CN107699536A - 一种基因工程菌及其在生产d‑1,2,4‑丁三醇中的应用 - Google Patents

一种基因工程菌及其在生产d‑1,2,4‑丁三醇中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基因工程菌及其在生产D‑1,2,4‑丁三醇中的应用。该基因工程菌为构建克隆表达2‑酮酸脱羧酶基因MdlC和木糖脱氢酶基因XylB,木糖酸脱水酶基因YjhG和醇脱氢酶基因YqhD,并将构建好的基因转入宿主菌BL21(DE3)的细胞内得基因工程菌BL21‑02,在此基因工程菌的基础上筛选新的木糖酸脱水酶，得到新的基因工程菌，经发酵培养生产D‑1,2,4‑丁三醇。本发明通过筛选所提供的木糖酸脱水酶基因CcXylD,能够提高D‑木糖合成D‑1,2,4‑丁三醇的能力。再将本发明中最适的木糖酸脱水酶基因CcXylD与来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的α‑酮酸脱羧酶KdcA共同应用到D‑1,2,4‑丁三醇生产过程中，得到最优菌株BL21‑15,最终BT产量可达10.66g/L。

Description

一种基因工程菌及其在生产D-1,2,4-丁三醇中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因工程菌及其在生产D-1,2,4-丁三醇中的应用。
背景技术
D-1,2,4-丁三醇 （简称BT）是一种四碳的多元醇，性质与甘油类似，广泛应用于医药、农药、化妆品、造纸、高分子材料、烟草、军工等领域。BT及其相关衍生物是许多天然产物合成中的重要底物，也是许多手性化合物的合成前体：军事上，由于BT的硝基化合物冲击敏感性低、热稳定性好、低毒性、吸湿性好，与其它含能增塑剂混合使用，可显著提高以硝化纤维素为基火药的低温力学性能。因此，BT常作为 1,2,4-丁三醇三硝酸酯 (BTTN) 的合成前体，后者可代替硝化甘油作为推进剂和含能增塑剂，并具有更优的理化性质。医药方面，BT可被用作阳离子脂质体和多种药物的合成前体，BT还可以用来制备降胆固醇类药Movinolin、抗癌药物 compatin、治疗皮肤病药物羟基二十碳四烯酸(12-HETE)及艾滋病药物 3-羟基-四氢呋喃。此外，BT 还可用作可消除硝基化合物对人体的毒害，减少焦油成分危害的卷烟添加剂，可用作高分子材料的交联剂，增加材料的强度和硬度，还可用作高级墨水 的防干剂、高级服装表面处理剂、陶瓷加工助剂、特殊用途包装与储运等。
目前工业上使用的 D-1,2,4-丁三醇都是由反应条件苛刻的化学法合成。自Wagner以3-丁烯醇为原料合成D-1,2,4-丁三醇以来，合成方法不断改进，先后有苹果酸还原法、丙烯醇法、2-丁烯-1,4-二醇的汞氧化水合法、2-丁烯-1,4-二醇的酸催化法、马来酸及其酯的氢化法、3-丁烯-1-醇的氧化水合法等。由于化学合成法存在反应条件苛刻、污染物排放严重等诸多缺点,部分研究者将目光转向更为经济和环保的生物合成技术。
2003 年，Niu等首先提出了BT的生物合成法。通过在大肠杆菌( Escherichia coli)中构建异源代谢途径，以 D-木糖或 L-阿拉伯糖为底物，经过四步酶催化实现。整个工艺使用了莓实假单胞菌 Pseudomonas fragi 和大肠杆菌 Escherichia coli 两种微生物作为催化剂。之后，研究者将BT 转化途径的四步酶都在 E. coli 中进行表达，用 E. coli 即可完成整个 BT 的生物转化，大大简化了转化工艺。但从目前已有报道来看，用重组 E. coli 生产 BT 的催化效率较低，导致 BT产量无法满足工业生产的需求。如果要进一步提高 BT 的转化效率，首先必须对 BT 合成途径进行系统地优化，找出催化限速步骤，精确调节催化各个步骤酶的表达量，以实现最大的转化通量。
发明内容
针对现有BT生物转化途径仍面临的效率低的问题，本发明考察了不同来源的木糖酸脱水酶和不同来源的2-酮酸脱羧酶。筛选得到最优的木糖酸脱水酶基因CcXylD和最优的α-酮酸脱羧酶基因KdcA，构建得到一株基因工程菌BL21-15，该菌株D-1,2,4-丁三醇产量较高，可达10.66g/L。
本发明采用的技术方案为:
一种基因工程菌，该基因工程菌是首先构建克隆表达α-酮酸脱羧酶基因KdcA、木糖脱氢酶基因XylB, 木糖酸脱水酶基因CcXylD和醇脱氢酶基因YqhD, 并将构建好的基因转入宿主菌细胞内得基因工程菌，所述基因工程菌用于发酵生产D-1,2,4-丁三醇。
所述α-酮酸脱羧酶基因KdcA来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），所述木糖酸脱水酶基因CcXylD来源于新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）。
本发明公开了来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的α-酮酸脱羧酶在D-1,2,4-丁三醇生产过程中的应用,分别构建克隆表达不同的2-酮酸脱羧酶基因KivD, KdcA和Aro10,并将构建好的基因与D-木糖脱氢酶基因XylB,D-木糖酸脱水酶YjhG和醇脱氢酶基因YqhD共同转入宿主菌BL21(DE3)的细胞内得基因工程菌BL21-08,BL21-09,BL21-10。
本发明公开了来源于新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）的木糖酸脱水酶在D-1,2,4-丁三醇生产过程中的应用,构建克隆表达不同的木糖酸脱水酶的基因CcXylD,PsXylD和HvXylD,并将构建好的基因与苯甲酰甲酸脱羧酶基因MdlC,D-木糖脱氢酶基因XylB和醇脱氢酶基因YqhD共同转入宿主菌BL21(DE3)的细胞内得基因工程菌BL21-11，BL21-12，BL21-13。
分别通过发酵实验验证，得到最优的木糖酸脱水酶基因CcXylD和最优的α-酮酸脱羧酶基因KdcA，并与D-木糖脱氢酶基因XylB，醇脱氢酶基因YqhD共同转入宿主菌BL21(DE3)的细胞内构建得到一株高产BT的基因工程菌BL21-15,培养基因工程菌BL21-15并接种至发酵培养基中生产BT。
所述的2-酮酸脱羧酶分别是苯甲酰甲酸脱羧酶MdlC (恶臭假单胞杆菌，Pseudomonas putida), GenBank: AY143338.1、α-酮异戊酸脱羧酶KivD (乳酸乳球菌KF147，Lactococcus lactis subsp. lactis (strain KF147)), GenBank: AIS03677.1、α-酮酸脱羧酶KdcA (乳酸乳球菌，Lactococcus lactis), GenBank: AAS49166.1、苯丙酮酸脱羧酶Aro10 (酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae), GenBank: KZV12623.1；所述的木糖酸脱水酶分别是木糖酸脱水酶(大肠杆菌，Escherichia coli), Gene ID: 946829、木糖酸脱水酶 (新月柄杆菌，Caulobacter crescentus)，Gene ID: 7329902,木糖酸脱水酶(恶臭假单胞菌，Pseudomonas sp.SHC52),GenBank: CDF93987.1,木糖酸脱水酶(沃氏嗜盐菌，Haloferax volcanii), NCBI Reference Sequence: NC_013964.1；所述的D-木糖脱氢酶，Gene ID: 7329904；所述的醇脱氢酶，GenBank: ADK47404.1。
木糖酸脱水酶基因CcXylD基因序列见SEQ.NO.1所示。
作为优选的是,所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
作为上述方法优选的是,具体包括以下步骤：
步骤1，构建克隆表达α-酮酸脱羧酶基因KdcA和木糖脱氢酶基因XylB,木糖酸脱水酶基因CcXylD和醇脱氢酶基因YqhD。
