CN101402922A - 一种节杆菌及其产生黄嘌呤氧化酶的应用和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种节杆菌及其产生黄嘌呤氧化酶的应用和制备方法，该节杆菌Arthrobacter XL2006来源于自然界，其16S rRNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示，以该节杆菌发酵产黄嘌呤氧化酶，提取纯化该酶，制备检验试剂盒。本发明的节杆菌Arthrobacter XL2006具有产生黄嘌呤氧化酶特性，能以次黄嘌呤或黄嘌呤为唯一碳氮源和能源，发酵生产黄嘌呤氧化酶具有营养要求简单，容易培养和发酵时间短的特点；所产黄嘌呤氧化酶具有很高的活性，利用本发明提供的菌株发酵提取黄嘌呤氧化酶，制备的检验试剂盒，可用于临床上检测病人血清中的次黄嘌呤和黄嘌呤的水平。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体涉及一种节杆菌Arthrobacter sp.XL2006及其产生黄嘌呤氧化酶的应用和制备方法。
技术背景
黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XOD，EC 1.2.3.22)是嘌呤核苷代谢途径的限速酶。其催化次黄嘌呤和黄嘌呤氧化生成尿酸，与缺血性再灌注损伤、痛风、高尿酸血症、风湿性关节炎、心肌梗塞、肝炎等疾病密切相关。通过查阅资料和文献检索所知，黄嘌呤氧化酶可开发成一种医学检验用酶，应用于检测血清无机磷、血清超氧化物歧化酶活力、细胞损伤后胞外次黄嘌呤和黄嘌呤水平以及次黄嘌呤核苷(肌苷)、鸟嘌呤、鸟苷、鸟嘌呤酶和核苷磷酸化酶的活性等。现在所用的黄嘌呤氧化酶来源单一，主要是从牛奶黄油中分离提取。原料奶受不同产地、不同种类奶牛的影响，使其中黄嘌呤氧化酶的含量和质量不稳定，导致生产成本高，限制了其应用领域的扩展。而产生黄嘌呤氧化酶的微生物种类不多。
发明内容
本发明的目的是提供一种节杆菌及其产生黄嘌呤氧化酶的应用和制备方法，该菌株节杆菌Arthrobactersp.XL2006为分离纯化出的新菌种，具有一定产黄嘌呤氧化酶水平的安全、非致病性细菌；该菌种所产黄嘌呤氧化酶具有产品活性高，质量稳定，生产周期短的特点，用于检测病人血清中次黄嘌呤和黄嘌呤的水平，具有操作简便、快捷、精确和稳定的特点。
本发明的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006，其特征在于：所述菌株16S rRNA的序列如下所示：
ggatgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgaa cgatgatgcc cacttgtggg 60
tggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgagtaacct gcccttgact ctgggataag 120
cctgggaaac tgggtctaat accggatatg actgaccgtc gcatggtggt tggtggaaag 180
cttttgtggt tttggatgga ctcgcggcct atcagcttgt tggtggggta atggcctacc 240
aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gtgaccggcc acactgggac tgagacacgg 300
cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc 360
agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag tagggaagaa 420
gcgtaagtga cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact acgtgccagc agccgcggta 480
atacgtaggg cgcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagagctcgt aggcggtttg 540
tcgcgtctgc cgtgaaagtc cggggctcaa ctccggatct gcggtgggta cgggcagact 600
agagtgatgt aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcacga 660
ggaacaccga tggcggtcga acgatgatgc ccacttgtgg gtggattagt ggcgaaagca 720
tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgttg ggcactaggt 780
gtgggggaca ttccacgttt tccgcgccgt agctaacgca ttaagtgccc cgcctgggga 840
gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca 900
tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttcgacatg gaccggaccg 960
