355 360 365
Trp Val Gln Leu Pro Leu Met Met Asn Trp Thr Ser Ala Ala Leu Asn
370 375 380
Asn Ala Asp Phe Val Leu Arg Gly Leu Gln Val Phe Pro Asp Ala Met
385 390 395 400
Gln His Asn Leu Asp Leu Ser Lys Gly Leu Ile Val Ser Glu Ala Val
405 410 415
Met Met Gly Leu Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gln Tyr Ala His Asp Ala
420 425 430
Val Tyr Glu Cys Cys Arg Thr Ala Phe Val Gln Asp Arg Pro Leu Leu
435 440 445
Asp Val Leu Leu Glu Asn His Glu Ile Ala Ser Lys Leu Asp Arg Thr
450 455 460
Glu Leu Glu Lys Leu Cys Asp Pro Ala Asn Tyr Leu Gly Gln Cys Ser
465 470 475 480
Gln Trp Ile Asp Arg Val Leu Ser Arg Pro Ser Ser Ala
485 490
<210> 11
<211> 1476
<212> DNA
<213> 基因itp1密码子优化后的核苷酸序列(Unknown)
<400> 11
atggaccaag ccgatcattc cggcgtccca gacgacgctg cgctcgagga ggcgcccaat 60
acagtaccga ttcaagaaaa gagcgcacag cctcacgaca cgcagccgta ctgtgcattc 120
acgaagcggt ccaagctgtt tatcgtcctc accgtctctc ttgccggctt tttttcgccg 180
tttgccatca acatttacat ccctgccctg ccccagatcg ccggtatgct gcatacctct 240
gaagccgcta ccaacgtcac ggtgaccgtc tacatgattg cacagggact ttcaccggtt 300
atctgggctc ctctctcgga tgtgtttggg cgccgaccga tctacatctt gacgtttttc 360
atctttttca ttgccaacct cgggctgtcg ttcaccaacg tctactggct cttggtggtg 420
ctgcgtatgg tgcaggctgc aggcgcgtgc agtgcgattg cgattggcgc tggtacgatt 480
ggcgacgtta ctgagcgcaa ggaacgagga agttacatgg gctactatgc gcttgcgcaa 540
tacacgggcc ccgccatcgg accggttgtc ggtggcgcgc tttcgcagag atgggactac 600
catgctacgt ttttcttctt gacggcgatc tcgggtccgt ttttgttgtt catgcttctc 660
tttctcgttg aaacgcttcg agtcattgtt ggcaacggca gtgcaaaaac gtcgggcatc 720
tatcgcccct tggtggagcc caagctgcaa cgctcgatcg ccaatgcgcc tcggcctggc 780
atcaagaacc cactgcatgg cacgctcgat ttcggcttcc accgtccgtt tttggtgttt 840
gcgcgccccg agaccagcct agccatcctg gctttttcga tggtatatgc gagctactac 900
ttgtcatctg gttcgctgcc gtatctgttc aagcaggtgt acggtctgga cgagctcctg 960
atcggcgtat gctttgttcc gagcggtgtg gggtgtgcgg tgggcacagt gctcgccggc 1020
aagatcctcg actgggacta tcgtcgtgcg ttggacaaga gcaagcttgg tgtcaaggtg 1080
acgcgcgcaa ggttgcagtc ggcgtggatc tacctgccgt gctactgcgc ttcgcttctg 1140
gcgtacggat ggtgtgttcg tgcgcatacg catatcgccg ctccgatcgt gtttcagttt 1200
acactgggca tgttttcgac catgtacttt accaatgtca atacgctcat tgtcgacctg 1260
tatcctggca aagcggccag cgcaaccgca gcggtcaacg tcggacggtg cttgctcggc 1320
gcagtagcag tcgccgtggt ccagcccatg atcgacgcaa tgggcgccgg ctggactttt 1380
acgctcggcg cactactcac actgatcgtc ggtctcatct gccaagttct catctacctc 1440
tacggcgaaa tgtgggcagc tcgcaaacac tcgtga 1476
<210> 12
<211> 491
<212> PRT
<213> 基因itp1氨基酸序列(Unknown)
<400> 12
Met Asp Gln Ala Asp His Ser Gly Val Pro Asp Asp Ala Ala Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Pro Asn Thr Val Pro Ile Gln Glu Lys Ser Ala Gln Pro His
20 25 30
Asp Thr Gln Pro Tyr Cys Ala Phe Thr Lys Arg Ser Lys Leu Phe Ile
35 40 45
Val Leu Thr Val Ser Leu Ala Gly Phe Phe Ser Pro Phe Ala Ile Asn
50 55 60
Ile Tyr Ile Pro Ala Leu Pro Gln Ile Ala Gly Met Leu His Thr Ser
65 70 75 80
Glu Ala Ala Thr Asn Val Thr Val Thr Val Tyr Met Ile Ala Gln Gly
