CN103558402A - 利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素b12含量的方法 - Google Patents

Abstract

利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，本发明涉及测定维生素B₁₂含量的方法。本发明要解决现有测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法存在实验体系大，测试费用高，样品容易污染，操作复杂及测试结果偏差大的问题。方法：一、样品的制备；二、标准工作液的制备；三、工作菌液的制备；四、96微孔板培养样品；五、测试并计算B₁₂含量，进而计算出婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量。本发明利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法实验体系小，测试费用低，样品不易污染，操作简单及测试结果稳定。本发明用于利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量。

Description

利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B12含量的方法

技术领域

本发明涉及测定维生素B₁₂含量的方法。

背景技术

目前，国外检验婴幼儿食品和乳品中必需营养素生物素的测定主要采用美国公职分析化学家学会(AOAC)提供的AOAC Official Method952.20Cobalamin(Vitamin B₁₂Activ ity)方法，而国内检验婴幼儿食品和乳品中必需营养素生物素的测定采用《中华人民共和国国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂的测定》GB5413.14-2010。

但现有测定方法存在实验需要较大量的玻璃器皿，不但占用实验室空间，而且难以保管和洗刷；检验体系较大，因此需要较多化学试剂、培养基和标准物质；由于维生素测定菌株对外界污染较敏感，所用玻璃器皿需要严格灭菌，实验准备工作较繁琐；盛载所需玻璃器皿体积较大，需要培养空间较大，操作步骤复杂导致实验污染几率较大，失误率较高；操作步骤复杂，实验量大，对实验人员体力和技术能力要求较高，个人偏差明显，因此同一标准曲线附带检验样品数量有限，单个样品检验费用较高等缺点。

综上所述，现有测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法存在以下问题：1.存在实验体系大；2需要大量实验器皿，较多化学试剂、培养基和标准物质，因此测试费用高；3.样品容易污染，操作复杂；4.测试结果偏差大。

发明内容

本发明要解决现有测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法存在实验体系大，需要较多化学试剂、培养基和标准物质，样品容易污染，失误率高，测试结果偏差大，操作复杂，测试费用高的问题，而提供利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂的方法。

利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，具体是按照以下步骤进行的：

一、样品的制备：将婴幼儿食品和乳品液体过滤除菌，得到过滤除菌后的样品，再将过滤除菌后的样品加入到预灭菌一级水中稀释，得到稀释后样品；

所述的过滤除菌后的样品质量与预灭菌一级水的体积比为(0.001～0.15)g:1mL；

二、标准工作液的制备：将标准物质加入到体积浓度为25%的乙醇中，配制成储备液，再将储备液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到中间液，然后将中间液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到标准工作液；

所述的标准物质为sigma B₁₂标准品；所述的储备液浓度为10μg/mL；所述的中间液浓度为100ng/mL；所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.15ng/mL；

三、工作菌液的制备：在温度为34℃～37℃下，将莱士曼氏乳酸杆菌的一个单独菌落用10mL复壮液体培养基培养18h～24h，再从复壮液体培养基中取菌株，然后在温度为34℃～37℃下，将取出的菌株更换10mL复壮液体培养基继续传代2代～3代至2个～3个麦氏浊度，每代培养18h～24h，得到增强活力后的菌株，将增强活力后的菌株置于温度为2℃～5℃的冰箱内保存备用，在保存备用过程中每15天更换新鲜的复壮液体培养基传代一次，传代温度为34℃～37℃，得到保存备用的菌株，再将保存备用的菌株在2000r/min下离心2min～3min，得到离心后的菌株，将离心后的菌株去掉上清液，再向去掉上清液的离心菌株内加入3次生理盐水，每次生理盐水的体积为10mL，混合均匀，得到菌泥，最后将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个～0.6个麦氏浊度，得到工作菌液；

