CN106244668A

CN106244668A - 一种快速测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法

Info

Publication number: CN106244668A
Application number: CN201610894280.4A
Authority: CN
Inventors: 付瑞燕; 徐倩
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2016-10-14
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2016-12-21
Anticipated expiration: 2036-10-14
Also published as: CN106244668B

Abstract

本发明提供了一种全新的通过液体培养测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法，属于乳酸菌胁迫菌株存活率测定方法的技术领域，主要包括步骤：通过OD₆₀₀计算取样时间点的生物量比值；以不同标准胁迫时间制备的标准胁迫组取样时间点的生物量比值为横坐标，相对应胁迫时间的菌株存活率为纵坐标，绘制线性标准曲线，得到胁迫标准方程；验证胁迫标准方程是否有效；若胁迫标准方程有效，将取样时间点的生物量比值代入所述胁迫标准方程，得到待测胁迫条件下的菌株存活率；本发明方法操作简单，测定结果与稀释平板菌落计数法的线性相关良好，检测时间和检测工作量大幅度降低，实验误差较小，有利于实现乳酸菌胁迫菌株存活率的快速准确检测。

Description

一种快速测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法

技术领域

本发明涉及乳酸菌胁迫菌株存活率测定方法，特别是涉及一种通过液体培养测定乳酸菌类益生菌胁迫菌株存活率的方法。

背景技术

乳酸菌是对一类能利用可发酵碳水化合物生产乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。益生菌是指来源于宿主并对宿主健康有一定促进作用的微生物活体。已发现的乳酸菌类益生菌大体上可分成三大类，其中包括乳杆菌类、双歧杆菌类和革兰氏阳性球菌。大量研究表明，作为人类胃肠道中的益生菌，乳酸菌具有抗氧化、降低胆固醇、增强免疫力、抗肿瘤等重要生物学功能。益生菌能够在宿主体内有多大程度的存活量，和到达部位后的繁殖能力决定着其对宿主提供益处的力度或效果。这就要求制品中的乳酸菌能够通过上消化道以大量的存活菌到达肠道并且定植于肠粘膜，以发挥其益处，因而细胞应该具有对胃酸和胆盐的耐受性。胃酸pH值一般为0.9～1.5，当嗜中性的乳酸菌处于如此高浓度H⁺环境条件下时，细胞膜上的蛋白会受到损伤，从而影响营养物质的跨膜转运，胞内多种对酸敏感的酶活性也会下降，糖降解速率降低，从而影响细胞能量的产生，抑制菌体的生长。胆盐的主要作用是帮助消化脂肪，所以胆盐对细胞膜中磷脂、脂肪酸和膜蛋白具有一定的破坏作用，从而改变了细胞膜的渗透性，对细胞造成伤害。因而乳酸菌对于胃酸和胆盐的抗性是其能够顺利通过胃肠屏障，安全抵达肠道定殖并发挥功效的先决条件之一。除此之外，在生产、贮藏、运输的过程中，乳酸菌还会面临多种物理的或化学的胁迫作用，如氧胁迫、渗透压肋迫和冷冻胁迫等，这些胁迫作用都会影响细胞的许多重要生理功能，降低细胞的活力，从而制约着相关产品的开发。因而，改善乳酸菌的环境胁迫抗性具有很高的实际应用价值，近年来选育具有多种胁迫抗性乳酸菌菌株的研究受到广泛关注。