ccgcagaaat gtggtttctc cttttggggc cggttcacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg ttccatgttg 1080
ccagcgcgta atggcgggga ctgcatggga gactgccggg 1120。
本发明的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006应用于发酵生产黄嘌呤氧化酶。
本发明的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006应用于发酵生产黄嘌呤氧化酶的制备方法包括以下步骤：
(1)将菌种Arthrobacter sp.XL2006从斜面接种至装液量为20％的液体种子培养基中进行振荡摇瓶培养，摇床转速为200rpm，温度为30℃，培养时间为20h，制备成一级种子液；
(2)将一级种子液，按发酵液体积的5～10％接种量转接入产酶发酵培养基中，在32℃培养42h达到产酶高峰；
(3)于5000～8000rpm离心收集(2)发酵液中的Arthrobacter sp.XL2006细胞，采用超声波法和溶菌酶法破碎细胞壁，8000～10000rpm离心去除细胞碎片，收集到的上清夜即为粗酶液；
(4)根据不同需要和使用对象不同将(3)得到的粗酶液进一步分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
本发明的优点是：本发明从自然土壤中分离纯化出一株节杆菌Arthrobacter sp.XL2006，用该菌株作为黄嘌呤氧化酶的生产菌，具有产品活性高，质量稳定，生产周期短的特点。以该菌种能以次黄嘌呤或黄嘌呤为唯一碳氮源和能源，发酵生产黄嘌呤氧化酶具有营养要求简单，容易培养和发酵时间短的特点；所产黄嘌呤氧化酶具有很高的活性，可以作为临床检验用酶，用于检测病人血清中次黄嘌呤和黄嘌呤的水平，具有操作简便、快捷、精确和稳定的特点。
附图说明
图1是本发明节杆菌Arthrobacter sp.XL2006制备的黄嘌呤氧化酶的native-PAGE电泳图谱。
具体实施方式
本发明的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006的分离纯化为：采集富含有核苷类物质的土壤样品，以黄嘌呤和少量酵母粉作为微生物生长的碳源、氮源及能源，通过分批摇瓶培养及恒化富集培养后，分别涂布于选择培养基琼脂平板上进行单菌落分离；然后挑取单菌落进行液体发酵测定酶活力复筛获得具有高产黄嘌吟氧化酶特性的一株细菌；该细菌通过形态观察、生理生化分析和16S rRNA序列鉴定为节杆菌属的一个新种；节杆菌Arthrobacter sp.XL2006的分离纯化的具体步骤为：采集多地不同植被的土样20份，分别取少量样品接种于100mL选择培养基中于30℃在180rpm进行恒温振荡摇瓶培养，每隔12h采用HPLC监测黄嘌呤的降解情况；待黄嘌呤消耗尽后，分别取200uL培养上清液涂布于选择培养基平板上进行分批筛选；同时各取2mL培养上清液，混合接种于恒化器中；所述恒化器的容积为500mL，装液量为100m；连续培养7d后取菌液进行平板涂布分离；然后挑取单菌落进行液体发酵测定酶活力复筛获得具有高产黄嘌呤氧化酶特性的一株细菌；所采用的选择培养基为：Na2HPO4 6.0g，KH2PO4 3.0g，CaC12 3.0mg，MgSO4·7H2O 0.2mg，FeSO4·7H2O 0.5mg，酵母粉100mg，黄嘌呤1.52g，加水定容至1L，pH7.5。
该节杆菌Arthrobacter sp.XL2006为革兰氏阳性、好氧球菌；接触酶阳性；菌体不运动，细胞呈现成对、四个或不规则簇状排列；菌落为浅黄色；最适生长温度为30℃；属于化能异养菌，通常生长在简单培养基加生物素，进行氧化代谢；代谢葡萄糖或其他糖产生少量酸或不产酸。
节杆菌Arthrobacter sp.XL2006应用于发酵生产黄嘌呤氧化酶的制备方法包括以下步骤：
(1)将菌种Arthrobacter sp.XL2006从斜面接种至装液量为20％的液体种子培养基中进行振荡摇瓶培养，摇床转速为200rpm，温度为30℃，培养时间为20h，制备成一级种子液；
(2)将一级种子液，按发酵液体积的5～10％接种量转接入产酶发酵培养基中，在32℃培养42h达到产酶高峰；
(3)于5000～8000rpm离心收集(2)发酵液中的Arthrobacter sp.XL2006细胞，采用超声波法和溶菌酶法破碎细胞壁，8000～10000rpm离心去除细胞碎片，收集到的上清夜即为粗酶液；
(4)根据不同需要和使用对象不同将(3)得到的粗酶液进一步分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
所述步骤(4)进一步提取纯化黄嘌呤氧化酶的方法为：采用40％～60％饱和度的硫酸铵进行分级盐析沉淀离心收集的粗酶液，再利用10％(w/v)PEG6000/15％(w/v)(NH4)2SO4双水相萃取、Butyl-Sepharose 4B疏水层析、DEAE Sepharose CL-6B F F离子交换层析、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤和冷冻干燥的提纯步骤，制备检测用试剂酶。
