CN114350688A

CN114350688A - guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用

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Publication number: CN114350688A
Application number: CN202111620877.7A
Authority: CN
Inventors: 陈云鹏; 冯保云; 章梦婷
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114350688B

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用。本发明利用原核表达载体pET28a(+)构建固氮菌GXGL‑4A的guaA基因表达载体，将其转化至野生株GXGL‑4A，获得阳性转化株，该菌株在培养时通过添加微量的IPTG诱导，即可高表达嗜铁素。现有技术相比，本发明通过表达固氮菌自身基因组中的guaA基因就能显著提高该菌嗜铁素产率，所得到的转化株可以用作植物促生菌，在原有能固氮的基础上增加对土壤中铁的吸收，帮助植物根系从土壤等环境中获取更多的铁元素，增强植株长势，同时竞争土壤中病原菌的铁营养，帮助植物提高抗病性。

Description

guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用。

背景技术

铁元素是生物生长发育的必需营养元素，参与多种酶的合成和生命体代谢功能的发挥，如细胞色素氧化酶、铁氧还蛋白、固氮酶等。铁在地壳中含量较高，但大部分形态不可被生物直接利用。有些植物根际促生菌能分泌可以与铁离子高效结合的小分子物质，称为嗜铁素。在缺铁的情况下，这些细菌就可以通过产生嗜铁素鳌合土壤中有限的Fe³⁺，供给植物和自身的生长发育，此时使环境中的铁浓度被降低，病原微生物由于缺铁生长受限制甚至死亡。细菌嗜铁素与生物防治能力密切相关，提高植物促生菌如固氮菌等的嗜铁素合成能力有助于将这些菌改造成高络合铁的菌剂用于农业生产，提高作物产量和对病害的抗性。

由于病原微生物自身不能产生嗜铁素或产生量很少，在这种竞争作用下，病原微生物因铁缺乏而不能生长繁殖。除此之外，嗜铁素还可与其他金属元素形成螯合物，促进植物对Al³⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺金属元素等的富集，大量的科研资料证实嗜铁素在促进植物生长发育、提高植物的抗逆性等方面发挥至关重要的作用。

对非豆科植物来源的联合固氮菌进行遗传改造以扩大其应用范围是近年来微生物固氮领域的研究热点。由于固氮菌自身具有很好的生物固氮能力，如果再进一步提高其产嗜铁素能力，就可以将固氮菌改造成为理想的植物生长促生菌，提高作物对土壤缺铁逆境的适应能力，并有效抑制土壤中的病原菌，提高植株健康水平，减少农药和化学氮肥的使用量，最终达到保护环境，实现农作物优质的绿色高效生产。而传统的提高细菌嗜铁素产率的思路局限于通过优化细菌培养条件，如最适发酵时间、起始pH值、接种量、装液量及Fe³⁺浓度等来获得最高产量的嗜铁素。方法复杂，影响因素多，操作不方便，在实际应用中很难推广，不实用，因而在拮抗菌株的抑菌活性开发及生防杀菌剂的创制中效果并不理想。为了能更好地利用包括固氮菌在内的植物促生菌，将之开发成多功能的生物菌剂，需要新思路和方法。

核苷酸的从头合成是由简单的前体小分子物质(磷酸核糖，CO₂，氨基酸等)先经过11步反应合成次黄嘌呤核苷酸(inosine monophosphate IMP)，再由IMP通过不同代谢途径生成AMP和GMP(guanosine monophosphate，GMP)。GMP的生成首先需要IMP在IMP脱氢酶的催化下，生成黄嘌呤核苷酸(xanthosine monophosphate，XMP)，XPM再由guaA基因合成的GMP合成酶(GMPS)催化生成GMP。GMP对DNA和RNA的合成至关重要。此外，GMP合成酶催化生成GMP过程中产生的GTP参与了许多与细菌细胞分裂有关的生理活动。guaA基因在GMP最终生成中起关键作用，该基因和细胞分裂有关，且主要作用于XPM生成GMP的过程。利用过表达guaA基因来调控细菌嗜铁素的合成，从而达到高产嗜铁素的目的，这方面的研究尚未见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用。本发明可以很方便地获得高产细菌嗜铁素的转化子。这种方法适用于所有产嗜铁素的植物促生菌，如固氮菌、植物根际促生菌等，可方便地实现靶基因guaA的高表达，依靠其调控嗜铁素的高合成，操作简单有效。本发明的方法也适用于其他产嗜铁素细菌的遗传操作，通过遗传转化快速构建高产嗜铁素的转化株，迅速用于农业生产等。