四、96微孔板培养样品：取150μL工作菌液分别加入96微孔板全部微孔中，得到含工作菌液的96微孔板，再取5个不同浓度的标准工作液分别加到含工作菌液的96微孔板不同微孔中，每个浓度的标准工作液取3次，每次取标准工作液150μL，然后再取3次稀释后样品分别加到含工作菌液的96微孔板其余微孔中，每次取稀释后样品150μL，得到加样后的96微孔板，将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为35℃～37℃下培养43h～49h，得到在96微孔板培养后的样品；

五、测试并计算B₁₂含量：使用酶标仪对在96微孔板培养后的样品进行浊度分析，得到不同浓度的标准工作液浊度及稀释后样品浊度，以不同浓度标准工作液的浊度读数相对于各梯度水平标准工作液浓度绘制B₁₂标准曲线，再通过测得的稀释后样品浊度即可从B₁₂标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度并利用样品中B₁₂含量计算公式，进而计算出样品中B₁₂含量；

样品中B₁₂含量计算公式：

其中：X为样品中维生素B₁₂的含量，单位为μg/100g；C为从标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度，单位为ng/mL；F为稀释后样品的体积，单位为mL；m为过滤除菌后的样品质量，单位为g。

利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，具体是按照以下步骤进行的：

一、样品的制备：将婴幼儿食品和乳品固体加入到预灭菌一级水中稀释，得到初步稀释样品，然后将初步稀释样品在115℃下灭菌10min，得到灭菌后初步稀释样品，再将灭菌后初步稀释样品加入到预灭菌一级水中稀释，得到稀释后样品；

所述的婴幼儿食品和乳品固体的质量与预灭菌一级水的体积比为0.05g:1mL；所述的灭菌后初步稀释样品的质量与预灭菌一级水的体积比为(0.001～0.15)g:1mL；

二、标准工作液的制备：将标准物质加入到体积浓度为25%的乙醇中，配制成储备液，取储备液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到中间液，然后将中间液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到标准工作液；

所述的标准物质为sigma B₁₂标准品；所述的储备液浓度为10μg/mL；所述的中间液浓度为100ng/mL；所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.15ng/mL；

三、工作菌液的制备：在温度为34℃～37℃下，将莱士曼氏乳酸杆菌的一个单独菌落用10mL复壮液体培养基培养18h～24h，再从复壮液体培养基中取菌株，然后在温度为34℃～37℃下，将取出的菌株更换10mL复壮液体培养基继续传代2代～3代至2个～3个麦氏浊度，每代培养18h～24h，得到增强活力后的菌株，将增强活力后的菌株置于温度为2℃～5℃的冰箱内保存备用，在保存备用过程中每15天更换新鲜的复壮液体培养基传代一次，传代温度为34℃～37℃，得到保存备用的菌株，再将保存备用的菌株在2000r/min下离心2min～3min，得到离心后的菌株，将离心后的菌株去掉上清液，再向去掉上清液的离心菌株内加入3次生理盐水，每次生理盐水的体积为10mL，混合均匀，得到菌泥，最后将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个～0.6个麦氏浊度，得到工作菌液；

四、96微孔板培养样品：取150μL工作菌液分别加入96微孔板全部微孔中，得到含工作菌液的96微孔板，再取5个不同浓度的标准工作液分别加到含工作菌液的96微孔板不同微孔中，每个浓度的标准工作液取3次，每次取标准工作液150μL，然后再取3次稀释后样品分别加到含工作菌液的96微孔板其余微孔中，每次取稀释后样品150μL，得到加样后的96微孔板，将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为35℃～37℃下培养43h～49h，得到在96微孔板培养后的样品；

五、测试并计算B₁₂含量：使用酶标仪对在96微孔板培养后的样品进行浊度分析，得到不同浓度的标准工作液浊度及稀释后样品浊度，以不同浓度标准工作液的浊度读数相对于各梯度水平标准工作液浓度绘制B₁₂标准曲线，再通过测得的稀释后样品浊度即可从B₁₂标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度并利用样品中B₁₂含量计算公式，进而计算出样品中B₁₂含量；

样品中B₁₂含量计算公式：

其中：X为样品中维生素B₁₂的含量，单位为μg/100g；C为从标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度，单位为ng/mL；F为稀释后样品的体积，单位为mL；m为过滤除菌后的样品质量，单位为g。

