CN114686508A - 一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产l-苹果酸的方法 - Google Patents

一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产l-苹果酸的方法 Download PDF

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Abstract

一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L‑苹果酸的方法，涉及生物工程技术领域，步骤包括：S1，上调谷氨酸棒杆菌胞内四碳二羧酸转运蛋白的表达水平，得到重组谷氨酸棒杆菌；S2，将所述重组谷氨酸棒杆菌进行发酵，生产L‑苹果酸。本发明的一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L‑苹果酸的方法，通过上调胞内四碳二羧酸转运蛋白水平，促进胞内积累的苹果酸转运出胞，解除胞内高浓度苹果酸对菌株生长的影响和形成的底物反馈抑制，进而提高发酵法生产L‑苹果酸的产量。

Description

一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的 方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法。
背景技术
苹果酸又名2-羟基丁二酸，是一种四碳二羧酸，其分子式为C4H6O5。L-苹果酸因其优良的特性和口感，被广泛用于食品、医药和化工等领域。目前苹果酸的合成主要有化学合成法、酶法和发酵法，存在产量低、成本高、选择性差等问题。由于D型、DL-型苹果酸的部分生理毒性，美国FDA限制D型、DL-型苹果酸用于食品、医药；通过微生物发酵法可以获得单一的L-苹果酸。谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)是经典的食品性安全菌，随着C.glutamicumATCC13032全基因组测序的完成及其遗传操作系统的完善，都为利用代谢工程手段对其进行定向改造提供了有利条件，使得C.glutamicum ATCC13032作为细胞工厂，越来越广泛地应用于化学品的生物制造。C.glutamicum在厌氧条件下，通过还原型TCA循环，葡萄糖通过磷酸烯醇式丙酮酸、草酰乙酸、最终还原成L-苹果酸，该途径的糖酸转化率的理论值最大为200％，是目前所有已知L-苹果酸合成途径中最高的。
但是野生型C.glutamicum胞内不积累苹果酸，经遗传改造后的工程菌株，经发酵后胞内形成苹果酸积累，高浓度的苹果酸在一方面形成底物反馈抑制进而影响苹果酸的持续合成，另一方面胞内高浓度苹果酸不利于菌株生长；因此，需要将胞内积累的苹果酸及时转运至胞外。赵一等利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的苹果酸转运蛋白酶编码基因(transb)置换苹果酸醌氧化还原酶编码基因(mqo)以及协同苹果酸酶编码基因(male)、丙酮酸醌氧化还原酶编码基因(pqo)，丙酮酸脱氢酶编码基因(pdh)和乳酸脱氢酶编码基因(lldh)的敲除，发酵后上清液中L-苹果酸增加12.8g/L，其基因改造的位点偏多，制备工艺复杂，而且产量偏低。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，通过上调胞内四碳二羧酸转运蛋白水平，促进胞内积累的苹果酸转运出胞，解除胞内高浓度苹果酸对菌株生长的影响和形成的底物反馈抑制，进而提高发酵法生产L-苹果酸的产量。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，步骤包括：
S1，上调谷氨酸棒杆菌胞内四碳二羧酸转运蛋白的表达水平，得到重组谷氨酸棒杆菌；
S2，将所述重组谷氨酸棒杆菌进行发酵，生产L-苹果酸。发酵在有氧或厌氧条件下均可实现；优选地，所述发酵为厌氧发酵，有利于通过还原型TCA循环，进一步提高L-苹果酸的产量。
进一步地，步骤S1中，所述重组谷氨酸棒杆菌的改造方法包括以下的任一种或两种以上：
1)在谷氨酸棒杆菌中异源过表达四碳二羧酸转运蛋白DcuC；
2)在谷氨酸棒杆菌中异源过表达Na+/H+-二羧酸协同蛋白Sdas；
3)通过在谷氨酸棒杆菌的Sdas基因上游敲入gape强启动子以上调内源蛋白Sdas水平。
进一步地，步骤S1中，所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)获得目的DNA片段；所述目的DNA片段包括DcuC基因、Sdas基因和gape强启动子中的一种或两种以上；
(2)将所述目的DNA片段与酶切后的载体连接，构建重组质粒；
(3)将所述重组质粒电转至谷氨酸棒杆菌，得到重组谷氨酸棒杆菌。
进一步地，所述DcuC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述Sdas基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述gape启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步地，所述目的DNA片段包括DcuC基因和/或Sdas基因时，以pEC-XK99E为表达载体，得到重组质粒pEC-XK99E-Sdas和/或重组质粒pEC-XK99E-Sdas。
