CN102816715B - 小肠结肠耶尔森菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肠道病原菌中耶尔森菌属的小肠结肠耶尔森菌的分离和鉴定方法，主要解决现有小肠结肠耶尔森菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。试剂盒，包括：1）、通用型非选择性增菌液；2）、10倍浓缩通用型非选择性增菌液；3）、耶尔森菌冷增菌液；4）、耶尔森菌快速选择性增菌液；5）、选择性分离平板；6）、产毒性小肠结肠耶尔森菌显色琼脂平板；7）、小肠结肠耶尔森菌生化鉴定管配方；8）、硫化氢滤纸条；9）、吲哚滤纸条。利用选择性增菌、选择性分离培养基对应生长的典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验筛选、鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及肠道病原菌中耶尔森菌属的小肠结肠耶尔森菌的分离和鉴定方法，特别涉及利用选择性增菌、选择性分离培养基对应生长的典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验筛选、鉴定包括多种复杂生物型和产毒或非产毒血清型在内的小肠结肠耶尔森的试剂盒、制备和应用。
背景技术
小肠结肠耶尔森菌广泛分布在自然界中，在野生动物和家养的偶蹄动物中（尤其是猪）体内（包括淋巴系统和循环、肠道等部位）寄生或定殖，属于目前已知的动物类肉类制品明确检疫的病原菌，同时，也是能引起食源性传播和暴发的重要病原菌之一。国内的许多实验室（包括临床实验室和公共卫生实验室）在实际工作中无法通过可选择的常规微生物分离方法和材料达到分离的预期效果，反而受制于培养基的批间质控要求繁琐、敏感性和特异性低以及多次对疑似菌落筛选和鉴定所用自动化生化反应试剂材料的昂贵费用，费工费时。本发明是基于传统细菌学技术简化，经提炼、加入创新材料组合成的检测程序，包括对多种复杂样品的预处理和选择性增值，使用选择性平板分离出所有小肠结肠耶尔森菌的典型菌落，结合简易生化和特异性酶-底物反应组合试验同时筛选、鉴定产毒性小肠结肠耶尔森菌的试剂盒和筛选方法，较之现阶段使用的传统分离平板和鉴定技术单纯依赖自动化生化鉴定仪器为主的方法更具有综合成本低、操作简单、快速、无需依赖特殊仪器且有特异性、准确性及阳性预期值高的优点。适用粪便（或者粪便拭子）、食品、环境水样等多种增菌标本中小肠结肠耶尔森菌的同步分离和鉴定。
发明内容
本发明的目的是提供一种可利用产毒性小肠结肠耶尔森菌的生物学特性和酶反应试验鉴定的试剂盒、制备和应用。主要解决现有小肠结肠耶尔森菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。本发明针对不同类型标本分别使用2种选择性增菌液及专一性分离平板配合简单的糖生化发酵-动力反应模式和细菌特异性酶-底物反应特征建立一套行之有效的分离和特异性鉴别试验，达到对产毒性小肠结肠耶尔森菌分离、筛选和简易鉴定的效果。
本发明的技术方案为：小肠结肠耶尔森菌分离、鉴定的试剂盒及其制备方法，包括：
1、通用型非选择性增菌液：胰酪胨大豆胨肉汤（TSB）。成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅15分钟（121℃）灭菌后分装225ml/瓶备用。
2、10倍浓缩通用型非选择性增菌液：胰酪胨大豆胨肉汤（TSB）。成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水100ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅15分钟（121℃）灭菌后分装10ml/瓶备用。
3、耶尔森菌冷增菌液：蛋白胨山梨醇胆盐肉汤：动物组织胰化胨5.0g，山梨醇10.0g，磷酸氢二钠8.23g，磷酸二氢钠1.2g，混合胆盐1.5g，氯化钠5.0g，加热溶解后矫正pH至7.6±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅15分钟（121℃）灭菌后分装10ml/管备用。