本发明利用原核表达载体pET28a(+)构建固氮菌GXGL-4A的guaA基因表达载体，通过电击转化导入野生株GXGL-4A，获得阳性转化株，该菌株在培养时通过添加微量的IPTG诱导，即可高表达嗜铁素。所获得的高表达嗜铁素菌株能明显促进黄瓜幼苗的生长，在CAS检测平板上较野生株嗜铁环更大，能络合更多的铁，通过分光光度法测定证实过表达guaA基因的固氮菌转化株产更多嗜铁素，合成嗜铁素能力显著提高。与现有技术相比，本发明通过表达固氮菌自身基因组中的guaA基因就能显著提高该菌嗜铁素产率，所得到的转化株可以用作植物促生菌，在原有能固氮的基础上增加对土壤中铁的吸收，帮助植物根系从土壤等环境中获取更多的铁元素，增强植株长势，同时竞争土壤中病原菌的铁营养，帮助植物提高抗病性。实验结果表明，这种方法能有效提高固氮菌产嗜铁素的能力，是一种性价比高、简单有效的处理方法，在缺铁栽培环境中通过施用高表达guaA基因的固氮菌可以提高植物对铁逆境的适应能力，并减轻植物病害，是一种充分利用特定基因的表达来调控固氮菌产嗜铁素能力的方法，根据实际需要可以决定是否诱导，操作灵活，此方法将在固氮菌的嗜铁素合成调控及相关植物促生菌的遗传改造等领域有着广泛应用前景。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的第一个目的是提供一种目的基因在表达固氮菌嗜铁素中的应用，所述目的基因为guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种质粒在表达固氮菌嗜铁素中的应用，所述质粒包含guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个实施方式中，所述质粒为pET28a(+)-guaA。

本发明的第三个目的是提供一种菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用，所述菌株包含含有guaA基因的质粒，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个实施方式中，所述菌株为包含pET28a(+)-guaA的GXGL-4A；

所述GXGL-4A制备感受态细胞的方法包括以下步骤：

(1)普通LB培养基过夜培养带荚膜细菌，活化细菌；

(2)再以1％接种量接种于含有7.5g/L CaCl₂的培养基中培养到对数期；

(3)低温下离心收集细菌沉淀，PEB电击缓冲液洗去杂质和菌体碎片，得到细菌感受态细胞。

在本发明的一个实施方式中，在菌株培养时，添加IPTG诱导。

在本发明的一个实施方式中，所述IPTG的浓度为15-25mg/L。

本发明的第四个目的是提供一种目的基因在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，所述目的基因为guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明的第五个目的是提供一种质粒在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，所述质粒guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第六个目的是提供一种菌株在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，所述固氮菌包含含有guaA基因的质粒，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明采用遗传转化法，通过高表达调控基因guaA来实现菌株产嗜铁素能力的提升是一条可控高效的途径。本方法使用简单，质粒转化和目标基因的表达很容易操控实现，具有普遍的适用性，在植物促生菌、固氮菌等产嗜铁素调控方面有很好的推广价值。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过微量IPTG诱导guaA基因的表达，实现嗜铁素合成的人工调控，避免了优化细菌培养条件等繁琐操作和许多对嗜铁素合成有显著影响的外界环境因子的干扰，所得结果可靠，效果明显。研究发现细菌guaA基因与嗜铁素合成产率密切相关，尽管该基因对嗜铁素生物合成的具体调控机制目前并不清楚。