步骤2，KdcA基因被插入质粒pTRC99a 的Nco Ⅰ和Sac Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-KdcA,XylB基因被插入质粒pTRC99a 的Nco Ⅰ和BamHⅠ位点之间，从而获得pTRC99a-XylB。然后通过PCR得到带有TRC启动子的XylB片段，将该片段插入质粒pTRC-KdcA的Sac Ⅰ和BamH Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-KdcA-TRC-XylB。
步骤3，将基因片段CcXylD、YqhD分别插入pCWJ质粒，得到重组质粒 pCWJ-CcXylD和pCWJ-YqhD。以pCWJ-YqhD质粒为模板扩增出带有TRC启动子的YqhD片段，将片段插入质粒pCWJ-CcXylD，得到质粒pCWJ-CcXylD-TRC-YqhD。
步骤4，将质粒pTRC-KdcA-TRC-XylB和质粒pCWJ-CcXylD-TRC-YqhD共同转入宿主菌BL21（DE3）细胞内得基因工程菌BL21-15。
步骤5，发酵培养基的制备
发酵培养基:蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10 g/L， D-木糖 25g/L ，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L
步骤6,将基因工程菌接种至发酵培养基中,加入IPTG诱导发酵得产物D-1,2,4-丁三醇。
作为步骤5优选的是，发酵时间60~72h，发酵温度30~37℃。
有益效果
本发明通过筛选不同的木糖酸脱水酶与2-酮酸脱羧酶，筛选得到木糖酸脱水酶CcXylD与α-酮酸脱羧酶基因KdcA共同表达，能够显著提高D-1,2,4-丁三醇的产量，优化了D-木糖生产D-1，2，4-丁三醇的路径，该菌株D-1,2,4-丁三醇产量高达10.66g/L。
附图说明
图1不同的2-酮酸脱羧酶对发酵生产BT的影响；
图2为不同的木糖酸脱水酶对发酵生产BT的影响；
图3基因工程菌BL21-15发酵生产BT
图4为诱导时机对发酵生产BT的影响。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。本发明中，重组表达载体可以用本领域熟知的方法导入宿主细胞中，这些方法包括：氯化钙热激法，电转化法，PEG介导法，基因枪法等。
本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
下面结合实验室具体的实验数据进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作，例如《分子克隆实验指南》，或者制造厂商所建议的条件。
本发明分别构建克隆表达不同的2-酮酸脱羧酶基因KivD, KdcA和Aro10,并将构建好的基因与D-木糖脱氢酶基因XylB,D-木糖酸脱水酶YjhG和醇脱氢酶基因YqhD共同转入宿主菌BL21(DE3)的细胞内得基因工程菌BL21-08,BL21-09,BL21-10。
本发明构建克隆表达不同的木糖酸脱水酶的基因CcXylD, PsXylD和HvXylD,并将构建好的基因与苯甲酰甲酸脱羧酶基因MdlC,D-木糖脱氢酶基因XylB和醇脱氢酶基因YqhD共同转入宿主菌BL21(DE3)的细胞内得基因工程菌BL21-11，BL21-12，BL21-13。
所述的2-酮酸脱羧酶分别是苯甲酰甲酸脱羧酶MdlC (恶臭假单胞杆菌，Pseudomonas putida), GenBank: AY143338.1、α-酮异戊酸脱羧酶KivD (乳酸乳球菌KF147，Lactococcus lactis subsp. lactis (strain KF147)), GenBank: AIS03677.1、α-酮酸脱羧酶KdcA (乳酸乳球菌，Lactococcus lactis), GenBank: AAS49166.1、苯丙酮酸脱羧酶Aro10 (酿酒酵母，Saccharomyces cerevisiae), GenBank: KZV12623.1；所述的木糖酸脱水酶分别是木糖酸脱水酶(大肠杆菌，Escherichia coli), Gene ID: 946829、木糖酸脱水酶 (新月柄杆菌，Caulobacter crescentus)，Gene ID: 7329902,木糖酸脱水酶(恶臭假单胞菌，Pseudomonas sp.SHC52),GenBank: CDF93987.1,木糖酸脱水酶(沃氏嗜盐菌，Haloferax volcanii), NCBI Reference Sequence: NC_013964.1；所述的D-木糖脱氢酶，Gene ID: 7329904；所述的醇脱氢酶，GenBank: ADK47404.1。
实施例1 构建基因工程菌BL21-02、 BL21-08、BL21-09、 BL21-10
1）构建克隆表达2-酮酸脱羧酶基因MdlC、KivD、KdcA、Aro10；木糖脱氢酶基因XylB、D-木糖酸脱水酶YjhG和醇脱氢酶基因YqhD；D-木糖酸脱水酶YjhG (Escherichia coli),GeneID: 946829；所述的木糖脱氢酶基因XylB，Gene ID: 7329904；所述的醇脱氢酶基因YqhD，GenBank: ADK47404.1；所述α-酮酸脱羧酶 (Lactococcus lactis), GenBank:AAS49166.1；
2） 2-酮酸脱羧酶基因MdlC、KivD、KdcA、Aro10分别被插入质粒pTRC99a （TransGen）的Nco Ⅰ和Sac Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-MdlC、pTRC-KivD、pTRC-KdcA、pTRC-Aro10,XylB基因被插入质粒pTRC99a 的Nco Ⅰ和BamHⅠ位点之间，从而获得pTRC99a-XylB。然后通过PCR得到带有TRC启动子的XylB片段，将该片段分别插入质粒pTRC-MdlC、pTRC-KivD、pTRC-KdcA、pTRC-Aro10的Sac Ⅰ和BamH Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-MdlC-TRC-XylB、pTRC-KivD-TRC-XylB、pTRC-KdcA-TRC-XylB、pTRC-Aro10-TRC-XylB。
3）将基因片段YjhG、YqhD分别插入pCWJ质粒， 到重组质粒 pCWJ-YjhG和pCWJ-YqhD。以pCWJ-YqhD质粒为模板扩增出带有TRC启动子的YqhD片段，将片段插入质粒pCWJ-YjhG，得到质粒pCWJ-YjhG-TRC-YqhD。
4）将质粒pTRC-MdlC-TRC-XylB、pTRC-KivD-TRC-XylB、pTRC-KdcA-TRC-XylB、pTRC-Aro10-TRC-XylB分别和质粒pCWJ-YjhG-TRC-YqhD共同转入宿主菌BL21（DE3）细胞内得基因工程菌BL21-02、 BL21-08、BL21-09、 BL21-10。
实施例2基因工程菌BL21-11，BL21-12，BL21-13的构建
1) 构建克隆表达苯甲酰甲酸脱羧酶基因MdlC和木糖脱氢酶基因XylB,木糖酸脱水酶基因CcXylD、PsXylD、HvXylD和醇脱氢酶基因YqhD。
2）MdlC基因被插入质粒pTRC99a 的Nco Ⅰ和Sac Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-MdlC,XylB基因被插入质粒pTRC99a 的Nco Ⅰ和BamHⅠ位点之间，从而获得pTRC99a-XylB。然后通过PCR得到带有TRC启动子的XylB片段，将该片段插入质粒pTRC-MdlC的Sac Ⅰ和BamH Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-MdlC-TRC-XylB。
3）将基因片段CcXylD、PsXylD、HvXylD、YqhD分别插入pCWJ质粒， 得到重组质粒pCWJ-CcXylD、pCWJ-PsXylD、pCWJ-HvXylD和pCWJ-YqhD。以pCWJ-YqhD质粒为模板扩增出带有TRC启动子的YqhD片段，将片段分别插入质粒pCWJ-CcXylD、pCWJ-PsXylD、pCWJ-HvXylD，得到质粒pCWJ-CcXylD-TRC-YqhD、pCWJ-PsXylD-TRC-YqhD、pCWJ-HvXylD-TRC-YqhD。