4、耶尔森菌快速选择性增菌液：替卡西林高氯酸肉汤（TCB）。成分：氯化镁（含6H2O）60.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，高氯酸1.0g，酵母浸出物1.0g，2%质量百分浓度的孔雀石绿5.0ml，三氯生溶液（用质量百分浓度95%的乙醇配成质量百分浓度0.1%的溶液）1.0ml，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.6±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅15分钟（121℃）灭菌冷却至50℃后加入替卡西林（羟噻吩青霉素，0.1%质量百分浓度水溶液）1.0ml，分装10ml/管备用。
5、选择性分离平板（CIN）：成分：琼脂12.5g，甘露醇20.0g，胰化酪蛋白胨20.0g，酵母浸出物3.0g，氯化钠1.0g，丙酮酸钠2.0g，去氧胆酸那2.0g，硫酸镁0.01g置950ml蒸馏水加热溶解煮沸，矫正pH至7.4±0.1（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅15分钟（121℃）灭菌后冷却至80℃加入三氯生溶液（用95%质量百分浓度的乙醇配成0.4%质量百分浓度的溶液）1ml，混匀，继续冷却至50℃加入中性红（3mg/ml）10ml，结晶紫（0.1mg/ml）10ml，头孢噻吩（1.5mg/ml）10ml，新生霉素（0.25mg/ml）10ml，最后不断搅拌，加入10%质量百分浓度的氯化锶溶液10ml后倾注无菌平皿，置冰箱中，备用。
6、产毒性小肠结肠耶尔森菌显色琼脂平板（CYA）：成分：琼脂15.0g，脑心浸液肉汤干粉25g，植物蛋白胨3.0g.0g，酵母浸出物6.0g，丙酮酸钠2.0g，D-纤维二糖20g，置950ml蒸馏水加热溶解煮沸，矫正pH至7.4±0.1（按冷却至25℃后测量值为标准）。冷却至80℃加入酶显色底物：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷（X-Glc,1MTris.HClpH8.0溶解）150mg,5ml；X-β-glc（N-N-二甲基甲酰胺溶解）200mg，5ml和三氯生溶液（用95%质量百分浓度的乙醇配成0.4%质量百分浓度的溶液）1ml，混匀，继续冷却至50℃加入中性红（3mg/ml）10ml，结晶紫（0.1mg/ml）10ml，头孢磺啶（0.5mg/ml）10ml，万古霉素（1mg/ml）10ml，最后不断搅拌后倾注无菌平皿，置冰箱中，备用。
7、小肠结肠耶尔森菌生化鉴定管配方：
第一管成分：琼脂14.0g，牛肉膏2.0g，酵母浸出物2.0g，葡萄糖1.0g，蛋白胨15.0g，甘露醇10.0g，尿素10.0g，0.2%质量百分浓度的麝香草酚蓝溶液10ml，0.2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝溶液12.5ml，0.2%质量百分浓度的甲酚红溶液4ml，蒸馏水1000ml；
第一管配制：
1）、取琼脂14.0g、牛肉膏2.0g及蒸馏水1000ml，混合后加热溶解，并用数层纱布过滤；
2）、再取酵母浸出粉2.0g、葡萄糖1.0g、蛋白胨15.0g、甘露醇10.0g及尿素10.0g，混入已溶解的琼脂中。充分摇匀，使全部溶解。再加入15%质量百分浓度的氢氧化钠约1.5ml，矫正pH至7.1（按冷却至25℃后测量值为标准）；
3）、然后加入指示剂0.2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝溶液12.5ml、0.2%质量百分浓度的甲酚红溶液4ml、0.2%质量百分浓度麝香草酚蓝溶液10ml；
4）、混合后，充分摇匀。分装于13×100mm的试管内，每管约3ml；