本发明的有益效果是：1.实验体系缩小33倍，本发明采用实验器皿可采用以工业化生产的无菌的一次性96微孔板，聚苯乙烯96微孔板本身价格低，体积小，便于移动，储藏和培养；2.节约大量实验器皿，药品及标准物质，测试费用低；3.样品无需经过反复提取定容，一步灭菌即可完成，方便快捷不易污染，利于实验人员操作，对实验技术水平要求较低；4.测试结果稳定。

本发明用于利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法。

附图说明

图1是B₁₂标准曲线。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式所述的利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，具体是按照以下步骤进行的：

一、样品的制备：将婴幼儿食品和乳品液体过滤除菌，得到过滤除菌后的样品，再将过滤除菌后的样品加入到预灭菌一级水中稀释，得到稀释后样品；

所述的过滤除菌后的样品质量与预灭菌一级水的体积比为(0.001～0.15)g:1mL；

二、标准工作液的制备：将标准物质加入到体积浓度为25%的乙醇中，配制成储备液，再将储备液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到中间液，然后将中间液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到标准工作液；

所述的标准物质为sigma B₁₂标准品；所述的储备液浓度为10μg/mL；所述的中间液浓度为100ng/mL；所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.15ng/mL；

三、工作菌液的制备：在温度为34℃～37℃下，将莱士曼氏乳酸杆菌的一个单独菌落用10mL复壮液体培养基培养18h～24h，再从复壮液体培养基中取菌株，然后在温度为34℃～37℃下，将取出的菌株更换10mL复壮液体培养基继续传代2代～3代至2个～3个麦氏浊度，每代培养18h～24h，得到增强活力后的菌株，将增强活力后的菌株置于温度为2℃～5℃的冰箱内保存备用，在保存备用过程中每15天更换新鲜的复壮液体培养基传代一次，传代温度为34℃～37℃，得到保存备用的菌株，再将保存备用的菌株在2000r/min下离心2min～3min，得到离心后的菌株，将离心后的菌株去掉上清液，再向去掉上清液的离心菌株内加入3次生理盐水，每次生理盐水的体积为10mL，混合均匀，得到菌泥，最后将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个～0.6个麦氏浊度，得到工作菌液；

四、96微孔板培养样品：取150μL工作菌液分别加入96微孔板全部微孔中，得到含工作菌液的96微孔板，再取5个不同浓度的标准工作液分别加到含工作菌液的96微孔板不同微孔中，每个浓度的标准工作液取3次，每次取标准工作液150μL，然后再取3次稀释后样品分别加到含工作菌液的96微孔板其余微孔中，每次取稀释后样品150μL，得到加样后的96微孔板，将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为35℃～37℃下培养43h～49h，得到在96微孔板培养后的样品；

五、测试并计算B₁₂含量：使用酶标仪对在96微孔板培养后的样品进行浊度分析，得到不同浓度的标准工作液浊度及稀释后样品浊度，以不同浓度标准工作液的浊度读数相对于各梯度水平标准工作液浓度绘制B₁₂标准曲线，再通过测得的稀释后样品浊度即可从B₁₂标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度并利用样品中B₁₂含量计算公式，进而计算出样品中B₁₂含量；

样品中B₁₂含量计算公式：

其中：X为样品中维生素B₁₂的含量，单位为μg/100g；C为从标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度，单位为ng/mL；F为稀释后样品的体积，单位为mL；m为过滤除菌后的样品质量，单位为g。

本实施方式针对莱士曼氏乳酸杆菌Lactobacillus leichamanni(ATCC7830)对维生素B₁₂的存在具有极高的特异性和灵敏性,利用这种特异性可以定量地测出食品中维生素的含量。为了达到定量测定的目的,在测定用培养基中供给除待测维生素B₁₂以外的所有营养成分,这样细菌的生长就会同标准溶液及未知待测溶液中维生素B₁₂的含量相对应。以不同浓度标准溶液的浊度读数相对于各梯度水平标准物质的量绘制标准曲线,根据标准曲线即可计算出样品中维生素B₁₂的含量。测试时间段样品及标准溶液制备时间：30分钟；检测时间：约60分钟；培养时间：44-48小时；结果分析时间：2分钟；