4）将质粒pTRC-MdlC-TRC-XylB分别和质粒pCWJ-CcXylD-TRC-YqhD、pCWJ-PsXylD-TRC-YqhD、pCWJ-HvXylD-TRC-YqhD共同转入宿主菌BL21（DE3）细胞内得基因工程菌BL21-11、BL21-12、BL21-13。
实施例3 基因工程菌BL21-02、 BL21-08、BL21-09、 BL21-10发酵生产D-1,2,4-丁三醇
平板培养：
将储存于-80℃的甘油冻存菌取出，在平板培养基（蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl10 g/L，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L ）上进行划线操作，然后将平板置于37℃培养箱培养12-16h。
种子液培养：
向50 mL离心管中加入5 mL种子培养基（蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10 g/L，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L ），挑取少量甘油冻存菌进行接种，在200 rpm、37 ℃条件下培养10~12 h。
摇瓶发酵培养：
在500 mL摇瓶中装入50 mL发酵培养基（蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10 g/L，D-木糖 25g/L ，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L），接种量为1 %，转速为200 rpm，培养温度为37℃，发酵时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导，并加入10g/LCaCO3作为缓冲。每隔12h取样1-2mL，离心取上清，进行液相检测。
通过发酵结果比较（图1），来源于Lactococcus lactis的α-酮酸脱羧酶KdcA的基因工程菌有更高的催化效率，能够提高重组菌株合成BT的能力，比来源于Pseudomonas putida的苯甲酰甲酸脱羧酶MdlC和来源于Lactococcus lactis subsp. lactis (strain KF147)的α-酮异戊酸脱羧酶KivD分别提高了102%，58.97%。
实施例4基因工程菌BL21-02、 BL21-11、BL21-12、 BL21-13发酵生产D-1,2,4-丁三醇
平板培养：
将储存于-80℃的甘油冻存菌取出，在平板培养基（蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl10 g/L，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L ）上进行划线操作，然后将平板置于37℃培养箱培养12-16h。
种子液培养：
向50 mL离心管中加入5 mL种子培养基（蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10 g/L，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L ），挑取少量甘油冻存菌进行接种，在200 rpm、37 ℃条件下培养10~12 h。
摇瓶发酵培养：
在500 mL摇瓶中装入50 mL发酵培养基（蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10 g/L，D-木糖 25g/L ，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L），接种量为1 %，转速为200 rpm，培养温度为37℃，发酵时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导，并加入10g/LCaCO3作为缓冲。每隔12h取样1-2mL，离心取上清，进行液相检测。
通过发酵结果比较（图2），来源于新月柄杆菌的木糖酸脱水酶CcXylD有更高的催化效率，能够提高重组菌株合成BT的能力，比来源于大肠杆菌的木糖酸脱水酶YjhG和来源于恶臭假单胞菌的木糖酸脱水酶分别提高了53.32%，29.23%。
实施例5构建基因工程菌BL21-15
构建克隆表达α-酮酸脱羧酶基因KdcA，木糖脱氢酶基因XylB,木糖酸脱水酶基因CcXylD和醇脱氢酶基因YqhD。
1）α-酮酸脱羧酶基因KdcA被插入质粒pTRC99a （TransGen）的Nco Ⅰ和Sac Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-KdcA,XylB基因被插入质粒pTRC99a 的Nco Ⅰ和BamHⅠ位点之间，从而获得pTRC99a-XylB。然后通过PCR得到带有TRC启动子的XylB片段，将该片段插入质粒pTRC-KdcA的Sac Ⅰ和BamH Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-KdcA-TRC-XylB。
2）将木糖酸脱水酶基因片段CcXylD和醇脱氢酶基因YqhD分别插入pCWJ质粒， 得到重组质粒pCWJ-CcXylD和pCWJ-YqhD。以pCWJ-YqhD质粒为模板扩增出带有TRC启动子的YqhD片段，将片段插入质粒pCWJ-CcXylD，得到质粒pCWJ-CcXylD-TRC-YqhD。
4）将构建得到的质粒pTRC-KdcA-TRC-XylB和pCWJ-CcXylD-TRC-YqhD共同转入宿主菌BL21（DE3）细胞内得基因工程菌BL21-15。
实施例6 基因工程菌BL21-15发酵生产D-1,2,4-丁三醇
将储存于-80℃的甘油冻存菌取出，在平板培养基（蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl10 g/L，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L ）上进行划线操作，然后将平板置于37℃培养箱培养12-16h。
种子液培养：向50 mL离心管中加入5 mL种子培养基（蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10 g/L，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L ），挑取少量甘油冻存菌进行接种，在200 rpm、37 ℃条件下培养10~12 h。
摇瓶发酵培养：在500 mL摇瓶中装入50 mL发酵培养基（蛋白胨 10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10 g/L， D-木糖 25g/L ，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L），接种量为1%，转速为200 rpm，培养温度为37℃，发酵初始时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导，并加入10g/LCaCO3作为缓冲，发酵60~72h。每隔12h取样1-2mL，离心取上清，进行液相检测。
经液相检测，发酵结果如图3，D-1,2,4-丁三醇的产量显著提高，最终可达10.66g/L，摩尔收率60.32%。
实施例7 诱导时机对重组菌株BL21-15发酵产BT的影响
对于基因工程菌，诱导时机是影响菌体生长和蛋白表达的一个重要因素，过早诱导会抑制菌体的生长，而诱导滞后会影响蛋白的表达。本实验选择BL21-15作为实验菌株，分别在OD为0.025、0.2、0.4、0.6、0.8时对菌体进行诱导，结果如图4所示。若在接种时便加入IPTG诱导，BT的产量最高，说明此时机诱导有利于提高菌株活力。若菌株OD600长到0.4之后再进行诱导，菌株活力会受到明显抑制，说明蛋白表达受到严重影响。因此本试验确定最佳的诱导时机为接种时便加入IPTG诱导。
检测结果
D-1，2，4-丁三醇的高效液相色谱检测方法
D-1，2，4-丁三醇的检测条件为：Agilent Technologies1290 高效液相色谱；Bio-RadAminex® HPX-87H IonExclusion Column (300 mm × 7.8 mm) 有机酸柱；流动相为5mmol/L H2SO4；流速0.6 mL/min，柱温55 ℃，进样量20 μL，