5）、置高压灭菌器内，经10磅10分钟的灭菌；
6）、灭菌后，制成斜面，底部宜厚。待凝固后，置于冰箱中，备用；
表1 指示剂所需量及其配制
| 指示剂名称 | 所需重量 | 加N/20氢氧化钠溶液 | 蒸馏水量 | 敏感范围（pH） | 色泽改变（酸→碱） |
| 溴麝香草酚蓝 | 0.2g | 6.4ml | 93.6ml | 6.0-7.6 | 黄→蓝 |
| 甲酚红 | 0.2g | 10.6ml | 89.4ml | 7.2-8.8 | 黄→红 |
| 麝香草酚蓝 | 0.2g | 8.6ml | 91.4ml | 1.2-2.8 | 红→黄 |
第二管成分：琼脂3.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，10%质量百分浓度的Na2HPO42.5ml，蔗糖10.0g，1%质量百分浓度的硫代硫酸钠溶液2.5ml，0.2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝溶液5ml，蒸馏水1000ml；
第二管的配制：
1）、取琼脂3.0g，加入1000ml的蒸馏水中，加热溶解，并用数层纱布过滤；
2）、再取胰化酪蛋白胨10.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、10% 质量百分浓度的Na2HPO42.5ml、蔗糖10.0g及硫代硫酸钠溶液2.5ml，混合后，加入已溶解的琼脂中，充分摇匀，使全部溶解，再加入15%质量百分浓度的氢氧化钠溶液约1.5ml左右，矫正pH至7.6（按冷却至25℃后测量值为标准）；
3）、溴麝香草酚蓝的配制：取溴麝香草酚蓝0.2g、N/10氢氧化钠溶液5ml及蒸馏水95ml，混合后，放在棕色瓶中，备用；
4）、加0.2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝5ml。充分摇匀，分装于13×100mm的试管内，每管约3ml；
5）、置高压灭菌器内，经10磅10分钟的灭菌，取出后，置于冰箱中，备用。
8、硫化氢滤纸条：硫化氢滤纸条的制备：选取细薄的滤纸剪成3×50mm的长条，浸在饱和的醋酸铅溶液中（35%质量百分浓度的醋酸铅饱和），取出后放于平皿中，置56℃烘箱中2-3h，烤干备用。此纸条阳性结果显黑色。
9、吲哚滤纸条：吲哚滤纸条的制备：滤纸条（同上述大小）浸于对—二甲氨基苯甲醛5.0g、甲醇50ml、磷酸10ml的混合液中，取出后放于平皿中，置56℃烘箱中约3-4h，稍微烤干即取出，保存室温内备用。此纸条经对—二甲氨基苯甲醛染成淡黄色，如靛基质阳性，纸条就变为红色。
本发明的有益效果是：根据不同类型的标本选择进行直接分离或预增菌后选择性增菌方式使标本中目的菌达到可以通过平板进行分离的菌量，通过选择性分离平板生长的“疑似”典型菌落接种于小肠结肠耶尔森菌生化鉴定管进行生化筛检达到初步筛选、鉴定小肠结肠耶尔森菌的目的，通过使用小肠结肠耶尔森菌显色琼脂平板（CYA）初步判断小肠结肠耶尔森菌致病血清-生物群的快速甄别。将生化反应识别和特异性酶-底物显色琼脂平板结合进行筛选提高了筛选的时效性和准确性，通过显色判定结果非常直观。
具体实施方式
首先按照技术方案内容配制试剂盒，使用者根据不同检材选择使用不同的增菌液和选择性平板进行组合分离，最后使用简易生化和特异性酶-底物反应试验鉴别产毒性小肠结肠耶尔森菌（表2）。
1、不同检材的解释、采集要求和预处理方法
1）、粪便：包括人（患者和带菌者）、家禽（畜）等动物性粪便标本尽可能新鲜采集约1g（拇指大小），液状便采约1ml，在1h-2h内进行接种-分离培养。若短时间不能检测时，应使用商品化培养基保存，运送至实验室。先使用棉签（拭子）挑取标本直接接种选择性琼脂平板（CIN），36℃培养24h-48h观察菌落生长结果；然后使用棉签（拭子）挑取粪便标本至耶尔森菌快速选择性增菌液（TCB，建议临床实验室使用）和或耶尔森菌冷增菌液中（建议公共卫生实验室使用），分别置36℃增菌24h-48h和置4℃-8℃增菌20d后再分别转种于耶尔森菌选择性琼脂平板（CIN），36℃培养24h-48h观察菌落生长结果。