进一步地，所述目的DNA片段包括gape强启动子时，以pK19mobsacB载体构建启动子敲入载体，得到重组质粒pK19-gape。
进一步地，步骤S2中，所述重组谷氨酸棒杆菌的发酵方法包括：将重组谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基中种子培养，然后取种子液转送至发酵培养基中发酵，收集纯化，得到L-苹果酸。
进一步地，发酵的条件为：温度28-32℃，发酵24h以内的摇瓶速率为180-220rpm，发酵24h以上的摇瓶速率为80-100rpm。
进一步地，重组谷氨酸棒杆菌在发酵培养基中发酵至18-22h时，加入IPTG进行诱导培养。
进一步地，所述发酵培养基包括以下组分：(NH4)2SO4 18-22g/L、MOPES38-42g/L、尿素3-7g/L、KH2PO4 0.8-1.2g/L、K2HPO4 0.8-1.2g/L、Glucose38-42g/L、生物素0.01-0.05mg/L、原儿茶酸0.01-0.05mg/L、MgSO4·7H2O0.1-0.4g/L、CuSO4 0.1-0.3mg/L、CaCl28-12mg/L、FeSO4·7H2O 8-12mg/L、ZnSO4·7H2O 0.5-1.5mg/L、MnSO4·7H2O 8-12mg/L、NiCl2·6H2O 0.01-0.03mg/L。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明的一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，通过上调胞内四碳二羧酸转运蛋白水平，促进胞内积累的苹果酸转运出胞，解除胞内高浓度苹果酸对菌株生长的影响和形成的底物反馈抑制，进而提高发酵法生产L-苹果酸的产量。
进一步地，上调胞内四碳二羧酸转运蛋白水平手段包括以下至少一种：1)在谷氨酸棒杆菌中异源过表达四碳二羧酸转运蛋白DcuC；2)在谷氨酸棒杆菌中异源过表达Na+/H+-二羧酸协同蛋白Sdas；3)通过在谷氨酸棒杆菌的Sdas基因上游敲入gape强启动子以上调内源Sdas蛋白水平。通过过表达Sdas、DcuC或敲入gape强启动子得到重组菌株，有助于L-苹果酸的转运，进而提高发酵法生产L-苹果酸的产量。
附图说明
图1为本发明实施例3中重组菌株C11的验证图；其中，M：2000Plus DNA Marker；lane 1：重组1号菌扩增片段1316bp；lane 2：重组2号菌扩增片段1023bp；lane 3：重组3号菌扩增片段1023bp；
图2为本发明实施例3中重组菌株C10-Sdas的验证图；其中，M2：DL15000DNAMarker；lane 1：重组子pEC-Sdas；lane 2：重组子pEC-Sdas BamH I单酶切，大片段7018bp为载体和小片段1341bp为Sdas基因；lane 3：重组子pEC-Sdas PCR扩增Sdas结果，大小为1341bp；
图3为本发明实施例3中重组菌株C10-DcuC的验证图；其中，M2：DL15000DNAMarker；lane 1：重组子pEC-DcuC；lane 2：重组子pEC-DcuC BamH I单酶切，大片段7018bp为载体和小片段1386bp为DcuC基因；lane 3：重组子pEC-DcuC PCR扩增DcuC结果，大小为1386bp；
图4为本发明实施例4中各重组菌株发酵培养生长情况图；
图5为本发明实施例5中各重组菌株发酵培养后上清中L-苹果酸的含量图；
图6为本发明实施例5中各重组菌株发酵培养产有机酸的含量图；
图7为本发明谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的流程图。
具体实施方式
下面，结合附图与具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
强启动子gape敲入质粒的构建
所述重组谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032；通过蛋白序列号cg2870在NCBI网站上获取C.glutamicum ATCC13032的Sdas基因序列，如、E.coli MG1655的Dcuc基因序列、以及C.glutamicum的gape启动子序列；其中，所述DcuC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述Sdas基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述gape启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
