CN109628367B - 一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法，属于发酵工程技术领域。本发明通过敲除氧化葡萄糖酸杆菌中D‑山梨醇或L‑山梨糖代谢副产物形成相关的基因，降低其副产物的生成，提高了D‑山梨醇转化为L‑山梨糖的效率，从而来提高L‑山梨糖的产量和生产强度。本发明构建的重组菌株G.oxydan‑11，相对于对照菌，L‑山梨糖的转化率达到了96.12％，比野生菌提高了4.47％，生产强度为14g/L·h，相比于野生菌提高了14.7％，果糖副产物含量仅为5.6g/L，和野生菌相比下降了45.6％。

Description

一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法
技术领域
本发明涉及一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
L-山梨糖(L-sorbose)是一种己酮糖，是生产维生素C直接前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，简称2-KLG)的一种重要原材料。工业生产山梨糖的方法主要是利用氧化葡萄糖酸杆菌发酵D-山梨醇形成L-山梨糖。山梨糖进一步通过“微生物发酵法”或者“莱氏法”形成维生素C的直接前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，简称2-KLG)，2-KLG在经内脂化和烯醇化后得到维生素C。因此，D-山梨醇到L-山梨糖的转化率决定了工业生产维生素C的转化率。
氧化葡萄糖酸杆菌是工业生产L-山梨糖的主要菌株，其细胞膜上的山梨醇脱氢酶可以催化D-山梨醇形成L-山梨糖。除了山梨醇脱氢酶以外，氧化葡萄糖酸杆菌细胞膜上还含有大量的其他脱氢酶，如葡萄糖脱氢酶等。其中有一部分脱氢酶有较广的底物谱，可以催化D-山梨醇形成果糖等其他杂糖，影响D-山梨醇到L-山梨糖的转化率。通过基因工程手段对氧化葡萄糖酸杆菌基因组进行改造，将氧化葡萄糖酸杆菌部分脱氢酶基因进行敲除，有望解决在发酵过程中果糖等副产物积累的问题。
目前，对于微生物发酵法生产L-山梨糖的研究主要集中在对于氧化葡萄糖酸杆菌的发酵过程的优化和控制，而对于氧化葡萄糖酸杆菌的基因组的分子改造报道较少。虽然简单的发酵优化在一定程度上可以减少副产物的产生，但是不能从根本上解决发酵过程中副产物积累的问题。随着基因测序技术、代谢工程、合成生物学等方法技术的发展，从分子水平对氧化葡萄糖酸杆菌基因组进行改造，有望从根本上解决传统菌株在发酵过程中的缺陷。目前，通过代谢工程的方法来过表达山梨醇脱氢酶可以提高山梨糖的生产强度，缩短发酵周期，但是仅仅过表达山梨醇脱氢酶并不能解决发酵过程中其他脱氢酶催化D-山梨醇形成副产物的问题。鉴于此，我们对氧化葡萄糖酸杆菌代谢途径中可能形成代谢副产物的脱氢酶基因进行敲除，有效的提高了D-山梨醇的转化率和生产强度。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种通过敲除其代谢副产物形成的脱氢酶基因，从而增强L-山梨糖发酵的生产强度和转化率的方法。
本发明的第一个目的是提供一种提高L-山梨糖产量和生产强度的方法，所述方法通过对氧化葡萄糖酸杆菌基因组改造，敲除L-山梨糖代谢副产物形成相关的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述代谢副产物形成相关的基因包括：GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3、NADH-DH、NADH-dependent ADH基因。
在本发明的一种实施方式中，所述GDH含有SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列；所述GA-5-DH含有SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；所述XDH2含有SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列；所述ALDH含有SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列；所述XDH含有SEQ ID NO.5所述的核苷酸序列；所述sDH SLC含有SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列；所述PTS含有SEQ ID NO.7所述的核苷酸序列；所述PQQ-dependent DH3含有SEQ ID NO.8所述的核苷酸序列；所述NADH-DH含有SEQ ID NO.9所述的核苷酸序列；所述NADH-dependent ADH含有SEQ ID NO.10所述的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述生产菌株是以G.oxydans CGMCC 1.110为出发菌株。
本发明的第二个目的是提供一种L-山梨糖转化率和生产强度提高的重组菌，所述重组菌的产L-山梨糖代谢途径中合成山梨糖的主要代谢副产物形成相关的基因被敲除；所述主要代谢副产物包括但不限于果糖。
在本发明的一种实施方式中，所述主要代谢副产物形成相关的基因包括：GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3、NADH-DH、NADH-dependent ADH基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以氧化葡萄糖酸杆菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以G.oxydans CGMCC 1.110为宿主，采用同源重组的方式敲除了GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3、NADH-DH、NADH-dependent ADH基因中的至少一种。
本发明的第三个目的是提供所述重组菌的构建方法，所述方法是：分别扩增目的基因在G.oxydans CGMCC 1.110基因组的上下游各1000bp的序列，并与抗性基因和负向筛选标记基因融合，构建敲除框：左侧同源臂(HAL)-抗性基因-负向筛选标记基因-右侧同源臂(HAR)；将敲除框连接到载体上，转化至氧化葡萄糖酸杆菌的感受态细胞中；在含抗性标记物的D-山梨醇培养基中进行首次筛选，并在含有负向筛选标记物类似物的D-山梨醇培养基再次筛选。
在本发明的一种实施方式中，所述抗性基因为编码抗生素抗性的基因，包括但不限于卡纳霉素抗性、氨苄青霉素抗性。
在本发明的一种实施方式中，所述负向筛选标记基因为upp基因，所述负向筛选标记物类似物为5-氟尿嘧啶。
在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：分别扩增目的基因在G.oxydansCGMCC 1.110基因组的上下游各1000bp的序列，并与卡那抗性基因和upp基因融合，构建敲除框：左侧同源臂(HAL)-kana-upp-右侧同源臂(HAR)；将敲除框连接到到pMD19-T载体上；将测序正确的上述敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌的感受态细胞中，在含卡那霉素的D-山梨醇培养基中进行首次筛选，并在含有5-氟尿嘧啶的D-山梨醇培养基再次筛选，最终得到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydans-1、G.oxydans-2、G.oxydans-2、G.oxydans-3、G.oxydans-4、G.oxydans-5、G.oxydans-6、G.oxydans-7、G.oxydans-8、G.oxydans-9、G.oxydans-10和G.oxydans-11。
在本发明的一种实施方式中，所述upp基因序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第四个目的是提供一种利用所述重组菌发酵生产L-山梨糖的方法，是将重组菌活化后接种至发酵培养基，在28～30℃，200～220rpm条件下进行发酵培养。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有D-山梨醇280-350g，酵母膏0.4-0.6g，液体玉米浆1.5-2.5g，轻质碳酸钙0.5-1g。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基每L含有：D-山梨醇180-200g，酵母膏6-8g，碳酸钙2-4g。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有：D-山梨醇280-350g，酵母膏0.4-0.6g，液体玉米浆1.5-2.5g，轻质碳酸钙0.5-1g，消泡剂0.2g。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液由甘油管直接接种三角瓶培养48h后得到一级种子，一级种子OD600约2-3；按照接种量1％进行转接，培养24h后得到发酵种子液，OD600约2-3；将发酵种子液按照接种量为25％转接到发酵罐，37℃发酵。
本发明还要求保护所述方法在制备含L-山梨糖的产品方面的应用。
