CN101096634A - 微生物快速测试卡及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能快速检测微生物的测试卡及其使用方法，属于微生物检验检测装置及其使用方法领域。本发明所述的微生物快速测试卡，包括从下到上依次互相粘合的底板、吹塑纸和薄膜；其中底板上粘有微生物生长所需的营养物质及菌落显色剂，吹塑纸中间有直径为6cm的圆形镂空，薄膜上粘有吸水性凝胶剂。本发明所述的测试卡结构简单，使用方便，携带便利，成本低廉，并且测试结果准确。

Description

微生物快速测试卡及其使用方法

【技术领域】

本发明涉及一种能快速检测微生物的测试卡及其使用方法，属于微生物检验检测装置及其使用方法领域。

【背景技术】

随着人们生活水平的不断提高，食品安全问题越来越受到人们的重视，微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质，会导致食源性感染和食物中毒。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，可导致人类感染的致病菌种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大。采用适当的检验方法来对食品进行检测，是预防食源性中毒的重要手段。利用传统的检测方法，主要包括形态和生化检验，其准确性、灵敏性均较高；但涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重。为此，人们相继提出了一系列简便、快捷、敏感、准确的检测新思路。快速测试片法是近年来得到快速发展的一种新型的检测方法。

微生物快速测试卡是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质通过特定凝胶剂粘附在载体上而制成的，通过微生物在上面的生长、显色来测试食品中污染的微生物。测试卡始创于1955年，德国学者FJ.Forg发明了一种简单快速的大肠菌群快速检测法——纸片法，使检测周期由72小时缩短到15小时，材料成本降低了3/4，同时大大简化了操作程序。从此，这种集化学、高分子学和微生物学于一体的检测方法开始发展起来。快速测试卡检测具有显著的优点：第一，对样品的数量要求较低，检样前一般不需要进行培养基的制备和器皿的灭菌，也不需要复杂的实验器材，观察结果后只需灭菌不需要清洗工作，因而能大大减少检测的工作量，缩短检测周期，操作简便迅速，故适用于实验条件有限的基层实验室、生产现场和野外环境工作使用；第二，由于测试卡体积较小便于运输、保存、携带和灭菌，除纸片等载体外不产生其他任何废液废物，大大减少对环境的污染。第三，测试卡检样所需的时间较短，降低了因检样存放时间过长导致被检测微生物增殖而影响了定量计数结果的风险。另外，测试卡也适合不宜采用琼脂倾注法的受伤损微生物的检测。近年来国内以滤纸为载体的测试卡和美国3M公司以Petrifilm为载体的测试卡已逐步被应用。

但是现有的快速测试片仍存在许多问题：国内的测试卡产品用滤纸作载体，滤孔过大，导致滤纸双面都有菌落生长而难以准确计数；滤纸保水性差，检验培养中又不能保持湿度，不利于菌体生长；滤纸测试卡还存在营养物质分布不均匀的问题，检样液由于不能迅速扩散，从而导致菌落生长和分布不均匀；另外，由于显色指示剂系统单一，国内的测试卡产品不能对细菌进行分类计数，真菌测试卡产品用于酵母菌的检测存在同样的问题，所以难以全面推广。3MPetrifilm测试片上覆盖一层薄膜，当细菌产气、产粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；其次凝胶剂吸水比较缓慢，如果操作不慎，会使检样液从边缘流出，从而影响结果；Petrifilm使用不同明的底板材料，因此难以通过自动计数仪计数；同时，进口产品价格昂贵，不易被国内客户所接受。因此，开发具有自主产权的、更方便计数的测试卡，对我国微生物快速检测的发展具有重要意义。