目前，国内外主要采用稀释平板菌落计数法测定活菌数量（CFU）从而计算胁迫抗性，该法主要是通过梯度稀释、混匀使菌悬液中的细胞充分分散后，将定量的稀释液进行平板涂布培养，一个活细胞繁殖形成一个单菌落，即是“菌落形成单位”（colony formingunit，CFU），这些过程费时费力，尤其是呈分散式生长的乳酸菌并不多见，大部分乳酸菌细胞在分裂后并不立即分开，而是两两或呈链状连在一起，这就造成多数菌悬液样品往往不易完全分散成单个细胞，长出的单菌落可能来自2～3或更多个细胞，导致实验结果可能误差较大，此外，单个细胞需经过多次分裂增殖才能形成肉眼可见的菌落，因此，培养时间较长，一般需要2-3 d才能完成。近年来报道了一些基于荧光技术的快速测定胁迫菌株存活率的方法，包括检测细胞膜完整性、酶活性和跨膜电势梯度等，这些方法需要专门的仪器设备和专用试剂，但可以准确地测定出存活但无法培养的细胞（viable-but-nonculturablecells , VBNC），VBNC细胞依然具有一定的代谢活力，对于食品和饮料的发酵生产仍然可以发挥作用。然而，VBNC细胞不能进行分裂，因此VBNC数据并不能完全表征出细胞经胁迫后繁殖力损伤的多少，而经胁迫后细胞具有多少残存繁殖力对于益生菌产品质量的评估是非常重要的，如经胃酸胁迫后细胞如能快速恢复繁殖力，则有助于其在体内定殖，因而需要对有生长能力的乳酸菌细胞进行计数。此外，有研究指出这些基于荧光技术的新方法并不适用于所有类型的胁迫菌株存活率测定，例如Zotta等发现，使用基于细胞膜完整性的荧光显微镜测定细菌菌株存活率的方法，在测定乳酸菌酸胁迫和渗透压胁迫时，其结果与稀释平板菌落计数法的结果具有良好的相关性，但在测定氧胁迫时菌株存活率数值明显低于平板法，可能是因为氧胁迫可以使某些细胞代谢失活，但不会破坏其细胞膜。因而，建立准确、快速、简便的胁迫抗性测定方法对于益生菌类乳酸菌产品的研发和生产以及细胞胁迫生理学方面的研究都具有重要的价值和意义。

发明人通过发酵乳杆菌CGMCC 1.3261和植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566经酸胁迫后再培养的生长特性，研究出一种全新的测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法，并比较了该法与稀释平板菌落计数法测定结果的相关性，同时证明了本发明方法测定乳酸菌胁迫菌株存活率的可行性。

发明内容

本发明为了解决传统稀释平板计数法操作复杂，且对各种胁迫的测定准确度不高等问题，提出了一种全新的快速测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法，具体包括如下步骤：

制备至少5组经过不同时间盐酸溶液胁迫后的胁迫菌悬液和未经过胁迫的对照菌悬液；

采用传统稀释平板计数法测定菌株存活率并通过OD₆₀₀计算取样时间点的生物量比值；

以不同标准胁迫时间制备的标准胁迫组取样时间点的生物量比值为横坐标，相对应胁迫时间的菌株存活率为纵坐标，绘制线性标准曲线，得到胁迫标准方程；

首次测定某胁迫菌株存活率，须选择至少两个不同胁迫时间处理的菌悬液，通过OD₆₀₀计算每个胁迫时间处理的取样时间点的生物量比值，并将该取样时间点的生物量比值代入该胁迫标准方程，得到该胁迫下拟合的菌株存活率值，并与传统平板计数法方法对比，若误差率均小于10%，所述胁迫标准方程适用于该胁迫菌株存活率的测定；计算待测胁迫任意条件的取样时间点的生物量比值，代入所述胁迫标准方程，得到待测胁迫条件下的菌株存活率；

其中，所述取样时间点的生物量比值的计算方法为：取经过胁迫的乳酸菌菌悬液和未经胁迫的菌悬液，接种至MRS培养基中，得到胁迫组和对照组，静置培养，在所述胁迫组和对照组到达稳定期之前，间隔测定胁迫组和对照组乳酸菌发酵液的OD₆₀₀，得到胁迫组OD₆₀₀变化曲线和对照组OD₆₀₀变化曲线；根据公式：生物量比值=酸胁迫组OD₆₀₀/对照组OD₆₀₀，计算乳酸菌的生物量比值；得到不同培养时间的生物量比的变化曲线，以生物量比变化曲线最低点后第一个测定时间点作为取样时间点，并得到取样时间点的生物量比值。