所述Butyl-Sepharose 4B疏水层析为：使用φ1.6cm×25cm层析柱，平衡缓冲液为0.5mol/L硫酸铵的pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液；上样后，用平衡缓冲液冲洗层析柱；然后改用含0.2mol/L、0.1mol/L和0mol/L硫酸铵的pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液分阶段洗脱，流速0.6mL/min；
所述DEAE Sepharose CL-6B F F离子交换层析为：疏水层析分离收集的活性组分，经PEG6000浓缩、20mmol/L Tris-HCl缓冲液透析后，Tris-HCl缓冲液pH7.8，8000rpm冷冻离心15min，收集上清液；加至已用pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose fast flow层析柱，φ1.6cm×20cm；上样后，继续用平衡缓冲液冲洗层析柱；然后改用含0mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L NaCl的pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，流速1.0mL/min；收集活性组分；
所述Sephacryl S-200 HR凝胶过滤：收集的活性组分经冷冻干燥浓缩后，进行Sephacryl S-200分子筛层析；用pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡层析柱φ1.6cm×100cm，上样量10mL，然后用相同的缓冲液洗脱，流速1.0mL/min；收集活性组分。
所述斜面培养基、液体种子培养基和产酶发酵培养基分别为：
斜面培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15g，加蒸馏水定容至1L，pH7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min；
液体种子培养基：酵母膏2.0g，葡萄糖5g，Na2HPO4 6.0g，KH2PO4 1.6g，CaCl2 3.0mg，MgSO4·7H2O0.2mg，FeSO4·7H2O 0.5mg，加蒸馏水定容至1L，pH8.0，121℃高压蒸汽灭菌15min；
产酶发酵培养基：乳糖∶葡萄糖为3∶1的混合物：12g，(NH4)2SO4 4.0g，酵母粉2.13g，黄嘌呤2.57g，FeSO4·7H2O 0.5mg，Mg SO4·7H2O 0.2mg，CaCl2 5.33mg，KH2PO4 0.94，Na2HPO4 5.92g，加蒸馏水定容至1L，pH8.5，121℃高压蒸汽灭菌15min。
制备获得的黄嘌呤氧化酶制剂作为医学检验用酶，或用作缺血性再灌注损伤、痛风、高尿酸血症、风湿性关节炎、心肌梗塞、肝炎等疾病患者血清中次黄嘌呤和黄嘌呤水平的检测。
下面通过具体实施例说明本发明，但是本发明不仅限于此：
实施例
采集富含有核苷类物质的土壤样品，以黄嘌呤和少量酵母粉作为微生物生长的碳源、氮源及能源，通过分批摇瓶培养及恒化富集培养后，分别涂布于选择培养基琼脂平板上进行单菌落分离。然后挑取单菌落进行液体发酵测定酶活力复筛获得具有高产黄嘌呤氧化酶特性的一株细菌。该细菌通过形态观察、生理生化分析和16S rRNA序列鉴定为节杆菌属的一个新种。(选择培养基为：酵母膏2.0g，葡萄糖5g，NaCl 5.0g，琼脂15g，H2O2 1L，pH8.0)
节杆菌Arthrobacter sp.XL2006的分离纯化的具体步骤为：采集多地不同植被的土样20份，分别取少量样品接种于100mL选择培养基中于30℃在180rpm进行恒温振荡摇瓶培养，每隔12h采用HPLC监测黄嘌呤的降解情况；待黄嘌呤消耗尽后，分别取200uL培养上清液涂布于选择培养基平板上进行分批筛选；同时各取2mL培养上清液，混合接种于恒化器中；所述恒化器的容积为500mL，装液量为100m；连续培养7d后取菌液进行平板涂布分离；然后挑取单菌落进行液体发酵测定酶活力复筛获得具有高产黄嘌呤氧化酶特性的一株细菌；所采用的选择培养基为：Na2HPO4 6.0g，KH2PO4 3.0g，CaC12 3.0mg，MgSO4·7H2O0.2mg，FeSO4·7H2O 0.5mg，酵母粉100mg，黄嘌呤1.52g，加水定容至1L，pH7.5。
Arthrobacter sp.XL2006菌体培养特征：该菌种为革兰氏阳性、好氧球菌；接触酶阳性；菌体不运动，细胞呈现成对、四个或不规则簇状排列；菌落为浅黄色；最适生长温度为30℃。属于化能异养菌，通常生长在简单培养基加生物素，进行氧化代谢。代谢葡萄糖或其他糖产生少量酸或不产酸。
将菌种用选择培养基活化后，接种至装有100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中培养，摇床转速为200rpm，温度为30℃，培养20h作为种子液。然后按发酵液体积的8％接种量转接入装有100mL产酶发酵培养基的250mL三角瓶中振荡培养，摇床转速为250rpm，在32℃培养42h达到产酶高峰，结束发酵。将培养液用冷冻高速离心机(10000rpm，15min)离心收集菌体细胞，随后重新悬浮于100mmol·L-1 Tris-HCL(pH7.8)缓冲液中，采用Y92-II型超声粉碎仪(400W，15min)和2mg/mL的溶菌酶于37℃恒温振荡60min进行细胞破壁，离心后去除细胞碎片，收集上清液即为粗酶液。