85 90 95
Leu Ser Pro Val Ile Trp Ala Pro Leu Ser Asp Val Phe Gly Arg Arg
100 105 110
Pro Ile Tyr Ile Leu Thr Phe Phe Ile Phe Phe Ile Ala Asn Leu Gly
115 120 125
Leu Ser Phe Thr Asn Val Tyr Trp Leu Leu Val Val Leu Arg Met Val
130 135 140
Gln Ala Ala Gly Ala Cys Ser Ala Ile Ala Ile Gly Ala Gly Thr Ile
145 150 155 160
Gly Asp Val Thr Glu Arg Lys Glu Arg Gly Ser Tyr Met Gly Tyr Tyr
165 170 175
Ala Leu Ala Gln Tyr Thr Gly Pro Ala Ile Gly Pro Val Val Gly Gly
180 185 190
Ala Leu Ser Gln Arg Trp Asp Tyr His Ala Thr Phe Phe Phe Leu Thr
195 200 205
Ala Ile Ser Gly Pro Phe Leu Leu Phe Met Leu Leu Phe Leu Val Glu
210 215 220
Thr Leu Arg Val Ile Val Gly Asn Gly Ser Ala Lys Thr Ser Gly Ile
225 230 235 240
Tyr Arg Pro Leu Val Glu Pro Lys Leu Gln Arg Ser Ile Ala Asn Ala
245 250 255
Pro Arg Pro Gly Ile Lys Asn Pro Leu His Gly Thr Leu Asp Phe Gly
260 265 270
Phe His Arg Pro Phe Leu Val Phe Ala Arg Pro Glu Thr Ser Leu Ala
275 280 285
Ile Leu Ala Phe Ser Met Val Tyr Ala Ser Tyr Tyr Leu Ser Ser Gly
290 295 300
Ser Leu Pro Tyr Leu Phe Lys Gln Val Tyr Gly Leu Asp Glu Leu Leu
305 310 315 320
Ile Gly Val Cys Phe Val Pro Ser Gly Val Gly Cys Ala Val Gly Thr
325 330 335
Val Leu Ala Gly Lys Ile Leu Asp Trp Asp Tyr Arg Arg Ala Leu Asp
340 345 350
Lys Ser Lys Leu Gly Val Lys Val Thr Arg Ala Arg Leu Gln Ser Ala
355 360 365
Trp Ile Tyr Leu Pro Cys Tyr Cys Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Trp
370 375 380
Cys Val Arg Ala His Thr His Ile Ala Ala Pro Ile Val Phe Gln Phe
385 390 395 400
Thr Leu Gly Met Phe Ser Thr Met Tyr Phe Thr Asn Val Asn Thr Leu
405 410 415
Ile Val Asp Leu Tyr Pro Gly Lys Ala Ala Ser Ala Thr Ala Ala Val
420 425 430
Asn Val Gly Arg Cys Leu Leu Gly Ala Val Ala Val Ala Val Val Gln
435 440 445
Pro Met Ile Asp Ala Met Gly Ala Gly Trp Thr Phe Thr Leu Gly Ala
450 455 460
Leu Leu Thr Leu Ile Val Gly Leu Ile Cys Gln Val Leu Ile Tyr Leu
465 470 475 480
Tyr Gly Glu Met Trp Ala Ala Arg Lys His Ser
485 490
<210> 13
<211> 875
<212> DNA
<213> 基因ictA上游同源臂的核苷酸序列(Unknown)
<400> 13
gatgatcgtc aagcgagttc cctggacgat gccgtcctcc ccgatggaac agccattatc 60
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gtgtgacctt cccgtcttta agtagtatag cttcacaatt gggggttaag gctgcttgtg 180
tcccttgtaa gtgaccgaca tcagcaatgg ccgttatgac gaccctccgg tatttggtcg 240
catacgaggt gcagtagtac agcatattag accaaaagcc tccagggtgc ttgcattggg 300
atgaacatcg tccaggatca cctccggcgg tatccagcag gtgttcagcc gaatagcccc 360
gtggctgtat ttggcaggga gtatccttgt cggtttgcat ataggtagct gtctagaact 420
tgtgagttcg agctgcgcag ttatatgggt gatcgttttc caagtggcat gctagcgacg 480
tggctggaat aagctatggt caccaggcct catagcacat tgctccttcg taatgcggca 540
attcaattcc tatataacct ttctaaagcc ctcgctacga tcagaaataa gcaggccgtg 600
attgaattct ggtagtagac cttatgcgac cgcgcgaaat tagtaaccga atcattgatg 660
gattgactgc gagatggaga ttccagtatc attcctacaa ccatgctcaa gctgggaaaa 720
gctgtgaatg aacaattagc agaagatagg ccgtgatcaa gccttgagat gcaatgaata 780
