CN102311990A - 一种大肠菌群的显色培养基及其快速检测卡 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠菌群的显色培养基及其快速检测卡，培养基含有蛋白胨、酵母浸出物、乳糖、氯化钠、丙酮酸钠、SDS、磷酸二氢钠、特异性酶显色底物、IPTG。快速检测卡结构由下至上依次为：底片、吸水保湿层、培养基层和盖膜，培养基层上吸附有上述的培养基。本发明提供的大肠菌群的显色培养基及检测卡，能对饮用水、地表水、或食品中的大肠菌群进行检测，检测时间短，且效率高；既能对大肠菌群进行定性检测，又同时可进行定量分析，阳性结果显色明显且观察方便，减少假阳性和假阴性出现的几率，检测结果准确。

Description

一种大肠菌群的显色培养基及其快速检测卡

技术领域

本发明属于微生物检验领域，涉及微生物显色培养基，还涉及用显色培养基制作的快速检测卡。

背景技术

大肠菌群作为食品卫生质量的重要指标之一，一方面能反映被检测物有无粪便污染，根据数量多少判断样品被污染程度，另外一方面在一定程度上反映了食品在生产、加工、运输、保存等过程的卫生状况，所以具有广泛的微生物意义。

目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法有好多种，中华人民共和国食品安全国家标准大肠菌群计数4789.3-2010中规定有两种方法：MPN计数法和平板计数法。其中MPN计数法基本等效于美国FDA的标准方法的两步法：推测实验-证实实验，相比之前的三步法：乳糖发酵试验-分离培养-证实试验，实验步骤已经简化了许多。平板计数法相对比较简单，选择培养-证实实验。两种检测方法都采用的发酵管法检测，实验前期需要做大量的准备工作，对实验室的要求也比较高，另外试验后也有大量的处理和清洗工作，浪费大量的人力和无力，而且检测效率不高，一个样品要2～4天才能出报告，影响了产品的流通。

CN1093409A、 CN1483835A、CN101013127A公开的大肠菌群检测卡或者纸片都是利用了大肠菌群产酸使PH指示剂变色的原理对样品中大肠菌群进行检验。目前市场上还有美国petrifilm测试片法，该测试片含有改良的VRB培养基、冷水可溶胶和PH指示剂可增强菌落技术效果，大肠菌群菌落在测试片上生长产酸，PH指示剂使培养基颜色变深，在红色菌落周围有气泡者，为大肠菌群细菌。该测试片检测灵敏度较高，但是检测结果容易受样品酸碱度的影响，因此样品稀释处理后必须进行酸碱调节后才可以加样，另外该测试片成本相对较高，一般的基层单位和食品企业根本无法负担。

CN1796568A公开的快速检测大肠菌群和大肠杆菌的培养基，是利用微生物培养过程中产生的特异性酶与显色底物反应而显色的原理检测大肠菌群和大肠杆菌。培养基中有两个特异性酶底物，一个是4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷被大肠菌群特有的β-D-半乳糖苷酶所分解，游离出来的4-甲基伞形酮基团，在366mm紫外灯下产生荧光从而表面检样中存在大肠菌群，另外一个底物吲哚酚-β-D-葡萄糖苷被大肠杆菌特有的β-D-葡萄糖苷酶分解后产生不溶性的靛蓝色沉淀，从而表明检样中存在大肠杆菌，大肠菌群数和大肠杆菌数总和为检样中总大肠菌群数。该检验方法检测大肠杆菌造作简单且便于观察，但是大肠菌群数观察必须在紫外灯下观察产生荧光菌的落数，结果观察相对比较麻烦，而且工作人员长期在紫外灯下工作对身体特别是视力副作用特别大，一定程度上限制了该培养基的推广和应用。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种大肠菌群的显色培养基及其快速检测卡。

本发明解决其技术问题的解决方案是：

一种大肠菌群的显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨5～50g，酵母浸出物3～50g，乳糖1～25g，氯化钠2～15g，丙酮酸钠0.1～5g，SDS 0.01～0.5g，磷酸二氢钠0.1～4g，特异性酶显色底物0.001～2g，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）0.001～2g。

优选的，每1000mL培养基含有蛋白胨5～25g，酵母浸出物3～12.5g，乳糖1～10g，氯化钠2.5～6.5g，丙酮酸钠0.1～1g，SDS 0.05～0.3g，磷酸二氢钠0.2～2g，特异性酶显色底物0.05～1g，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）0.05～1g。

