KR20000040839A - 핵산 분해능이 약화되고 단백질 합성능이 강화된 변이 대장균 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대장균의 변이주에 속하고 돌연변이원에 의해 형질전환되어 5’-크산틸산 및 5’-구아닐산의 분해능이 크게 저하됨을 특징으로 함과 동시에 단백질 합성능이 크게 강화되어 단백질 과량 발현용 균주로 유용한 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이 돌연변이 균주를 이용하여 산업적으로 가치있는 5'-구아닐산이나 트레할로스 등을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 분해능이 약화되고 단백질 합성능이 강화된 변이 대장균(A mutated E. coli having decreased nucleic acid-decomposing capability and increased protein-producing capability)
본 발명은 5’-크산틸산(XMP)을 5’-구아닐산(GMP)으로 전환하는 반응의 전이율을 높이기 위해 돌연변이원의 처리에 의해 얻어진 핵산 분해능이 약화되고 균체내의 단백질 합성계가 특이적으로 크게 강화되어 XMP 아미나제(XMP aminase) 뿐만 아니라 여타 다른 단백질의 발현용 균주로 사용 가능한 미생물에 관한 것이다.
GMP는 모노소디움 글루타메이트(MSG) 및 5’-이노신산(IMP)과 더불어 조미료로서 직접 이용되고 있는 조미 식품의 식품첨가제로써 많은 양이 요구되고 있어 식품공업 분야에서 중요한 품목중의 하나이다.
지금까지 알려진 GMP의 제조방법으로서는 (1) 효모 세포로부터 추출한 리보핵산을 효소학적으로 분해하는 방법, (2) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적으로 인산화시키는 방법, (3) 미생물 발효법에 의한 GMP의 직접생산법 (4) 미생물 발효법으로 생산한 XMP를 코리네형 미생물을 이용하여 GMP로 전환시키는 방법(J. Ferment. Technol. Vol. 62, No. 2, pp 131-137) 및 (5) 미생물 발효법으로 생산한 XMP를 대장균을 이용하여 GMP로 전환시키는 방법 등이 있다. 위 방법중 (1)과 (2)의 방법은 원료공급의 문제와 수율 및 생산량이 적은점 등의 단점이 있으며 (3)의 방법은 GMP의 세포막투과성이 매우 낮아 공업적 이용이 불가능하여, (4)와 (5)의 방법이 현재 경제적으로 생산비용이 저렴하여 공업적으로 가장 널리 이용되고 있다.
(4)와 (5)의 방법과 같이 효소균체를 이용하여 XMP로부터 GMP를 제조하는 방법에는 XMP 아미나제(XMP aminase)라는 효소가 관여하며 이의 효소학적 반응 메카니즘은 다음의 반응식과 같이 나타낼 수 있다.
1. XMP + ATP + NH3 ------------→ GMP + AMP + PPi
XMP 아미나제
2. XMP + ATP + L-글루타민 -------------→ GMP + AMP + L-글루타메이트 + PPi
XMP 아미나제
상기 (4)와 (5)의 방법에 사용되는 또 다른 기질인 ATP는 값이 비싸므로 ATP의 첨가를 수반하는 방법에 있어서 효소학적 반응을 이용하여 GMP를 생산할 수 있는 경제적인 공정의 개발이 요구되어 왔으며, GMP 합성 반응계와 5’-아데닐산(AMP)을 재생하는 반응계를 병행시켜 ATP를 반복적으로 생산함으로써 반응공정의 ATP를 첨가할 필요가 없게 되었다. 즉 반응 부산물인 AMP로부터 ATP를 재생하는 반응계(이하 “ATP 재생계”라고 함)와 XMP, 암모니아 및(또는) 글루타민 및 ATP로부터 GMP를 생성하는 반응계(이하 “전환반응계”라고 함)를 조합시킨 공역반응을 이용하여 XMP로부터 GMP를 효과적으로 생산하는 반응을 수행할 수 있다. 