gcaaaaatgt ttcaatacct gctatcacaa tctttgcaga cagattgtta ctagggtgga 840
aggatatcta gttctttggg aacaacacac tttgc 875
<210> 14
<211> 896
<212> DNA
<213> 基因ictA下游同源臂的核苷酸序列(Unknown)
<400> 14
aatccaattc aggcaaccta cccctgctgc ccctaatatc accccgcgac ggtatccagc 60
gtaaagtgaa tatcggcgca atatacccat cgccgaagca agtggatcgg gaaaacaggc 120
aaaaagccga catgcccgcc aagaccgagg cagcataaag ccgctttatc ctcgactacg 180
gctacttgca ttctgcctgg ccacctctga actccactgt ggacgatctc tttcattggt 240
aattggagct aattcgagga tcatgtccag tcaggagtca tcgggccacc gacaggtaag 300
aaccagggcc aagcaggctt gtctccactg caataagcgg cgaatccgct gcaatgtgct 360
acagatgcgc ccatgccaga attgtctggc attgaatgta ccctgtgaga taggcgtttc 420
aaagcgagga aagtatgttt tcacggtttc gtcattatgg tagtttggcg tagactgatt 480
caatggctta ggtatccccg taagaagagt gctcggcaac aaaccgacgg caactcggtc 540
caattgccgg catcatctgc gaagggaggg aaccattcat tcaccgtgtc agcaggtgat 600
aaatccgacg caaaagagtc gcatgttcac ccgataccag gggatgctgc gagtgcgcat 660
ccaacagtgt tctttggtga atcgagtcca ctcactgtag tgattgacga agggcgccgg 720
tcgcctgaaa agggaactaa tgagatgcat atgactcgct ttcattatgc cattcctgag 780
aaacttgatg ccttcaacac ccgtgatgag gctttccgag cacacaagat caagcaggaa 840
ggccagctga gagctgatgg ggccttctcg tacccgccgc cagagacatg cgaaac 896
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> Primer 1(Unknown)
<400> 15
atggaattcg agctcggtac catgaccaaa caatctgcgg ac 42
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> Primer 2(Unknown)
<400> 16
agtggatccc tgcagggtac cttataccag tggcgatttc acg 43
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> Primer 3(Unknown)
<400> 17
taaacaatgg aattcgaatt catggactcc aagattcaga cc 42
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> Primer 4(Unknown)
<400> 18
tgcagggtac cgagctcggt acctcagttg ggctgagtca gg 42
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> Primer 5(Unknown)
<400> 19
taaacaatgg aattcgagct catgggccac ggtgacact 39
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> Primer 6(Unknown)
<400> 20
tccctgcagg gtaccgagct cttattgtgg gcatgtacac aa 42
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> Primer 7(Unknown)
<400> 21
atggaattcg agctcggtac catgctgcac cccattgac 39
<210> 22
<211> 39
<212> DNA
<213> Primer 8(Unknown)
<400> 22
tcagtaacgt taagtggatc ctcaggacag ggagcggtc 39
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> Primer 9(Unknown)
<400> 23
tcatccgtca agatggaatt catggccccc gccctgaat 39
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> Primer 10(Unknown)
<400> 24
tccagatctc tgcagggtac ctcaggcgga ggaggggcg 39
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> Primer 11(Unknown)
<400> 25
gctatacgaa gttataagct tgagactagt ggactaacat tat 43
<210> 26
<211> 43
<212> DNA
<213> Primer 12(Unknown)
<400> 26
acgacggcca gtgccaagct tgtctagaaa gaaggattac ctc 43
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> Primer 13(Unknown)
<400> 27
tcatccgtca agatggaatt catggaccaa gccgatcact c 41
<210> 28
<211> 39
<212> DNA
<213> Primer 14(Unknown)
<400> 28
