CN102031281A - 沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒、制备和应用 - Google Patents

沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒、制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肠道病原菌中沙门菌与志贺菌的同步分离和鉴定方法，主要解决现有沙门菌和志贺菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。试剂盒包括：1)通用型非选择性增菌液：胰酪胨大豆胨肉汤；2)10倍浓缩通用型非选择性增菌液：10倍浓缩胰酪胨大豆胨肉汤；3)沙门菌增菌液：亚硒酸盐磺绿-磺胺增菌液；4)志贺菌增菌液；5)木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板；6)沙门菌显色琼脂平板；7)沙门菌-志贺菌综合生化鉴定管：包括第一试管和第二试管；8)硫化氢滤纸条；9)吲哚滤纸条。利用选择性分离培养基生长相应的典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验鉴定2种肠道病原菌。

Description

沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒、制备和应用
技术领域
本发明涉及肠道病原菌中沙门菌与志贺菌的同步分离和鉴定方法，特别涉及利用选择性分离培养基生长相应的典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验鉴定2种肠道病原菌的试剂盒和使用方法。
背景技术
现阶段使用的沙门菌、志贺菌常规分离方法在实际工作中使用传统分离培养基的批间质控要求繁琐、敏感性和特异性低，对疑似菌落筛选和鉴定所用自动化生化反应试剂材料的费用昂贵。中国专利申请200810047994.7公开了“一种同时快速检测沙门菌和志贺菌的方法”，该发明属于食源性致病菌的快速检测技术，具体说是一种对沙门菌和志贺菌同时进行检测的环介导等温DNA扩增（LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION，LAMP）检测方法。包括由样品处理试剂、LAMP反应试剂、BST DNA聚合酶的大片段、琼脂糖、溴酚蓝上样缓冲溶液、溴化乙锭溶液组成的试剂的配制，以及扩增产物的检测和沉淀产生的检测程序。其步骤是：首先设计特异性引物；其次是提取样品DNA；第三是配制反应体系。该法较之目前采用的传统细菌培养方法、免疫检测方法和其它分子生物学方法具有操作简单、快速且灵敏特异的优点。可应用于食品和其它样品中沙门菌和志贺菌的同时快速检测。但是该方法筛选病原菌还存在一定局限性，即筛选到的阳性结果可能无法通过细菌学方法分离到；也可能因为存在死菌而获得假阳性结果；另外，需设计特异性引物及提取DNA步骤较为复杂，筛选结果判断还不够直观。本发明是基于传统细菌学技术简化，经提炼、加入创新材料组合成的检测程序，包括对样品的预处理和增值，使用专一性、选择性平板分离出沙门菌和志贺菌的典型菌落，结合简易生化和特异性酶-底物反应组合试验同时鉴定沙门菌和志贺菌的试剂盒和筛选方法，较之现阶段使用的传统分离平板和鉴定技术单纯依赖生化鉴定为主的方法更具有综合成本低、操作简单、快速、无需依赖特殊仪器且有特异性、准确性及阳性预期值高的优点。适用粪便（或者粪便拭子）、食品、环境水样等多种增菌标本中沙门菌、志贺菌的同步分离和鉴定。更在原理设计、操作人员与实验室要求方面和分子生物学方法有本质的区别，且筛检的方位更为广泛、针对性更强，所以与中国专利申请200810047994.7不存在相似性与可比性。
发明内容
本发明的目的是提供一种一次可同步分离沙门菌和志贺菌并利用生化和酶反应试验鉴定的沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒、制备和应用。主要解决现有沙门菌和志贺菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。本发明用2种不同选择性增菌液及专一性的选择性分离平板配合简单的糖生化发酵反应模式和细菌特异性酶-底物反应特征建立一套行之有效的分离和特异性鉴别试验，达到对沙门菌和志贺菌同步筛选分离和简易鉴定的效果。
本发明的技术方案为：沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒，包括：
