CN101914613B - 生化和酶反应试验筛检4种肠道病原菌的试剂盒和筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病原菌的筛选方法，特别涉及利用生化和酶反应试验筛检4种肠道病原菌的试剂盒和筛选方法。主要解决现有筛选方法存在的覆盖面不广、步骤较为复杂，筛选结果不够直观的技术问题。本发明提供了筛检4种肠道病原菌的试剂盒：1)、氧化酶试剂；2)、肠道细菌综合发酵管配方；3)、硫化氢滤纸条；4)、吲哚滤纸条；5)、酶显色琼脂平板配方；6)、马尿酸盐纸片。筛选包括第一管识别；第二管识别；酶显色琼脂平板使用方法；本发明用一种简单的糖生化发酵反应模式和细菌特异性酶-低物反应特征建立一套行之有效的鉴别试验，达到对这4种病原菌简单易行的鉴别效果。

Description

生化和酶反应试验筛检4种肠道病原菌的试剂盒和筛选方法

技术领域：本发明涉及病原菌的筛选方法，特别涉及利用生化和酶反应试验筛检4种肠道病原菌的试剂盒和筛选方法。

背景技术：依据传统的沙门菌、志贺菌、小肠结肠耶尔森菌、空肠弯曲菌的菌落筛检流程在实际工作中的工作量较大，使用系统化的鉴定材料批间质控要求繁琐，费用昂贵。中国专利申请200810047994.7公开了“一种同时快速检测沙门菌和志贺菌的方法”，该发明属于食源性致病菌的快速检测技术，具体说是一种对沙门菌和志贺菌同时进行检测的环介导等温DNA扩增(LOOP-MEDIATEDISOTHERMAL AMPLIFICATION，LAMP)检测方法。包括由样品处理试剂、LAMP反应试剂、BST DNA聚合酶的大片段、琼脂糖、溴酚蓝上样缓冲溶液、溴化乙锭溶液组成的试剂的配制，以及扩增产物的检测和沉淀产生的检测程序。其步骤是：首先设计特异性引物；其次是提取样品DNA；第三是配制反应体系。该法较之目前采用的传统细菌培养方法、免疫检测方法和其它分子生物学方法具有操作简单、快速且灵敏特异的优点。可应用于食品和其它样品中沙门菌和志贺菌的同时快速检测。但是该方法筛选病原菌还存在一定局限性，即筛选到的阳性结果可能无法通过细菌学方法分离到；也可能因为存在死菌而获得假阳性结果；另外，需设计特异性引物及提取DNA步骤较为复杂，筛选结果判断还不够直观。

发明内容：本发明的目的是提供一种一次可筛选4种肠道病原菌的利用生化和酶反应试验筛检4种肠道病原菌的试剂盒和筛选方法。主要解决现有筛选方法存在的覆盖面不广、步骤较为复杂，筛选结果不够直观的技术问题。本发明用一种简单的糖生化发酵反应模式和细菌特异性酶-低物反应特征建立一套行之有效的鉴别试验，达到对这4种病原菌简单易行的鉴别效果。

本发明的技术方案为：生化和酶反应试验筛检4种肠道病原菌的试剂盒，包括：

1、氧化酶试剂：1％(质量百分浓度，以下各种溶液百分数均同)对-氨基-4-甲基苯胺盐酸盐水溶液；

2、肠道细菌综合发酵管配方：

第一管成分：琼脂14g，牛肉膏2g，酵母浸出粉2g，葡萄糖1g，蛋白胨15g，甘露醇10g，尿素10g，0.2％麝香草酚蓝溶液10ml，0.2％溴麝香草酚蓝溶液12.5ml，0.2％甲酚红溶液4ml，蒸馏水1000ml；

第二管成分：琼脂3g，胰蛋白胨10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，10％Na₂HPO₄2.5ml，蔗糖10g，1％硫代硫酸钠溶液2.5ml，0.2％溴麝香草酚蓝溶液5ml，蒸馏水1000ml；

3、硫化氢滤纸条；

4、吲哚滤纸条；

5、酶显色琼脂平板配方：琼脂17g，胰蛋白胨10g，蛋白胨10g，酵母粉3g，氯化钠5g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg，辛酸盐250mg；

6、马尿酸盐纸片。

试剂盒的配制和使用方法：1、氧化酶试剂使用：涂抹一个纯菌落于清洁干燥的薄滤纸上，滴加氧化酶试剂，在30秒内出现粉红色结果为阳性，反之为阴性。

2、第一管配制：

1)、取琼脂14g、牛肉膏2g及蒸馏水1000ml，混合后加热溶解，并用数层纱布过滤。

2)、再取酵母浸出粉2g、葡萄糖1g、蛋白胨15g、甘露醇10g及尿素10g，混入已溶解的琼脂中。充分摇匀，使全部溶解。再加入15％氢氧化钠约1.5ml，矫正pH至7.1(按冷却至25℃后测量值为标准)。