(2)本发明中guaA基因的高表达不会影响细菌细胞自身产生任何危害。所得到的转化株作为促生菌较对照野生株能显著促进植物的生长。

(3)本发明首次明确了guaA能够正向调节嗜铁素的生物合成，通过高表达guaA基因可以实现细菌嗜铁素的高产出。本发明采用特定的高渗LB培养基，即将常规的LB培养基中的NaCl(浓度10g/L)替换为7.5g/L CaCl₂，通过电击转化固氮菌GXGL-4A，得到转化子。

(4)本发明通过构建合适的基因表达载体，依据需要自主诱导高表达guaA基因，通过该基因的表达来调控嗜铁素的生物合成。实验结果表明，这种处理能有效地提高细菌嗜铁素得率，是一种性价比高、简单有效的处理方法，在细菌嗜铁素生物合成调控及植物促生菌基因工程操作中将有广泛应用前景。

(5)本发明的guaA基因、含guaA基因的质粒、包含含guaA基因质粒的菌株应用于制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂，尤其是当土壤缺铁或低铁时，应用高产嗜铁素菌株作为促生菌能显著提高植物对铁的吸收，做成菌剂后可用于农业生产或生态环境保护领域。

附图说明

图1是固氮菌GXGL-4A全基因组圈图。

图2是guaA基因的PCR克隆。

图3是guaA基因的系统发育树；其中，P：Proteobacteria；K：Kosakonia；E：Enterobacteriaceae；L：Leclercia；C：Citrobacter；S：Salmonella。

图4是GMP合成酶保守结构域预测。

图5是GMP合成酶三级结构预测。

图6是GMP合成酶氨基酸序列与其他细菌的多重比对。

图7是固氮菌GXGL-4A guaA基因敲除验证；其中，A：guaA上下游同源臂扩增；B：guaA同源臂融合扩增；C：guaA-pRE112菌落PCR鉴定；D：guaA-JD-F/guaA-JD-R鉴定敲除菌与野生菌；M：DL2000 DNA marker；UP：上游基因的扩增；Down：下游基因的扩增；UD：上下游融合基因的扩增；1-12：双抗平板上随机挑取的单交换子。

图8是原核表达载体pET-28a(+)物理图谱。

图9是guaA基因回补株和过表达株的PCR检测。

图10是固氮菌GXGL-4A转座突变株的PCR验证；其中，A：anfD-F/anfD-R；B：Screen1-F/Screen1-R；C：Screen2-F/Screen2-R；D：Screen3-F/screen3-R；M：Marker2000；4A：固氮菌GXGL-4A野生株；图中各泳道展示不同的突变株。

图11是突变株M246-2转座插入位点示意图；其中，Tr：Transcriptionalregulator(Locus tag:A3780_17060)；ADH：alcohol dehydrogenase(Locus tag:A3780_17065)；HP：hypothetical protein(Locus tag:A3780_17070)；Glyoxalase：(Locus tag:A3780_17075)；guaA：glutamine-hydrolyzing GMP synthase(Locus tag:A3780_17080)；IMPDH：IMP dehydrogenase(Locus tag:A3780_17085)；xseA：exodeoxyribonuclease VIIlarge subunit(Locus tag:A3780_17090)；Peptidase M4：(Locus tag:A3780_17095)；HP：hypothetical protein(Locus tag:A3780_17100)。

图12是目标菌株的生长曲线。

图13是目标菌株嗜铁素合成能力的检测。

图14是目标菌株对黄瓜的促生作用检测；其中，A为目标菌株对黄瓜株高和根长的影响；B为目标菌株对黄瓜株鲜重和根重的影响。

图15是目标菌株对黄瓜的促生作用实物图。

具体实施方式

本发明提供一种目的基因在表达固氮菌嗜铁素中的应用，所述目的基因为guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供一种质粒在表达固氮菌嗜铁素中的应用，所述质粒包含guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个实施方式中，所述质粒为pET28a(+)-guaA。

本发明提供一种菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用，所述菌株包含含有guaA基因的质粒，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