1、通用型非选择性增菌液：胰酪胨大豆胨肉汤（TSB）。成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅压力15分钟（121℃）灭菌后分装225mL/瓶备用。
2、10倍浓缩通用型非选择性增菌液：胰酪胨大豆胨肉汤（TSB）。成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水100ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经压力15磅15分钟（121℃）灭菌后分装10mL/瓶备用。
3、沙门菌增菌液：亚硒酸盐磺绿-磺胺增菌液（SBG）。成分：酵母浸出物5.0g，蛋白胨5.0g，D-甘露醇5.0g，牛磺酸钠1.0g，磺胺抑制剂0.5g，亚硒酸钠4.0g，KH2PO42.65g，K2HPO41.02g，磺绿5.0mg，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.2±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。煮沸3次后分装9mL无菌试管备用。
4、志贺菌增菌液：成分：胰化酪蛋白胨20.0g，氯化钠5.0g，KH2PO42.0g，K2HPO42.0g，葡萄糖1.0g，新生霉素0.05g，吐温-80 1.5mL，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.0±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅压力15分钟（121℃）灭菌后冷却至45℃-50℃添加新生霉素溶液后混匀分装9mL无菌试管备用。
5、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）：成分：琼脂13.5g，乳糖7.5g，蔗糖7.5g，硫代硫酸钠6.8g，L-赖氨酸5.0g，氯化钠5.0g，木糖3.5g，酵母浸出物3.0g，脱氧胆酸钠2.5g，枸橼酸铁铵0.8g，酚红0.08g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.5±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅压力15分钟（121℃）灭菌后倾注无菌平皿置冰箱中，备用。
6、沙门菌显色琼脂平板（CAS）：成分：琼脂17.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸出物3.0g，氯化钠5.0g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg，辛酸盐250mg，磺胺吡啶0.5g，蒸馏水1000ml。配制：取琼脂粉17.0g、胰化酪蛋白胨10.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸出物3.0g、氯化钠5.0g置990ml蒸馏水中加热溶解煮沸2次后，称取5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于4mlTri.HCl（pH8.0），继续称取辛酸盐250mg溶解于4ml蒸馏水中，再称取磺胺吡啶0.5g溶解于2ml0.01摩尔浓度NaOH中，待加热培养基冷却至50℃一并加入后混匀，调整pH至7.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。倾注无菌平板置冰箱中，备用。
7、沙门菌-志贺菌综合生化鉴定管配方：
第一试管：琼脂14.0g，牛肉膏2.0g，酵母浸出物2.0g，葡萄糖1.0g，蛋白胨15.0g，甘露醇10.0g，尿素10.0g，重量百分浓度为0.2%麝香草酚蓝溶液10ml，重量百分浓度为0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.5ml，重量百分浓度为0.2%甲酚红溶液4ml，蒸馏水1000ml。
第一试管配制：
1）、取琼脂14.0g、牛肉膏2.0g及蒸馏水1000ml，混合后加热溶解，并用数层纱布过滤；
2）、再取酵母浸出粉2.0g、葡萄糖1.0g、蛋白胨15.0g、甘露醇10.0g及尿素10.0g，混入已溶解的琼脂中。充分摇匀，使全部溶解。再加入重量百分浓度为15%氢氧化钠约1.5ml，矫正pH至7.1（按冷却至25℃后测量值为标准）；
3）、然后加入重量百分浓度为0.2%指示剂溴麝香草酚蓝溶液12.5ml、重量百分浓度为0.2%甲酚红溶液4ml、重量百分浓度为0.2%麝香草酚蓝溶液10ml。指示剂配制见表1；