示差检测器。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种基因工程菌及其在生产D-1,2,4-丁三醇中的应用
<141> 2017-11-27
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1776
<212> DNA
<213> 新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)
<400> 1
atgtctaacc gtaccccgcg tcgtttccgt tctcgtgact ggttcgacaa cccggaccac 60
atcgacatga ccgctctgta cctggaacgt ttcatgaact acggtatcac cccggaagaa 120
ctgcgttctg gtaaaccgat catcggtatc gctcagaccg gttctgacat ctctccgtgc 180
aaccgtatcc acctggacct ggttcagcgt gttcgtgacg gtatccgtga cgctggtggt 240
atcccgatgg aattcccggt tcacccgatc ttcgaaaact gccgtcgtcc gaccgctgct 300
ctggaccgta acctgtctta cctgggtctg gttgaaaccc tgcacggtta cccgatcgac 360
gctgttgttc tgaccaccgg ttgcgacaaa accaccccgg ctggtatcat ggctgctacc 420
accgttaaca tcccggctat cgttctgtct ggtggtccga tgctggacgg ttggcacgaa 480
aacgaactgg ttggttctgg taccgttatc tggcgttctc gtcgtaaact ggctgctggt 540
gaaatcaccg aagaagaatt catcgaccgt gctgcttctt ctgctccgtc tgctggtcac 600
tgcaacacca tgggtaccgc ttctaccatg aacgctgttg ctgaagctct gggtctgtct 660
ctgaccggtt gcgctgctat cccggctccg taccgtgaac gtggtcagat ggcttacaaa 720
accggtcagc gtatcgttga cctggcttac gacgacgtta aaccgctgga catcctgacc 780
aaacaggctt tcgaaaacgc tatcgctctg gttgctgctg ctggtggttc taccaacgct 840
cagccgcaca tcgttgctat ggctcgtcac gctggtgttg aaatcaccgc tgacgactgg 900
cgtgctgctt acgacatccc gctgatcgtt aacatgcagc cggctggtaa atacctgggt 960
gaacgtttcc accgtgctgg tggtgctccg gctgttctgt gggaactgct gcagcagggt 1020
cgtctgcacg gtgacgttct gaccgttacc ggtaaaacca tgtctgaaaa cctgcagggt 1080
cgtgaaacct ctgaccgtga agttatcttc ccgtaccacg aaccgctggc tgaaaaagct 1140
ggtttcctgg ttctgaaagg taacctgttc gacttcgcta tcatgaaatc ttctgttatc 1200
ggtgaagaat tccgtaaacg ttacctgtct cagccgggtc aggaaggtgt tttcgaagct 1260
cgtgctatcg ttttcgacgg ttctgacgac taccacaaac gtatcaacga cccggctctg 1320
gaaatcgacg aacgttgcat cctggttatc cgtggtgctg gtccgatcgg ttggccgggt 1380
tctgctgaag ttgttaacat gcagccgccg gaccacctgc tgaaaaaagg tatcatgtct 1440
ctgccgaccc tgggtgacgg tcgtcagtct ggtaccgctg actctccgtc tatcctgaac 1500
gcttctccgg aatctgctat cggtggtggt ctgtcttggc tgcgtaccgg tgacaccatc 1560
cgtatcgacc tgaacaccgg tcgttgcgac gctctggttg acgaagctac catcgctgct 1620
cgtaaacagg acggtatccc ggctgttccg gctaccatga ccccgtggca ggaaatctac 1680
cgtgctcacg cttctcagct ggacaccggt ggtgttctgg aattcgctgt taaataccag 1740
gacctggctg ctaaactgcc gcgtcacaac cactaa 1776
<210> 2
<211> 1968
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtctgttc gcaatatttt tgctgacgag agccacgata tttacaccgt cagaacgcac 60
gccgatggcc cggacggcga actcccatta accgcagaga tgcttatcaa ccgcccgagc 120
ggggatctgt tcggtatgac catgaatgcc ggaatgggtt ggtctccgga cgagctggat 180
cgggacggta ttttactgct cagtacactc ggtggcttac gcggcgcaga cggtaaaccc 240
gtggcgctgg cgttgcacca ggggcattac gaactggaca tccagatgaa agcggcggcc 300
gaggttatta aagccaacca tgccctgccc tatgccgtgt acgtctccga tccttgtgac 360
gggcgtactc agggtacaac ggggatgttt gattcgctac cataccgaaa tgacgcatcg 420
atggtaatgc gccgccttat tcgctctctg cccgacgcga aagcagttat tggtgtggcg 480
agttgcgata aggggcttcc ggccaccatg atggcactcg ccgcgcagca caacatcgca 540
accgtgctgg tccccggcgg cgcgacgctg cccgcaaagg atggagaaga caacggcaag 600
gtgcaaacca ttggcgcacg cttcgccaat ggcgaattat ctctacagga cgcacgccgt 660
gcgggctgta aagcctgtgc ctcttccggc ggcggctgtc aatttttggg cactgccggg 720
acatctcagg tggtggccga aggattggga ctggcaatcc cacattcagc cctggcccct 780
tccggtgagc ctgtgtggcg ggagatcgcc agagcttccg cgcgagctgc gctgaacctg 840
agtcaaaaag gcatcaccac ccgggaaatt ctcaccgata aagcgataga gaatgcgatg 900
acggtccatg ccgcgttcgg tggttcaaca aacctgctgt tacacatccc ggcaattgct 960
caccaggcag gttgccatat cccgaccgtt gatgactgga tccgcatcaa caagcgcgtg 1020