有益效果：本发明方法可提高L-山梨糖产量和生产强度的；本发明构建的重组菌株G.oxydan-11，相对于对照菌G.oxydans CGMCC 1.110，L-山梨糖的转化率达到了96.12％，比对照菌提高了4.47％，生产强度为14g/L·h，相比于野生菌提高了14.7％，果糖副产物含量仅为5.6g/L，和野生菌相比下降了45.6％。
具体实施方式
山梨醇和山梨糖的测定：采用高效液相色谱(HPLC)进行检测。仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和)，色谱条件：Aminex HPX-87H(Bio-Rad)，流动相为稀H2SO4，浓度为5mmol·L-1，流速为0.5mL·min-1，柱温为40℃，进样量为10μL。210nm(检测副产物)，示差折光检测器：检测L-山梨糖，样品制备：1mL发酵液于12,000rpm下离心5min，上清经过适当的稀释处理和经0.22μL滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。
种子培养基(g/L)：D-山梨醇200g，酵母粉10g，去离子水定容至1L。
用于筛选的山梨醇培养基：D-山梨醇50g，酵母粉10g，去离子水定容至1L。固体培养基加2％的琼脂。(头孢西丁抗生素终浓度50mg/L，卡那抗生素终浓度50mg/L，5-氟尿嘧啶300mg/L)。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，去离子水定容至1L。固体培养基加2％的琼脂。(氨苄抗生素终浓度100mg/L)。
生产强度计算＝最终发酵液L-山梨糖总质量/(发酵液体积*发酵总时间)。
实施例1：基因的敲除框的构建
以G.oxydans CGMCC 1.110的基因组为模板扩增待敲除的基因上下游各1000bp的序列，同时利用引物以pBBR1MCS-2为模板扩增出kana基因，以G.oxydans 1.110基因组为模板扩增upp基因，利用融合PCR将上述四个个片段连接起来，构建基因敲除框：左侧同源臂(HAL)-kana-upp-右侧同源臂(HAR)，并将敲除框连接到pMD-19-T载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞JM109中，并将转化子涂布在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板筛选，测序，将测序正确的菌株进行保存。
实施例2：重组菌G.oxydans-1的构建
按照实施例1的方法构建敲除GDH基因的敲除框：GDHL-kana-upp-GDHR，由于脱氢酶敲除框上带有kana(Genbank登录号：MH539767.1)-upp基因，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌受体菌CGMCC 1.110中，得到在含卡那抗性和头孢西丁的D-山梨醇培养基中正常生长的upp基因缺陷的菌株G.oxydans(敲除基因::kana-upp)，第一轮经过kana抗生素筛选完成后，将其在含有5-氟尿嘧啶(300mg/L)和头孢西丁(50mg/L)的D-山梨醇培养基进行第二轮筛选，得到敲除了GDH基因的重组菌G.oxydans-1。
实施例3：重组菌G.oxydans-2的构建
按照实施例1的方法构建敲除GA-5-DH基因的敲除框：GA-5-DHL-kana-upp-GA-5-DHR，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC CGMCC 1.110中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了GA-5-DH基因的重组菌G.oxydans-02。
实施例4：重组菌G.oxydans-3的构建
按照实施例1的方法构建敲除XDH2基因的敲除框XDH2L-kana-upp-NAD-XDH2R，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC 1.110中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了XDH2基因的重组菌G.oxydans-03。
实施例5：重组菌G.oxydans-4的构建
按照实施例1的方法构建敲除ALDH基因的敲除框ALDHL-kana-upp-ALDHR，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydans CGMCC 1.110中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了ALDH基因的重组菌G.oxydans-04。
实施例6：重组菌G.oxydans-5的构建
按照实施例1的方法构建敲除了XDH基因的敲除框XDHL-kana-upp-XDHR，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydans-04中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了XDH基因的重组菌G.oxydans-05。
实施例7：重组菌G.oxydans-6的构建
按照实施例1的方法构建敲除sDH SLC基因的敲除框s sDH SLCL-kana-upp-sDHSLCR，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydans CGMCC 1.110中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了sDH SLC基因的重组菌G.oxydans-06。
实施例8：重组菌G.oxydans-7的构建
按照实施例1的方法构建敲除PTS基因的敲除框PTSL-kana-upp-PTSR，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydans CGMCC 1.110中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了PTS基因的重组菌G.oxydans-07。
实施例9：重组菌G.oxydans-8的构建
按照实施例1的方法构建敲除PQQ-dependent DH3基因的敲除框PQQ-dependentDH3L-kana-upp-PQQ-dependent DH3R，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydans CGMCC 1.110中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了PQQ-dependentDH3基因的重组菌G.oxydans-08。
实施例10：重组菌G.oxydans-9的构建
按照实施例1的方法构建敲除NADH-DH基因的敲除框NADH-DHL-kana-upp-NADH-DHR，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydans CGMCC 1.110中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了NADH-DH基因的重组菌G.oxydans-09。
实施例11：重组菌G.oxydans-10的构建
按照实施例1的方法构建敲除NADH-dependent ADH基因的敲除框NADH-dependentADHL-kana-upp-NADH-dependent ADHR，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydans CGMCC 1.110中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了NADH-dependentADH基因的重组菌G.oxydans-09。
实施例12：重组菌G.oxydans-11的构建
(1)按照实施例1的方法构建敲除GDH基因的敲除框：GDHL-kana-upp-GDHR，由于脱氢酶敲除框上带有kana(Genbank登录号：MH539767.1)-upp基因，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌受体菌CGMCC 1.110中，得到在含卡那抗性和头孢西丁的D-山梨醇培养基中正常生长的upp基因缺陷的菌株G.oxydans(敲除基因::kana-upp)，第一轮经过kana抗生素筛选完成后，将其在含有5-氟尿嘧啶(300mg/L)和头孢西丁(50mg/L)的D-山梨醇培养基进行第二轮筛选，得到敲除了GDH基因的重组菌；
(2)按照实施例3的步骤，将构建的敲除框GA-5-DHL-kana-upp-GA-5-DHR转化到步骤(1)构建的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌中，按照步骤(1)相同方法筛选，得到敲除了GDH和GA-5-DH基因的重组菌；
(3)按照实施例4的步骤，将构建的敲除框XDH2L-kana-upp-NAD-XDH2R转化到步骤(2)构建的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了GDH、GA-5-DHXDH2和XDH2基因的重组菌；
(4)按照实施例5的步骤，将构建的敲除框ALDHL-kana-upp-ALDHR转化到步骤(3)构建的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了GDH、GA-5-DHXDH、XDH2和ALDH基因的重组菌；
