CN103013830A - 一种高效筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基 - Google Patents

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本发明涉及一种生物细菌培养基，尤其涉及一种能够高效筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基。该培养基在普通LB琼脂培养基中添加次黄嘌呤和苯酚，能够抑制不产生黄嘌呤氧化酶的菌株的生长，使得产黄嘌呤氧化酶的菌株得以选择性生长，提高了对于生物菌的筛选效率。

Description

一种高效筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基
技术领域
本发明涉及一种生物细菌培养基，尤其涉及一种能够高效筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基。
背景技术
黄嘌呤氧化酶是生化诊断试剂的重要用酶，常用于检验血清中的腺苷脱氨酶和5-核苷酸酶等，其稳定性、特异性、最适pH、Km值等对试剂盒质量均有着重要的影响。中国专利CN101402922（一种节杆菌及其产生黄嘌呤氧化酶的应用和制备方法）公开了一种利用节杆菌来制备黄嘌呤氧化酶的方法，为进一步获得适合于诊断用的性能更优良的酶源，从土壤中筛选新的酶源菌种和酶很有必要。然而，土壤微生物多样，在普通筛选板上，产酶菌和非产酶菌大量生长，筛选工作量太大，因此，设计高效筛选培养基，淘汰非产酶株，保留产酶株是提高工作效率，减小盲目性的前提。目前，这方面的研究很少。由于该酶催化次黄嘌呤生成过氧化氢，而过氧化氢可解除苯酚对菌体生长的抑制，由此，本发明设计了一种以苯酚作为筛选压力的选择性培养基，使得大量非目的菌株被抑制，并使筛选平板上出现的菌落中产酶菌株丰度提高，提高筛选效率。目前该方法未见文献报道。
发明内容
本发明的技术方案为在普通LB琼脂培养基（蛋白胨1.0%，酵母粉0.5%，氯化钠1.0%，pH7.0,琼脂2.0%） 中添加0.02%-10.0%，优选0.5%的次黄嘌呤，同时添加0.01-0.3%，优选0.2%的苯酚。由于黄嘌呤氧化酶在有氧的条件下能够催化次黄嘌呤形成黄嘌呤，并进一步将后者氧化成尿酸，同时形成过氧化氢，因此，产黄嘌呤氧化酶的菌株可解除苯酚抑制，因此得以扩增，不产生该酶的菌株生长的机率小。
本发明的培养基的制备方法包含了：将蛋白胨，酵母粉和氯化钠溶解于水中，用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至7.00±0.05,再加入次黄嘌呤和琼脂,灭菌，待温度降到45度以下时，加入苯酚，混匀，倒平板，凝固得到培养基的步骤。其中，苯酚是在配成水溶液后，用膜(0.45微米)过滤除菌，在倒平板之前加入培养基混合物中的。
本发明还包括所述培养基在从土壤中定向筛选黄嘌呤氧化酶产生菌中的用途。
具体实施方式
器材：100毫升三角瓶、直径45毫米培养皿、培养箱、摇床、超声波破碎仪等。
试剂：蛋白胨、酵母粉、次黄嘌呤、苯酚、氯化钠、盐酸、氢氧化钠等。
方法：
（1）样品准备方法：
取1克潮湿土壤，用1.0%氯化钠溶液20毫升稀释（装于100毫升三角瓶中），在摇床上150转旋转1小时，迅速取0.1毫升用于涂板（取样之前先摇匀）。
（2）复筛培养基配制方法：
蛋白胨10克，酵母粉5克，氯化钠10克，水1000毫升，搅拌使变清，用0.1摩尔/升的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至7.0，用100毫升培养基每瓶装20毫升，每瓶加40毫克次黄嘌呤，用玻璃纤维透气膜封口。120度灭菌15分钟。冷切待用。
（3）复筛方法：
按洁净操作要求，从筛选平板上挑出单菌落接于筛选培养基中 ，在30度，150转摇床培养36小时，超声（取1毫升在试验室小型超声波破碎仪上超声5分钟），取出按附录检验酶活 。酶活在50u/l以上认为阳性（u/l为单位/升，具体定义参考附录）。
（4）酶活检验方法：
1）、酶活定义
1个酶活单位等于在以下反应条件下1分钟生成1微摩尔过氧化氢（1/2微摩尔醌染料）的酶量。
2）、检测原理
Figure BDA0000259598301
Figure BDA0000259598302
3）、酶活检测试剂
3.1 试剂1（R1）配制（按表中次序配制）
Figure BDA0000259598303
3.2 试剂2（ R2）配制（按表中次序配制）
Figure BDA0000259598304
3.3 酶稀释液配制（按表中次序配制）：
Figure BDA0000259598305
4）.注意事项
4.1由于Na和K离子都会影响XOD的活性，在R1、R2和酶的稀释液配制过程中都不得回调PH，务必要小心，不得调过再用碱溶液回调。温度对PH的影响非常大，一定要注意检测pH值时的温度。
4.2此法酶的线性为50-700 U/L，建议检测时用90-600 U/L之间的标本进行检测。
4.3样本配制完成后，在日立7060上按后附（4.8）参数进行检测，重复检测3次。
5）.操作步骤：
取1毫升R1，200微升R2 在比色杯（光程1厘米）中混合，37度预热5分钟，迅速取20微升酶加入其中，并开始计时，在505nm读取加样后180秒到240秒之间吸光度的变化率R（ΔA/Min.），根据产物的摩尔消光系数计算出样品中酶的比活=9173R,单位为u/l.
（5）对照培养基（筛选平板的对照平板培养基）制备方法：
蛋白胨10克，酵母粉5克，氯化钠10克，水1000毫升，用0.1摩尔/升的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至7.0, 120度灭菌15分钟。待温度降到接近45度时，倒平板。
（6）苯酚溶液配制方法
  3克苯酚，加15克水搅拌溶解，再加水至20毫升，混匀，用0.45微米的微孔滤器（波尔公司产）过滤后待用。
实例1：
蛋白胨10克，酵母粉5克，氯化钠10克，水1000毫升，用0.1摩尔/升的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至7.00±0.05,加次黄嘌呤0.2克，加琼脂20克, 120度灭菌15分钟。待温度降到45度以下时，加入苯酚（溶液）至终浓度为0.1克/升，混匀，倒平板（直径大约45mm）。重复数为3 。
待平板凝固后，取样品（土壤稀释液）0.1毫升在平板上涂布，在30度培养4天，见在平板上长出菌落，挑菌落在复筛培养基上诱导检测酶活。统计菌落数和阳性率，结果见表1。
实例2：
蛋白胨10克，酵母粉5克，氯化钠10克，水1000毫升，用0.1摩尔/升的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至7.00±0.05,加次黄嘌呤2克，加琼脂20克, 120度灭菌15分钟。待温度降到45度以下时，加入苯酚（溶液）至终浓度为1克/升，混匀，倒平板（直径大约45mm）。重复数为3 。
待平板凝固后，取样品（土壤稀释液）0.1毫升在平板上涂布，在30度培养4天，见在平板上长出菌落，挑菌落在复筛培养基上诱导检测酶活。统计菌落数和阳性率，结果见表1。
实例3：
蛋白胨10克，酵母粉5克，氯化钠10克，水1000毫升，用0.1摩尔/升的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至7.00±0.05,加次黄嘌呤5克，加琼脂20克, 120度灭菌15分钟。待温度降到45度以下时，加入苯酚（溶液）至终浓度为2克/升，混匀，倒平板（直径大约45mm）。重复数为3 。
待平板凝固后，取样品（土壤稀释液）0.1毫升在平板上涂布，在30度培养4天，见在平板上长出菌落，挑菌落在复筛培养基上诱导检测酶活。统计菌落数和阳性率，结果见表1。
实例4：
蛋白胨10克，酵母粉5克，氯化钠10克，水1000毫升，用0.1摩尔/升的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至7.00±0.05,加次黄嘌呤10克，加琼脂20克, 120度灭菌15分钟。待温度降到45度以下时，加入苯酚（溶液）至终浓度为3克/升，混匀，倒平板（直径大约45mm）。重复数为3 。
待平板凝固后，取样品（土壤稀释液）0.1毫升在平板上涂布，在30度培养4天，见在平板上长出菌落，挑菌落在复筛培养基上诱导检测酶活。统计菌落数和阳性率，结果见表1。
表1  实施例与对照平板上的阳性菌落对比
平均总菌落数/皿 平均阳性株/皿 酶活阳性株百分率
实例1对照 太多，分不清 - -
实例1 157 46 29%
实例2对照 太多，分不清 - -
实例2 63 42 67%
实例3对照 太多，分不清 - -
实例3 34 27 79%
实例4对照 太多，分不清 - -
实例4 4 3 75%
结论：
从以上结果来看，此筛选平板确实能淘汰大量的非产酶菌株，且，随着苯酚浓度的增加，总菌数增加，阳性率上升，说明确实起到了定向筛选的作用，该筛选培养基效果显著。最后从选出的菌株中挑出一株菌种，其产酶水平大约在0.6ku/l ,需进一步坚定，并开展酶性能和发酵和纯化方面的研究。本筛选培养基也可作为高效筛选高产突变株淘汰低产菌株的参考培养基。