本实施方式的有益效果是：1.实验体系缩小33倍，本发明采用实验器皿可采用以工业化生产的无菌的一次性96微孔板，聚苯乙烯96微孔板本身价格低，体积小，便于移动，储藏和培养；2.节约大量实验器皿，药品及标准物质；3.样品无需经过反复提取定容，一步灭菌即可完成，方便快捷不易污染，利于实验人员操作，对实验技术水平要求较低；4.测试结果稳定。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述的过滤除菌后的样品质量与预灭菌一级水的体积比为(0.001～0.1)g:1mL。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是：步骤二中所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.1ng/mL。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个麦氏浊度，得到工作菌液。其它与具体实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤四中将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为36℃下培养44h～48h，得到在96微孔板培养后的样品。其它与具体实施方式一至四相同。

具体实施方式六：本实施方式所述的利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，具体是按照以下步骤进行的：

一、样品的制备：将婴幼儿食品和乳品固体加入到预灭菌一级水中稀释，得到初步稀释样品，然后将初步稀释样品在115℃下灭菌10min，得到灭菌后初步稀释样品，再将灭菌后初步稀释样品加入到预灭菌一级水中稀释，得到稀释后样品；

所述的婴幼儿食品和乳品固体的质量与预灭菌一级水的体积比为0.05g:1mL；所述的灭菌后初步稀释样品的质量与预灭菌一级水的体积比为(0.001～0.15)g:1mL；

二、标准工作液的制备：将标准物质加入到体积浓度为25%的乙醇中，配制成储备液，取储备液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到中间液，然后将中间液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到标准工作液；

所述的标准物质为sigma B₁₂标准品；所述的储备液浓度为10μg/mL；所述的中间液浓度为100ng/mL；所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.15ng/mL；

三、工作菌液的制备：在温度为34℃～37℃下，将莱士曼氏乳酸杆菌的一个单独菌落用10mL复壮液体培养基培养18h～24h，再从复壮液体培养基中取菌株，然后在温度为34℃～37℃下，将取出的菌株更换10mL复壮液体培养基继续传代2代～3代至2个～3个麦氏浊度，每代培养18h～24h，得到增强活力后的菌株，将增强活力后的菌株置于温度为2℃～5℃的冰箱内保存备用，在保存备用过程中每15天更换新鲜的复壮液体培养基传代一次，传代温度为34℃～37℃，得到保存备用的菌株，再将保存备用的菌株在2000r/min下离心2min～3min，得到离心后的菌株，将离心后的菌株去掉上清液，再向去掉上清液的离心菌株内加入3次生理盐水，每次生理盐水的体积为10mL，混合均匀，得到菌泥，最后将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个～0.6个麦氏浊度，得到工作菌液；

四、96微孔板培养样品：取150μL工作菌液分别加入96微孔板全部微孔中，得到含工作菌液的96微孔板，再取5个不同浓度的标准工作液分别加到含工作菌液的96微孔板不同微孔中，每个浓度的标准工作液取3次，每次取标准工作液150μL，然后再取3次稀释后样品分别加到含工作菌液的96微孔板其余微孔中，每次取稀释后样品150μL，得到加样后的96微孔板，将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为35℃～37℃下培养43h～49h，得到在96微孔板培养后的样品；

五、测试并计算B₁₂含量：使用酶标仪对在96微孔板培养后的样品进行浊度分析，得到不同浓度的标准工作液浊度及稀释后样品浊度，以不同浓度标准工作液的浊度读数相对于各梯度水平标准工作液浓度绘制B₁₂标准曲线，再通过测得的稀释后样品浊度即可从B₁₂标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度并利用样品中B₁₂含量计算公式，进而计算出样品中B₁₂含量；