所述GXGL-4A制备感受态细胞的方法包括以下步骤：

(1)普通LB培养基过夜培养带荚膜细菌，活化细菌；

在本发明的一个实施方式中，在菌株培养时，添加IPTG诱导。

在本发明的一个实施方式中，所述IPTG的浓度为15-25mg/L。

本发明提供一种目的基因在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，所述目的基因为guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供一种质粒在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，所述质粒guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供一种菌株在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，所述固氮菌包含含有guaA基因的质粒，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

下述各实施例中，所用材料如无特殊说明，均为市售；所述技术或检测手段若无特殊说明均为本领域常规技术或检测手段。

实施例1

guaA基因的克隆与生物信息学分析

(1)固氮菌GXGL-4A全基因组测序

对固氮菌GXGL-4A进行了全基因组测序和基因注释(图1)，整个基因组全长5660197bp，GC含量53.94％，共注释了5261个基因。含有22个rRNA、86个tRNA以及131个其它非编码RNA。其中，GXGL-4A全基因组序列的收录号为CP015113.1；GXGL-4A在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏号为CGMCC No.12588。

1)根据基因注释结果，设计含guaA基因上下游序列的PCR扩增引物，进行扩增。所用正向引物5′-ATAACGCTGCCGACAAACTGGTG-3′；反向引物为5′-GTCGCCCGGAAATAGTTAAGCAA-3′。扩增条件：94℃5min；30cycle(94℃30s、55℃30s、72℃40s)，目标产物为1578bp(图2)。

2)对PCR扩增产物进行测序，验证序列正确性。

(2)guaA基因序列相似性比对与系统进化树构建

通过NCBI网站的Blastp功能进行guaA基因序列比对；采用软件MEGA6.0邻近法进行聚类分析，并构建进化树(图3)。

(3)guaA基因表达产物进行初步的生信预测分析，结果如下：

1)固氮菌GXGL-4A guaA基因表达产物的基本理化性质

通过在线工具Expasy分析guaA序列，可知该基因含有1578bp，翻译产物为525个氨基酸。guaA编码蛋白分子式为C₂₆₂₃H₄₁₁₃N₇₁₃O₇₆₈S₂₂，原子数为8239个，分子量为58631.05Da；理论等电点为5.31，含有75个酸性氨基酸Asp+Glu和55个碱性氨基酸Arg+Lys；脂溶性系数为94.27，平均亲水性为-0.1；不稳定系数是38.07，属于稳定蛋白。

2)固氮菌GXGL-4A GMP合成酶的结构

GMP合成酶在PSORT上预测其定位在细菌细胞质中，具有一个guaA的特定保守结构域，属于guaA超家族(图4)。SOMPA和SWISS-MODEL对GMP合成酶三级结构的预测表明GMP合成酶含有42.10％的α折叠、8.19％的β转角、18.86％的延伸主链和30.86％无规则卷曲(图5)。

3)固氮菌GXGL-4A GMP合酶氨基酸同源性分析

在NCBI上进行Blastp比对后，得到同源性较高的细菌guaA基因的氨基酸序列，再利用MEGA软件邻近法构建系统进化树，通过DNAman对不同属细菌的guaA氨基酸序列与固氮菌GXGL-4A进行同源性比对，结果如图6所示。Kosakonia属的K.radicincitans、K.oryzae、K.sacchari、K.oryziphila、K.arachidis、K.oryzendophytica及K.quasisacchari种的guaA遗传距离较近，在进化上较一致。固氮菌GXGL-4A隶属K.radicincitans，与K.oryzae的遗传距离最近，相似度最高。Proteobacteria、Enterobacteriaceae、Citrobacter、Leclercia和Salmonella属的菌与Kosakonia的遗传距离较远，其中Proteobacteriabacterium和Kosakonia arachidis进化方向上一致性强，Citrobacter、Leclercia和Salmonella属的细菌guaA聚为一大类，在进化上相似度较高。在进行GMP合成酶氨基酸的多重比对时发现不同属细菌整体一致性高达98.86％，Kosakonia属的细菌氨基酸序列完全一致，其他属的细菌仅有个别氨基酸序列的改变，说明该基因在进化上较为保守。