ccccgactgg tgagcgtact gcctaatggc ccggtttatc atccaacggt caatgccttt 1080
atggcaggtg gtgtgccgga agtcatgttg catctgcgca gcctcggatt gttgcatgaa 1140
gacgttatga cggttaccgg cagcacgctg aaagaaaacc tcgactggtg ggagcactcc 1200
gaacggcgtc agcggttcaa gcaactcctg ctcgatcagg aacaaatcaa cgctgacgaa 1260
gtgatcatgt ctccgcagca agcaaaagcg cgcggattaa cctcaactat caccttcccg 1320
gtgggcaata ttgcgccaga aggttcggtg atcaaatcca ccgccattga cccctcgatg 1380
attgatgagc aaggtatcta ttaccataaa ggtgtggcga aggtttatct gtccgagaaa 1440
agtgcgattt acgatatcaa acatgacaag atcaaggcgg gcgatattct ggtcattatt 1500
ggcgttggac cttcaggtac agggatggaa gaaacctacc aggttaccag tgccctgaag 1560
catctgtcat acggtaagca tgtttcgtta atcaccgatg cacgtttctc gggcgtttct 1620
actggcgcgt gcatcggcca tgtggggcca gaagcgctgg ccggaggccc catcggtaaa 1680
ttacgcaccg gggatttaat tgaaattaaa attgattgtc gcgagcttca cggcgaagtc 1740
aatttcctcg gaacccgtag cgatgaacaa ttaccttcac aggaggaggc aactgcaata 1800
ttaaatgcca gacccagcca tcaggattta cttcccgatc ctgaattgcc agatgatacc 1860
cggctatggg caatgcttca ggccgtgagt ggtgggacat ggaccggttg tatttatgat 1920
gtaaacaaaa ttggcgcggc tttgcgcgat tttatgaata aaaactga 1968
<210> 3
<211> 1785
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtctgaca ccccgaaacg tcgtctgcgt tctgaacagt ggttcaacga cccggctcac 60
gctgacatga ccgctctgta cgttgaacgt tacatgaact acggtatgac ccgtgaagaa 120
ctgcaatctg gtcgtccgat catcggtatc gctcagaccg gttctgacct gaccccgtgc 180
aaccgtcacc acctggaact ggctcagcgt gttaaagctg gtatccgtga cgctggtggt 240
atcccgatgg aatttccggt tcacccgatc gctgaacagt ctcgtcgtcc gaccgctgct 300
ctggaccgta acctggctta cctgggtctg gttgaaatcc tgcacggtta cccgctggac 360
ggtgttgttc tgaccaccgg ttgcgacaaa accaccccgg cttgcctgat ggctgctgct 420
accaccgacc tgccggctat cgttctgtct ggtggtccga tgctggacgg tcactacaaa 480
ggtgacctga tcggttctgg taccgttctg tggcacgctc gtaacctgat ggctgctggt 540
gaaatcgact acgaaggttt catggaaatg accaccgctg cttctccgtc tgttggtcac 600
tgcaacacta tgggtaccgc tctgtctatg aacgctctgg ctgaagctct gggtatgtct 660
ctgccgggtt gcgcttctat cccggctccg taccgtgaac gtggtcagat ggcttacgct 720
accggtaaac gtatctgcga actggttcgt caggacatcc gtccgtctca gatcatgacc 780
cgtcaggctt tcgaaaacgc tatcgctgtt gcttctgctc tgggtgcttc ttctaactgc 840
ccgccgcacc tgatcgctat cgctcgtcac atgggtgttg aactgtctct ggacgactgg 900
cagcgtatcg gtgaagacgt tccgctgctg gttaactgca tgccggctgg taaatacctg 960
ggtgaaggtt tccaccgtgc tggtggtgtt ccgtctgtta tgcacgaact gcaaaaagct 1020
ggtcgtctgc acaccgactg cgctaccgtt tctggtcgta ccatcggtga aatcgttggt 1080
aactctcgta ccaacgacgt tgacgttatc cacccgttcg acaccccgct gaaacaccgt 1140
gctggtttca tcgttctgtc tggtaacttc ttcgactctg ctatcatgaa aatgtctgtt 1200
gttggtgaag cgttccgtaa aacctacctg tctgaaccgg gtgctgaaaa ctctttcgaa 1260
gctcgtgcta tcgttttcga aggtccggaa gactaccacg ctcgtatcga cgacccggct 1320
ctggacatcg acgaacgttg catcctggtt gttcgtggtg ttggtaccgt tggttacccg 1380
ggttctgctg aagttgttaa catggctccg ccggctgctc tgatcaaacg tggtatcgac 1440
tctctgccgt gcctgggtga cggtcgtcag tctggtacct ctgcttctcc gtctatcctg 1500
aacatgtctc cggaagctgc tgttggtggt ggtctggctc tgctgaaaac caacgaccgt 1560
ctgaaagttg acctgaacac ccgtaccgtt aacctgctga tcgacgaagc tgaaatggaa 1620
cgtcgtcgtc gtgaatgggt tccgcagatc ccgccgtctc agaccccgtg gcaggaactg 1680
taccgtcagc tggttggtca gctgtctacc ggtggttgcc tggaaccggc taccctgcac 1740
ctgcgtgtta tcgctcgttc tggtgaaccg cgtcactctc actaa 1785
<210> 4
<211> 1239
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggttgaac aggctaaact gtctgacccg aacgctgaat acaccatgcg tgacctgtct 60
gctgaaacca tcgacatcac caacccgcgt ggtggtgttc gtgacgctga aatcaccgac 120
gttcagacca ctatggttga cggtaactac ccgtggatct tagttcgtgt ttacaccgac 180