2）、水：包括饮用水、生活用水、江、河、湖水和污水等液态标本用无菌玻璃或塑料瓶采集250ml-500ml，液体清澈者可使用孔径0.22μm-0.45μm滤膜进行负压过滤后将滤膜剪碎后置于耶尔森菌冷增菌液和快速选择性增菌液（TCB）中，分别置4℃-8℃增菌20d和36℃增菌24h-48h后转种于耶尔森菌选择性琼脂平板（CIN），36℃培养24h-48h观察菌落生长结果；液体浑浊者可在10倍浓缩通用型非选择性增菌液瓶中加入90ml，36℃增菌培养6h-8h后吸取1ml接种于耶尔森菌冷增菌液和快速选择性增菌液（TCB）中，分别置4℃-8℃增菌20d和36℃增菌24h-48h后转种于耶尔森菌选择性琼脂平板（CIN），36℃培养24h-48h观察菌落生长结果。
3）、食品：采集定型包装或非定型包装500g-1000g，若为表面含水样品可以用棉签（拭子）直接在食品表面进行多点涂抹后直接接种于耶尔森菌选择性琼脂平板（CIN），36℃培养24h-48h观察菌落生长结果；然后取剪碎或均质后食品25g与通用型非选择性增菌液（TSB，225ml）按照1:9比例进行混匀，36℃增菌培养6h-8h后吸取1ml接种于耶尔森菌冷增菌液和快速选择性增菌液（TCB）中，分别置4℃-8℃增菌20d和36℃增菌24h-48h后转种于耶尔森菌选择性琼脂平板（CIN），36℃培养24h-48h观察菌落生长结果。
检查方法
2、疑似典型菌落的判断、生化反应识别和特异性酶-底物平板鉴定产毒性小肠结肠耶尔森菌的使用方法（表2）
1）、选择性琼脂平板（CIN））生长疑似典型菌落特征（48h）：小肠结肠耶尔森生长典型的“公牛眼”菌落：中心红色或粉红色，边缘呈现透明样质感者，2mm中等或略小菌落。挑选符合典型生长的疑似菌落（≤3个）穿刺接种于小肠结肠耶尔森生化鉴定管第一、二管（每个菌落接种2套），分别置28℃和36℃培养18-24h观察结果。
2）、生化反应识别
小肠结肠耶尔森生化鉴定管第一管：葡萄糖、甘露醇同时发酵的菌株经28℃和36℃培养18h后，斜面底层均显鲜明黄色；尿素分解菌株产生深蓝色（脲酶阳性）；产碱假单胞菌、铜绿假单胞菌脲酶阳性生长时，斜面变蓝色，单独底层显黄色；斜面保持绿色的，为只发酵葡萄糖不发酵甘露醇的菌株；产气菌株能见气泡产生（pH7.0-8.0时为绿色，pH8.0-8.2时为绿蓝色，pH8.2以上时为深蓝色略带紫色）。
该培养基直立部分产酸而变黄色，为葡萄糖发酵，这因斜面部分少量葡萄糖产酸后，在有氧环境下，少量酸与空气化合而成二氧化碳和水，因而失去酸在培养基内影响酸碱度改变的作用。而在直立部分所产生的酸，则因在厌氧状况下，可使培养基的酸碱度改变而变黄；斜面部分产酸而变黄色，为甘露醇发酵，这因加入的大量甘露醇产酸后，在有氧环境下，其部分的酸与空气结合而化合成二氧化碳和水，但因甘露醇量多，所产生的酸量亦多。因此，一部分酸变质，而还有一部分酸存在，故仍可改变斜面部分的酸碱度而变黄色。
小肠结肠耶尔森生化鉴定管第二管：接种细菌经28℃和36℃培养18h以上培养后，产酸时变黄色；产酸产气时可见气泡并变黄色。观察动力的有无，可根据穿刺线生长情况；另在管口悬挂硫化氢滤纸条和吲哚滤纸条，如一条显黑色，则为硫化氢反应阳性；另一条如显红色则为靛基质反应阳性。
3）、特异性酶-底物平板鉴定产毒性小肠结肠耶尔森菌的使用方法
生化初筛符合小肠结肠耶尔森菌特征者接种产毒性小肠结肠耶尔森菌显色琼脂平板（CYA）36℃培养24-48h生长疑似典型菌落特征：产毒性小肠结肠耶尔森的菌落为淡黄色或无色、边缘光滑有透明质样感的圆整、半透明菌落，呈2-3mm中等大小；不产毒小肠结肠耶尔森菌落为红色或粉红色、边缘光滑有透明质样感的圆整、深红色或紫红色菌落，呈2-3mm中等大小。
表2 简易生化和特异性酶-底物反应试验结果
注：+：发酵产酸；+/-：大多数阳性反应，少数阴性；-/+：大多数阴性反应，少数阳性。
Claims (4)
1.小肠结肠耶尔森菌分离、鉴定的试剂盒，包括：