进一步采用40％～60％饱和度的硫酸铵分级盐析、10％(w/v)PEG6000与15％(w/v)(NH4)2SO4双水相萃取获得粗酶夜。然后进行精提，步骤如下：第一步，将粗酶液的硫酸铵浓度调节至0.5mol/L，即为疏水层析上样液。用含0.5mol/L硫酸铵的pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡Butyl-Sepharose CL-4B疏水柱层析柱(φ1.6cm×25cm)；上样后，继续用平衡缓冲液冲洗层析柱；然后改用含0.2mol/L、0.1mol/L和0mol/L硫酸铵的pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液分阶段洗脱，流速0.6mL/min。洗脱完毕，收集及合并活性组分。第二步，疏水层析分离收集的活性组分，经PEG6000浓缩、20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)透析后，8000rpm冷冻离心15min，收集上清液。加至已用pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose fast flow层析柱(φ1.6cm×20cm)。上样后，继续用平衡缓冲液冲洗层析柱；然后改用含0mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L NaCl的pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，流速1.0mL/min。收集活性组分。第三步，收集的活性组分经冷冻干燥浓缩后，进行Sephacryl S-200分子筛层析。用pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡层析柱(φ1.6cm×100cm)，上样量10mL，然后用相同的缓冲液洗脱，流速1.0mL/min。收集活性组分。
采用如上的Butyl-Sepharose 4B疏水层析、DEAE Sepharose CL-6B F F离子交换层析、Sephacryl S-200HR凝胶过滤以及冷冻干燥的制备步骤，获得电泳纯级别的黄嘌呤氧化酶粉剂。
采用间歇补料发酵，XOD酶产量达到409.6U·L-1。经过分离纯化，黄嘌呤氧化酶的比酶活达到24.27U·mg-1，回收率为11.55％。经过非变性凝胶电泳，获得单一条带，达到电泳纯级别。
核苷酸序列：
<110>集美大学
<120>一株节杆菌及其产生黄嘌呤氧化酶的应用和制备方法
<160>1
<210>1
<211>1120
<212>RNA
<213>节杆菌
<220>
<223>
<400>1
ggatgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgaa cgatgatgcc cacttgtggg 60
tggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgagtaacct gcccttgact ctgggataag 120
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ggaacaccga tggcggtcga acgatgatgc ccacttgtgg gtggattagt ggcgaaagca 720
tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgttg ggcactaggt 780
gtgggggaca ttccacgttt tccgcgccgt agctaacgca ttaagtgccc cgcctgggga 840
gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca 900
tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttcgacatg gaccggaccg 960
ccgcagaaat gtggtttctc cttttggggc cggttcacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg ttccatgttg 1080
ccagcgcgta atggcgggga ctgcatggga gactgccggg 1120
Claims (9)
1.一种节杆菌Arthrobacter sp.XL2006，其特征在于：所述菌株16S rRNA的序列如下所示：
ggatgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgaa cgatgatgcc cacttgtggg 60
tggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgagtaacct gcccttgact ctgggataag 120
cctgggaaac tgggtctaat accggatatg actgaccgtc gcatggtggt tggtggaaag 180