gctggtgttg ttggtaccgg tgaagcgtac tggggtggtg gtgacaccgc tatcatcgaa 240
cgtatgaaac cgttcctggt tggtgaaaac ccgctggaca tcgaccgtct gtacgaacac 300
ctggttcaga aaatgtctgg tgaaggttct gtttctggta aagttatctc tgctatctct 360
ggtatcgaaa tcgctctgca cgacgttgct ggtaaactgc tggacgttcc ggcttaccag 420
ctggttggtg gtaaataccg tgacgaagtt cgtgtttact gcgacctgca caccgaagac 480
gaagctaacc cgcaggcttg cgctgaagaa ggtgttcgtg ttgttgaaga actgggttac 540
gacgctatca aattcgacct ggacgttccg tctggtcacg aaaaagaccg tgctaaccgt 600
cacctgcgta acccggaaat cgaccacaaa gttgaaatcg ttgaagctgt taccgaagct 660
gttggtgacc gtgctgacgt tgctttcgac tgccactggt ctttcaccgg tggttctgct 720
aaacgtctgg cttctgaact ggaagactac gacgtttggt ggctggaaga cccggttccg 780
ccggaaaacc acgacgttca gaaactggtt acccagtcta ccaccacccc gatcgctgtt 840
ggtgaaaacg tttaccgtaa attcggtcag cgtaccctgc tggaaccgca ggctgttgac 900
atcatcgctc cggacctgcc gcgtgttggt ggtatgcgtg aaacccgtaa aatcgctgac 960
ctggctgaca tgtactacat cccggttgct atgcacaacg tttcttctcc gatcggtact 1020
atggcttctg ctcaggttgc tgctgctatc ccgaactctc tggctctgga ataccactct 1080
taccagctgg gttggtggga agacctggtt gaagaagacg acctgatcca gaacggtcac 1140
atggaaatcc cggaaaaacc gggtctgggt ctgaccctgg acctggacgc tgttgaagct 1200
cacatggttg aaggtgaaac cctgttcgac gaagaataa 1239
<210> 5
<211> 1644
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)
<400> 5
atgtataccg tgggcgatta tctgctggat cgcctgcatg aactgggcat cgaagaaatt 60
tttggcgtgc cgggcgatta taatctgcag ttcctggatc agattattag ccgcgaagac 120
atgaaatgga ttggcaatgc gaatgaactg aatgcgagct atatggcgga tggctatgcg 180
cgcaccaaaa aagcagcggc gtttctgact acctttggcg tgggtgaact gagcgcgatt 240
aatggtctgg cgggcagcta tgcagaaaat ctgccggtgg tggaaattgt tggtagcccg 300
accagcaaag tgcagaatga tggcaaattt gtgcatcata ccctggcgga tggcgatttt 360
aaacacttca tgaagatgca tgaaccggtt accgcggcgc gtactttatt gaccgcggaa 420
aatgcgacct atgaaattga tcgcgtgctg agccagttgc tgaaagaacg caaaccggtg 480
tatattaatc tgccggtgga tgttgcggca gcgaaagcgg aaaaaccagc gctgagcctg 540
gaaaaagaaa gcagcaccac caataccacc gaacaggtga ttctgagcaa aattgaggag 600
agcctgaaaa atgcgcagaa accggtggtt attgcgggcc atgaagtgat tagctttggc 660
ctggaaaaaa ccgtgaccca gtttgtgagc gaaaccaaac tgccgattac caccctgaat 720
tttggcaaaa gcgcggtgga tgaaagcctg ccgagctttc tgggcattta taatggcaag 780
ctgagcgaaa ttagcctgaa gaactttgtg gaaagcgcgg attttattct gatgctgggc 840
gtgaaactga ccgatagcag caccggcgcg tttacccatc atctggacga gaataagatg 900
atcagcctga atattgacga gggcatcatc tttaacaagg tggtggagga ttttgatttt 960
cgcgcggtgg ttagcagtct gagcgaactg aaaggcattg aatatgaggg ccagtatatc 1020
gataaacagt acgaggagtt tattccgagc agcgcgccat taagccagga tcgtttgtgg 1080
caagcggtgg aaagcctgac ccagagcaat gaaaccattg tggcggaaca gggcaccagt 1140
ttttttggcg cgagcaccat ttttctgaaa agcaacagcc gctttattgg ccaaccactg 1200
tggggcagca ttggctatac ctttccagcg gcgttgggta gccagattgc ggataaagaa 1260
agccgccatc tgctgtttat tggcgatggc agcttgcaac tgaccgtgca agaactgggc 1320
ctgagcattc gcgaaaaact gaatccgatc tgcttcatca tcaacaacga tggctatacc 1380
gtggaacgcg aaattcatgg cccgacccag agctataatg atatcccgat gtggaattat 1440
agcaaactgc cggaaacctt tggcgcgacc gaagatcgtg tggtgagcaa aattgtgcgc 1500
accgagaatg aatttgtgag cgtgatgaaa gaagcgcagg cggatgtgaa tcgcatgtat 1560
tggattgaac tggtgctgga aaaagaagat gcgccgaaac tgctgaaaaa aatgggcaaa 1620
ctgtttgcgg aacagaacaa gtga 1644
<210> 6
<211> 1587
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)
<400> 6
atggcttctg ttcacggtac cacctacgaa ctgctgcgtc gtcagggtat cgacaccgtt 60
ttcggtaacc cgggttctaa cgaactgccg ttcctgaaag acttcccgga agacttccgt 120
tacatcctgg ctctgcagga agcttgcgtt gttggtatcg ctgacggtta cgctcaggct 180
tctcgtaaac cggctttcat caacctgcac tctgctgctg gtaccggtaa cgctatgggt 240