实施例2

固氮菌guaA基因敲除株的构建

(1)guaA基因敲除体系的构建

1)引物合成

以固氮菌guaA基因为模板，用Primer Premier 5.0设计上下游引物(表1)，合成敲除引物。相关的表达载体鉴定引物及guaA基因转化子鉴定引物均列于表1。

表1guaA基因敲除引物序列

2)敲除质粒构建

以固氮菌GXGL-4A DNA为模板，分别用guaA-SmaI-UP-F/guaA-UP-R、guaA-SmaI-down-R/guaA-down-F按照以下体系(表2)及条件对上下游序列进行扩增：

表2扩增体系

扩增条件：94℃5min；30cycles(94℃30s、55℃30s、72℃40s)；10℃保存。

PCR扩增产物经凝胶电泳检测后，切胶回收产物，按照如下体系(表3)及条件进行融合PCR扩增：

表3融合PCR扩增体系

扩增条件：94℃5min 2cycles(94℃3s、50℃30s、68℃1min)；30cycles(94℃30s、55℃30s、68℃1min)；10℃保存。

融合后的产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后与SmaI单酶切pRE112载体克隆连接，体系(表4)如下：

表4酶切体系

冰上放置30min，转化E.coli S17λpir感受态，涂布Cm平板。

3)菌落PCR鉴定

鉴定引物：guaA-SmaI-UP-F/guaA-SmaI-down-R体系：挑取单克隆至10μL无菌水中混匀后取0.5μL为模板按照如下体系(表5)：

表5验证体系

扩增条件：94℃5min 32Cycles(94℃30s、55℃30s、72℃1min10 s)10℃保存。

4)固氮菌guaA基因的敲除

guaA-pRE112 S17λpir和固氮菌GXGL-4A摇至对数生长期，按照1:1体积比进行结合实验，涂布Amp/Cm双抗平板，长出的单克隆用蔗糖培养基筛选双交换子。具体步骤如下：

利用PCR技术对固氮菌GXGL-4A guaA基因的上下游进行扩增(图7A)，说明上下游基因已成功被克隆。凝胶电泳结果显示上下游基因已融合(图7B)，对产物进行胶回收后构建敲除载体guaA-pRE112 S17λpir。将敲除载体guaA-pRE112S17λpir转入固氮菌GXGL-4A中，随机挑取12个Amp/Cm双抗平板上的克隆子做菌液PCR(图7C)，说明敲除载体guaA-pRE112 S17λpir已经成功转入固氮菌GXGL-4A中。用含蔗糖的平板进行双交换，挑取双交换菌落进行PCR验证，固氮菌GXGL-4A野生株作为对照，敲除株没有条带，野生株克隆出一条1500-2000bp的条带，与guaA基因条带长度1578bp相符，即说明guaA基因已被成功敲除，得到固氮菌GXGL-4A guaA基因敲除的突变株(ΔguaA)。

实施例3

固氮菌guaA基因过表达株及回补株的构建

(1)过表达株的构建

依据guaA基因序列信息进行全基因合成，两端分别引入BamHI和XhoI酶切位点，经BamHI/XhoI双切后连入双切后的pET28a(+)载体中(图8)，构建成表达载体pET28a(+)-guaA。当固氮菌GXGL-4A野生株培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，利用电击转化法将pET28a(+)-guaA表达载体转入宿主菌中，得到guaA基因过表达株。

(2)guaA基因回补株的构建

利用电击转化法将质粒pET28(+)-guaA转入固氮菌GXGL-4A敲除株中，即向含有细菌感受态细胞的PEB溶液中，加入待转入的pET28a(+)-guaA质粒至一定终浓度，轻轻混匀后冰浴，使细菌细胞和外源DNA充分接触；取混合液加入到0℃预冷过的电击杯中，冰浴，电击转化后立即加入SOC培养基，摇床上慢速恢复生长。最后，涂布含抗生素的平板，培养后挑取单菌落进行鉴定。转化子长出后采用PCR方法筛选转化子。其中，所用pET28(+)-guaA质粒终浓度为2.5ng/mL。