(5)按照实施例6的步骤，将构建的敲除框XDHL-kana-upp-XDHR转化到步骤(4)构建的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了GDH、GA-5-DHXDH、XDH2、ALDH和XDH基因的重组菌；
(6)按照实施例7的步骤，将构建的敲除框sDH SLCL-kana-upp-sDH SLCR转化到步骤(5)构建的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了GDH、GA-5-DHXDH、XDH2、ALDH、XDH和sDH SLC基因的重组菌；
(7)按照实施例8的步骤，将构建的敲除框PTSL-kana-upp-PTSR转化到步骤(6)构建的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了GDH、GA-5-DHXDH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC和PTS基因的重组菌；
(8)按照实施例9的步骤，将构建的敲除框PQQ-dependent DH3转化到步骤(7)构建的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了GDH、GA-5-DHXDH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS和PQQ-dependent DH3基因的重组菌；
(9)按照实施例10的步骤，将构建的敲除框NADH-DH转化到步骤(8)构建的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了GDH、GA-5-DHXDH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3和NADH-DH基因的重组菌；
(10)按照实施例11的步骤，将构建的敲除框NADH-DH转化到步骤(9)构建的氧化葡萄糖酸杆菌重组菌中，按照上述相同方法筛选，得到敲除了GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3、NADH–DH和NADH-dependent ADH基因的重组菌G.oxydans-11(G.oxydans CGMCC 1.110(ΔGDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3、NADH-DH、NADH-dependent ADH))。
实施例13：重组菌与对照菌发酵生产山梨糖
挑取实施例11制备的重组菌G.oxydans-10和对照菌G.oxydans CGMCC 1.110，分别于种子培养基上活化培养24-36h，以25％的接种量，将上述活化培养好的种子液分别接种到发酵培养基(按g/L计，含有：D-山梨醇280-350g，酵母膏0.4-0.6g，液体玉米浆1.5-2.5g，轻质碳酸钙0.5-1g)中，在37℃，750rpm条件下进行发酵培养，发酵15-20h,检测发酵过程中的溶氧和pH，待发酵溶氧开始回升时2.5h后，结束发酵，对发酵液L-山梨糖和果糖含量进行检测，发酵结果如表1所示，与对照菌株G.oxydans CGMCC 1.110相比，G.oxydans-11转化率提高至96.12％，生产强度提高了14.7％，果糖副产物下降了45.6％。
表1氧化葡萄糖酸杆菌敲除不同脱氢酶发酵结果
山梨糖含量 转化率 果糖含量
G.oxydans CGMCC 1.110 265.8g/L 91.65％ 10.3g/L
G.oxydans-1 267.8g/L 92.83％ 9.2g/L
G.oxydans-2 269.1g/L 93.27％ 8.6g/L
G.oxydans-3 269.4g/L 93.38％ 8.2g/L
G.oxydans-4 267.2g/L 92.62％ 9.6g/L
G.oxydans-5 270.8g/L 93.87％ 7.5g/L
G.oxydans-6 273.4g/L 94.77％ 6.7g/L
G.oxydans-7 269.7g/L 93.52％ 9.1g/L
G.oxydans-8 269.3g/L 93.35％ 9.4g/L
G.oxydans-9 268.8g/L 93.17％ 8.3g/L
G.oxydans-10 272.2g/L 94.35％ 6.9g/L
G.oxydans-11 277.3g/L 96.12％ 5.6g/L
实施例14：基因敲除提高山梨糖转化率在其他氧化葡萄糖酸杆菌的应用
按照实施例1～2的方法，将该敲除方法应用到其他氧化葡萄糖酸杆菌中，具体为：敲除G.oxydans 621H的PQQ-dependent DH3基因；敲除G.oxydans CGMCC 1.049的gDH基因；敲除G.oxydans WSH-003的Sdh-SLC基因。其中，G.oxydans 621H购自ATCC,G.oxydansCGMCC 1.049购自CGMCC；G.oxydans WSH-003已公开于公开号为CN 104611285B的专利中。将重组菌按照实施例12的方式发酵。
结果如表2所示，本发明的方法仍可以不同程度的提高氧化葡萄糖酸杆菌转化D-山梨醇到L-山梨糖的效率，说明该方法在大部分氧化葡萄糖酸杆菌都可以应用。
表2不同氧化葡萄糖酸杆菌敲除不同脱氢酶发酵结果
Figure BDA0001962835230000081
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖产量和生产强度的方法
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2421
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgagatact taacgaatat acaaaaaaat ttatcaatta ttaccatact gtatttattt 60
attatattat tcggtttatt ggaaatttat ggaggaataa tactttttat aaatggtggg 120
tctttgtatt atataatatc aggagcactt ttggttgcgt ctggtatttt tttgcagaaa 180
agacgtattg agggtgcgtg gatatttgca ggagtatttt tccttaccct gatctggaca 240
atttgggagc gcggtttcgt ttactgggcc tggattccac gacttgatgt tcttgttgtt 300
ttggcttttg ttctgggatt tcagcttcct aaacttggac gtggcgtaaa cccagtcgtt 360
gccagatctg tttccggtgc ctccgctgcg ctgttcgggt tgggggcaat cagtgctttt 420
tatccccatt atgtaactcc tccacctgcg gattttcagg gaaaacctct ggtggatacc 480
gcggaaaccg ttacaatcca gcctgatagc gactgggata cttacgggcg tgacaagaat 540
gccacccggt tttcgcccct caagcagatc actcctgcaa atgtcggtca actgagagag 600
gcctgggttt accggacagg cgcactgaca cctgtaggtc atgccaatgc gcgcggtgct 660
gaaacgacgc ctcttaaagt cggaaatggt gtctatgtct gcacgcctct tgatgacatc 720
atcaagattg atcccgcgac gggaaagcag atctggcgcc acaattcagg aacggaatgg 780
aagaacaccc gctacgcagc cagctgccgt ggtgtaaccc actatgtttc gaccgttgtt 840
cccgttgggg agccctgtca tgagcgtatt attactggaa cactcgatga tggtcgctgg 900
cgtcttctgg cagtggatac ggaaactgga caatcctgca aggaatttgg ccaaaacgga 960
gaagtaaacc tgctggaggg aatgggacat gttgcacccg gaatggttga tgaggcagcg 1020
cctcctccga tcgtaaacgg cgtgatcgtg accaatcagg aagtgatgga cggccagcgt 1080
cgttatcctc cttctggtgt aattcgtggc tacagcgccg aagatggtca attactgtgg 1140
gcgtgggacg tcaaacgacc ggatcgcaaa gggctgccgc ccgctggcga gacatatagc 1200
aggggaaccc ccaattcctg ggccgtcatg accggggacg agaaactggg gttggtctat 1260
gttccgacag gcaacactgc tgttgactat tacagtgcta cacgttcacc cgaagaactc 1320