样品中B₁₂含量计算公式：

其中：X为样品中维生素B₁₂的含量，单位为μg/100g；C为从标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度，单位为ng/mL；F为稀释后样品的体积，单位为mL；m为过滤除菌后的样品质量，单位为g。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：步骤一中所述的灭菌后初步稀释样品的质量与预灭菌一级水的体积比为体积比为(0.001～0.1)g:1mL。其它与具体实施方式六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六或七之一不同的是：步骤二中所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.1ng/mL。其它与具体实施方式六或七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式六至八之一不同的是：步骤三中将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个麦氏浊度，得到工作菌液。其它与具体实施方式六至八相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式六至九之一不同的是：步骤四中将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为36℃下培养44h～48h，得到在96微孔板培养后的样品。其它与具体实施方式六至九相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一：

本实施例所述的利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，具体是按照以下步骤进行的：

一、样品的制备：将婴幼儿食品和乳品液体过滤除菌，得到过滤除菌后的样品，再将1g过滤除菌后的样品加入到预灭菌一级水中稀释，得到稀释后样品；

所述的过滤除菌后的样品质量与预灭菌一级水的体积比为1g:1000mL；

二、标准工作液的制备：将标准物质加入到体积浓度为25%的乙醇中，配制成储备液，再将储备液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到中间液，然后将中间液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到标准工作液；

所述的标准物质为sigma B₁₂标准品；所述的储备液浓度为10μg/mL；所述的中间液浓度为100ng/mL；所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.1ng/mL；

三、工作菌液的制备：在温度为36℃下，将莱士曼氏乳酸杆菌的一个单独菌落用10mL复壮液体培养基培养18h～24h，再从复壮液体培养基中取菌株，然后在温度为36℃下，将取出的菌株更换10mL复壮液体培养基继续传代2代～3代至2个～3个麦氏浊度，每代培养18h～24h，得到增强活力后的菌株，将增强活力后的菌株置于温度为2℃～5℃的冰箱内保存备用，在保存备用过程中每15天更换新鲜的复壮液体培养基传代一次，传代温度为36℃，得到保存备用的菌株，再将保存备用的菌株在2000r/min下离心2min～3min，得到离心后的菌株，将离心后的菌株去掉上清液，再向去掉上清液的离心菌株内加入3次生理盐水，每次生理盐水的体积为10mL，混合均匀，得到菌泥，最后将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个麦氏浊度，得到工作菌液；

四、96微孔板培养样品：取150μL工作菌液分别加入96微孔板全部微孔中，得到含工作菌液的96微孔板，再取0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.05ng/mL、0.08ng/mL、0.1ng/mL浓度的标准工作液分别加到含工作菌液的96微孔板不同微孔中，每个浓度的标准工作液取3次，每次取标准工作液150μL，然后再取3次稀释后样品分别加到含工作菌液的96微孔板其余微孔中，每次取稀释后样品150μL，得到加样后的96微孔板，将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为36℃下培养48h，得到在96微孔板培养后的样品；

五、测试并计算B₁₂含量：使用酶标仪对在96微孔板培养后的样品进行浊度分析，得到不同浓度的标准工作液浊度及稀释后样品浊度，以不同浓度标准工作液的浊度读数相对于各梯度水平标准工作液浓度绘制B₁₂标准曲线如图1所示，再通过测得的稀释后样品浊度即可从B₁₂标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度并利用样品中B₁₂含量计算公式，进而计算出测定出婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量；

本实施例步骤五中使用酶标仪对在96微孔板培养后的样品进行浊度分析，得到不同浓度的标准工作液浊度及稀释后样品浊度，测得稀释后样品浊度分别为20.5、21.0和20.0，因此稀释后样品平均浊度为20.3，测得不同浓度标准工作液的浊度如下表1所示，根据表中不同浓度标准工作液的浊度读数相对于各梯度水平标准工作液浓度绘制B₁₂标准曲线。

表1：不同浓度标准工作液的浊度

T%浊度	82.5	50.5	30.5	20.3	15.9
						标准品浓度（ng/mL）	0.01	0.03	0.05	0.08	0.1

再将稀释后样品平均浊度20.3代入B₁₂标准曲线如图1所示，从B₁₂标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度为0.08ng/mL，