gctctgtcta acgcttggaa ctctcactct ccgctgatcg ttaccgctgg tcagcagacc 300
cgtgctatga tcggtgttga agctctgctg accaacgttg acgctgctaa cctgccgcgt 360
ccgctggtta aatggtctta cgaaccggct tctgctgctg aagttccgca cgctatgtct 420
cgtgctatcc acatggcttc tatggctccg cagggtccgg tttacctgtc tgttccgtac 480
gacgactggg acaaagacgc tgacccgcag tctcaccacc tgttcgaccg tcacgtttct 540
tcttctgttc gtctgaacga ccaggacctg gacatcctgg ttaaagctct gaactctgct 600
tctaacccgg ctatcgttct gggtccggac gttgacgctg ctaacgctaa cgctgactgc 660
gttatgctgg ctgaacgtct gaaagctccg gtttgggttg ctccgtctgc tccgcgttgc 720
ccgttcccga cccgtcaccc gtgcttccgt ggtctgatgc cggctggtat cgctgctatc 780
tctcagctgc tggaaggtca cgacgttgtt ctggttatcg gtgctccggt tttccgttac 840
caccagtacg acccgggtca gtacctgaaa ccgggtaccc gtctgatctc tgttacctgc 900
gacccgctgg aagctgctcg tgctccgatg ggtgacgcta tcgttgctga catcggtgct 960
atggcttctg ctctggctaa cctggttgaa gaatcttctc gtcagctgcc gaccgctgct 1020
ccggaaccgg ctaaagttga ccaggacgct ggtcgtctgc acccggaaac cgttttcgac 1080
accctgaacg acatggctcc ggaaaacgct atctacctga acgaatctac ctctaccacc 1140
gctcagatgt ggcagcgtct gaacatgcgt aacccgggtt cttactactt ctgcgctgct 1200
ggtggtctgg gtttcgctct gccggctgct atcggtgttc agctggctga accggaacgt 1260
caggttatcg ctgttatcgg tgacggttct gctaactact ctatctctgc tctgtggacc 1320
gctgctcagt acaacatccc gaccatcttc gttatcatga acaacggtac ctacggtgct 1380
ctgcgttggt tcgctggtgt tctggaagct gaaaacgttc cgggtctgga cgttccgggt 1440
atcgacttcc gtgctctggc taaaggttac ggtgttcagg ctctgaaagc tgacaacctg 1500
gaacagctga aaggttctct gcaggaagct ctgtctgcta aaggtccggt tctgatcgaa 1560
gtttctaccg tttctccggt taaataa 1587
<210> 7
<211> 1908
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 7
atggcaccgg tgaccattga aaaattcgtg aaccaggaag aacgccatct ggtgagcaat 60
cgcagcgcga ccattccatt tggcgagtac atttttaaac gcctgctgag cattgatacc 120
aaaagcgtgt ttggcgtgcc gggcgatttt aatctgagcc tgctggaata tctgtatagc 180
ccgagcgttg aaagcgcggg cttacgttgg gttggcacct gcaatgaact gaatgcggcg 240
tatgcggcgg atggttatag ccgctacagc aataaaattg gctgcctgat taccacctat 300
ggcgtgggtg aactgagtgc gctgaatggt attgcgggca gctttgcgga aaatgtgaag 360
gtgctgcata ttgtgggcgt ggcgaaaagc attgatagcc gcagcagcaa ttttagcgat 420
cgcaatctgc atcatctggt gccgcagctg catgatagca attttaaagg cccgaaccat 480
aaagtgtatc acgacatggt gaaagatcgc gtggcatgca gtgtggcgta tctggaagat 540
attgaaaccg cgtgcgatca ggtggataat gtgatccgcg acatttacaa gtatagcaag 600
ccgggctata tttttgtgcc ggcggatttt gcggatatga gcgtgacctg cgataatctg 660
gtgaatgtgc cgcgcattag ccagcaggat tgcattgtgt atccgagcga aaatcagctg 720
agcgacatca ttaataagat caccagctgg atctatagca gcaaaacccc ggcgattctg 780
ggtgatgtgc tgaccgatcg ctatggcgtg agcaattttc tgaacaagct gatttgcaaa 840
accggcatct ggaattttag caccgtgatg ggcaaaagcg tgattgatga aagcaatccg 900
acctatatgg gccagtataa tggcaaagaa ggcctgaaac aggtgtatga gcattttgaa 960
ctgtgcgatc tggtgctgca ttttggcgtg gatatcaacg aaatcaacaa cggccattac 1020
accttcacct ataaaccgaa cgcgaagatt attcagttcc acccgaatta tattcgcctg 1080
gtggataccc gtcagggcaa tgaacagatg ttcaagggca ttaattttgc gccgatcctg 1140
aaagaactgt acaagcgcat tgatgtgagc aaactgagcc tgcagtatga tagcaatgtg 1200
acccagtata ccaatgaaac catgcgcctg gaagatccga ccaatggcca gagcagcatt 1260
attacccagg tgcatctgca gaaaaccatg ccgaaatttc tgaatccggg cgatgtggtg 1320
gtttgtgaaa ccggcagctt tcagtttagc gtgcgcgatt ttgcgtttcc gagccagctg 1380
aaatatatta gccagggctt ctttctgagc attggcatgg cattgccagc agcgttaggt 1440
gttggcattg cgatgcagga tcatagcaac gcgcatatta atggcggcaa cgtgaaggaa 1500
gattataaac cgcgcctgat tctgtttgaa ggcgatggtg cggcgcaaat gaccattcag 1560
gaactgagca ccattctgaa atgcaatatt ccgctggaag tgatcatttg gaacaacaac 1620
ggctatacca ttgaacgcgc gattatgggt ccaacccgca gctataatga tgtgatgagc 1680