优选的，特异性酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。

一种大肠菌群快速检测卡，其结构由下至上依次为：底片、吸水保湿层、培养基层、盖膜，培养基层上吸附有上述的培养基。

优选的，培养基层是由吸附有培养基的吸水滤纸构成。 

优选的，吸水滤纸由天然纤维素材料、半合成材料或全合成材料制成。

优选的，吸水保湿层含有瓜尔胶、卡拉胶、琼脂粉、聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、辛烯酸琥珀酸树脂、海藻酸钠中的一种或者几种组合物。

优选的，吸水保湿层由瓜尔胶、聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠组成，其质量比为5:25:5:65。

优选的，底片由合成纸或聚酯材料制成。

优选的，盖膜由聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯膜材料制成。

本发明的有益效果是：

本发明是根据近年来发展起来的酶触显色原理研制而成，能对饮用水、地表水、或食品中的大肠菌群进行检测；特别添加了半乳糖苷酶诱导剂，使大肠菌群细菌在短时间内分泌出大量的半乳糖苷酶，与培养基中的显示底物发生特异性反应，大大缩短检测时间，提高了检测效率；本发明既能对大肠菌群进行定性检测，又同时可进行定量分析，阳性结果显色明显且观察方便，减少假阳性和假阴性出现的几率，检测结果准确。

本发明用大肠菌群显色培养基制作的快速检测卡，其操作简便、灵敏度高、结果准确、成本低、实用快速、所产生的垃圾仅仅是纸片，可以减少环境污染。

附图说明

图1是大肠菌群快速检测卡结构示意图；

图2是I号平板的大肠杆菌检测图；

图3是I号检测卡的大肠杆菌检测图；

图4是II号平板的大肠杆菌检测图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

一种大肠菌群的显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨5～50g，酵母浸出物3～50g，乳糖1～25g，氯化钠2～15g，丙酮酸钠0.1～5g，SDS 0.01～0.5g，磷酸二氢钠0.1～4g，特异性酶显色底物0.001～2g，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）0.001～2g。

优选的，一种大肠菌群的显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨5～25g，酵母浸出物3～12.5g，乳糖1～10g，氯化钠2.5～6.5g，丙酮酸钠0.1～1g，SDS 0.05～0.3g，磷酸二氢钠0.2～2g，特异性酶显色底物0.05～1g，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）0.05～1g。

优选的，特异性酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。

本发明利用大肠菌群特异性酶——半乳糖苷酶与显色底物反应的原理，在检测卡上加入特异性酶显色底物，如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，当培养物中有大肠菌群时，其特有的半乳糖苷酶与显色底物反应，产生蓝色不溶于水物质， 蓝色菌落越多，大肠菌群越多。

一种大肠菌群快速检测卡，检测卡结构如图1所示，注：1为标签、2为盖膜、3为培养基层、4为吸水保湿层、5为底片。底片5上方涂有一层不干胶，将吸水保湿层4粘附在底片5上，吸水保湿层4上方粘连一张培养基层3，培养基层3上方盖有一张盖膜2，盖膜2通过标签1与底片5连在一起。其中，培养基层上吸附有上述的培养基。

优选的，培养基层由吸附有培养基的吸水滤纸构成。

优选的，吸水滤纸由天然纤维素材料、半合成材料或全合成材料制成。

优选的，吸水保湿层含有瓜尔胶、卡拉胶、琼脂粉、聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、辛烯酸琥珀酸树脂、海藻酸钠中的一种或者几种组合物。

优选的，吸水保湿层由瓜尔胶、聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠组成，其质量比为5:25:5:65，这种吸水保湿层的保湿性能好，且能长久提供检测大肠菌群生长所需水份。

优选的，底片由合成纸或聚酯材料制成。

优选的，盖膜由聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯膜材料制成。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

一种大肠菌群显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨5g，酵母浸出物50g，乳糖12.5g，氯化钠2g，丙酮酸钠5g，SDS 0.5g，磷酸二氢钠4g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷0.001g，IPTG 1g。

将上述成分溶于水至1000mL，加热煮沸，121℃灭菌15min，即可使用。

实施例2

一种大肠菌群显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨8.7g，酵母浸出物37.5g，乳糖25g，氯化钠15g，丙酮酸钠0.2g，SDS 0.3g，磷酸二氢钠0.1g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷2g，IPTG 0.001g。

将上述成分溶于水至1000mL，加热煮沸，121℃灭菌15min，即可使用。

实施例3

一种大肠菌群显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨25g，酵母浸出物5g，乳糖6.5g，氯化钠6.5g，丙酮酸钠0.1g，SDS 0.2g，磷酸二氢钠0.2g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷1g，IPTG 0.05g。