cttttgtggt tttggatgga ctcgcggcct atcagcttgt tggtggggta atggcctacc 240
aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gtgaccggcc acactgggac tgagacacgg 300
cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc 360
agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag tagggaagaa 420
gcgtaagtga cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact acgtgccagc agccgcggta 480
atacgtaggg cgcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagagctcgt aggcggtttg 540
tcgcgtctgc cgtgaaagtc cggggctcaa ctccggatct gcggtgggta cgggcagact 600
agagtgatgt aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcacga 660
ggaacaccga tggcggtcga acgatgatgc ccacttgtgg gtggattagt ggcgaaagca 720
tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgttg ggcactaggt 780
gtgggggaca ttccacgttt tccgcgccgt agctaacgca ttaagtgccc cgcctgggga 840
gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca 900
tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttaccaagg cttcgacatg gaccggaccg 960
ccgcagaaat gtggtttctc cttttggggc cggttcacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020
gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg ttccatgttg 1080
ccagcgcgta atggcgggga ctgcatggga gactgccggg 1120。
2.根据权利要求1所述的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006，其特征在于：所述的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006的分离纯化为：采集富含有核苷类物质的土壤样品，以黄嘌呤和少量酵母粉作为微生物生长的碳源、氮源及能源，通过分批摇瓶培养及恒化富集培养后，分别涂布于选择培养基琼脂平板上进行单菌落分离；然后挑取单菌落进行液体发酵测定酶活力复筛获得具有高产黄嘌呤氧化酶特性的一株细菌；该细菌通过形态观察、生理生化分析和16S rRNA序列鉴定为节杆菌属的一个新种。
3.根据权利要求2所述的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006，其特征在于：所述节杆菌Arthrobacter sp.XL2006的分离纯化的具体步骤为：采集多地不同植被的土样20份，分别取少量样品接种于100mL选择培养基中于30℃在180rpm进行恒温振荡摇瓶培养，每隔12h采用HPLC监测黄嘌呤的降解情况；待黄嘌呤消耗尽后，分别取200uL培养上清液涂布于选择培养基平板上进行分批筛选；同时各取2mL培养上清液，混合接种于恒化器中；所述恒化器的容积为500mL，装液量为100m；连续培养7d后取菌液进行平板涂布分离；然后挑取单菌落进行液体发酵测定酶活力复筛获得具有高产黄嘌呤氧化酶特性的一株细菌；所采用的选择培养基为：Na2HPO46.0g，KH2PO43.0g，CaCl23.0mg，MgSO4·7H2O 0.2mg，FeSO4·7H2O 0.5mg，酵母粉100mg，黄嘌呤1.52g，加水定容至1L，pH7.5。
4.根据权利要求1所述的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006，其特征在于：所述Arthrobacter XL2006菌体培养特征：该菌种为革兰氏阳性、好氧球菌；接触酶阳性；菌体不运动，细胞呈现成对、四个或不规则簇状排列；菌落为浅黄色；最适生长温度为30℃；属于化能异养菌，通常生长在简单培养基加生物素，进行氧化代谢；代谢葡萄糖或其他糖产生少量酸或不产酸。
5.一种如权利要1、2、3或4所述的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006的应用，其特征在于：所述的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006应用于发酵生产黄嘌呤氧化酶。