样品中B₁₂含量计算公式：

其中：X为样品中维生素B₁₂的含量，单位为μg/100g；C为从标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度，单位为ng/mL；F为稀释后样品的体积，单位为mL；m为过滤除菌后的样品质量，单位为g。

经测量F稀释后样品的体积为1000mL；因此样品中B₁₂含量计算公式 $X=\frac{C\×F\×100}{m\×100}=0.08\×1000\×\frac{100}{1000}=0.8\mathrm{\μg}/100g,$ 100g样品中含有0.8μg维生素B₁₂。

且本实实例方法与国家标准方法测得样品中维生素B₁₂含量及本实施例方法与国家标准方法相比较的偏差如下表2所示，可知本实施例测得的样品中维生素B₁₂含量结果稳定准确。

表2：本实实例方法与国家标准方法测得样品中维生素B₁₂含量及本实施例方法与国家标准方法相比较的偏差

Claims (10)

1.利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂的方法是按以下步骤进行：

一、样品的制备：将婴幼儿食品和乳品液体过滤除菌，得到过滤除菌后的样品，再将过滤除菌后的样品加入到预灭菌一级水中稀释，得到稀释后样品；

所述的过滤除菌后的样品质量与预灭菌一级水的体积比为(0.001～0.15)g:1mL；

二、标准工作液的制备：将标准物质加入到体积浓度为25%的乙醇中，配制成储备液，再将储备液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到中间液，然后将中间液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到标准工作液；

所述的标准物质为sigma B₁₂标准品；所述的储备液浓度为10μg/mL；所述的中间液浓度为100ng/mL；所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.15ng/mL；

三、工作菌液的制备：在温度为34℃～37℃下，将莱士曼氏乳酸杆菌的一个单独菌落用10mL复壮液体培养基培养18h～24h，再从复壮液体培养基中取菌株，然后在温度为34℃～37℃下，将取出的菌株更换10mL复壮液体培养基继续传代2代～3代至2个～3个麦氏浊度，每代培养18h～24h，得到增强活力后的菌株，将增强活力后的菌株置于温度为2℃～5℃的冰箱内保存备用，在保存备用过程中每15天更换新鲜的复壮液体培养基传代一次，传代温度为34℃～37℃，得到保存备用的菌株，再将保存备用的菌株在2000r/min下离心2min～3min，得到离心后的菌株，将离心后的菌株去掉上清液，再向去掉上清液的离心菌株内加入3次生理盐水，每次生理盐水的体积为10mL，混合均匀，得到菌泥，最后将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个～0.6个麦氏浊度，得到工作菌液；

四、96微孔板培养样品：取150μL工作菌液分别加入96微孔板全部微孔中，得到含工作菌液的96微孔板，再取5个不同浓度的标准工作液分别加到含工作菌液的96微孔板不同微孔中，每个浓度的标准工作液取3次，每次取标准工作液150μL，然后再取3次稀释后样品分别加到含工作菌液的96微孔板其余微孔中，每次取稀释后样品150μL，得到加样后的96微孔板，将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为35℃～37℃下培养43h～49h，得到在96微孔板培养后的样品；

五、测试并计算B₁₂含量：使用酶标仪对在96微孔板培养后的样品进行浊度分析，得到不同浓度的标准工作液浊度及稀释后样品浊度，以不同浓度标准工作液的浊度读数相对于各梯度水平标准工作液浓度绘制B₁₂标准曲线，再通过测得的稀释后样品浊度即可从B₁₂标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度并利用样品中B₁₂含量计算公式，进而计算出样品中B₁₂含量；

样品中B₁₂含量计算公式：

其中：X为样品中维生素B₁₂的含量，单位为μg/100g；C为从标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度，单位为ng/mL；F为稀释后样品的体积，单位为mL；m为过滤除菌后的样品质量，单位为g。