3)、然后加入指示剂0.2％溴麝香草酚蓝溶液12.5ml、0.2％甲酚红溶液4ml、0.2％麝香草酚蓝溶液10ml。

4)、混合后，充分摇匀。分装于13×100mm的试管内，每管约3ml。

5)、置高压灭菌器内，经10磅压力10分钟的灭菌。

6)、灭菌后，制成斜面，底部宜厚。待凝固后，置于冰箱中，备用。

表1  指示剂所需量及其配制

3、第二管的配制：

1)、取琼脂3g，加入1000ml的蒸馏水中，加热溶解，并用数层纱布过滤。

2)、再取胰蛋白胨10g、蛋白胨10g、氯化钠5g、10％Na₂HPO₄2.5ml、蔗糖10g及硫代硫酸钠溶液2.5ml，混合后，加入已溶解的琼脂中，充分摇匀，使全部溶解，再加入15％氢氧化钠溶液约1.5ml左右，矫正pH至7.6(按冷却至25℃后测量值为标准)。

3)、溴麝香草酚蓝的配制：取溴麝香草酚蓝0.2g、N/10氢氧化钠溶液5ml及蒸馏水95ml，混合后，放在棕色瓶中，备用。

4)、加0.2％溴麝香草酚蓝5ml。充分摇匀，分装于13×100mm的试管内，每管约3ml。

5)、置高压灭菌器内，经10磅10分钟的灭菌，取出后，置于冰箱中，备用。

4、硫化氢滤纸条的制备：选取细薄的滤纸剪成3×50mm的长条，浸在饱和的醋酸铅溶液中(35％醋酸铅饱和)，取出后放于平皿中，置56℃烘箱中约3h，烤干备用。此纸条阳性结果显黑色。

5、吲哚滤纸条的制备：滤纸条(同上述大小)浸于对—二甲氨基苯甲醛5g、甲醇50ml、磷酸10ml的混合液中，取出后放于平皿中，置56℃烘箱中约4h，稍微烤干即取出，保存室温内备用。此纸条经对—二甲氨基苯甲醛染成淡黄色，如靛基质阳性，纸条就变为红色。

6、酶显色琼脂平板配方的配制：取琼脂粉5g、胰蛋白胨10g、蛋白胨10g、酵母粉3g、氯化钠5g置990ml蒸馏水中加热溶解煮沸2次后，称取5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于5mlTri.HCl(pH8.0)，称取辛酸盐250mg溶解于5ml蒸馏水中，待加热培养基冷却至50℃一并加入酶底物溶液后混匀，调整pH至7.2(按冷却至25℃后测量值为标准)。倾注平板置冰箱中，备用。

7、快速马尿酸水解酶试验方法：取生理盐水0.1ml加于一清洁的小试管，并于其中加入马尿酸盐纸片(5μg)1张，再加入50μl经1～2d培养的用被测菌的新鲜菌落或菌苔调制成的≥10¹⁰/ml浓厚菌悬液，37℃水浴2h，缓缓加入茚三酮溶液(3.5％茚三酮溶解于按体积比1∶1混合的丙酮和丁醇溶液中)0.1ml，摇匀后36℃放置10分钟，逐渐呈深紫色即为阳性。快速氧化酶与马尿酸水解酶试验(阳性)是判定空肠弯曲菌的唯一依据。

然后通过生化反应识别和酶显色琼脂平板的判定，对4种肠道病原菌进行筛选。

本发明的有益效果是：本发明是基于传统细菌学技术简化提炼而成的利用生化和酶反应试验筛检4种肠道病原菌的试剂盒和筛选方法，较之现阶段使用的传统细菌学技术单纯依赖生化鉴定为主的方法更具有成本低、操作简单、快速、无需依赖特殊仪器且有特异性、准确性及阳性预期值高的优点。适用临床、食品、水、环境和其他标本中沙门菌、志贺菌、小肠结肠耶尔森菌、空肠弯曲菌的同时快速筛检。更在原理设计、操作人员与实验室要求方面和分子生物学方法有本质的区别，且筛检的方位更为广泛、针对性更强；肠道细菌综合发酵管的生化筛检指标多、效率高，结合酶显色平板的特异性菌落定位可一次筛选4种肠道病原菌，将生化反应识别和酶显色琼脂平板结合进行筛选提高了筛选的时效性和准确性，通过显色判定非常直观。同时，因为操作过程简便也提高了单位时间的工作效率，使操作者更易掌握和接受，减少试验过程中人为因素造成的随机误差。