4）、混合后，充分摇匀。分装于13×100mm的试管内，每管约3ml；
5）、置高压灭菌器内，经10磅压力10分钟的灭菌；
6）、灭菌后，制成斜面，底部宜厚。待凝固后，置于冰箱中，备用。
表1  指示剂所需量及其配制
Figure 113400DEST_PATH_IMAGE001
。
第二试管：琼脂3.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，重量百分浓度为10%Na2HPO42.5ml，蔗糖10.0g，重量百分浓度为1%硫代硫酸钠溶液2.5ml，重量百分浓度为0.2%溴麝香草酚蓝溶液5ml，蒸馏水1000ml。
第二试管配制：
1）、取琼脂3.0g，加入1000ml的蒸馏水中，加热溶解，并用数层纱布过滤；
2）、再取胰化酪蛋白胨10.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、重量百分浓度为10% Na2HPO42.5ml、蔗糖10.0g及硫代硫酸钠溶液2.5ml，混合后，加入已溶解的琼脂中，充分摇匀，使全部溶解，再加入重量百分浓度为15%氢氧化钠溶液约1.5ml左右，矫正pH至7.6（按冷却至25℃后测量值为标准）；
3）、溴麝香草酚蓝的配制：取溴麝香草酚蓝0.2g、N/10氢氧化钠溶液5ml及蒸馏水95ml，混合后，放在棕色瓶中，备用；
4）、加重量百分浓度为0.2%溴麝香草酚蓝5ml。充分摇匀，分装于13×100mm的试管内，每管约3ml；
5）、置高压灭菌器内，经10磅压力10分钟的灭菌，取出后，置于冰箱中，备用。
8、硫化氢滤纸条：硫化氢滤纸条的制备：选取细薄的滤纸剪成3×50mm的长条，浸在饱和的醋酸铅溶液中（重量百分浓度为35%醋酸铅饱和溶液），取出后放于平皿中，置56℃烘箱中约3h，烤干备用。此纸条阳性结果显黑色。
9、吲哚滤纸条：吲哚滤纸条的制备：滤纸条（同上述大小）浸于对—二甲氨基苯甲醛5.0g、甲醇50ml和磷酸10ml的混合液中，取出后放于平皿中，置56℃烘箱中约4h，稍微烤干即取出，冷却至室温备用。此纸条经对—二甲氨基苯甲醛染成淡黄色，如靛基质阳性，纸条就变为红色。
本发明的有益效果是：根据不同类型的标本选择进行预增菌或选择性增菌方式使标本中目的菌达到可以通过平板进行分离的菌量，通过选择性分离平板生长的“疑似”典型菌落接种于沙门菌-志贺菌综合生化鉴定管和沙门菌显色琼脂平板（CAS）进行的生化筛检与酶显色定位反应达到不同分离沙门菌和志贺菌的分离、鉴定效果。将生化反应识别和特异性酶-底物显色琼脂平板结合进行筛选提高了筛选的时效性和准确性，通过显色判定结果非常直观。同时，因为操作过程简便也极大提高了单位时间的工作效率，使操作者更易掌握和接受，减少试验过程中人为因素造成的随机误差。
具体实施方式
首先按照技术方案内容配制试剂盒，使用者根据不同检材选择使用不同的增菌液或选择性平板进行组合分离，最后使用简易生化和特异性酶-底物反应试验鉴别诊断沙门菌和志贺菌（表2）。
1、不同检材的解释、采集要求和预处理方法：
1）、患者的血液：以无菌操作采取患者静脉血3-7ml，立即接种于商业化血培养瓶增菌培养并同时接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）和沙门菌显色琼脂平板（CAS）进行直接分离，36℃培养24h-48h观察菌落生长结果。如果为凝固血液则将血块粉碎后接种。商业化血培养系统提示阳性者挑取培养液接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）和沙门菌显色琼脂平板（CAS），36℃培养24h观察菌落生长结果。
2）、粪便：包括人（患者和带菌者）、家禽（畜）等动物性粪便标本尽可能新鲜采集约1g（拇指大小），液状便采约1ml，在1h-2h内进行培养。若短时间不能检测时，应使用商品化培养基保存，运送至实验室。先使用棉签（拭子）挑取标本直接接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）和沙门菌显色琼脂平板（CAS），36℃培养24h观察菌落生长结果；然后使用棉签（拭子）挑取粪便标本分别置沙门菌增菌液、志贺增菌液中均质混匀后，放置36℃分别培养18h-24h和12h，取出分别接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）和沙门菌显色琼脂平板（CAS），36℃培养24h观察菌落生长结果。