gcaatttcct cttccgtggt tgcgcttgat gtgaagacag ggacagtccg atgggtgtac 1380
cagactgttc acaaggacgt atgggattac gatatcggca gtcaggctac tctgcttgat 1440
ttcccggatg cgaacggcaa ggcaatccca gggctggtta taccaaccaa gcgaggacag 1500
ctgttcgtgc ttaatcgggt aacaggtcag cccctgaccc gtgtagaaga gaaaccggcg 1560
ccgcagtatc tcgaaattcc ggaagatccg cactcgaaga cgcagccttg gtctgtcggt 1620
atgccgcggc taggtatgcc tgatcttacc gaagcaaaaa tgtggggatt gacgcctctg 1680
gatcagatat tttgccggat caagtttcgc cgtgcgcatt atgagggaga attcaccgcc 1740
cctacaatca aggaaccctg gatcgagttt cctgggaata acggtggggt agattgggga 1800
agtttggctt acgatcctac gaatggtgtt ctggtatcaa actggaacgt tgtagcaatg 1860
tataaccagc tccttcctag agcagaagcg gacaggcggg gtctgaaggc ttttgatgat 1920
ccgaactata gcccagctgt gcgtggtggc gaaggcggcg gagcacaagc tgacagtcca 1980
tatgctattg ctgtcgatgt tcttcagaat ccctttacag gtgttctttg taatgagccg 2040
ccctatggca tgatcaccgc catcgacatg catacgcaga aagtactctg ggagcgacct 2100
cttggtacag ctcgggcaaa tggtcctttc ggtttgaaga cctatgctcc agtagagttc 2160
ggcgtcccca gtaatggtgg tcccatgatt accgcaggtg gtctggtctt tatcgccgcc 2220
gctacggata acttgatccg ggccattgat atcaagacag gaaaaattgt ctggcatgcc 2280
attctaccgg caggcggaca ggcgacgcca atgacctatg aagtcaatgg ccagcaatat 2340
gttgcgatcg ttgcgggagg acatcattat atgaacacgc atgatggtga ttatgttatc 2400
gcctatgcac ttccgaaata a 2421
<210> 2
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgagtacct ctctttttga tctgaccggc cgccgtgccc ttatcaccgg ctcgtctcag 60
ggcattggtt tcagtctcgc gcaaggcctt caggcagccg gagccgacat cgttctcaat 120
ggtcgtgatc cagaaaaact cagtattgcg gctgagaaac tgggtggggt gaaaacgctg 180
ccttttgacg tcacggatca tgctggggtc aaagctgcga ttgatcgctt tgaagctgaa 240
acaggcccga tcgatattct tgtcaacaat gctggaatgc agcatcgggc gccgctggaa 300
gattttccgc cggaaatgtt tcagaaggtt ctccagacaa atctgacctc catcttcaat 360
gttgggcagg cagtcgcaaa acatatgctc ggccgaaaga gtggcaagat catcaatatc 420
gcgagcgtgc aaacagccct cgcccgcccg aacatctcgc catacaccgc gaccaaaggg 480
gcggttggta atctgacaaa gggcatggcc acggaatggg caaggcacgg tctgcaatgc 540
aacgcgatcg cgccagggta ttttgatacg cctttgaatg cagccttggt caaagacgct 600
gacttctcac aatggctgga aaagcggacc cctgccgggc gatggggaca attggacgaa 660
ctgaccggag cttgtatctt tctggcgtcg caggcttcgt ccttcgtaaa cggccatgtt 720
ctgtatgtgg atggcgggat tacggtctct ctttga 756
<210> 3
<211> 1044
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggctcaag ctttggttct ggaacgtaaa ggcgaactgt ccctccgaga gattgacgtg 60
cctgatgtcc tcggccctga tgacgtcagg gtagcgatcc atacagtcgg tatctgcgga 120
agtgatgtcc attattatac gcatggacgc atcggtcatt tcatcgtaga cgctccgatg 180
gttcttggcc atgaggcctc aggcaccgtg acggaagttg gttcacgcgt aacaagtctt 240
caggttggcg atcgtgtctg catggagcct ggcattcctg accccacctc acgcgcgtct 300
aaaatgggta tttacaacgt tgatcctgcc gtaactttct gggcgacgcc gccaattcat 360
ggttgcctca ccccctcggt cgtacaccca gcggccttta cttacaggct tcctgagaat 420
gtttcattcg ccgaaggcgc catggtagag ccattcgcta ttggcgttca ggcagccgtc 480
aaagccgccc tgaagccggg cgatacatgt ctagtcacgg ggtgtggacc gattgggctt 540
atgacagcac tggcagcact ggcttcaggg gcaggaacag tttttatttc cgatatcgcc 600
gctccgaagt tgcagatcgc tggacaatat aaaggtctcg ttcccttgaa cgctaaagaa 660
gtacggccac gcgatgcggt gtcgcagcag tgcggagcgg actggggtgt tgatgttgtt 720
ttcgaggcca gcggctttcc gggggcatat gacgatgtct tttcctgcgt ccgccccggt 780
ggaaccgttg tgttcgtcgg aatgcctgtc gagaaggtcc cgtttgatct ggtcgcagct 840
caagccaaag aaatccgaat ggaaacagtc ttcaggtacg cgaatgtcta tgaacgtgcc 900
attgccctga tttcttcagg aaaagtggat ctcaagcccc ttatttctga aacgtttcca 960
tttgcagaag gtatcgcagc ctttgaacgc gcggcttccg ctcgtccaac ggatgtgaag 1020
ctacaaatta agcttccagg ctga 1044
<210> 4
<211> 1539
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgtgtctgc acaatcgcca gaaagacagg gagaagccgt ccatgaacaa gatggcacag 60
aaactggctc catccggagt tgctcgtgac tttggatttt tcatcgatgg tgagtggcgc 120
cacggacgtg agatgttcga gcgcaaatct cccagtcatg atgttgtagt cacgcggatt 180
gcacgttgca cggaagagga tctgaacgac gcagtggctg ctgcccgccg tgcgtttgaa 240
aacggcacat gggctggtct ggcaagttcg gaacgtagtg cgatcctgtt gaagacggca 300
gaactgctga agcagcgccg cgacgatatt gccttctggg aagtgctgga aaacggcaag 360
ccgatctcac aggccaaggc cgagatcgac aactgtattt cctgtttcga gatggctgcg 420
ggtgccgcac gtcttctgca tggagacagc tttaacaatc ttggcgagag cctgttcggc 480