具体的，所述述快速测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法为：

a. 将活化后的乳酸菌用生理盐水稀释，将浊度OD₆₀₀调整至4.0~4.5，接种至MRS培养基中，静置液态培养至稳定期，得到乳酸菌发酵液；

b. 将乳酸菌发酵液离心，取乳酸菌菌体沉淀，分别重悬于等量盐酸溶液中，37±1℃下胁迫培养15 ~180 min中至少5个时间，再次离心，得到经过不同胁迫时间的乳酸菌菌体，用生理盐水培养的为未经过酸胁迫的乳酸菌菌体；

c．用生理盐水洗涤经过不同胁迫时间的乳酸菌菌体和未经过酸胁迫的乳酸菌菌体，分别重悬于等量生理盐水中，得到标准胁迫菌悬液和对照菌悬液；

d．取标准胁迫菌悬液和对照菌悬液，分别采用传统稀释平板计数法测定菌株存活率并通过OD₆₀₀计算取样时间点的生物量比值；

e．以不同标准胁迫时间制备的标准胁迫组取样时间点的生物量比值为横坐标，相对应胁迫时间的菌株存活率为纵坐标，绘制线性标准曲线，得到胁迫标准方程；

f. 首次测定某胁迫菌株存活率，须选择至少两个不同胁迫时间处理的菌悬液，通过OD₆₀₀计算每个胁迫时间的取样时间点的生物量比值，并将该取样时间点的生物量比值代入该胁迫标准方程，得到该胁迫下拟合的菌株存活率值，并与传统平板计数法方法对比，若误差率小于10%，所述胁迫标准方程适用于该胁迫菌株存活率的测定。

g. 计算待测胁迫任意条件的取样时间点的生物量比值，代入所述胁迫标准方程，得到待测胁迫条件下的菌株存活率。

其中，所述待测胁迫包括：酸胁迫，H₂O₂ 胁迫，NaCl胁迫，胆盐胁迫和冷冻胁迫。所述所述盐酸溶液的pH值在2.2~2.8之间。所述所述离心条件是：离心转速10000 rpm，离心时间5 min。

有益效果

如图1所示，当发酵乳杆菌在pH2.3条件下胁迫 1 h后重新接种新鲜MRS培养基，与对照组相比，其生长曲线延滞期明显延长。微生物延滞期的长短与许多因素有关，在菌种、培养基和培养条件相同条件下，延滞期的长短主要与接种量密切相关。因此，经过酸胁迫后，部分发酵乳杆菌细胞活性受到严重损伤，失去繁殖的能力，活细胞数减少，将胁迫后的菌液接种新鲜培养基后，其生长曲线会有相应的响应。由胁迫组和对照组的生物量比值绘制得到的生物量比曲线呈现出先下降后上升的特点，在4 h时生物量比最低，可能的原因是对照组在4 h时已进入对数期，而胁迫组在4h时还处于延滞后期，导致此时胁迫组与对照组生物量比值最低，随着培养时间的延长，胁迫组开始快速生长，导致胁迫组与对照组生物量的比值开始增加。

对于需要测定一个乳酸菌菌株多种胁迫抗性的研究而言，本发明通过液体培养测定胁迫菌株存活率是一个简单有效的方法，只需使用普通的可见光分光光度计通过测定生物量，获得取样时间点的生物量比值，并测定相同胁迫条件下利用稀释平板菌落计数法测得的菌株存活率，建立两者之间的线性回归方程，并验证其他类型胁迫是否适用该标准曲线方程后，在后续测定胁迫样品菌株存活率时，即可通过测定相应取样时间点的生物量比值，即可由该线性方程计算得到准确的菌株存活率值。

如前所述，稀释平板菌落计数法容易产生人为操作造成的误差，并且菌株存活率的准确性无从考证，本法借助建立标准曲线，通过测定一系列不同程度酸胁迫样品中残存活细胞在固体培养和液体培养方式下繁殖力之间的线性相关，可以将菌株存活率误差控制在<10%的范围内，从而极大地提高准确性。此外，本法还大大减少了传统稀释平板菌落计数法的测定次数，尤其对于对一种胁迫的研究，可以大大减少检测时间，不需要大量的人力物力对微生物接种平板培养，节约了大量实验成本，同时，也可以减少因传统稀释平板菌落计数法产生的实验误差。以植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566为例，本发明测定样品菌株存活率所需时间最多为7 h，与传统稀释平板菌落计数法需要48 h相比，检测所用时间明显缩短，具有很大的优势，节省人力物力，从而有利于实现乳酸菌胁迫抗性的快速准确检测。