1）、通用型非选择性增菌液：成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml；
2）、10倍浓缩通用型非选择性增菌液：成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水100ml；
3）、耶尔森菌冷增菌液：蛋白胨山梨醇胆盐肉汤：动物组织胰化胨5.0g，山梨醇10.0g，磷酸氢二钠8.23g，磷酸二氢钠1.2g，混合胆盐1.5g，氯化钠5.0g；
4）、耶尔森菌快速选择性增菌液：成分：氯化镁60.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，高氯酸1.0g，酵母浸出物1.0g，2%质量百分浓度的孔雀石绿5.0ml，三氯生溶液1.0ml，蒸馏水1000ml，替卡西林1.0ml；
5）、选择性分离平板：成分：琼脂12.5g，甘露醇20.0g，胰化酪蛋白胨20.0g，酵母浸出物3.0g，氯化钠1.0g，丙酮酸钠2.0g，去氧胆酸那2.0g，硫酸镁0.01g，蒸馏水950ml，三氯生溶液1ml，中性红10ml，结晶紫10ml，头孢噻吩10ml，新生霉素10ml，氯化锶溶液10ml；
6）、产毒性小肠结肠耶尔森菌显色琼脂平板：成分：琼脂15.0g，脑心浸液肉汤干粉25g，植物蛋白胨3.0g.0g，酵母浸出物6.0g，丙酮酸钠2.0g，D-纤维二糖20g，蒸馏水950ml，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷150mg，X-β-glc 200mg，三氯生溶液1ml，中性红10ml，结晶紫10ml，头孢磺啶10ml，万古霉素10ml；
7）、小肠结肠耶尔森菌生化鉴定管配方：
第一管成分：琼脂14g，牛肉膏2g，酵母浸出粉2g，葡萄糖1g，蛋白胨15g，甘露醇10g，尿素10g，0.2%质量百分浓度的麝香草酚蓝溶液10ml，0.2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝溶液12.5ml，0.2%质量百分浓度的甲酚红溶液4ml，蒸馏水1000ml；
第二管成分：琼脂3g，胰蛋白胨10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，10%质量百分浓度的Na2HPO42.5ml，蔗糖10g，1%质量百分浓度的硫代硫酸钠溶液2.5ml，0.2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝溶液5ml，蒸馏水1000ml；
8）、硫化氢滤纸条；
9）、吲哚滤纸条。
2.权利要求1所述小肠结肠耶尔森菌分离、鉴定的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1、通用型非选择性增菌液制备：将胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，加热溶解后按冷却至25℃后测量值为标准，矫正pH至7.3±0.2，经121℃15磅15分钟灭菌后分装225ml/瓶备用；
2、10倍浓缩通用型非选择性增菌液制备：将胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水100ml，加热溶解后按冷却至25℃后测量值为标准，矫正pH至7.3±0.2，经121℃15磅15分钟灭菌后分装10ml/瓶备用；
3、耶尔森菌冷增菌液制备：将蛋白胨山梨醇胆盐肉汤：动物组织胰化胨5.0g，山梨醇10.0g，磷酸氢二钠8.23g，磷酸二氢钠1.2g，混合胆盐1.5g，氯化钠5.0g，加热溶解后按冷却至25℃后测量值为标准，矫正pH至7.6±0.2，经121℃15磅15分钟灭菌后分装10ml/管备用；