atggttctgc gggagccggt cggggttgtt ggcctcatta cgccctggaa cttcccgttc 540
atgatcctgt gtgagcgcgt gccattcatt ctggcatccg gctgcacagt tgttgtgaag 600
ccagcggaag tgaccagcgc caccacgctg atgctcgccg atattctgac agaagctggc 660
ctgccaaagg gcgtctataa cgtcgtaacc ggcacgggca aaagcgttgg gcaggccctg 720
acgcagcatc cggatgtaga catgctctcc ttcaccggct ccaccggggt tggccggtcc 780
tgcattcatg cgtccgcaga cagcaacctc aagaagcttg gcctggagct tggtggcaag 840
aacccgatcg tcgtcttcgc ggatagtgat ctggaagatg cggccgatgc ggtggccttc 900
gggatcagct tcaacaccgg gcagtgctgc gtctcgtcca gccgcttgat tgtcgaagag 960
tccgtggccg acaagtttga gaagctggtt gtcgccaaga tggaaaagat ccgcgtgggt 1020
gacccgttcg acccggaaac gcagattggc gccatcacaa cggatgcgca gaacaaaacc 1080
attcttgatt atattgagaa gggtaaggcc gaaggcgcgc gcgttctgtg tggtggcaac 1140
aaggtcgatc tgggtcgtgg gcagtacatc gcgccaacgc tcttcacgaa tgtgaagccg 1200
gacatgtcga ttgcgacaga cgaaatcttt ggtcctgtgc tgtcagtctt ccggttcggc 1260
acccttgaag aagcgatctc cctggccaat gacacggctt atggtctggc ggcgtctgtc 1320
tggacgaagg acatcagcaa ggccctcaag gtgacacgca aggttcaggc cgggcgcttc 1380
tgggtcaaca cgatcatggc tggcggcccc gaaatgccgc tgggtggttt caagcagtcc 1440
ggctggggcc gtgaagcggg gatgtacgga gtggaggaat acacccagat caaatccgtt 1500
cacgtcgatc tcggtaaacg gacgcactgg atctcctga 1539
<210> 5
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggctcagg cactggtgtt tgaaaggaga ggtgaactct ctctacggga gatcgccctt 60
ccgtcggagc ttggaccgga tgatgtccgt atcgccatcc atatggtggg tatctgcggc 120
agcgacgtgc attactacac gcatggtgcc attgggccct tcgttgtttg tgagcccatg 180
gtgctgggac acgaagcctc tggaacaatc actgaagtcg gaagccatgt ccggtctctg 240
aaggtcggag accgggtgtg cagggagccg ggtatcccag acccacaatc ccgtgcaacg 300
ctgatggttc ggtacaccgt tgatcctgct gttcgcttct gggcgacccc gccaatccac 360
ggctgtatca gtgcagggaa aatcgatctc aagccgcttg tgtcggaaac attccctttt 420
gatcagggta ttgccgcttt tgaacgggct gccgaggctc agccgagcga cgtcaaactc 480
cagatcgttc tctga 495
<210> 6
<211> 3487
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggatcggg aaaaagtcca tcctctcatc gggcaggccc tctacgacac tcttttgtct 60
caaagagcag cctaccgaag tgagatcaat caactgcatg atcttctcac tacaaaagag 120
tttagttcag ccgccgaatt tgcccgtgag gccgagcatt ctgacaacgc gctgaaagag 180
accattcatg ccctgatgca cggctggtat cggggcgtcg tgggtcagac agtcgtcgtc 240
taccgtgcgg ccgccatgtt tgctctgact gatgatgcgg tctttcccaa gacttatgcg 300
acagcgagac ccttctactg gactgaaaag ccgccagtcg ttgagacgcc aacagcggcc 360
ccggcactgt ctccatcgga atatgtcgca gaatcccagt aagaaacgga tgttatttca 420
atgagttctt cgaattccct ttcggcagat gtcgtgatcg tgggatccgg cgtcgcaggg 480
gccagtattg ccaacgaact tgcgagagcc ggcctctccg tcatcgttct tgaagccggc 540
ccccggatcg accgccagca tattcttgaa aatttccgca ccacggaaaa caagggagca 600
taccagcttc cctacccacc cgtgccttgg gcgatgcatc cgcctgatca gggctctccc 660
aatggctatc tgcatacgac cggacctgac ggtgctgcgt atcagcaggg ctatctgcgt 720
gttgtcgggg gaacgacctg gcattgggca ggatgtgcct ggcggtatct cccctctgac 780
ttcgagttac attcccgata tggcgttggc cgcgactggg ccatcaagta cgatgatctg 840
gagccattct actatcaggc cgaagtcatg atgggcgtgg caggccctaa catggatgtc 900
gatgacctgg gatctccacg atctcacgat tacccgatga aggaagtacc cctgtcctat 960
ggcgcggatc agtttcgcaa actgatccat gagaagacga attaccgcgt cgttcacgag 1020
ccacaggccc gtaacactcg cccttatgac aagcgcccaa cctgtgaggg caacaacaac 1080
tgcatgccga tctgtccgat cggggcgatg tacaacggaa ttcactcggt caatcatgcg 1140
gaagcagcag gcgcccgtat tattccgaat gcggttgtct accgactgga gaccgacgcc 1200
agcaacaaga aggtcgtggc cgtaaattat tacgatcccg ataagaattc tcatcgtgtc 1260
accggtaagt tcttcgtggt cgctgcgcac tgcattgaga gtgccaagct gctcctgctg 1320
tccgccgatg acaaaaatcc ccggggcatt gccaacagtt cagatcaggt tggtcggaac 1380
atgatggatc acacgggcgt acagctctcg tttatgagcg gaaacgactc tctgtggccg 1440
ggtcgtggtc ctctgctgac cagcattatc gactcgtttc gtgacggccc atggcggagc 1500
gaacgtggtg cgtatcttgt gcatatggtt gacgataatc aggtcgactt cgcaacgggt 1560
ctggcgattg ccaagggcta tgtcgggaaa gagctggaag agcagatccg ttatggctcc 1620
tctcatgccg ttcgtctctt cagccataac gaaggcattg ccgaccccga caaccggctg 1680
acactgagca aaacacataa agacgttctg ggcattcctc accccgaagt ctattacaag 1740
cttcccgagt acacagtgaa gagttgtgac cataccaagg agctgttcaa ggaactgatg 1800
gctctgatga gtggtactga tcctcaatgg acaaagggtt acttcccgca gtgccatccg 1860
tcgggcagca cgatcatggg aacagacccc accaattcgg tcgttgacgg tgagtgccgc 1920