현재 공업적으로 널리 이용되는 (4)와 (5)의 방법을 비교해보면 (4)의 방법에 비하여 (5)의 방법이 여러 가지 장점을 가지고 있다. ①XMP로부터 GMP를 생산하는 전환반응계에 대장균을 사용함으로써 공지의 기술인 유전자 재조합 기술을 이용하여 XMP 아미나제의 활성을 현저히 증가시킬 수 있다. ②현저히 증가된 XMP 아미나제의 활성으로 인해 XMP 발효액과 XMP 아미나제의 액량비를 조절하여 생산성 및 수율을 크게 증가시킬 수 있다. ③공업적인 XMP 생산균들은 강력한 ATP 재활성능을 가지고 있으므로 XMP로부터 GMP로의 전환에 유리하다. ④ 또한 반응계를 구성하는 2가지 활성이 서로 다른 2종의 미생물에 의해 수행되므로 2가지 활성을 각기 독립적으로 조절할 수 있어서 반응공정의 제어가 용이하다. 그러나 전환반응계에 야생균주인 대장균을 이용할 경우 이들의 핵산분해능(XMP →크산토신 →크산틴과 GMP →구아노신 → 구아닌)이 비교적 강하기 때문에 반응의 기질(XMP)과 생성물(GMP)의 농도가 감소하여 생산성에 악영향을 미치는 단점이 존재한다. 그러므로 위 방법이 공업적으로 이용되기 위해서는 핵산분해능이 약화된 균주의 개발이 선행되어야 하는 선결과제가 있다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 돌연변이원 처리에 의해 핵산분해능이 약화된 균주를 개발하는데 그 목적이 있다. 본 발명자들은 핵산분해능이 크게 약화된 변이주를 선별하기 위하여 여러 야생균주에 돌연변이원인 N-메틸-N’-니트로소구아니딘(NTG)을 처리하였고 그 결과 대장균 NM522, W3110 및 pop2136로부터 핵산분해능이 각각 70%, 74% 및 84% 감소한 변이주를 얻을 수 있었다. 이들은 각각 N238, W246 및 A106으로 명명하였다. 이들 변이주에 XMP 아미나제를 코딩하는 guaA 유전자와 트레할로스 생합성 효소를 코딩하는 트레할로스 신테이즈 유전자를 여러 가지의 단백질 발현용 플라스미드를 이용하여 도입한 결과 특이적으로 A106의 경우 모균주인 pop2136에 비하여 획기적으로 단백질 발현이 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 핵산분해능이 약화되고 단백질합성능이 강화된 돌연변이 균주 대장균(Escherichia coli) A106를 제공한다. 본 발명에서 개발된 이 변이주는 1998년 12월 12일자로 한국종균협회에 KFCC-11066으로 기탁되었다.
또한, 본 발명은 돌연변이 균주 대장균 A106에 단백질 코딩 유전자를 갖는 벡터가 함유하고 그 유전자를 고역가로 발현하는 형질전환 균주를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 단백질 코딩 유전자로서 XMP 아미나제 코딩 유전자 또는 트레할로스 신테이즈 유전자를 함유한 공지의 벡터로 본 발명의 대장균 A106을 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 미생물발효법에 있어서 XMP 아미나제 코딩 유전자를 함유한 벡터로 본 발명의 대장균 A106을 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 이용하여 5'-크산틸산으로부터 5'-구아닐산을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 미생물발효법에 있어서 트레할로스 신테이즈 코딩 유전자를 함유한 벡터로 본 발명의 대장균 A106을 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 이용하는 말토오스로부터 트레할로스를 제조하는 방법을 제공한다.