制备细菌感受态细胞体包括以下步骤：

1)无菌条件下接种细菌野生株，培养基采用普通LB培养基，37℃，180rpm摇菌，过夜培养带荚膜细菌，活化细菌；

2)过夜培养细菌按1％接种量接种到高渗LB培养基(含有7.5g/L CaCl₂的培养基)中，在37℃下培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时停止培养，冰浴。

当OD₆₀₀达到0.6-0.8时可收获较多的细菌细胞。此时细胞活性好，便于电击转化；

3)在4℃下4000rpm离心10min收集细菌，弃去上清液，采用事先冰浴过的PEB电击缓冲液(含272mmol/L蔗糖、1mmol/L MgCl₂、7mmol/L K₂HPO₄，用磷酸调节pH值至7.4，8磅压力下灭菌20min，于4℃保存备用)重悬细胞，重复离心、重悬2次，最后细菌细胞重悬在PEB电击缓冲液中，冰浴；得到细菌感受态细胞。

电击转化方法具体包括以下步骤：

1)电击转化：含有细菌的感受态细胞的PEB溶液中，加入质粒DNA或转座复合体，使其终浓度为2.5μg/mL，冰浴5分钟，然后，取此混合液200μL加入到0℃预冷过的电击杯中，电极距离0.2cm，冰上放置，在电压2.0Kv的Bio-Rad MicroPulser电击转化仪上电击，电击时间一般为2-3ms。

2)电击细菌细胞的恢复生长：电击结束后，立即加入800μL SOC培养基，37℃，150rpm培养1h。

3)涂布平板，筛选转化子的步骤：取100μL恢复生长细胞涂布含抗生素的平板，37℃培养箱中培养16-24h，挑取转化子，纯培养后进行鉴定。

在本发明的一个实施方式中，所述SOC恢复培养基：含0.5％(W/V)酵母抽提物、2％(W/V)胰蛋白胨、10mmol/L NaCl、2.5mmol/L KCl、10mmol/L MgCl₂、20mmol/L MgSO₄、20mmol/L葡萄糖。8磅压力下灭菌20min，于4℃保存备用。

(3)回补株及过表达株的PCR验证

由anfD引物和pET28a(+)-guaA引物做菌液PCR扩增验证。结果表明表达载体已经转入相应的宿主菌中(图9)，成功获得guaA基因的回补株和过表达株。其中，引物对anfD-F/anfD-R用于鉴定转化子是否是固氮菌GXGL-4A，引物序列分别为：anfD-F：5′-CGGGCAATCTCTTCATCAAT-3′、

anfD-R：5′-ATACCTTCGCGACCGATATG-3′，扩增产物为655bp。

实施例4

固氮菌guaA基因转座插入突变株的构建

(1)固氮菌GXGL-4A野生株的培养及电击转化方法

将固氮菌GXGL-4A在固体LB平板上划线，37℃培养12h，挑取单菌落至20mL LB中，37℃180rpm隔夜培养。以2％的接种量转接至100mLHO-1和HO-2中，180rpm摇菌，每30min测一次OD₆₀₀值，OD₆₀₀在0.6-0.8之间即可开始后续试验。冰浴15min后，8000rpm离心5min，弃上清液。无菌环境中加入等体积的PEB缓冲液悬浮，离心后弃上清液，该步骤重复操作2次。最后将固氮菌GXGL-4A菌体悬浮于800μLPEB中。参照Tn5转座试剂盒，加入1μL转座复合体，用枪头温和吸打混匀，静置冰浴5分钟。然后，取200μL固氮菌GXGL-4A和Tn5转座复合体的混合液加入冰上预冷的电击杯中，在2.0kV电压下电击。电击后加入0.8mL SOC，37℃100rpm培养1h。取200μL菌液均匀涂布在LB(含25mg/L Kan)平板上，37℃培养箱中培养一天后，挑取单菌落在含抗生素的液体LB培养基的1.5mL离心管中培养后进行鉴定。

(2)突变株的鉴定及筛选

以固氮菌GXGL-4A的anfD基因和Tn5基因序列为模板，设计引物(表6)进行PCR验证。PCR程序：预变性94℃10min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃1min，共进行35个循环，最后延伸72℃7min。