Claims (8)

1.一种从土壤中定向筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基，其特征在于，该培养基除了含有普通LB平板培养基的组分外，还同时含有次黄嘌呤与苯酚。
2.根据权利要求1所述的从土壤中定向筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基，其特征在于，所述次黄嘌呤在培养基各组分中的所占的重量百分浓度为0.02%- 1.0%，优选重量百分浓度为0.5%，所述苯酚在培养基各组分中所占的重量百分浓度为0.01-0.3%，优选重量百分浓度为0.2%。
3.根据权利要求1或2所述的从土壤中定向筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基，其特征在于，普通LB平板培养基含有蛋白胨、酵母粉、氯化钠和琼脂。
4.根据权利要求3所述的从土壤中定向筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基，其特征在于，所述蛋白胨的重量百分含量浓度为1.0%，酵母粉的重量百分含量浓度为0.5%，氯化钠的重量百分含量浓度为1.0%，琼脂的重量百分含量浓度为2.0%。
5.根据权利要求1-4任一项所述的从土壤中定向筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基的制备方法，其特征在于，包含在普通LB琼脂培养基或培养基组合物中添加次黄嘌呤和苯酚的步骤。
6.根据权利要求1-4任一项所述的从土壤中定向筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基的制备方法，其特征在于，将蛋白胨，酵母粉和氯化钠溶解于水中，用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至7.00±0.05,再加入次黄嘌呤和琼脂,灭菌，待温度降到45度以下时，加入苯酚，混匀，倒平板，凝固得到培养基。
7.根据权利要求6所述的从土壤中定向筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基的制备方法，其特征在于，将苯酚配成水溶液，通过膜过滤除菌，在倒平板之前加入。
8.根据权利要求1-4任一项所述的培养基在从土壤中定向筛选黄嘌呤氧化酶产生菌中的用途。
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