3）、水：包括饮用水、生活用水、江、河、湖水和污水等液态标本用无菌玻璃或塑料瓶采集250ml-500ml，液体清澈者可使用孔径0.22μm-0.45μm滤膜进行负压过滤后将滤膜剪碎后放置沙门菌增菌液和志贺增菌液中选择性增菌，36℃分别培养18h-24h和12h，分别接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）和沙门菌显色琼脂平板（CAS），36℃培养24h观察菌落生长结果；液体浑浊者可在10倍浓缩通用型非选择性增菌液瓶中加入90ml，36℃培养6h-8h后吸取1ml，分别接种于沙门菌增菌液和志贺增菌液中进行选择性增菌，36℃分别培养18h-24h和12h，分别接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）和沙门菌显色琼脂平板（CAS），36℃培养24h观察菌落生长结果。
4）、食品：采集定型包装或非定型包装500g-1000g，先使用棉签（拭子）直接在食品表面进行多点涂抹后直接接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）和沙门菌显色琼脂平板（CAS），36℃培养24h观察菌落生长结果；然后将剪碎或均质后食品与通用型非选择性增菌液按照重量比1:10比例进行混匀，36℃培养6h-8h后吸取1ml，分别接种于沙门菌增菌液和志贺增菌液中进行选择性增菌，36℃分别培养18h-24h和12h，分别接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）和沙门菌显色琼脂平板（CAS），36℃培养24h观察菌落生长结果。
检查方法：
2、疑似典型菌落的判断、生化反应识别和特异性酶-底物平板鉴定沙门菌与志贺菌的使用方法（表2）
1）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）生长疑似典型菌落特征（24h）：非伤寒-副伤寒沙门菌中心黑色（产生硫化氢），边缘淡红色或平板底色，中等（2mm-3mm）大小的半透明、光滑、湿润菌落，伤寒-副伤寒沙门菌产生硫化氢能力弱不易形成典型菌落形态；志贺菌一般为2mm-3mm大小的淡红色或平板底色，半透明、光滑、湿润菌落，少数宋内志贺菌粗糙型的木糖阳性株可能因产生黄色菌落而无法形成典型菌落形态。肠杆菌科中部分普卢菲登肠杆菌、变形杆菌、爱德华肠杆菌和少数大肠埃希菌与假单胞菌因具有产生硫化氢的能力可能会形成疑似沙门菌典型菌落生长；肠杆菌科中部分阴沟肠杆菌、蜂房哈夫尼亚肠杆菌、少数不活泼大肠埃希菌和假单胞菌可能会形成疑似志贺菌典型菌落生长，需要使用沙门菌-志贺菌综合生化鉴定管进行鉴别诊断。
2）、沙门菌显色琼脂平板（CAS）生长疑似典型菌落（24h）：所有的沙门菌（包括伤寒沙门菌与非伤寒沙门菌）均为中等（2mm-3mm）大小、边缘光滑、湿润的酒红色菌落；非沙门菌中部分酵母菌或假单胞菌有时也会表现为粉红色菌落形态；志贺菌中所有福氏志贺菌（B群）的菌落表现为中等（2mm）大小、不透明、湿润、边缘光滑的白色菌落（延长培养至48h可呈现淡红色），宋内志贺菌（D群）绝大多数表现为中等（3mm）大小、不透明、湿润、边缘光滑的蓝色菌落（偶有白色菌落为ONPG阴性株），其他A群和C群志贺菌除志贺Ⅰ、鲍氏9型和鲍氏15型外菌落均为白色菌落（延长培养至48h可呈现淡红色）。部分假丝酵母菌（白色念珠假丝酵母菌）、部分假单胞菌（铜绿假单胞菌和不动假单胞菌）和少数大肠埃希菌也偶有粉红色的疑似沙门菌典型菌落生长，需要使用沙门菌-志贺菌综合生化鉴定管进行鉴别诊断。
3）、生化反应识别：
沙门菌-志贺菌综合生化鉴定管第一管：葡萄糖、甘露醇同时发酵的菌株在36℃培养18h后，斜面底层均显鲜明黄色；尿素分解菌株产生深蓝色（脲酶阳性）；产碱假单胞菌、铜绿假单胞菌脲酶阳性生长时，斜面变蓝色，单独底层显黄色；斜面保持绿色的，为只发酵葡萄糖不发酵甘露醇的菌株；产气菌株能见气泡产生（pH7.0-8.0时为绿色，pH8.0-8.2时为绿蓝色，pH8.2以上时为深蓝色略带紫色）。
该培养基直立部分产酸而变黄色，为葡萄糖发酵，这因斜面部分少量葡萄糖产酸后，在有氧环境下，少量酸与空气化合而成二氧化碳和水，因而失去酸在培养基内影响酸碱度改变的作用。而在直立部分所产生的酸，则因在厌氧状况下，可使培养基的酸碱度改变而变黄；斜面部分产酸而变黄色，为甘露醇发酵，这因加入的大量甘露醇产酸后，在有氧环境下，其部分的酸与空气结合而化合成二氧化碳和水，但因甘露醇量多，所产生的酸量亦多。因此，一部分酸变质，而还有一部分酸存在，故仍可改变斜面部分的酸碱度而变黄色。
沙门菌-志贺菌综合生化鉴定管第二管：接种细菌经36℃培养18h以上培养后，产酸时变黄色；产酸产气时可见气泡并变黄色。观察动力的有无，可根据穿刺线生长情况；另在管口悬挂硫化氢滤纸条和吲哚滤纸条，如一条显黑色，则为硫化氢反应阳性；另一条如显红色则为靛基质反应阳性。
4）、特异性酶-底物平板鉴定沙门菌和志贺菌使用方法