대장균 배양시에는 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, pH7.0)를 전기장 충격법에 의한 형질전환 후 발현시에는 SOC배지(2% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 20mM 포도당)를 각각 사용하였다. 엠피실린은 50mg/L의 농도가 되도록 첨가하였다. 전기장충격법(electroporation)에 의한 대장균 형질전환에는 BIO-RAD사 제품의 진펄서, 펄스조절기, 0.2cm 간극의 진 펄서 큐벳을 사용하였다. 본 발명에서 사용한 유전자 조작법은 주로 분자클로닝 실험 조작법(Molecular cloning; a laboratory manual, 2nd ed., Sambrook, J., E.F. Frisch, and T. Maniatis) 및 분자클로닝 기술의 지표(Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymol. vol. 152, Berger, S.L., A.R.Kimme) 등의 방법에 준하여 실시하였다
효소반응은 pH가 5.5 내지 10.5, 바람직하게는 6.5 내지 9.0이 적당하며, 반응 온도는 4℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 42℃가 적당하다. 기질농도는 XMP 및 GMP를 5g/L 내지 20g/L까지 사용할 수 있으며, 효소는 세포파쇄액을 사용하거나 정제하여 사용할 수 있다.
본 발명에 사용된 균주 및 플라스미드 및 배지는 다음의 표1 및 표2과 같다.
본 발명에 사용된 균주 및 플라스미드
균주 및 플라스미드 특 성 비 고
대장균 W3110 야생균주
대장균 NM522 hsd△5, △(lac-pro)〔F',Pro+,laclQZ△M15〕 Amersham
대장균 pop2136 F-, supE44, hsdR17, mcrA+,mcrB+,rk+, aroB, mal-
대장균 W246 W3110유래의 변이주 본 발명
대장균 N238 NM522유래의 변이주 본 발명
대장균 A106 pop2136유래의 변이주 본 발명
pUC18 Apr, 2.7kb New EnglandBiolabs
pTrc99A Apr, Ptrc, 4.2kb Pharmacia
pPL-lambda Apr, PL, 5.2kb Pharmacia
pGEMEX-2 Apr, T7, 4.0kb Pharmacia
pUGA16 pUC18에 1.67kb의 guaA DNA 절편함유, 4.37kb 본 발명
pTGA21 pTrc99A에 1.67kb의 guaA DNA 절편함유, 5.87kb 본 발명
pPGA48 pPL-lambda에 1.67kb의 guaA DNA 절편함유, 6.87kb 본 발명
pGGA09 pGEMEX-2에 1.67kb의 guaA DNA 절편함유, 5.67kb 본 발명
pUTS08 pUC18에 1.7kb의트레할로오스 신테이즈 유전자 절편함유, 4.47kb 본 발명
pTTS12 pTrc99A에 1.7kb의트레할로오스 신테이즈 유전자 절편함유, 5.97kb 본 발명
pPTS16 pPL-lambda에 1.7kb의트레할로오스 신테이즈 유전자 절편함유, 6.9kb 본 발명
pGTS19 pGEMEX-2에 1.7kb의트레할로오스 신테이즈 유전자 절편함유, 5.77kb 본 발명
본 발명에 사용된 배지의 조성
배 지 조 성
LB 효모 추출액 5g/L, 트립톤 10g/L,염화나트륨 10g/L
최소배지(글루코즈 함유) 염화나트륨 0.5g/L, 염화암모늄1g/L,이인산수소칼륨 3g/l, 한천 15g/L,글루코우스 20g/L, 이인산나트륨 12.4g/L
최소배지(XMP 함유) 염화나트륨 0.5g/L, 염화암모늄1g/L,이인산수소칼륨 3g/l, 한천 15g/L,XMP 10g/L, 이인산나트륨 12.4g/L, pH7.2
최소배지(GMP 함유) 염화나트륨 0.5g/L, 염화암모늄1g/L,이인산수소칼륨 3g/l, 한천 15g/L,GMP 10g/L, 이인산나트륨 12.4g/L, pH7.2
본 발명은 아래의 실시예로 좀더 구체적으로 예시될 것이다.