将上述成分溶于水至1000mL，加热煮沸，121℃灭菌15min，即可使用。 

实施例4

一种大肠菌群显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨5g，酵母浸出物3g，乳糖1g，氯化钠2.5g，丙酮酸钠0.5g，SDS 0.05g，磷酸二氢钠0.3g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷0.1g，IPTG 0. 1g。

将上述成分溶于水至1000mL，加热煮沸，121℃灭菌15min，即可使用。 

实施例5

一种大肠菌群显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨10g，酵母浸出物12.5g，乳糖10g，氯化钠5g，丙酮酸钠1g，SDS 0.3g，磷酸二氢钠2g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷0.05g，IPTG 1g。

将上述成分溶于水至1000mL，加热煮沸，121℃灭菌15min，即可使用。 

实施例6

一种大肠菌群显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨50g，酵母浸出物20g，乳糖2g，氯化钠6.3g，丙酮酸钠0.2g，SDS 0.01g，磷酸二氢钠0.3g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷0.01g，IPTG 2g。

将上述成分溶于水至1000mL，加热煮沸，121℃灭菌15min，即可使用。 

实施例7

大肠菌群快速检测卡，包括底片、吸水保湿层、培养基层、盖膜。其中，底片材料为聚酯；吸水保湿层由质量比为：5:25:5:65的瓜尔胶、聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠等粉碎混合均匀制成；培养基层的吸水滤纸材料为天然纤维素，其均匀地吸附有实施例1配制的大肠菌群显色培养基；盖膜材料为聚丙烯。

实施例8

大肠菌群快速检测卡，底片为合成纸，吸水保湿层由瓜尔胶粉碎制成，培养基层的吸水滤纸由半合成材料制成，其均匀地吸附有实施例2配制的大肠菌群显色培养基，盖膜材料为聚酯。

实施例9

大肠菌群快速检测卡，底片材料为聚酯，吸水保湿层由丙烯酸树脂、琼脂粉、辛烯酸琥珀酸树脂等粉碎混合均匀制成；培养基层的吸水滤纸材料为天然纤维素，其均匀地吸附有实施例3配制的大肠菌群显色培养基，盖膜材料为聚苯乙烯膜。

实施例10

大肠菌群快速检测卡，底片为合成纸，吸水保湿层由瓜尔胶、卡拉胶、海藻酸钠等粉碎混合均匀制成，培养基层的吸水滤纸由全合成材料制成，其均匀地吸附有实施例4配制的大肠菌群显色培养基，盖膜材料为聚丙烯。

实施例11

大肠菌群快速检测卡，底片材料为聚酯，吸水保湿层由瓜尔胶、海藻酸钠等粉碎混合均匀制成，培养基层的吸水滤纸材料为天然纤维素，其均匀地吸附有实施例5配制的大肠菌群显色培养基，盖膜材料为聚丙烯。

实施例的大肠菌群显色培养基，加样后需培养18～24h，可以观察结果；快速检测卡，加样后培养15～24h就可以观察结果。显色平板或者检测卡上出现蓝绿色的菌落即为阳性菌落。

特异性实验：

将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii) ATCC 43864、粪链球菌（S.faecalis）ATCC29212、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）ATCC51329、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) ATCC 13047、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）CMCC(B) 50115、肠炎沙门氏菌（Salmonella）39111、大肠杆菌O157：H7(Escherichia coli O157:H7)  ATCC 35150、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach) CMCC（B）26003、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）ATCC17802、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）CMCC63303、铜绿假单胞菌(Monilia albican) ATCC10231、白色假丝酵母菌（C.albicans）ATCC10231等13种标准菌株分别制成适当浓度的标准菌悬液（浓度为10⁰～10²cfu/mL），每种菌分别用NA平板或者PDA平板检测，实施例7的大肠菌群快速检测卡，实施例1的大肠菌群显色培养基三种方式进行检测。每种方式均从13种菌悬液分别吸取1mL菌液检测，37℃培养18～24h。检测结果如表1，“+”表示阳性结果，有蓝点出现，“-”表示阴性结果，无蓝点出现。

由表1可知，各种标准菌株在实施例7的大肠菌群快速检测卡检测结果与实施例1的大肠菌群显色培养基结果完全一致，特异性好，可以用于大肠菌群的检测和计数。

最低浓度检测实验：

制备大肠埃希氏菌（ATCC25922）10倍系列梯度稀释标准菌悬液（保证10^-7稀释度菌悬液浓度为10²～10³cfu/mL），对10^-8稀释度以后的标准菌悬液进行倍半稀释，然后将菌悬液分别用大肠菌群快速检测卡和VRBA平板在37℃下培养20h，然后用倾注法进行最低浓度检测。 