附图说明

图1：发酵乳杆菌经pH 2.3盐酸溶液胁迫30 min的生物量曲线和生物量比曲线

图2：发酵乳杆菌和植物乳杆菌植物亚种取样时间点的生物量比和菌株存活率之间的线性标准曲线。

具体实施方式

本实施例中提及的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum) 购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC 1.3261；实施例中提及的植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC 1.2566

实施例1

分别将所述发酵乳杆菌和植物乳杆菌植物亚种置于安徽农业大学茶与食品科技学院食品微生物实验室保藏。分别将-70℃下保存的上述两菌株甘油贮存液接种于MRS培养基中，在37±1℃下静置培养12 h制备活化种子液。

本发明提供了一种通过液体培养测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法,具体步骤如下：

1、将活化后的发酵乳杆菌用生理盐水稀释，将浊度OD₆₀₀调整至4.0，以5%的接种量转接至MRS培养基中，37±2℃下静置液态培养至稳定期，得到发酵乳杆菌发酵液。

2、将发酵乳杆菌发酵液在10000 rpm的条件下离心5 min，去上清液，取发酵乳杆菌菌体沉淀，并重悬于pH2.3±0.1的等量盐酸溶液中，在37±2℃下水浴30 min后，继续采用10000 rpm的条件，离心5 min，去上清液，得到经过酸胁迫的发酵乳杆菌菌体；用生理盐水代替盐酸溶液，其余处理方法不变，得到未经过酸胁迫的发酵乳杆菌菌体。

3、用生理盐水洗涤经过酸胁迫的发酵乳杆菌菌体和未经过酸胁迫的发酵乳杆菌菌体，分别重悬于等量生理盐水中，以5%的接种量接种至20 mL MRS培养基中，37±1℃下静置培养，得到酸胁迫组和对照组，在静置培养过程中，间隔1 h测定其OD₆₀₀，分别得到酸胁迫组OD₆₀₀变化曲线和对照组OD₆₀₀变化曲线。

4、计算发酵乳杆菌的生物量比值，生物量比值=酸胁迫组OD₆₀₀/对照组OD₆₀₀。并获得生物量比的变化曲线，以生物量比曲线上达到谷底后第一个测试的时间点作为取样时间点，

5、采用步骤2的方法，任意选择15 ~180 min中至少5个时间对发酵乳杆菌进行盐酸胁迫处理，本实施例选用20min，50min，80min，110min，140min和170min。酸胁迫完成后，发酵液经过离心、去上清液、生理盐水洗涤处理后重悬于等量生理盐水中，配制成不同酸胁迫时间的菌悬液，取出该菌悬液用传统稀释平板计数法测定菌株存活率。

其中，传统稀释平板计数法测定酸胁迫菌株存活率的方法为：梯度稀释经酸胁迫且重悬于等量生理盐水的菌悬液，吸取10μL稀释菌液在MRS固体培养基上点样，每个稀释度点5个平行，待表层菌液被吸收后，放入37±1℃培养箱，倒置培养至菌落长出，对每个稀释度平板进行菌落计数，同时以未经过酸胁迫处理的对照组的菌悬液作为对照，计算菌株存活率。菌株存活率=胁迫后的菌落数/对照菌落数。

6、取步骤5中制备的菌悬液，以5%的接种量接种至20 mL MRS培养基中，37±1℃下静置培养，根据胁迫程度在培养中取样测定OD₆₀₀，并采用步骤4对照组OD₆₀₀，计算生物量比值。以取样时间点的生物量比值为横坐标，菌株存活率为纵坐标，绘制两者之间的关系曲线，并线性回归分析，如果线性回归方程相关系数大于0.99，则说明两者之间存在线性相关，得到胁迫标准方程，此回归方程作为后续计算菌株存活率的标准方程。

7、验证胁迫标准方程是否适用：将待测发酵乳杆菌经胁迫n时间后，详见表1，用传统平板计数法方法测定得到菌株存活率值并计算步骤4得到的取样时间点的生物量比值，将该生物量比值代入该胁迫标准方程，即可得到该胁迫水平下拟合的菌株存活率值，将拟合值与测定的菌株存活率真值比较，如果两者之间的误差率小于10%，则表明该酸胁迫标准方程可适用于该胁迫菌株存活率的测定。其中，所述胁迫包括：H₂O₂和NaCl胁迫，胆盐胁迫，酸胁迫和冷冻胁迫，验证结果见表1。