生化反应识别符合的疑似沙门菌培养物接种沙门菌显色琼脂平板，36℃培养18-24h后，所有的沙门菌（包括伤寒沙门菌与非伤寒沙门菌）均呈现为中等大小、湿润、边缘光滑的酒红色菌落。
生化反应识别符合的疑似志贺菌培养物接种沙门菌显色琼脂平板，36℃培养18-24h后，志贺菌中所有福氏志贺菌（B群）的菌落表现为中等大小、不透明、湿润、边缘光滑的白色菌落（延长培养至48h可呈现淡红色）；宋内志贺菌（D群）绝大多数表现为中等大小、不透明、湿润、边缘光滑的蓝色菌落（偶有白色菌落为ONPG阴性株）；其他A群和C群志贺菌除志贺Ⅰ型、鲍氏9型和鲍氏15型外菌落均为白色菌落（延长培养至48h可呈现淡红色）。
表2 简易生化和特异性酶-底物反应试验结果
Figure 656639DEST_PATH_IMAGE003
注：⊕：发酵产酸产气；+：发酵产酸；+/-：大多数阳性反应，少数阴性；-/+：大多数阴性反应，少数阳性；ND：不检测。1：A群志贺Ⅰ型为兰色；2：C群鲍氏9型和15型为兰色；3：极个别菌为酶反应阴性菌表现为白色菌落。

Claims (11)

1.沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒，包括：
1）、通用型非选择性增菌液：胰酪胨大豆胨肉汤；
2）、10倍浓缩通用型非选择性增菌液：10倍浓缩胰酪胨大豆胨肉汤； 
3）、沙门菌增菌液：亚硒酸盐磺绿-磺胺增菌液； 
4）、志贺菌增菌液； 
5）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板；
6）、沙门菌显色琼脂平板；
7）、沙门菌-志贺菌综合生化鉴定管：包括第一试管和第二试管； 
8）、硫化氢滤纸条；
9）、吲哚滤纸条。
2.根据权利要求1所述的沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒，其特征是：所述的胰酪胨大豆胨肉汤为：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml。
3.根据权利要求1所述的沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒，其特征是：所述的亚硒酸盐磺绿-磺胺增菌液：酵母浸出物5.0g，蛋白胨5.0g，D-甘露醇5.0g，牛磺酸钠1.0g，磺胺抑制剂0.5g，亚硒酸钠4.0g，KH2PO42.65g，K2HPO41.02g，磺绿5.0mg，蒸馏水1000ml。
4.根据权利要求1所述的沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒，其特征是：所述的志贺菌增菌液配方：胰化酪蛋白胨20.0g，氯化钠5.0g，KH2PO42.0g，K2HPO42.0g，葡萄糖1.0g，新生霉素0.05g，吐温-80 1.5mL，蒸馏水1000ml。
5.根据权利要求1所述的沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒，其特征是：所述的沙门菌显色琼脂平板：琼脂17.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸出物3.0g，氯化钠5.0g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg，辛酸盐250mg，磺胺抑制剂0.5g，蒸馏水1000ml。
6.根据权利要求1所述的沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒，其特征是：所述的第一试管：琼脂14g，牛肉膏2g，酵母浸出粉2g，葡萄糖1g，蛋白胨15g，甘露醇10g，尿素10g，重量百分浓度为0.2%麝香草酚蓝溶液10ml，重量百分浓度为0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.5ml，重量百分浓度为0.2%甲酚红溶液4ml，蒸馏水1000ml；
第二试管：琼脂3g，胰蛋白胨10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，重量百分浓度为10%Na2HPO42.5ml，蔗糖10g，重量百分浓度为1%硫代硫酸钠溶液2.5ml，重量百分浓度为0.2%溴麝香草酚蓝溶液5ml，蒸馏水1000ml。
7.权利要求1所述的沙门菌和志贺菌同步分离、鉴定的试剂盒的制备方法，其特征是：
通用型非选择性增菌液制备：将胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2，经加热加压灭菌后备用；