tggaaatgga ccaaactgtt tgaagcgttc ggcgattttg atggcaaata caccaatagc 1740
accctgattc agtgcccgag caaactggcg ctgaaactgg aagaactgaa aaacagcaat 1800
aaacgcagcg gcattgaact gctggaagtg aaactgggcg aactggattt tccggaacag 1860
ctgaaatgca tggttgaagc ggcagcgctg aaacgcaata agaagtga 1908
<210> 8
<211> 1647
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)
<400> 8
atgtataccg tgggcgatta tctgctggat cgcctgcatg aactgggcat cgaagaaatt 60
tttggcgtgc cgggcgatta taatctgcag ttcctggatc agattattag ccgcaaggat 120
atgaaatggg tgggcaatgc gaatgaactg aatgcgagct atatggcgga tggctatgcg 180
cgcaccaaaa aagcggcggc gtttctgact acctttggcg ttggtgaact gagcgcggtt 240
aatggtctgg cgggcagcta tgcagaaaat ctgccggtgg tggaaattgt tggtagcccg 300
accagcaaag tgcagaatga aggcaaattt gtgcatcata ccctggcgga tggcgatttt 360
aagcacttca tgaagatgca tgaaccggtt accgcggcgc gtaccttatt gaccgcggaa 420
aatgcgaccg tggaaattga tcgcgtgctg agcgcgttac tgaaagaacg caagccggtg 480
tatattaatc tgccggtgga tgttgcggca gcgaaagcgg aaaaaccaag cctgccgctg 540
aaaaaagaaa atccgaccag caataccagc gatcaggaaa tcctgaataa aatccaggag 600
agcctgaaaa atgcgaaaaa gccgattgtg attaccggcc acgaaattat tagcttcggc 660
ctggaaaata ccgtgaccca gtttattagc aaaaccaagc tgccgattac caccctgaat 720
tttggcaaaa gcagcgtgga tgaaaccctg ccgagctttc tgggcattta taatggcaaa 780
ctgagcgaac cgaacctgaa agaatttgtg gaaagcgcgg attttattct gatgctgggc 840
gtgaaactga ccgatagcag cactggcgcg tttacccatc atctgaacga gaacaagatg 900
atcagcctga atatcgacga aggcaagatt tttaacgaaa gcatccagaa ctttgacttt 960
gaaagcctga ttagcagcct gctggatctg agcggcattg aatataaggg caagtacatc 1020
gataagaagc aggaggattt tgtgccgagc aatgcgctgt taagccagga tcgtctgtgg 1080
caggcggttg aaaatctgac ccagagcaat gaaaccattg tggcggaaca gggcaccagc 1140
ttttttggcg cgagcagcat ttttctgaaa ccgaagagcc attttattgg ccagccgctg 1200
tggggtagca ttggctatac ctttccagca gcgctgggca gtcaaattgc ggataaagaa 1260
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ctggcgattc gcgaaaaaat taacccgatc tgcttcatca tcaacaatga tggctatacc 1380
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agcaaactgc cggaaagctt tggcgcgacc gaagaacgtg tggtgagcaa aattgtgcgc 1500
accgagaatg aatttgtgag cgtgatgaaa gaagcgcagg ccgatccgaa tcgcatgtat 1560
tggattgaac tggtgctggc gaaagaagat gcgccgaaag tgctgaaaaa aatgggcaaa 1620
ctgtttgcgg aacagaacaa gagctaa 1647

Claims (8)

1.一种基因工程菌，其特征在于，构建克隆表达α-酮酸脱羧酶基因KdcA、木糖脱氢酶基因XylB, 木糖酸脱水酶基因CcXylD和醇脱氢酶基因YqhD, 并将构建好的基因转入宿主菌细胞内得基因工程菌，所述基因工程菌用于发酵生产D-1,2,4-丁三醇。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述α-酮酸脱羧酶基因KdcA来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），所述木糖酸脱水酶基因CcXylD来源于新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于所述的宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
4.权利要求1所述基因工程菌的构建方法,其特征在于：包括如下步骤：
步骤1，构建克隆表达α-酮酸脱羧酶基因KdcA和木糖脱氢酶基因XylB,木糖酸脱水酶基因CcXylD和醇脱氢酶基因YqhD；
步骤2，KdcA基因被插入质粒pTRC99a 的NcoⅠ和Sac Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-KdcA,XylB基因被插入质粒pTRC99a 的NcoⅠ和BamHⅠ位点之间，从而获得pTRC99a-XylB；然后通过PCR得到带有TRC启动子的XylB片段，将该片段插入质粒pTRC-KdcA的Sac Ⅰ和BamH Ⅰ位点之间，得到质粒pTRC-KdcA-TRC-XylB；
步骤3，将基因片段CcXylD、YqhD分别插入pCWJ质粒，得到重组质粒 pCWJ-CcXylD和pCWJ-YqhD；以pCWJ-YqhD质粒为模板扩增出带有TRC启动子的YqhD片段，将片段插入质粒pCWJ-CcXylD，得到质粒pCWJ-CcXylD-TRC-YqhD；
步骤4，将质粒pTRC-KdcA-TRC-XylB和质粒pCWJ-CcXylD-TRC-YqhD共同转入宿主菌BL21（DE3）细胞内得基因工程菌BL21-15。
5.权利要求1所述的基因工程菌在发酵生产D-1,2,4-丁三醇中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将基因工程菌接种至发酵培养基中，加入IPTG诱导发酵得产物D-1,2,4-丁三醇。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为: 蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10 g/L， D-木糖 25g/L ，氨苄霉素100 mg/L, 氯霉素 68 mg/L 。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于，发酵温度为30~37℃，发酵时间为60~72h。
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