실시예 1
약화된 핵산 분해능 형질 도입
야생균주 대장균 W3110, NM522 및 pop2136을 LB배지에서 30℃, 16시간 동안 진탕 배양한다. 다시 LB 배지에 흡광도(562nm)가 0.3 이하가 되도록 접종한 후 30℃의 온도에서 흡광도(562nm)가 0.8 -1.0 이 될 때까지 진탕 배양하고 원심분리기를 사용하여 균체를 회수한다. 살균한 식염수를 이용하여 2회 세척한 후 동일 부피의 식염수에 현탁한다. 돌연변이원으로 NTG를 이용하여 60 내지 80㎍/ml의 농도로 얼음 속에서 1 시간 정치한 후 식염수로 3회 세척한다. 식염수로 현탁 후 XMP 또는 GMP를 함유한 최소배지에서 5-10시간 진탕배양하고 30-100㎍/mL의 암피실린을 처리하여 다시 10-20시간을 진탕배양한다. 원심분리기로 균체를 다시 회수하여 식염수로 3회 세척후 글루코즈 함유 한천배지와 XMP 또는 GMP를 함유한 한천배지에 도말하여 균체의 성장을 비교한다. XMP 또는 GMP를 함유한 한천배지에서 성장이 현저히 지연되는 콜로니를 선별하여 핵산 분해능의 역가를 확인한다. 핵산 분해능의 역가를 확인하기 위하여 선별된 콜로니들을 LB배지에서 초기 휴지기까지 키운 후 원심분리하여 균체를 분리한 뒤 세포파쇄하여 효소원으로 이용하였다. 핵산 분해능의 역가 분석조건은 기질농도 5-20g/L의 XMP 또는 GMP를 완충액은 140-180mM의 Tris(pH6.5-9.0), 20-30mM의 MgCl2, 250-350mM (NH4)2SO4에서, 온도는 25℃-42℃에서 3시간동안 실시한후 1.0%트리클로로아세트산을 첨가하여 원심분리하고 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 XMP, GMP 및 분해물들을 정량분석하였다. 그 결과 3종의 대장균으로부터 핵산 분해능이 70-85%까지 현저하게 감소한 3주의 변이주를 획득하고 이들을 각각 W246, N238, 및 A106으로 명명하였다(표3).
핵산분해능 역가 비교
균 주 XMP 분해능 GMP 분해능
비효소 활성(U1/mg 단백질) 상대활성도(변이주/모균주 *100) 비효소 활성(U2/mg 단백질) 상대활성도(변이주/모균주 *100)
대장균 W3110 7.9 100 11.2 100
변이주 W246 2.1 26.6 3.8 33.9
대장균 NM522 8.2 100 14.3 100
변이주 N238 2.5 30.5 4.1 28.7
대장균 pop2136 7.6 100 10.8 100
변이주 A106 1.2 15.8 1.9 17.6
U1: umol 감소된 XMP/분
U2: umol 감소된 GMP/분
실시예 2
XMP 아미나제 유전자의 서브클로닝 및 단백질 발현
(1) XMP 아미나제 유전자의 서브클로닝
실시예 1에서 얻어진 변이주들과 모균주들의 단백질 발현능을 비교하기 위하여 4종의 각기 다른 단백질 발현용 프로모터를 갖는 벡터들을 이용하여 XMP 아미나제 유전자를 공지의 유전자 재조합 기술을 이용하여 서브클로닝 하였다. 이들을 각각 pUGA16(pUC18-guaA), pTGA21(pTrc99A-guaA), pPGA48(pPL-lambda-guaA) 및 pGGA09(pGEMEX-2-guaA)으로 명명하고 대장균 및 그 변이주에 형질전환하여 다음 표4와 같이 서로 다른 9종의 형질전환체를 획득하였다
형질전환체들의 구성
형질전환체 균 주 플라스미드
pUC18/NM522 대장균 NM522 pUC18
pUGA16/NM522 대장균 NM522 pUGA16
pUGA16/N238 대장균 N238 pUGA16
pTGA21/NM522 대장균 NM522 pTGA21
pTGA21/N238 대장균 N238 pTGA21
pGGA09/NM522 대장균 NM522 pGGA09
pGGA09/N238 대장균 N238 pPGA09
pPGA48/pop2136 대장균 pop2136 pPGA48
pPGA48/A106 대장균 A106 pPGA48
(2) XMP 아미나제 유전자의 단백질 발현
상기 획득한 9종의 형질전환체들을 그들이 함유한 프로모터의 특성에 따라 이소프로필티오-β-D-갈라토시다제(IPTG) 또는 열처리에 의해 XMP 아미나제 유전자의 단백질 발현을 유도하였다.