以C.glutamicum ATCC 13032菌株的基因组DNA为模板，分别扩增Sdas基因用于同源重组的上游同源臂LA 515bp；gape启动子DNA片段293bp；Sdas基因用于同源重组的下游同源臂RA 508bp。利用Soeing-PCR技术获得LA-gape-RA融合片段1316bp，将融合片段克隆至载体pK19mobSacB，敲入强启动子gape的重组质粒pK19-gape。
实施例2
基因过表达载体的构建
分别以C.glutamicum ATCC3032菌株和E.coli MG1655菌株的基因组DNA为模板，扩增Sdas基因1341bp、DcuC基因1386bp，并克隆至pEC-XK99E载体，构建重组质粒重组质粒pEC-XK99E-Sdas和重组质粒pEC-XK99E-DcuC。
Sdas基因和DcuC基因的PCR扩增引物如表1所示。
表1
Figure BDA0003533090170000061
其中，USdas01和USdas02为上调Sdas上游片段合成引物对；Pg-Sdas01和Pg-Sdas02为上调Sdas中游片段PCR引物对；USdas03和USdas04为上调Sdas下游片段PCR引物对；PSdasB1F和PSdasB2R为过表达Sdas的SdasDNA pcr引物对；PDcuCB1F和PDcuCB2R为过表达DcuC的DcuC DNA PCR引物对。
实施例3
目的重组菌株的构建
1、通过重组质粒pK19-gape构建重组菌株
(1)取C.glutamicum ATCC3032菌株记为菌株C10，将重组质粒pK19-gape电转至菌株C10中，涂布无抗性LB平板。
(2)挑取平板上单菌落对点LBG平板(含有蔗糖10％，卡那霉素Kan 50μg/mL)，以及LB平板(卡那霉素Kan 50μg/mL)，30℃培养。
(3)选取在LBG平板上不长或较小的菌落，而在对应的只含有卡那霉素的LB平板上长势良好，菌落较大的菌落挑取至无抗的LB液体培养基中，30℃，190rpm/min进行过夜培养。
(4)将上述菌液转接至含10％蔗糖的培养基中，过夜培养后，将培养菌液稀释10万倍，然后取100μl涂布于无抗的LBG平板，30℃培养。
(5)挑取平板上的单菌落对点至含有蔗糖的平板和含有卡那霉素的平板，置于30℃培养。选取在含有卡那霉素的LB平板上不生长或长势不好而在对点的含有蔗糖的LB平板上长势良好的菌落接至LB液体培养基中进行培养，并进行菌液PCR检测。
(6)挑取PCR检测初步正确的单菌落接种至含有卡那霉素的LB液体培养基中进行培养，观察是否有菌体长出，以验证抗性是否消除，获得目标菌株C11。
2、通过重组质粒pEC-Sdas和重组质粒pEC-Dcuc构建重组菌株
同理，将重组质粒pEC-Sdas和重组质粒pEC-Dcuc电转至菌株C10的感受态中，通过卡纳抗性筛选出目标菌株C10-Sdas、C10-DcuC。
如图1-3所示，通过基因片段跑胶鉴定出目标菌株C11、C10-Sdas、C10-DcuC构建成功。
实施例4
重组菌株的生长表达
将菌株C10、C11、C10-DcuC、C10-Sdas进行限氧发酵；
具体步骤为：将菌株C10、C11、C10-DcuC、C10-Sdas接种于种子培养基中种子培养，然后取种子液转送至发酵培养基中限氧发酵，收集纯化，得到L-苹果酸。
限氧发酵的条件为：接取培养15h的种子培养液至发酵培养基，接种量控制初始OD600＝0.4，温度30℃，发酵24h以内的摇瓶速率为200rpm，发酵24h以上的摇瓶速率为90rpm，培养72h，其中过表达重组菌株(C10-DcuC、C10-Sdas)需继续发酵培养20h后添加IPTG进行诱导培养。
其中，1)菌体浓度测定：将发酵液稀释一定倍数，利用紫外分光光度计测定OD600处的值。
2)种子培养基：Tryptone 32g/L，Yeast 20g/L，氯化钠10g/L，葡萄糖40g/L。种子培养：从新鲜的平板上接一环菌接到种子培养基(50mL)，30℃，200r/min培养15h。
3)发酵培养基：(NH4)2SO4 20g/L、MOPES 40g/L、尿素5g/L、KH2PO41g/L、K2HPO4 1g/L、Glucose 40g/L、生物素0.03mg/L、原儿茶酸0.03mg/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CuSO40.2mg/L、CaCl2 10mg/L、FeSO4·7H2O 10mg/L、ZnSO4·7H2O 1mg/L、MnSO4·7H2O 10mg/L、NiCl2·6H2O 0.02mg/L。
如图4所示，通过测定各株重组菌株的生物量，检测重组菌株的生长情况，结果表明：重组菌株(C11、C10-DcuC、C10-Sdas)的生物量与对照菌株(C10)相比，无明显差异。
实施例5
重组菌株产有机酸情况检测
将工程菌株C10、C11、C10-DcuC、C10-Sdas进行限氧发酵，比较分析几种菌株的L-苹果酸变化。
L-苹果酸的检测方法：发酵培养基中L-苹果酸的含量使用高效液相色谱即HPLC测定，其操作条件设置为：安捷伦1100型，柱子型号为Agilent ZORBA Eclipse XDB-C18(5μm、4.6nm×250nm)；流动相为20mmol/L的KH2PO4(pH＝2.8)，流动相流速：0.5mL/min，紫外检测波长：210nm，柱温：25℃。