表6引物序列

(3)固氮菌GXGL-4A转座突变株的鉴定

anfD基因是固氮菌GXGL-4A特有的具有固氮功能的基因，为防止外因导致其他微生物的污染，利用anfD-F/anfD-R引物用于验证挑取的转化子是否为固氮菌GXGL-4A。Screen1-F/Screen1-R、Screen2-F/Screen2-R、Screen3-F/Screen3-R三对引物的模板链是Tn5转座子，目标产物片段大小分别为922bp、602bp和656bp，用于验证挑取的菌落是否为阳性菌株。转化子和野生株均能扩增出650bp左右的anfD条带(图10)。三种验证阳性转化子的引物均能扩增出与目标片段相似的条带，而对照组野生株则不能扩增出条带。三种引物均能取得较好的筛选效果。

(4)M246-2突变株的获得

建立了1个含1633株突变株的突变株库，从中筛选鉴定出1个突变株M246-2，基因组测序表明该突变株Tn5转座插入位点在guaA基因中(图11)。

实施例5

目标菌株生长曲线的测定

分别对固氮菌GXGL-4A、guaA基因敲除株、回补株和过表达株进行连续12h的生长情况监测，发现这些菌株的生长速率有差异。其中敲除株的对数期出现在5-9h之间。回补株、野生株和过表达株的生长曲线类似，对数期在3-6h之间，比敲除株提前2-3h。过表达株的含菌量高于回补株和野生株。敲除株在进入对数期前与野生株的生长速度差异不明显，但在进入对数期后其生长繁殖速度明显降低。在接种后12h，各菌的生长量逐渐趋于相近(图12)。

实施例6

目标菌株嗜铁素合成能力的检测

采用CAS平板法检测嗜铁素可知，guaA基因敲除株未见橙黄色嗜铁环产生，回补株的嗜铁环直径小于固氮菌GXGL-4A野生株，过表达株的嗜铁环直径比固氮菌GXGL-4A野生株大。定量检测结果表明，过表达株的嗜铁素产生量显著高于固氮菌GXGL-4A野生株，回补株的嗜铁素表达量低于GXGL-4A野生株，敲除株的产生量低于10％。说明guaA基因的敲除导致固氮菌GXGL-4A嗜铁素的产生受阻(图13)。

实施例7

目标菌株对黄瓜促生作用的测定

用目标菌株对黄瓜幼苗进行处理后，测定黄瓜的株高、株鲜重、根长和根鲜重等生理指标。结果表明，对照组(CK)的黄瓜株高和根长都显著低于处理组(图14A)，且各处理组间在高度上均无显著差异。过表达株在株鲜重和根重上都极显著高于其他处理组(图14B)。固氮菌GXGL-4A和回补株在黄瓜的各生理指标中均无显著差异，均高于对照组。敲除株的根重明显降低，与对照组无显著差异，且低于其他处理组。图15显示各处理下黄瓜植株整体情况。

实施例8

各菌株发酵液上清对玉米小斑病H.maydis分生孢子萌发的抑制测定

对分生孢子的萌发抑制测定共持续检测7h。在1h内H.maydis孢子未见萌发。2h时对照组孢子萌发率为8.3％，处理组未见孢子萌发。3h时，对照组的孢子萌发率为21.8％，回补株和ΔguaA敲除株发酵液培养的孢子萌发抑制率仍为100％；固氮菌GXGL-4A野生株发酵液处理组的抑制率为75％左右，过表达株发酵液处理组抑制率为91.9％。4-7h时，回补株和ΔguaA敲除株的孢子萌发抑制率仍保持在90％以上。第7h对照组的孢子萌发率为70.59％，过表达株和固氮菌GXGL-4A野生株发酵液处理组孢子萌发抑制率在80％左右(表7)。