【发明内容】

本发明旨在提供一种价格低廉，使用方便，测试结果准确的微生物快速测试卡，并提供一种使用所述测试卡的方法。

本发明所述的微生物快速测试卡，包括下上依次粘合的底板、吹塑纸、薄膜；底板上粘有微生物生长需要的营养物质(营养物质及其使用量的选择参照GB/T4789.1-15 2003及GB/T4789.28 2003)及菌落显色需要的显色剂(显色剂及其使用量的选择参照1.Manafi，M.，Kneifel，W.and Bascomb，S.1991.Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics.Microbial.Rev.55：335-348.2.Manafi，M.1996.Flurogenic andchromogenic enzyme substrates in culture media and identification tests.Int.J.Food Microbiol.31：45-58.3.Manafi，M.OECD WorkshopMolecular Methods for Safe Drinking Water.Interlaken’98.4.Manafi，M.2000.New developments in chromogenic and flurogenic culture media.Int.J.Food Microbiol.60：205-218.5.卢勉飞，吴清平，刘云林等.特异性酶反应在食源性致病菌检测中的应用.中国卫生检验杂志，2005，15(3)：354-356.)；吹塑纸粘着在底板上，其中间有一镂空；薄膜粘着在吹塑纸上，薄膜上粘有吸水性凝胶剂。

粘着剂为无毒胶体，如环氧树脂、水性聚氨酯等。

其中所述的底板可以是透明的，其选用过塑纸板或尼龙类物质为材料；也可以是不透明的，其选用聚酯、聚乙烯类或聚丙烯类物质为材料；厚度为0.1～0.25mm，长度为7.5～10cm，宽度为7.0～9.0cm。

其中所述的吹塑纸厚度为0.08～0.3mm，其中间的镂空是直径为6cm的圆形。

其中所述的薄膜可选用聚酯、聚乙烯类或聚丙烯类物质为材料，厚度为0.05～0.12mm，长度为7.5～10cm，宽度为7.0～9.0cm。

其中所述的吸水性凝胶剂含有聚丙烯酸钠、黄原胶与刺槐豆胶，其制备方法包括以下步骤：

(1)分别粉碎聚丙烯酸钠、黄原胶和刺槐豆胶，过160目以上筛；

(2)将粉碎后的黄原胶和刺槐豆胶以3∶2～5的质量比混合均匀；

(3)将上述混合物与粉碎后聚丙烯酸钠以5∶0.8～2.0的质量比混合均匀即得所述的凝胶剂。

(4)过筛法测凝胶剂的吸水率与粘度，以胶体不易流动(粘度大于1600mpa.s)和吸水率大于100g/g为符合要求。

其中所述的聚丙烯酸钠的合成方法包括以下步骤：

(1)将浓度为30％(g/g)的氢氧化钠溶液加入丙烯酸中，使中和度达到55％～80％；

(2)加去离子水调节丙烯酸单体浓度至30％～60％(g/g)；

(3)加入丙烯酸单体0.1％～0.8％(g/g)的交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺后混匀；

(4)在吹氮气的情况下加入丙烯酸单体0.3％～0.6％(g/g)的引发剂过硫酸铵；

(5)吹氮气驱氧密封，置恒温干燥箱中50℃～80℃聚合3～6h；

(6)用75％乙醇洗去未反应的单体、低聚物等；

(7)将胶体切成小块后于105℃烘干。

本发明所述的使用方法包括以下步骤：

(1)将测试卡灭菌，优选辐射灭菌(Co-60γ射线，辐射剂量为3000～7000Gy)；

(2)揭开测试卡的上层薄膜，将检样液1ml加于测试卡中间镂空形成的凹面内，然后将薄膜轻轻放下，使样液均匀分散于培养区；

(3)培养后计数。

本发明所述的测试卡结构简单，使用方便，携带便利，成本低廉，并且测试结果准确。此外，优选的聚酯、聚乙烯类或聚丙烯类物质为材料的透明底板，可按需要选择多种颜色的计数背景卡或通过自动计数仪计数，使计数更简易；其次，所用的材料均为常见的化工产品，使取材更简便，成本进一步降低；再次，吹塑纸中间优选的直径6cm的圆形镂空，使1ml菌液刚好能在该面积上分散均匀，生长更良好，结果更准确。