2.根据权利要求1所述的利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于步骤一中所述的过滤除菌后的样品质量与预灭菌一级水的体积比为(0.001～0.1)g:1mL。

3.根据权利要求1所述的利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于步骤二中所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.1ng/mL。

4.根据权利要求1所述的利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于步骤三中将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个麦氏浊度，得到工作菌液。

5.根据权利要求1所述的利用微生物法测定婴儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于步骤四中将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为36℃下培养44h～48h，得到在96微孔板培养后的样品。

6.利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂的方法是按以下步骤进行：

一、样品的制备：将婴幼儿食品和乳品固体加入到预灭菌一级水中稀释，得到初步稀释样品，然后将初步稀释样品在115℃下灭菌10min，得到灭菌后初步稀释样品，再将灭菌后初步稀释样品加入到预灭菌一级水中稀释，得到稀释后样品；

所述的婴幼儿食品和乳品固体的质量与预灭菌一级水的体积比为0.05g:1mL；所述的灭菌后初步稀释样品的质量与预灭菌一级水的体积比为(0.001～0.15)g:1mL；

二、标准工作液的制备：将标准物质加入到体积浓度为25%的乙醇中，配制成储备液，取储备液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到中间液，然后将中间液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到标准工作液；

所述的标准物质为sigma B₁₂标准品；所述的储备液浓度为10μg/mL；所述的中间液浓度为100ng/mL；所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.15ng/mL；

三、工作菌液的制备：在温度为34℃～37℃下，将莱士曼氏乳酸杆菌的一个单独菌落用10mL复壮液体培养基培养18h～24h，再从复壮液体培养基中取菌株，然后在温度为34℃～37℃下，将取出的菌株更换10mL复壮液体培养基继续传代2代～3代至2个～3个麦氏浊度，每代培养18h～24h，得到增强活力后的菌株，将增强活力后的菌株置于温度为2℃～5℃的冰箱内保存备用，在保存备用过程中每15天更换新鲜的复壮液体培养基传代一次，传代温度为34℃～37℃，得到保存备用的菌株，再将保存备用的菌株在2000r/min下离心2min～3min，得到离心后的菌株，将离心后的菌株去掉上清液，再向去掉上清液的离心菌株内加入3次生理盐水，每次生理盐水的体积为10mL，混合均匀，得到菌泥，最后将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个～0.6个麦氏浊度，得到工作菌液；

四、96微孔板培养样品：取150μL工作菌液分别加入96微孔板全部微孔中，得到含工作菌液的96微孔板，再取5个不同浓度的标准工作液分别加到含工作菌液的96微孔板不同微孔中，每个浓度的标准工作液取3次，每次取标准工作液150μL，然后再取3次稀释后样品分别加到含工作菌液的96微孔板其余微孔中，每次取稀释后样品150μL，得到加样后的96微孔板，将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为35℃～37℃下培养43h～49h，得到在96微孔板培养后的样品；

五、测试并计算B₁₂含量：使用酶标仪对在96微孔板培养后的样品进行浊度分析，得到不同浓度的标准工作液浊度及稀释后样品浊度，以不同浓度标准工作液的浊度读数相对于各梯度水平标准工作液浓度绘制B₁₂标准曲线，再通过测得的稀释后样品浊度即可从B₁₂标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度并利用样品中B₁₂含量计算公式，进而计算出样品中B₁₂含量；

样品中B₁₂含量计算公式：

其中：X为样品中维生素B₁₂的含量，单位为μg/100g；C为从标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度，单位为ng/mL；F为稀释后样品的体积，单位为mL；m为过滤除菌后的样品质量，单位为g。

7.根据权利要求6所述的利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于步骤一中所述的灭菌后初步稀释样品的质量与预灭菌一级水的体积比为体积比为(0.001～0.1)g:1mL。

8.根据权利要求6所述的利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于步骤二中所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.1ng/mL。

9.根据权利要求6所述的利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于步骤三中将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个麦氏浊度，得到工作菌液。

10.根据权利要求6所述的利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于步骤四中将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为36℃下培养44h～48h，得到在96微孔板培养后的样品。

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