表7固氮菌GXGL-4A目标菌株对H.maydis孢子萌发抑制活性的测定

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1578

<212> DNA

<213> GXGL-4A

<400> 1

atgacggaca acattcataa acatcgtatt ctcatcctcg acttcggttc tcagtacacc 60

cagctggttg cgcgccgcgt gcgtgaactg ggcgtttact gcgaactgtg ggcgtgggat 120

gtcaccgaag cgcagatccg cgacttcaac ccaagcggca tcatcctttc cggcggcccg 180

gaaagcacca ccgaagagaa cagcccgcgc gcaccgcagt atgtgttcga agccggtgtt 240

ccggtgctcg gcgtgtgcta cggcatgcag accatggcga tgcagcttgg cggccacgtt 300

gaaggttcta acgagcgtga attcggttac gcacaggttg aagtgcagac cgacagcgcg 360

ctggttcgcg gcattgaaga ttccctgacc gccgaaggca aagtgctgct tgacgtgtgg 420

atgagccacg gcgacaaagt gacggccatt ccgtccgatt tcgtaaccgt tgccagcacc 480

gaaagctgcc cgttcgccat catggcgaat gaagaaaaac gtttttacgg cgtgcagttc 540

cacccggaag tgacccacac ccgccagggc ctgcgtatgc tggagcgctt cgtgcgcgat 600

atctgccagt gcgaagcgct gtggaccccg gcaaaaatca tcgacgacgc ggttgaacgc 660

attcgtcagc aggttggcga cgataaagtg atcctcggcc tttccggtgg cgtggactcc 720

tccgtcaccg caatgctgct gcaccgcgcc atcggcaaaa acctgacctg cgtattcgtt 780

gataacggtc tgctgcgcct gaacgaagcc gctcaggtga tggacatgtt cggtgaccac 840

ttcggtctga acattgttca cgttcctgca gaagatcgct tcctttcagc actggctggc 900

gagaacgatc cggaagcaaa acgcaaaatc atcggccgcg tgttcgtgga agtgttcgac 960

gaagaggcac tgaagctgga agacgtgaaa tggctggcgc agggcactat ctacccggac 1020

gtgatcgaat ctgccgcatc cgcaaccggt aaagcgcacg ttattaaatc tcaccacaac 1080

gtgggcggtc tgccgaaaga gatgaagatg ggcctggttg agccgctgaa agagctgttc 1140

aaagacgaag tgcgtaaaat tggcctggaa ctcggcctgc cgtacgacat gctgtaccgt 1200

cacccgttcc cggggccggg ccttggcgtt cgcgtactgg gcgaagtgaa gaaagagtac 1260

tgcgacctgc tgcgtcgtgc cgatgcgatc tttatcgaag agctgcataa agccgacctc 1320

tacaacaaag tgagccaggc cttcaccgta ttcctgccgg tccgctccgt tggcgtgatg 1380

ggcgacggcc gtaaatacga ctgggttgtc tctctgcgtg cagtagaaac catcgatttt 1440

atgaccgcac actgggcgca cctgccgtac gatttcctcg gtcgcgtttc caaccgcatc 1500

atcaatgaag tgaacggtat ctcccgcgtg gtgtatgaca tcagcggcaa accgccagcg 1560

actattgagt gggaatga 1578

Claims

1.一种目的基因在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，所述目的基因为guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种质粒在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，所述质粒包含guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的一种质粒在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，所述质粒为pET28a(+)-guaA。

4.一种菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，所述菌株包含含有guaA基因的质粒，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的一种菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，所述菌株为包含pET28a(+)-guaA的GXGL-4A；

所述GXGL-4A制备感受态细胞的方法包括以下步骤：

(1)普通LB培养基过夜培养带荚膜细菌，活化细菌；

6.根据权利要求4所述的一种菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，在菌株培养时，添加IPTG诱导。

7.根据权利要求6所述的一种菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用，其特征在于，所述IPTG的浓度为15-25mg/L。

8.一种目的基因在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，其特征在于，所述目的基因为guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

9.一种质粒在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，其特征在于，所述质粒guaA基因，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

10.一种菌株在制备高产嗜铁素固氮菌菌剂或产嗜铁素的促生菌菌剂中的应用，其特征在于，所述固氮菌包含含有guaA基因的质粒，所述guaA基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。