分别用实施例7～9的大肠菌群快速检测卡进行检测，实施例7的大肠菌群快速检测卡的检测结果如表2，实施例8的大肠菌群快速检测卡的检测结果如表3，实施例9的大肠菌群快速检测卡的检测结果如表4。

 

 

检测结果表2～4均显示实施例7～9的大肠杆菌快速检测卡的最低检测浓度为1cfu/mL。

符合率实验：

制备大肠埃希氏菌（ATCC 25922）标准菌株菌悬液，浓度为10⁰～10³cfu/mL，稀释后分别用大肠菌群快速检测卡、大肠菌群显色培养基和VRBA平板在37℃培养20h后检测菌落浓度，最后计算出大肠菌群快速检测卡的符合率。

分别用实施例1～5的肠菌群培养基与实施例7～11的大肠菌群快速检测卡进行检测，实施例1与实施例7的检测结果如表5，实施例2与实施例8的检测结果如表6，实施例3与实施例9的检测结果如表7，实施例4与实施例10的检测结果如表8, 实施例5与实施例11的检测结果如表9。

 

 

由表5～9可以看出，大肠菌群检测卡准确度高，大肠菌群显色培养基的培养效果好。其中表7～9显示的每组检测卡和培养基符合率数据接近且符合率高，可见实施例3～5的培养基配方效果更佳。

不添加IPTG的实验组：对比显色培养基和对比快速检测卡的同一配方中不添加IPTG，除此以外配方和制备方法都与实施例3和实施例9相同。取对比显色培养基和对比快速检测卡作上述的符合率实验，结果见表10。由表10与表7对比可见，不添加IPTG的培养基和检测卡符合率低。 

 

大肠杆菌检测实验：

本发明显色培养基制作的平板为I号平板，本发明快速检测卡为I号检测卡，不添加IPTG的对比显色培养基的平板为II号平板，分别取10^-6 cfu/mL大肠杆菌ATCC25922标准菌株菌悬液1mL加入I号平板、I号检测卡、II号平板，37℃培养24h后大肠杆菌检测图如图2～4。

图2为I号平板的大肠杆菌检测图，图3 为I号检测卡的大肠杆菌检测图，图4为II号平板的大肠杆菌检测图，由图也可知，图4显示菌落颜色比较淡，标准阳性反应菌落比图2的明显少，说明本发明的检测培养基和检测卡灵敏度高，可以准确地辨别大肠菌群。

Claims (10)

1.一种大肠菌群的显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨5～50g，酵母浸出物3～50g，乳糖1～25g，氯化钠2～15g，丙酮酸钠0.1～5g，SDS 0.01～0.5g，磷酸二氢钠0.1～4g，特异性酶显色底物0.001～2g，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）0.001～2g。

2.根据权利要求1所述的大肠菌群的显色培养基，其特征在于：每1000mL培养基含有蛋白胨5～25g，酵母浸出物3～12.5g，乳糖1～10g，氯化钠2.5～6.5g，丙酮酸钠0.1～1g，SDS 0.05～0.3g，磷酸二氢钠0.2～2g，特异性酶显色底物0.05～1g，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）0.05～1g。

3.根据权利要求1或2所述的大肠菌群显色培养基，其特征在于：所述特异性酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。

4.一种大肠菌群快速检测卡，其结构由下至上依次为：底片、吸水保湿层、培养基层、盖膜，其特征在于：培养基层上吸附有权利要求1～3任一项所述的培养基。

5.根据权利要求4所述的一种大肠菌群快速检测卡，其特征在于：所述培养基层是由吸附有培养基的吸水滤纸构成。

6. 根据权利要求5所述的一种大肠菌群快速检测卡，其特征在于：所述吸水滤纸由天然纤维素材料、半合成材料或全合成材料制成。

7.根据权利要求4所述的一种大肠菌群快速检测卡，其特征在于：所述吸水保湿层含有瓜尔胶、卡拉胶、琼脂粉、聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、辛烯酸琥珀酸树脂、海藻酸钠中的一种或者几种组合物。

8.根据权利要求7所述的一种大肠菌群快速检测卡，其特征在于：所述吸水保湿层由瓜尔胶、聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠组成，其质量比为5:25:5:65。

9.根据权利要求4所述的一种大肠菌群快速检测卡，其特征在于：所述底片由合成纸或聚酯材料制成。

10.根据权利要求4所述的一种大肠菌群快速检测卡，其特征在于：所述盖膜由聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯膜材料制成。

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