6.一种如权利要求5所述的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006应用于发酵生产黄嘌呤氧化酶的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)将菌种Arthrobacter sp.XL2006从斜面接种至装液量为20％的液体种子培养基中进行振荡摇瓶培养，摇床转速为200rpm，温度为30℃，培养时间为20h，制备成一级种子液；
(2)将一级种子液，按发酵液体积的5～10％接种量转接入产酶发酵培养基中，在32℃培养42h达到产酶高峰；
(3)于5000～8000rpm离心收集(2)发酵液中的Arthrobacter sp.XL2006细胞，采用超声波法和溶菌酶法破碎细胞壁，8000～10000rpm离心去除细胞碎片，收集到的上清夜即为粗酶液；
(4)根据不同需要和使用对象不同将(3)得到的粗酶液进一步分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
7.根据权利要求6所述的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006应用于发酵生产黄嘌呤氧化酶的方法，其特征在于：所述步骤(4)进一步提取纯化黄嘌呤氧化酶的方法为：采用40％～60％饱和度的硫酸铵进行分级盐析沉淀离心收集的粗酶液，再利用10％(w/v)PEG6000/15％(w/v)(NH4)2SO4双水相萃取、Butyl-Sepharose 4B疏水层析、DEAE Sepharose CL-6B F F离子交换层析、Sephacryl S-200HR凝胶过滤和冷冻干燥的提纯步骤，制备检测用试剂酶。
8.根据权利要求7所述的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006应用于发酵生产黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于：
(1)所述Butyl-Sepharose 4B疏水层析为：使用φ1.6cm×25cm层析柱，平衡缓冲液为0.5mol/L硫酸铵的pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液；上样后，用平衡缓冲液冲洗层析柱；然后改用含0.2mol/L、0.1mol/L和0mol/L硫酸铵的pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液分阶段洗脱，流速0.6mL/min；
(2)所述DEAE Sepharose CL-6B F F离子交换层析为：疏水层析分离收集的活性组分，经PEG6000浓缩、20mmol/L Tris-HCl缓冲液透析后，Tris-HCl缓冲液pH7.8，8000rpm冷冻离心15min，收集上清液；加至已用pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡好的DEAE-Sepharose fast flow层析柱，φ1.6cm×20cm；上样后，继续用平衡缓冲液冲洗层析柱；然后改用含0mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/LNaCl的pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液梯度洗脱，流速1.0mL/min；收集活性组分；
(3)所述Sephacryl S-200HR凝胶过滤：收集的活性组分经冷冻干燥浓缩后，进行Sephacryl S-200分子筛层析；用pH7.8、20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡层析柱φ1.6cm×100cm，上样量10mL，然后用相同的缓冲液洗脱，流速1.0mL/min；收集活性组分。
9.根据权利要求6所述的节杆菌Arthrobacter sp.XL2006应用于发酵生产黄嘌呤氧化酶的制备方法，其特征在于：所述斜面培养基、液体种子培养基和产酶发酵培养基分别为：
(1)斜面培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15g，加蒸馏水定容至1L，pH7.5，121℃高压蒸汽灭菌20min；
(2)液体种子培养基：酵母膏2.0g，葡萄糖5g，Na2HPO46.0g，KH2PO41.6g，CaCl23.0mg，MgSO4·7H2O0.2mg，FeSO4·7H2O 0.5mg，加蒸馏水定容至1L，pH8.0，121℃高压蒸汽灭菌15min；
(3)产酶发酵培养基：乳糖∶葡萄糖为3∶1的混合物：12g，(NH4)2SO44.0g，酵母粉2.13g，黄嘌呤2.57g，FeSO4·7H2O 0.5mg，Mg SO4·7H2O 0.2mg，CaCl25.33mg，KH2PO40.94，Na2HPO45.92g，加蒸馏水定容至1L，pH8.5，121℃高压蒸汽灭菌15min。
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2008
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