如图5-6所示，结果表明：C10菌株L-苹果酸产量为23.2g/L，C11在C10的基础上敲入gape启动子上调Sdas基因，L-苹果酸产量为25g/L，与C10相比提高了7.2％；C10-DcuC是在C10的基础上，异源过表达DcuC基因，L-苹果酸产量为40.8g/L，与C10相比提高了75.86％；C10-Sdas是在C10的基础上对内源基因Sdas进行过表达，L-苹果酸产量为31.6g/L，与C10相比提高了36.2％。
比较C10与C11、C10-Sdas，可以看出同样是针对内源Sdas基因的改造，过表达Sdas基因(C10-Sdas)比上调Sdas基因(C11)，L-苹果酸提高量高了4.67倍；将C10与C10-DcuC、C10-Sdas相比较，来自E.coli的DcuC基因比C.glutamicum内源的Sdas基因，L-苹果酸的产量提高达2.1倍，DcuC基因较之于Sdas基因更具有优势一些，其L-苹果酸的提高量是Sdas基因的2.1倍，即E.coli MG655的DcuC能高效促进谷氨酸棒杆菌胞内苹果酸的转运。
如图7所示，本发明的一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，通过上调Sdas基因、过表达Sdas基因、过表达DcuC基因中的至少一种手段上调胞内四碳二羧酸转运蛋白水平，促进胞内积累的苹果酸转运出胞，解除胞内高浓度苹果酸对菌株生长的影响和形成的底物反馈抑制，进而提高发酵法生产L-苹果酸的产量。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉科技大学
<120> 一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法
<130> 2022-3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> E.coli MG1655
<400> 1
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gcgtacttca tcacgatgtc cacattcgca ctcgcagttg gcctgctagt cggtaacttc 360
atccagccag gtagcggact gaacatctca gttgatgaag aatcttcatt cgcatccaca 420
gagagcagcc ctgaaggact cttgggattc atccactcga tcatccctga aacgttcttc 480
tctgcattta ctgatggttc ggtgctgcag gtactgttca tcgccatcct cgtgggcttt 540
gcagctcagt cgatgggtga aaagggacag cccatccttg atttcgtatc ccatctgcag 600
aagctcatct tcaagatttt gaactggatt ctgtggctcg ccccagtcgg tgcattcggt 660
gcaatggccg gcgtcgttgg cgaaacaggc tttgatgccg ttgttcagct cggtattttg 720
atcctcgcct tttacgtcac ctgcgtgatc ttcatctttg gcgtgctggg cgccgtactg 780
aaggtgttca ccggcgtgaa tatcttcaag ctggtcaagt accttgccaa ggaattcctg 840
ctgatctttg ctacctcatc ctctgaatct gccttgccaa acctcatgcg caagatggaa 900
cacatcggtg tggctaaacc aaccgtcgga atcgtggtcc caaccggcta ttccttcaac 960
ttggacggca ccgcaattta cctcaccatg gcatctatct tcattgccga cgcgatgaat 1020
atgccgatga gcctcggcga gcaggtcggt ctgcttgtct tcatgatcat cgcatccaag 1080
ggcgctgctg gtgtctcggg tgccggtatt gcaacgttgg ctgccggatt gtcttcacac 1140
cgcccagaac ttctgcacgg cgttgacgtg attgtgggca tcgataaatt catgtctgaa 1200
gcccgcgcac taaccaactt cgccggaaac tccgtggcaa cactgctggt cggcaagtgg 1260
actggcaccg tggacatgaa ccaagtccat gacgttttga atggaaaatc tccatttgtg 1320
gagttagaag aagaccacta g 1341
<210> 3
<211> 293
<212> DNA
<213> C. glutamicum ATCC13032
<400> 3
agcgcaagtg ttggaaatgc ccccgtttgg ggtcaatgtc catttttgaa tgtgtctgta 60