① IPTG에 의한 단백질 발현: 대장균 NM522과 N238 유래의 7종의 형질전환체들을 SOC배지에서 30℃, 16시간 동안 진탕 배양한다. 다시 SOC배지에 흡광도(562nm)가 0.1 이하가 되도록 접종한 후 28-37℃의 온도에서 흡광도(562nm)가 0.5-1.0이 될 때까지 진탕 배양하고 1mM의 IPTG를 첨가하여 6-10시간 배양한다. 배양후 원심분리기를 사용하여 균체를 회수하고 식염수를 이용하여 1회 세척한다.
② 열처리에 의한 단백질 발현: 대장균 pop2136과 A106 유래의 형질전환체를 SOC배지에서 30℃, 16시간 동안 진탕 배양한다. 다시 SOC배지에 흡광도(562nm)가 0.1 이하가 되도록 접종한 후 25-30℃의 온도에서 흡광도(562nm)가 0.8 -1.0이 될 때까지 진탕 배양하고 이후 38-42℃의 온도에서 4-10시간 배양한다. 배양후 원심분리기를 사용하여 균체를 회수하고 식염수를 이용하여 1회 세척한다.
실시예 3
XMP 아미나제의 효소 역가 분석
실시예 2(2)에서 얻어진 형질전환체들의 균체를 적당량의 0.1M 트리스 완충액(pH 7.6)에 현탁하여 초음파 균체 분쇄기로 균체를 분쇄한 뒤 원심분리하여 얻어진 상등액을 농축하여 효소액으로 사용하였다. 이렇게 하여 얻어진 효소액에 2.4ml의 5'-크산틸산 아미나제 반응액(0.16M 트리스(pH 7.6), 30mM ATP, 16mM 염화 마그네슘, 30mM XMP, 0.33M 황산암모늄)을 첨가하여 35-50℃에서 6간 반응시킨 뒤, 0.1ml 반응액을 2.9ml의 1.0% 트리클로로아세트산에 첨가하여 원심분리하여 HPLC로 분석하였다. 그 결과 모균주에 비해 핵산분해능이 약화된 변이주들의 XMP 아미나제의 효소활성이 10% 내지 20%정도 증가되었음을 확인하였고 pop2136의 변이주인 pPGA48/A106의 경우 XMP 아미나제의 효소 활성이 특이적으로 70% 정도 현저하게 증가되었음을 확인하였다(표5).
실시예 4
트레할로스 신테이즈 유전자의 서브클로닝 및 효소 역가 분석
(1) 트레할로스 신테이즈 유전자의 서브클로닝
실시예 3에서 확인한 pPGA48/A106의 현저히 증가한 단백질 합성능이 변이주인 A106 균주 고유의 특성으로 기인한 것인지 여부를 확인하기 위하여 핵산 분해능과 직접적으로 관련이 없는 것으로 사료되는 트레할로스 신테이즈 유전자의 단백질 발현능을 확인하였다. 실시예 1에서 얻어진 변이주들과 모균주들의 단백질 발현능을 비교하기 위하여, 4종의 각기 다른 단백질 발현용 프로모터를 갖는 벡터들을 이용하여 트레할로스 신테이즈 유전자(TS)를 공지의 유전자 재조합 기술을 이용하여 서브클로닝 하였다. 이들을 각각 pUTS08(pUC18-TS), pTTS12(pTrc99A-TS), pPTS16(pPL-lambda-TS), 및 pGTS19(pGEMEX-2-TS)로 명명하고 대장균 및 그 변이주에 형질전환하여 서로 다른 9종의 형질전환체를 획득하였다.