具体实施方式：

首先按照技术方案内容配制试剂盒，然后根据生化和酶反应试验结果鉴别诊断4种肠道病原菌(表2)。

1、生化反应识别

肠道细菌综合发酵管第一管：葡萄糖、甘露醇同时发酵的菌株在37℃培养18h后，斜面底层均显鲜明黄色；尿素分解菌株产生深蓝色；产碱杆菌、铜绿假单胞菌生长时，斜面变蓝色，单独底层显黄色；斜面保持绿色的，为只发酵葡萄糖不发酵甘露醇的菌株；产气菌株能见气泡产生(pH7.0～8.0时为绿色，pH8.0～8.2时为绿蓝色，pH8.2以上时为深蓝色略带紫色)。

该培养基直立部分产酸而变黄色，为葡萄糖发酵，这因斜面部分少量葡萄糖产酸后，在有氧环境下，少量酸与空气化合而成二氧化碳和水，因而失去酸在培养基内影响酸碱度改变的作用。而在直立部分所产生的酸，则因在厌氧状况下，可使培养基的酸碱度改变而变黄；斜面部分产酸而变黄色，为甘露醇发酵，这因加入的大量甘露醇产酸后，在有氧环境下，其部分的酸与空气结合而化合成二氧化碳和水，但因甘露醇量多，所产生的酸量亦多。因此，一部分酸变质，而还有一部分酸存在，故仍可改变斜面部分的酸碱度而变黄色。

肠道细菌综合发酵管第二管：接种细菌经36℃培养18h以上培养后，产酸时变黄色；产酸产气时可见气泡并变黄色。观察动力的有无，可根据穿刺线生长情况；另加的纸条二条，如一条显黑色，则为硫化氢反应阳性；另一条如显红色则为靛基质反应阳性。

2、酶显色琼脂平板使用方法

疑似沙门菌培养物接种显色琼脂平板，36℃培养18-24h后，所有的沙门菌(包括伤寒沙门菌与非伤寒沙门菌)均呈现为中等大小、湿润、边缘光滑的酒红色菌落；非沙门菌中部分酵母菌或假单胞菌有时也会表现为粉红色菌落形态；少数大肠埃希菌也偶有粉红色菌落生长，需要通过肠道细菌综合发酵管辅助诊断。

疑似志贺菌培养物接种显色琼脂平板，36℃培养18-24h后，所有福氏志贺菌的菌落表现为中等大小、不透明、湿润、边缘光滑的白色菌落(延长培养至48h可呈现淡红色)；宋内志贺菌绝大多数表现为中等大小、不透明、湿润、边缘光滑(粗糙型为锯齿状)的蓝色菌落(偶有白色菌落为ONPG阴性株)；其他除志贺Ⅰ、鲍氏9型和鲍氏15型外菌落均为白色菌落(延长培养至48h可呈现淡红色)。结合肠道细菌综合发酵管可以辅助诊断。

疑似小肠结肠耶尔森菌培养物接种显色琼脂平板，28和36℃分别培养18-24h后，所有小肠结肠耶尔森菌落表现为中等大小、不透明、边缘湿润、光滑的蓝色菌落，结合肠道细菌综合发酵管可以辅助诊断。

Claims (1)

1.一种生化和酶反应试验筛检沙门菌、志贺菌、小肠结肠耶尔森菌、空肠弯曲菌的试剂盒，包括：

1)、氧化酶试剂：1％对-氨基-4-甲基苯胺盐酸盐水溶液；

2)、肠道细菌综合发酵管配方：

第一管成分：琼脂14g，牛肉膏2g，酵母浸出粉2g，葡萄糖1g，蛋白胨15g，甘露醇10g，尿素10g，0.2％麝香草酚蓝溶液10ml，0.2％溴麝香草酚蓝溶液12.5ml，0.2％甲酚红溶液4ml，蒸馏水1000ml；

第二管成分：琼脂3g，胰蛋白胨10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，10％Na₂HPO₄2.5ml，蔗糖10g，1％硫代硫酸钠溶液2.5ml，0.2％溴麝香草酚蓝溶液5ml，蒸馏水1000ml；

3)、硫化氢滤纸条；

4)、吲哚滤纸条；

5)、酶显色琼脂平板配方：琼脂17g，胰蛋白胨10g，蛋白胨10g，酵母粉3g，氯化钠5g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg，辛酸盐250mg；

6)、马尿酸盐纸片。