tgattttgca tctgctgcga aatctttgtt tccccgctaa agttgaggac aggttgacac 120
ggagttgact cgacgaatta tccaatgtga gtaggtttgg tgcgtgagtt ggaaaaattc 180
gccatactcg cccttgggtt ctgtcagctc aagaattctt gagtgaccga tgctctgatt 240
gacctaactg cttgacacat tgcatttcct acaatcttta gaggagacac aac 293

Claims (10)

1.一种促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，其特征在于，步骤包括：
S1，上调谷氨酸棒杆菌胞内四碳二羧酸转运蛋白的表达水平，得到重组谷氨酸棒杆菌；
S2，将所述重组谷氨酸棒杆菌进行发酵，生产L-苹果酸。
2.如权利要求1所述的促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，其特征在于，步骤S1中，所述重组谷氨酸棒杆菌的改造方法包括以下的任一种或两种以上：
1)在谷氨酸棒杆菌中异源过表达四碳二羧酸转运蛋白DcuC；
2)在谷氨酸棒杆菌中异源过表达Na+/H+-二羧酸协同蛋白Sdas；
3)通过在谷氨酸棒杆菌的Sdas基因上游敲入gape强启动子以上调内源蛋白Sdas水平。
3.如权利要求2所述的促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，其特征在于，步骤S1中，所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)获得目的DNA片段；所述目的DNA片段包括DcuC基因、Sdas基因和gape强启动子中的一种或两种以上；
(2)将所述目的DNA片段与酶切后的载体连接，构建重组质粒；
(3)将所述重组质粒电转至谷氨酸棒杆菌，得到重组谷氨酸棒杆菌。
4.如权利要求3所述的促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，其特征在于，所述DcuC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述Sdas基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述gape启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.如权利要求3所述的促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，其特征在于，所述目的DNA片段包括DcuC基因和/或Sdas基因时，以pEC-XK99E为表达载体，得到重组质粒pEC-XK99E-Sdas和/或重组质粒pEC-XK99E-Sdas。
6.如权利要求3所述的促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，其特征在于，所述目的DNA片段包括gape强启动子时，以pK19mobsacB载体构建启动子敲入载体，得到重组质粒pK19-gape。
7.如权利要求1所述的促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，其特征在于，步骤S2中，所述重组谷氨酸棒杆菌的发酵方法包括：将重组谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基中种子培养，然后取种子液转送至发酵培养基中发酵，收集纯化，得到L-苹果酸。
8.如权利要求7所述的促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，其特征在于，发酵的条件为：温度28-32℃，发酵24h以内的摇瓶速率为180-220rpm，发酵24h以上的摇瓶速率为80-100rpm。
9.如权利要求7或8所述的促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，其特征在于，重组谷氨酸棒杆菌在发酵培养基中发酵至18-22h时，加入IPTG进行诱导培养。
10.如权利要求7所述的促进苹果酸胞外转运以提高谷氨酸棒杆菌产L-苹果酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下组分：(NH4)2SO4 18-22g/L、MOPES 38-42g/L、尿素3-7g/L、KH2PO4 0.8-1.2g/L、K2HPO4 0.8-1.2g/L、Glucose38-42g/L、生物素0.01-0.05mg/L、原儿茶酸0.01-0.05mg/L、MgSO4·7H2O0.1-0.4g/L、CuSO4 0.1-0.3mg/L、CaCl2 8-12mg/L、FeSO4·7H2O 8-12mg/L、ZnSO4·7H2O 0.5-1.5mg/L、MnSO4·7H2O 8-12 mg/L、NiCl2·6H2O0.01-0.03 mg/L。
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