8、若样品胁迫后取样时间点的生物量比值在该标准方程线性范围内，只需将所述取样时间点对应的生物量比值代入该标准方程即可得到该胁迫水平下的菌株存活率值。

步骤8中所述的胁迫包括酸胁迫、胆盐胁迫、H₂O₂和NaCl胁迫和冷冻胁迫。

胆盐胁迫的操作方法：将经生理盐水洗涤的发酵乳杆菌CGMCC 1.3261重悬于等量0.001%胆盐溶液中37±1℃下水浴一定时间，其他操作方法与步骤2的酸胁迫一致。

H₂O₂和NaCl胁迫的操作方法：分别将经生理盐水洗涤的发酵乳杆菌CGMCC 1.3261重悬于等量500 mM H₂O₂溶液和400 mM NaCl溶液中室温下水浴一定时间，其他操作方法与步骤2酸胁迫一致。

冷冻胁迫的操作方法：将经生理盐水洗涤的发酵乳杆菌CGMCC 1.3261等量灭菌生理盐水中，分装于无菌离心管中，取出适量菌悬液作为对照组测定菌株存活率和生物量比，其余的置于-20℃下，分别于第0.5 d、2 d取出在室温解冻，作为胁迫组测定菌株存活率和生物量比。

以酸胁迫为例，经过计算，发酵乳杆菌的生物量比值在0.09～0.89的范围内，适用该标准方程。

乳酸菌会面临各种不同类型的胁迫，并且胁迫损伤机理差异较大，例如胆盐会破坏细胞膜的完整性，降低胞内pH；冷冻胁迫会使某些蛋白质折叠速率减缓或低效，降低细胞膜流动性等，从而剧烈干扰细胞的正常代谢。为评价前述得到的比浊法酸胁迫标准方程是否可以用于测定其他类型胁迫菌株存活率，将发酵乳杆菌CGMCC 1.3261分别经H₂O₂胁迫、胆盐胁迫、冷冻胁迫和NaCl胁迫，测定生物量比和菌株存活率，将取样时间点的生物量比值代入酸胁迫标准方程求得拟合菌株存活率，将拟合菌株存活率与真值结果进行比较，结果如表1所示，两者之间的误差率均小于10%，表明本法测定不同胁迫类型菌株存活率具有良好的可靠性。可见，该标准方程不是只能用于酸胁迫，而是可用于物理的或化学的各种类型胁迫，不论待测样品中残存的活细胞是经过怎样的胁迫，只要是存活的、有繁殖能力的，可能就适用这个标准方程。

表1 酸胁迫标准方程测定不同胁迫类型菌株存活率的验证性实验

^a误差率=（菌株存活率真值-菌株存活率拟合值）/菌株存活率真值×100

^b平均值 ± 标准偏差（SD）

实施例2

为验证实施例1的发明方法是否可以应用于测定其他乳酸菌胁迫菌株存活率，下面以植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566为研究对象，建立其酸胁迫标准方程。

1、将活化后的植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566用生理盐水稀释，将浊度OD₆₀₀调整至4.5，以10%的接种量转接至MRS培养基中，37±2℃下静置液态培养至稳定期，得到植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566发酵液。

2、将植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566发酵液在10000 rpm的条件下离心5 min，去上清液，取植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566菌体沉淀，并重悬于pH2.7±0.1的等量盐酸溶液中，在37±1℃下水浴90 min后，继续采用10000 rpm的条件，离心5 min，去上清液，得到经过酸胁迫的植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566菌体；用生理盐水代替盐酸溶液，其余处理方法不变，得到未经过酸胁迫的植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566菌体。

3、用生理盐水洗涤经过酸胁迫的植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566菌体和未经过酸胁迫的植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566菌体，分别重悬于等量生理盐水中，以10%的接种量接种至50 mL MRS培养基中，37±1℃下静置培养，得到酸胁迫组和对照组，在静置培养过程中，间隔1h测定其OD₆₀₀，分别得到酸胁迫组OD₆₀₀变化曲线和对照组OD₆₀₀变化曲线。