10倍浓缩通用型非选择性增菌液制备：将胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水100ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2，经加热加压灭菌后备用；
沙门菌增菌液的制备：将酵母浸出物5.0g，蛋白胨5.0g，D-甘露醇5.0g，牛磺酸钠1.0g，磺胺抑制剂0.5g，亚硒酸钠4.0g，KH2PO42.65g，K2HPO41.02g，磺绿5.0mg，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.2±0.2，煮沸3次后分装无菌试管备用；
志贺菌增菌液制备：将胰化酪蛋白胨20.0g，氯化钠5.0g，KH2PO42.0g，K2HPO42.0g，葡萄糖1.0g，新生霉素0.05g，吐温-80 1.5mL，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.0±0.2，经加热加压灭菌后冷却至45℃-50℃添加新生霉素溶液后混匀分装无菌试管备用；
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板制备：将琼脂13.5g，乳糖7.5g，蔗糖7.5g，硫代硫酸钠6.8g，L-赖氨酸5.0g，氯化钠5.0g，木糖3.5g，酵母浸出物3.0g，脱氧胆酸钠2.5g，枸橼酸铁铵0.8g，酚红0.08g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.5±0.2，经加温加压灭菌后倾注无菌平皿置冰箱中备用；
沙门菌显色琼脂平板制备：取琼脂粉17.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸出物3.0g，氯化钠5.0g置990ml蒸馏水中加热溶解煮沸2次后，称取5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于4mlTri.HCl（pH8.0），继续称取辛酸盐250mg溶解于4ml蒸馏水中，再称取磺胺吡啶0.5g溶解于2ml0.01摩尔浓度NaOH中，待加热培养基冷却至50℃一并加入后混匀，调整pH至7.2（按冷却至25℃后测量值为标准），倾注无菌平板置冰箱中，备用；
沙门菌-志贺菌综合生化鉴定管制备：
第一试管配制：
1）、取琼脂14.0g、牛肉膏2.0g及蒸馏水1000ml，混合后加热溶解，并用数层纱布过滤，
2）、再取酵母浸出粉2.0g、葡萄糖1.0g、蛋白胨15.0g、甘露醇10.0g及尿素10.0g，混入已溶解的琼脂中，充分摇匀，使全部溶解，再加入重量百分浓度为15%氢氧化钠1.5ml，矫正pH至7.1，
3）、然后加入指示剂重量百分浓度为0.2%溴麝香草酚蓝溶液12.5ml、重量百分浓度为0.2%甲酚红溶液4ml、重量百分浓度为0.2%麝香草酚蓝溶液10ml，
4）、混合后，充分摇匀，分装于13×100mm的试管内，
5）、置高压灭菌器内灭菌，
6）、灭菌后，制成斜面，待凝固后，置于冰箱中备用；
第二试管配制：
1）、取琼脂3.0g，加入1000ml的蒸馏水中，加热溶解，并用数层纱布过滤，
2）、再取胰化酪蛋白胨10.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、重量百分浓度为10% Na2HPO42.5ml、蔗糖10.0g及硫代硫酸钠溶液2.5ml，混合后，加入已溶解的琼脂中，充分摇匀，使全部溶解，再加入重量百分浓度为15%氢氧化钠溶液1.5ml，矫正pH至7.6，
3）、溴麝香草酚蓝的配制：取溴麝香草酚蓝0.2g、N/10氢氧化钠溶液5ml及蒸馏水95ml，混合后放在棕色瓶中备用，
4）、加重量百分浓度为0.2%溴麝香草酚蓝5ml，充分摇匀，分装于13×100mm的试管内，
5）、置高压灭菌器内灭菌，取出后，置于冰箱中备用；
硫化氢滤纸条的制备：选取细薄的滤纸剪成3×50mm的长条，浸在饱和的醋酸铅溶液中，取出后放于平皿中，置56℃烘箱中烤干备用；
吲哚滤纸条的制备：选取细薄的滤纸剪成3×50mm的长条浸于对—二甲氨基苯甲醛5.0g、甲醇50ml和磷酸10ml的混合液中，取出后放于平皿中，置56℃烘箱中烤干即取出，冷却至室温备用。
8.权利要求1所述试剂盒用于血液中沙门菌和志贺菌的筛选。
9.权利要求1所述试剂盒用于粪便中沙门菌和志贺菌的筛选。
10.权利要求1所述试剂盒用于水中沙门菌和志贺菌的筛选。
11.权利要求1所述试剂盒用于食品中沙门菌和志贺菌的筛选。
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