XMP 아미나제의 효소 활성 분석
형질전환체 비효소 활성(U*/mg 단백질) 상대활성도(변이주/모균주*100) 비 고
pUC18/NM522 0.1 대조
pUGA16/NM522 2.3 100
pUGA16/N238 2.7 115
pTGA21/NM522 10.3 100
pTGA21/N238 12.2 118
pGGA09/NM522 14.3 100
pGGA09/N238 16.3 114
pPGA48/pop2136 21.3 100
pPGA48/A106 36.6 172
U*= umol GMP/분
(2) 트레할로스 신테이즈 유전자의 효소 역가 분석
상기 제작한 9종의 형질전환체를 실시예 2와 같이 IPTG 또는 열처리에 의해 단백질 발현을 유도하고 원심분리하여 균체를 회수한다. 적당량의 20mM 디에탄올아민 용액으로 두 차례 세척한 후 적당량의 20mM 디에탄올아민 용액에 현탁하여 초음파 균체분쇄기로 균체를 분쇄하고 원심분리하여 얻어진 상등액을 효소액으로 사용하였다. 이렇게 하여 얻어진 효소액의 적당량을 트레할로오스 신테이즈 반응액(20% 말토오스, 20mM 디에탄올아민, pH8.5-9.0)에 첨가하여 35℃에서 반응시킨 뒤 1.0% 트리클로로아세트산을 첨가하고 원심분리하여 HPLC로 분석하였다. 1단위 효소 활성은 1분당 1umol의 α,α-트레할로오스를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 그 결과 표6에서 자세히 나타낸 바와 같이 대장균 NM522과 그 변이주인 N238은 프로모터의 종류와 관계없이 서로 비슷한 활성을 보여주었다. 그러나 pop2136의 변이주인 A106은 모균주에 비하여 약 60%이상 현저히 증가된 효소역가를 나타내었다.
트레할로스 신테이즈 유전자의 효소 활성 분석
형질전환체 비효소 활성(U*/mg 단백질) 상대활성도(변이주/모균주*100) 비 고
pUC18/NM522 0 대조
pUTS08/NM522 0.49 100
pUTS12/N238 0.48 98
pTTS12/NM522 2.35 100
pTTS12/N238 2.41 103
pGTS19/NM522 2.75 100
pGTS19/N238 2.84 103
pPTS16/pop2136 3.48 100
pPTS16/A106 5.63 162
U*= umol 트레할로즈/분
그러므로 핵산분해능 약화 형질을 가지고 있는 본 발명의 변이균주 대장균A106은 다른 변이주에 비하여 특이적으로 단백질 합성능이 강화되어 XMP 아미나제뿐만 아니라 여타의 다른 단백질 대량 발현용 균주로 사용될 수 있어 산업적으로 매우 가치 있고 다양한 용도로 유용될 수 있는 균주라 할 것이다.

Claims (6)

  1. 핵산분해능이 약화되고 단백질합성능이 강화된 돌연변이 균주 대장균 A106 (KFCC-11066).
  2. 제1항의 대장균 A106에 단백질 코딩 유전자를 갖는 벡터를 포함한 형질전환 균주.
  3. 제2항에 있어서, 단백질 코딩 유전자가 XMP 아미나제 코딩 유전자 또는 트레할로스 신테이즈 유전자인 형질전환 균주.
  4. 제2항 또는 3항에 있어서, 벡터가 pGA48 또는 pPTS16인 형질전환 균주.
  5. 5'-크산틸산으로부터 5'-구아닐산을 제조하는 미생물발효법에 있어서, 제1항의 대장균 A106에 XMP 아미나제 코딩 유전자를 갖는 벡터를 포함한 형질전환체를 이용하는 방법.
  6. 말토오스로부터 트레할로스를 제조하는 미생물발효법에 있어서, 제1항의 대장균 A106에 트레할로스 신테이즈 코딩 유전자를 함유한 벡터를 포함한 형질전환체를 이용하는 방법.
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