【具体实施方式】

实施例1：微生物快速测试卡检测大肠杆菌

(1)将环氧树脂胶液均匀喷在聚乙烯透明薄膜上，吸水性凝胶剂过200目筛后通过环氧树脂胶粘着在薄膜上；

(2)将环氧树脂胶液均匀喷在不透明尼龙纸板上，可检测大肠杆菌的培养基营养肉汤粉末和显色剂TTC混合均匀后粘着在尼龙板上；

(3)将上述制作完毕的薄膜、底板和吹塑纸裁剪为长8.0cm、宽7.0cm的规格；

(4)将上述剪好的三部分用环氧树脂胶液粘合在一起；

(5)测试卡Co-60γ射线辐照灭菌，辐射剂量为5000Gy；

(6)配制大肠杆菌菌液，做两个平行实验；

(7)分别用营养琼脂培养基平板计数法与上述制得的微生物快速测试卡对大肠杆菌菌液样品进行平行检测，其结果如下表1；

(8)结果表明：本发明所述的微生物快速测试卡的检测准确性与培养基平板计数法相同。

表1微生物快速测试卡检测大肠杆菌效果

检测方式	大肠杆菌菌液1	大肠杆菌菌液2
			测试卡菌落数cfu/mlNA平板菌落数cfu/ml	292±14.1278±28.3	197.5±10.6194.5±2.1

实施例2：微生物快速测试卡检测酿酒酵母

(1)将环氧树脂胶液均匀喷在聚乙烯透明薄膜上，吸水性凝胶剂过200目筛后通过环氧树脂胶黏着在薄膜上；

(2)将环氧树脂胶液均匀喷在透明聚酯板上，可检测酿酒酵母的YPD粉末和显色剂四氮唑蓝混合均匀后黏着在尼龙板上；

(3)将上述制作完毕的薄膜、底板和吹塑纸裁剪为长8.5cm、宽7.2cm的规格；

(4)将上述剪好的三部分用环氧树脂胶液粘合在一起；

(5)测试卡Co-60γ射线辐照灭菌，辐射剂量为5000Gy；

(6)配制酿酒酵母菌液，做两个平行实验；

(7)分别用麦芽汁琼脂培养基平板计数法与上述制得的微生物快速测试卡对酿酒酵母菌液样品进行平行检测，其结果如下表2；

(8)结果表明：两种检测方式所得的结果无显著差异，说明本发明所述的微生物快速测试卡的检测准确性与培养基平板计数法相同。

表2微生物快速测试卡检测酿酒酵母效果

检测方式	酵母菌液1	酵母菌液2
			测试卡菌落数cfu/mlMEA平板菌落数cfu/ml	32.5±0.733±2.8	26±2.826.5±2.1

Claims (10)

1.微生物快速测试卡，其特征在于包括从下到上依次粘合的底板、吹塑纸和薄膜；其中底板上粘有微生物生长需要的营养物质及菌落显色剂，粘着在底板上的吹塑纸中间有一镂空，粘着在吹塑纸上的薄膜底面粘有吸水性凝胶剂。

2.如权利要求1所述的微生物快速测试卡，其特征在于其中的底板选用聚酯、聚乙烯类或聚丙烯类物质为材料。

3.如权利要求1所述的微生物快速测试卡，其特征在于其中的底板选用过塑纸板或尼龙类物质为材料。

4.如权利要求1或2或3所述的微生物快速测试卡，其特征在于其中的底板厚度为0.1～0.25mm，长度为7.5～10cm，宽度为7.0～9.0cm。

5.如权利要求1所述的微生物快速测试卡，其特征在于其中的吹塑纸中间的镂空是直径为6cm的圆形。

6.如权利要求5所述的微生物快速测试卡，其特征在于其中的吹塑纸厚度为0.08～0.3mm。

7.如权利要求1所述的微生物快速测试卡，其特征在于其中的薄膜是选用聚酯或聚乙烯类或聚丙烯类物质为材料。

8.如权利要求7所述的微生物快速测试卡，其特征在于其中的薄膜厚度为0.05～0.12mm，长度为7.5～10cm，宽度为7.0～9.0cm。

9.如权利要求1所述的微生物快速测试卡的使用方法，其特征在于使用步骤为：

(1)将测试卡灭菌；

(2)无菌条件下打开测试卡的上层薄膜盖，将样液加于测试卡中间镂空形成的凹面内，然后将薄膜盖轻轻合上，使样液均匀分散于培养区；

(3)培养后计数。

10.如权利要求9所述的使用方法，其特征在于样液的加入量为1mL。