acccatgacc acgaaaacct gtttgttgcc agttcagcgg tcttctcttc ggtcggtaca 1980
ggcaatatca ccctgaccat tgccgcgctg gcgcttcgcg ttgcagcatc cctgaaaaag 2040
gagatgcttc atgcgtgagg ggaataaagc cggaatacgc cgcctctttc tgccagctgc 2100
catagcttcg ggtgtcctgt tcggcgcgca gtcagcgagg gcagaggatc aggccaccac 2160
tatcagccga ggcgcctatc tggctacagc aggcgactgc gttgcctgcc atacgaaacc 2220
aggtggggct ccctttgcgg gcggccttgt cattgcgtcc ccaatgggcg ggatcgtcgc 2280
gtccaacatt acacccgatc cggatacggg aattggcaaa tacaccgaag aggagtttgc 2340
caacgctctt cgcaagggta ttcgcaggga cggagctcat ctctatccgg ccatgcctta 2400
cacggcctat tcggagattg cggatacgga catccacgca ttgtatgtct acttcatgca 2460
tggcgtggcc cccctgcagc aggacaatcc gaagacggag ctgaaattcc ccttcaatat 2520
ccgcgcaatg atgatcagct ggaatctcct gttcgcagga cctccggccg caaagggtga 2580
tcctcagacc tattccaaaa tcgaaagagg ccactatctc gcagatgcct tgggacattg 2640
cggaacctgt catacaccac gcaatttcct gatgggcgaa cgcagcagca gtgcctatct 2700
tggcggaacg ccgctcgctg gctggtatgc tcccaacatc acaccgagca tgaatagcgg 2760
gatcggcgat tggagcgaag acgatctggt tcagtacctg cgtacaggct ccgtgccagg 2820
acgtgctcag gcggcaggca tgatgggcga agctgttgaa catagcttta gcaagctgac 2880
agacgaggat ctccacgcga tcgccgccta tatccgacag atcccaaaga tcgaggacag 2940
ccaagcaaaa cagccgcgtg accggttcgg ggttgccgtc cagcccatcg tggatctgca 3000
gaagccaaaa cttgatcgtg aagatgacct gtttccgatg gacggggaga ggatctacgt 3060
caacaactgt gcagcctgcc atggacttga tggtgcagga gcggccgatc acttcacgcc 3120
ctctctgtcc tccaatgcag tagtcggtgc accgggagct gacaatctga tcatggccat 3180
tgtcaacggc gttgatcgca cgacgaatgg tcatcacgtt ctgatgccgg gtttcggccc 3240
cacttccgat gtacaacggc tcagcgatac ggatgtggcg aaactcacca actatgtctc 3300
cgggacattt ggaagtggcg atcatcatgt cacagctcag gacgtaaagg tcgctcgtga 3360
aggcgggcct ctgccagcac tagtgaagga tatgccggcc ttaattgggg ctggtgttat 3420
tgcagccttt gcagcaatgt catgcctgat ctggtggttc agacggcgca ctcaaaaaca 3480
gaaataa 3487
<210> 7
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgacaccgg tgaatattcc cgagtccgaa cctttggcag gatatggtcc tggttccaga 60
cagatcctga tcgttacagg gctttccggt gccggaaaat catccattct acgtgtgctt 120
gaagatctcg gctacgaagt cgtggataat ccacctttgc accttcttga agccctggcc 180
tcacgaagca tctcccgact ggccattgga atcgatgtcc gaagtcgtgg ctttgaagcg 240
tcccgtgttc ttgaggaaat ggaccggctg aaagctctcc ctggcagtca ggttcagctt 300
ctctatgcaa cggccgagcc tgaaatcctg ttgcgtcgct ttacggccac ccggcgtcgc 360
catcctctgg ttacgagcgg cacgatcctt ccgggtatcg agcaggaaag tcgtctgctg 420
gcccctttgc gtgcccatgc ggattttgtc atcgatacat cggacttgcc cgcccctgaa 480
ttgaggcagt tgatcgagac ccgtttcggc agtggctccg aagatggtct gactgtcgcg 540
cttatgtctt tcgcttatcc atccggcctg ccgagggaag cggatatggt attcgatgcc 600
cggttcctgc gaaatccaca ttatgacccg acgctacaac ccatgacagg tctggatcag 660
gcggtcgtgc agcacgtcaa gcaggatccg gcttatccgg ccttcttcaa tcatgtgcat 720
ggcctgctgg atctcgtgct gccccgcttt gttgaggaag gcaaaaaata cgccaccatc 780
gctgtagggt gcagcggtgg ccgccaccgt tctgtcacca tcattgagga actggcgcgt 840
ctgctgccag aaacggcgcc tgttggcccg atgatggtgc tgcatcgtga gctggcgcgg 900
aaaggcctgt cctcttggcg ttgggctgtt ccgccgcata acctgtcccc gcaggacaaa 960
tctgcatga 969
<210> 8
<211> 2430
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgccgccta cgttgcgacg cagttcgttc ctgccccttg tgacgggcat cttgctcgtt 60
ctgctcggcc tagggctggc tttacccggt ctgtggttaa ttgggctggg aggctctttc 120
tactacgcca ttgcaggcgt tctcatggtg gcatccggcg ttctgatgat ccggctgcac 180
cccggcgctt ccgcagttta tgcagggctc ctgctttata cgcttgtctg ggcattaggg 240
cgtgttggcc ttgatggctg gcgccttctc ccgcctctcg cgctgccagc aggaatgggc 300
ctctgggtgt tcagcccctg gattacggga cgactgctcc agggcacgaa acatcgttcc 360
gtcagcatac ccgttgttgc aggtggcatg gcattctgcg cggcattgtt tgtctttgtg 420
ttcgcctgcg gttggcacat tactgcatca cgcgaccagc agttcaatcc gttccccggt 480
gagaccggtg cgacccttcc gggcgcggat cagcaggctg ccaatgactg gcagttctat 540
ggtggcactc cggccggaga ccgctttgcc atgccaaccc agatcaatgc ttccaacgct 600
cacggtctga aagtagcgtg ggtgtatcac agcaaggatc tgccgcgcgc tggcgagaac 660
tcccgtgggc gggaattcag ctttgaagca acgcccatca aaatcggcaa ccggctgttt 720
ttctgcacgc cgcaccgaga tgtcgtggcg ctggatgcaa catccggaaa ggaaatctgg 780
cgatattcgc cgggtggaga attcggcaag aacatctatc aggcctgccg cggcgtatcc 840