tctctgcagg gtaccgagct ctcaggagtg cttgcgggc 39
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> Primer 15(Unknown)
<400> 29
cccagaattc aattcgagct cgatgatcgt caagcgagtt c 41
<210> 30
<211> 40
<212> DNA
<213> Primer 16(Unknown)
<400> 30
attatacgaa gttatggatc cgcaaagtgt gttgttccca 40
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> Primer 17(Unknown)
<400> 31
cgaagttatt ctagaactag taatccaatt caggcaacct ac 42
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> Primer 18(Unknown)
<400> 32
tgcctgcagg ggcccactag tgtttcgcat gtctctggc 39

Claims (10)

1.一种生产衣康酸的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株，其特征在于：所述菌株是在出发黑曲霉中同时或单独强化表达顺乌头酸脱羧酶基因cadA、线粒体三羧酸转运蛋白编码基因mttA和一个超家族转运蛋白编码基因mfsA获得的。
2.根据权利要求1所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述顺乌头酸脱羧酶基因cadA的DNA序列为SEQ ID NO.1以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQID NO.2以及相似性80％以上的氨基酸序列；
或者，所述线粒体三羧酸转运蛋白编码基因mttA的DNA序列为SEQ ID NO.3以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4以及相似性80％以上的氨基酸序列。
或者，所述超家族转运蛋白编码基因mfsA的DNA序列为SEQ ID NO.5以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.6以及相似性80％以上的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：单独或者组合强化表达玉米黑粉菌胞质乌头酸-D-异构酶基因adi1、反式-乌头酸脱羧酶基因tad1和衣康酸转运蛋白编码基因itp1。
4.根据权利要求3所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述玉米黑粉菌胞质乌头酸-D-异构酶基因adi1的DNA序列为SEQ ID NO.7以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.8以及相似性80％以上的氨基酸序列；
或者，所述反式-乌头酸脱羧酶基因tad1的DNA序列为SEQ ID NO.9以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.10以及相似性80％以上的氨基酸序列；
或者，所述衣康酸转运蛋白编码基因itp1的DNA序列为SEQ ID NO.11以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.12以及相似性80％以上的氨基酸序列。
5.根据权利要求3或4所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：敲除衣康酰辅酶A转移酶基因ictA。
6.根据权利要求5所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述敲除衣康酰辅酶A转移酶基因ictA的DNA序列为SEQ ID NO.13以及相似性70％以上的DNA序列，其氨基酸序列为SEQ ID NO.14以及相似性80％以上的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6任一项所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株，其特征在于：所述出发黑曲霉菌株的编号为S575；
或者，所述控制基因强化表达的启动子为黑曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA，丙酮酸激酶基因启动子PpkiA，黑曲霉乙醇脱氢酶基因启动子PadhA，泡盛曲霉和黑曲霉谷氨酸脱氢酶基因启动子PgdhA，构巢曲霉ATP合成酶基因启动子PoliC，米曲霉磷酸甘油酸激酶基因启动子PpgkA，构巢曲霉磷酸丙糖异构酶基因启动子PtpiA，黑曲霉多蛋白桥接因子1启动子PmbfA,黑曲霉苹果酸脱氢酶基因PmdhA，黑曲霉细胞色素c氧化酶亚基4启动子PcoxA，黑曲霉蛋白质sip5启动子PsrpB。
8.如权利要求1至7任一项所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株在生产衣康酸中的应用。
9.利用如权利要求1至7任一项所述的生产衣康酸的黑曲霉菌株发酵高产衣康酸的方法，其特征在于：步骤如下：
首先，将黑曲霉菌株接种在PDA培养平板上，在0～28℃培养0～10天，直至产生分生孢子；然后，将孢子接种至衣康酸发酵培养基中，孢子的终浓度为1×104～2×106个孢子/mL，在0～40℃、0～300rpm条件下发酵0～15天，可得衣康酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述衣康酸发酵培养基的具体成分为：0～200g/L葡萄糖，0～5g/L柠檬酸钠×2H2O，0～10g/LKH2PO4，0～5g/LNH4NO3，0～2g/LMgSO4×7H2O，0～2g/L CaCl2×H2O，0～2g/L柠檬酸×H2O，0～2g/LZnSO4×7H2O，0～1g/LFe(NH4)2(SO4)2×7H2O，0～1mg/L CuSO4×5H2O，0～1mg/L MnSO4×H2O，0～2mg/L H3BO3，0～2g/LNa2MoO4×2H2O，0～2mg/L生物素和0～400g/L吗啉乙磺酸，初始pH＝2～8；
或者，所述发酵的条件为：35℃，250rpm条件下，发酵第6天，衣康酸滴度达到20g/L，糖酸转化率为0.34mol/mol。
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