4、耶尔森菌快速选择性增菌液制备：将含6份水的氯化镁60.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，高氯酸1.0g，酵母浸出物1.0g，2%质量百分浓度的孔雀石绿5.0ml，三氯生溶液1.0ml，蒸馏水1000ml，加热溶解后按冷却至25℃后测量值为标准，矫正pH至7.6±0.2，经121℃15磅15分钟灭菌冷却至50℃后加入替卡西林1.0ml，分装10ml/管备用；
5、选择性分离平板制备：将琼脂12.5g，甘露醇20.0g，胰化酪蛋白胨20.0g，酵母浸出物3.0g，氯化钠1.0g，丙酮酸钠2.0g，去氧胆酸那2.0g，硫酸镁0.01g置950ml蒸馏水加热溶解煮沸，按冷却至25℃后测量值为标准，矫正pH至7.4±0.1，经121℃15磅15分钟灭菌后冷却至80℃加入三氯生溶液1ml，混匀，继续冷却至50℃加入中性红10ml，结晶紫10ml，头孢噻吩10ml，新生霉素10ml，最后不断搅拌，加入10%质量百分浓度的氯化锶溶液10ml后倾注无菌平皿，置冰箱中，备用；
6、产毒性小肠结肠耶尔森菌显色琼脂平板制备：将琼脂15.0g，脑心浸液肉汤干粉25g，植物蛋白胨3.0g.0g，酵母浸出物6.0g，丙酮酸钠2.0g，D-纤维二糖20g，置950ml蒸馏水加热溶解煮沸，按冷却至25℃后测量值为标准，矫正pH至7.4±0.1，冷却至80℃加入酶显色底物：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷150mg；X-β-glc 200mg和三氯生溶液1ml，混匀，继续冷却至50℃加入中性红10ml，结晶紫10ml，头孢磺啶10ml，万古霉素10ml，最后不断搅拌后倾注无菌平皿，置冰箱中，备用；
7、小肠结肠耶尔森菌生化鉴定管配方制备：
第一管配制：
1）、取琼脂14.0g、牛肉膏2.0g及蒸馏水1000ml，混合后加热溶解，并用数层纱布过滤，
2）、再取酵母浸出粉2.0g、葡萄糖1.0g、蛋白胨15.0g、甘露醇10.0g及尿素10.0g，混入已溶解的琼脂中，充分摇匀，使全部溶解，再加入15%质量百分浓度的氢氧化钠1.5ml，按冷却至25℃后测量值为标准，矫正pH至7.1，
3）、然后加入指示剂0.2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝溶液12.5ml、0.2%质量百分浓度的甲酚红溶液4ml、0.2%质量百分浓度麝香草酚蓝溶液10ml，
4）、混合后，充分摇匀，分装于13×100mm的试管内，每管3ml，
5）、置高压灭菌器内，经10磅10分钟的灭菌，
6）、灭菌后，制成斜面，待凝固后，置于冰箱中，备用；
第二管的配制：
1）、取琼脂3.0g，加入1000ml的蒸馏水中，加热溶解，并用数层纱布过滤，
2）、再取胰化酪蛋白胨10.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、10% 质量百分浓度的Na2HPO42.5ml、蔗糖10.0g及硫代硫酸钠溶液2.5ml，混合后，加入已溶解的琼脂中，充分摇匀，使全部溶解，再加入15%质量百分浓度的氢氧化钠溶液1.5ml，按冷却至25℃后测量值为标准，矫正pH至7.6，
3）、溴麝香草酚蓝的配制：取溴麝香草酚蓝0.2g、N/10氢氧化钠溶液5ml及蒸馏水95ml，混合后，放在棕色瓶中，备用，
4）、加0.2%质量百分浓度的溴麝香草酚蓝5ml，充分摇匀，分装于13×100mm的试管内，每管3ml，
5）、置高压灭菌器内，经10磅10分钟的灭菌，取出后，置于冰箱中，备用；
8、硫化氢滤纸条的制备：选取细薄的滤纸剪成3×50mm的长条，浸在饱和的醋酸铅溶液中，取出后放于平皿中，置56℃烘箱中2-3小时，烤干备用；
9、吲哚滤纸条的制备：滤纸条浸于对—二甲氨基苯甲醛5.0g、甲醇50ml、磷酸10ml的混合液中，取出后放于平皿中，置56℃烘箱中3-4小时，烤干即取出，保存室温内备用。
3.权利要求1所述试剂盒在水中小肠结肠耶尔森菌分离、鉴定中的应用。
4.权利要求1所述试剂盒在食品中小肠结肠耶尔森菌分离、鉴定中的应用。
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