tacgtcaatg ctccgggaac ggattacgcc catcgcatcg tctcaacaaa ttccagctcc 900
cctccaaccc tgtttgaagt cgatgcagac acgggaaaac tctgcgaaag ctttggcgat 960
catggtgttg tggatctccg gggtgggatg ggagctattc cacccggctt tcacttcatc 1020
acgtccccac ccatggtgct gcataaccgt atcatgacga gtggctgggt ttatgatgat 1080
cagacagttg gcgaaccttc cggggttatt cgtggcttcg atgccattac gggccaactg 1140
gcctgggcct gggacatggg ccgcaccccg accaacaaac ctctggatcc gggcgaagtc 1200
tttacccgtg gcaccgccaa tggctggggc gtctatacgg ccgatgccgg gctgaacatg 1260
gtttacgtcc cgctcgggat tgccacgcct gactatttcg gtggcaaacg ccggagcttt 1320
gacgagaagt atgacagctc tctcgtagcg ctggacatca caacgggcga agagcgctgg 1380
catttccaga ccgttcatca tgatctgtgg gattttgatc tccccgttgg cccatcttta 1440
gtggatctgc cagatgccca cggcactctg acccccgcgc tggtacagac aaccaagcag 1500
ggcgaactct tcgtgctgga ccgccgaacc ggcgcgccat tctatcgcgt tcaggaaaca 1560
cccgtacctg ccggggacac gccgggcgag cattattcgc cgacgcagcc actctccgtc 1620
gacatgccca atctgcgccg ccccaatctg acggaagacg atatgtgggg cgcgaccccg 1680
tatgatcaga tgttctgccg tattgccttc cgctccatgc gggacaatgg ccttttcaca 1740
ccgccgagcc agaaaggcac cgtagggttt ccagcgtttg atggcgtggc ggactggtat 1800
ggtggcacca tcgatccgac gcatggtgtc atgtatatca acaccacgtt cattccattc 1860
ctgatgacgc tggtgccgca ggaaaaagct cttgccaaag ggctctacaa atcctggcgt 1920
gactgggcac agccttatcc ggagcctgtt ttcacaaaca atccccaaca tggcctgccc 1980
ttcgcggctg tcgtgaagcc atggcttggc ccgtttggcg ctccgtgcct ggcaccccca 2040
tggggcaaga tgcaggcgat tgatcttgtt catcgtcggg tcatctggga acgggctttg 2100
ggcacaacga agaatgttgg cccgacaaac atgctgcgga tgcccgttgg cctccccacc 2160
agtgtcttct ccatgggcgg cagcgtgacc acgccgaatg gtctggtgtt catgggcgcg 2220
ctggcggatc aaagcttcca tgttcttgat gggcatgacg gccatacgct cttcaagacg 2280
gaactggacg ccggcggcaa tgccacgccg ttgacctata tgggtgaaga cggccggcaa 2340
tatgtcgtgc tggctgtggg cggccacggt gggctaaaaa cgcgcaacag cgatgaagtc 2400
gtggcctttg cattacccaa agccccatga 2430
<210> 9
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgatcatca atgggatttt ccttcctttc cccctctttg tcctgtcagt ggggacaatg 60
cttctgcttg catcagtcac gctgcatcga tcgtccagac tcagtttctc tctggggctg 120
ctaacgctcg ttcttgcaac cgtgatgacc tattatcctg cccccatcat gcctcttgcg 180
gccacgcaga cactcttctt cgcagataca tgggccaact acacagccgc tctgatttta 240
ctctccgcat cctgcatctt cattctttcc tggcaggacg tgacccagcg cagcgcccgg 300
tcggcagacg aatacgccct cctcctactc cttggtgcgt tgggggctac ggccatggta 360
ttcagtgtaa actacatgcc gtttttcctt ggggtggaaa tactctccat tgcattgatt 420
ggactggtga cattcaggag ccgacacacc cagaaaggcc tggaagcggc gatgaaatac 480
ctgatcctgt caggtgtttc atcagccatt cttctctttg gtatcgggtt gtcctattcc 540
gtcaccggat ccttggtttt cgaattttcc accgcgggtc atgaaacggg cacaggtatt 600
gctgccgctg caagcataat ggttctgacc ggaattttct ttaagctctc cgctgtaccg 660
ttccatatgt ggattctcga cgtcatggag ggggcatctg tccctattgc cggtttcata 720
gccgtcgttc ccaagattgg tatattttct gcgctggtgc ggtatttcgg ttctgaaccc 780
gtcacgcctt tcctgcataa tacaatgtca gccatcatta ttctgaccat tctgggtgga 840
aatctgcttg cgctttgcca gaccagtctg atcagactga tggcgtgttc atccatcgcc 900
catgtaggct atctgctcat tgcattctat tcacctggtc atttccagtc tgatacaatg 960
gtgctctatc tggctgccta taccgcagcc acactgggta ctttctcgat tatccaggct 1020
ttcgtaagtc cagaagggct gcagcgcagc acgatttctg actggaaagg actgtttttt 1080
acccatccct ttctcgcggt cgcaatgact gccatgctgc tttccctcgc aggtattcct 1140
cccacaattg gcttttttgc caaatttgaa attgccgctt caggtctgga gcaaagacat 1200
tatatccttc tcacagcgtt aattgtcgga agcatcatag ccttatatta ttatctcaat 1260
attataagat taatgacaac accaaacact tccttaaata ttggacaaaa tgagaaaaca 1320
aatttaataa tttacagtac tgtttttatt ttaacattaa tcgtgtttgt aggaggaatt 1380
tttccttcat tttttatgaa ttccatacat ccggctcttc catcgacaag agctgaatat 1440
cttcaaagcc acattccatt accttga 1467
<210> 10
<211> 1164
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgatggatt tttccttctt caatcctaca cgcgtactct ttgggcgcac agcactgtcc 60
caaatgacgg cccttgttcc ggcaggagcc cgaattctca ttctttatgg cggtggaagc 120
gtcgtacgca acggaacgct tgcacgcgtt caagctgcgc ttgacgggta tgaaattcat 180
gagttcggag gcatcgaacc caatccgagc tttgaaaaac tgatggaagc cgtgacattg 240
gtgcgagagc aggacatcag tttcctgatc gccctcggcg gaggatccgt gatcgacggc 300
gcaaagtttg tggccgccgc agtttactat gatggcgatc cctgggacat tcttctgacg 360
cgtggcaatc ggatccaggc tgccctacca ctggccgcta ttccgacact gcccgcgacg 420
gggtcggaaa tgaacggaac atcggtaatt acgcggaccg aattttccgc caagcgtgtg 480
ttcaagagcg agcatgtttt ccccgttctg gcggttctcg atccgacatt gacgttcaca 540
ctgccgcccc gacaggtcgc caacggaatc gtcgatgcgt tcgtccatgt cctcgaacag 600
tatctgacct atcctgtgga tgctcctgta caggatcggt ttgcagaggg cctgctacgc 660
gtcctccttg acgttgccga caaaaatctt gccgagcctg aaaactatga tgcccgcgcc 720
tccctgatgt gggccgcaac gctggccctc aatggcctga taggatcagg cgtgccgcag 780
gactggtcca gtcacctgat cggacatgaa ctgacggctt tgtacggcct cgaccatgcc 840
cgcacactcg ccgtcattct gcctgccatg ctatccgtgc ggaaaagcga aaagcatgcc 900
aaactgcttc agtatgccga gcgtatttgg aatctccaca ccggctccga aaacgagcgg 960
attgataagg ccctgagtca cacgagggct tttttcagcc atctcggtct ggaaaccggt 1020
ctttcagatt atgggctggg ccggaacgct attgactctc tgctcgcatc cctgcggcag 1080
gctcacggaa atgattatgc ccttggtgaa aagcagactg tctcttcgga gcttgccaga 1140
gccgttctgg aggctagtct ataa 1164
<210> 11
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgagtcagg cgctgccgcc tatcgttctc acccatccgc tggtgcgcca caagctgacc 60
cgtctgcgtg ataagaacac atccacagcg ggctttcgtc gcctgacccg tgagctcagt 120
ctgcttctgg cttatgaagc cacgcgtaac ctgtctctcg tgccacgtca gatcgaggcg 180
ccaagcgggt tgatggaagg tgaggaactg gacggcaaga agctttgctt cgtctccatt 240
ctgcgtgccg gtaacggcct tctggacgga atgctggatc tcgtaccgtc tgcgcgtgtg 300
gggcatatcg ggctgcggcg cgaccatgag acgctggaag tcagcgaata ctatttcaat 360
atgccgagcg atgttccggg ccggacctgc atcgttctgg acccgatgct ggccaccggg 420
cactcggctg ccgctgctgt aacgcgcgtc aaggaagcgg gagcgattgc gcctgttttt 480
gcctgccttc tggcggctcc ggaaggaatt gctcacatga cggaactgca tccggatgtg 540
caggtcgtga cgtgttgtgt ggatcagaag cttgatgagc acggctatat tgtcccgggt 600
ctgggcgatg ctggcgaccg tctgttcggg acccgctaa 639

Claims (12)

1.一种提高L-山梨糖产量和生产强度的方法，其特征在于，敲除氧化葡萄糖酸杆菌L-山梨糖代谢副产物形成相关的基因；所述代谢副产物形成相关的基因为：GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3、NADH-DH和NADH-dependent ADH；所述GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述XDH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述ALDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GA-5-DH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；所述XDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述sDH SLC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PTS的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述PQQ-dependent DH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述NADH-DH的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述NADH-dependent ADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌为G.oxydansCGMCC 1.110。
4.一种产L-山梨糖的基因工程菌，其特征在于，以氧化葡萄糖酸杆菌为出发菌，敲除产L-山梨糖代谢途径中合成山梨糖的主要代谢副产物形成相关的基因；所述主要代谢副产物包括但不限于果糖；所述主要代谢副产物形成相关的基因为：GDH、GA-5-DH、XDH2、ALDH、XDH、sDH SLC、PTS、PQQ-dependent DH3、NADH–DH和NADH-dependent ADH；所述GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述XDH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述ALDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述GA-5-DH的核苷酸序列如SEQID NO.2所述的核苷酸序列；所述XDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述sDH SLC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PTS的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述PQQ-dependent DH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述NADH-DH的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；所述NADH-dependent ADH的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
6.一种构建权利要求4或5所述基因工程菌的方法，其特征在于，分别扩增待敲除的目的基因在基因组位置上、下游各800～1200bp的序列，并与抗性基因和负向筛选标记基因融合，构建敲除框：左侧同源臂-抗性基因-负向筛选标记基因-右侧同源臂；将敲除框连接到载体上，转化至宿主的感受态细胞中；在含抗性标记物的培养基中进行首次筛选，并在含有负向筛选标记物类似物的培养基再次筛选。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗性基因为编码抗生素抗性的基因，；所述负向筛选标记基因为upp基因，所述负向筛选标记物类似物为5-氟尿嘧啶。
8.一种生产L-山梨糖的方法，其特征在于，将权利要求4～5任一所述的基因工程菌活化，接种至发酵培养基，在28～30℃，200～220rpm条件下进行发酵培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基每L含有D-山梨醇280-350g，酵母膏0.4-0.6g，液体玉米浆1.5-2.5g，轻质碳酸钙0.5-1g。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述活化是将基因工程菌在种子培养基中培养，获得种子液；所述种子培养基每L含有：D-山梨醇180-200g，酵母膏6-8g，碳酸钙2-4g。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述种子液由甘油管直接接种三角瓶培养48h后得到一级种子，一级种子OD600为2-3；按照接种量1％进行转接，培养24h后得到发酵种子液，OD600为2-3；将发酵种子液按照接种量为25％转接到发酵罐，37℃发酵。
12.权利要求1～3任一所述的方法或权利要求4～5任一所述的基因工程菌在制备含L-山梨糖的产品方面的应用。
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