4、计算植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566的生物量比值，生物量比值=酸胁迫组OD₆₀₀/对照组OD₆₀₀。并获得生物量比的变化曲线，以生物量比曲线上达到谷底后1 h的时间点作为取样时间点，得到取样时间点的生物量比值。

5、采用步骤2~4的方法，任意选择15 ~180 min中至少5个时间对植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566进行盐酸胁迫处理，本实施例选用胁迫15min,45min,90min,135min和180min，发酵液经过离心、去上清液、生理盐水洗涤处理后重悬于等量生理盐水中，配制成不同酸胁迫时间的菌悬液，取出该菌悬液用传统稀释平板计数法测定菌株存活率。

6、取步骤5中制备的菌悬液，以10%的接种量接种至50 mL MRS培养基中，37±1℃下静置培养，根据胁迫程度在培养中取样测定OD₆₀₀，并按照步骤3的方法制备对照组OD₆₀₀，按照步骤5的方法计算取样时间点的生物量比值。以取样时间点的生物量比值为横坐标，菌株存活率为纵坐标，绘制两者之间的关系曲线，并线性回归分析，如果线性回归方程相关系数大于0.99，则说明两者之间存在线性相关，得到胁迫标准方程，此回归方程作为后续计算菌株存活率的标准方程。

7、验证胁迫标准方程是否适用：将待测植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566经某种胁迫m min后，详见表2，分别用传统平板计数法方法测定得到菌株存活率值并按照步骤4计算的取样时间点的生物量比值，将该生物量比值代入该胁迫标准方程，即可得到该胁迫水平下拟合的菌株存活率值，将拟合值与测定的菌株存活率真值比较，如果两者之间的误差率小于10%，则表明该酸胁迫标准方程可适用于该胁迫菌株存活率的测定，验证结果见表2。其中，所述某种胁迫包括：酸胁迫，H₂O₂ 胁迫和胆盐胁迫。

8、若样品胁迫后取样时间点的生物量比值在该标准方程线性范围内，只需将计算得到的生物量比值代入该标准方程即可得到该胁迫水平下的菌株存活率值。

结果如图2所示，将植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566经pH 2.5胁迫不同时间，菌株存活率在0.098～0.803范围内，本发明测定结果与稀释平板法之间线性关系良好，r²=0.9987。与实施例1的发酵乳杆菌相比，其菌株存活率线性范围较窄，可能是因为植物乳杆菌的对数期比发酵乳杆菌短，因而当胁迫程度较大时，胁迫组延滞期刚结束，对照组已进入稳定期，这样对照组生物量会包含部分死细胞，就会偏离生物量比与菌株存活率之间的线性相关。用两次独立酸胁迫、H₂O₂胁迫和胆盐胁迫实验来验证这个酸胁迫标准方程，结果如表2所示，菌株存活率真值与拟合值之间的误差率均小于10%，表明本发明的方法可以用来准确测定植物乳杆菌植物亚种CGMCC 1.2566酸胁迫、H₂O₂胁迫和胆盐胁迫菌株存活率。

表2 酸胁迫标准方程测定不同胁迫类型菌株存活率的验证性实验

实施例3

1. 将活化后的乳酸菌用生理盐水稀释，将浊度OD₆₀₀调整至4.0~4.5，接种至MRS培养基中，静置液态培养至稳定期，得到乳酸菌发酵液；

2. 将乳酸菌发酵液离心，取乳酸菌菌体沉淀，分别重悬于等量盐酸溶液和生理盐水中，37±1℃下胁迫培养15 ~180 min中至少5个时间，再次离心，得到经过不同胁迫时间的乳酸菌菌体和未经过酸胁迫的乳酸菌菌体；

3．用生理盐水洗涤经过不同胁迫时间的乳酸菌菌体和未经过酸胁迫的乳酸菌菌体，分别重悬于等量生理盐水中，得到标准胁迫菌悬液和对照菌悬液；

4．取标准胁迫菌悬液和对照菌悬液，采用传统稀释平板计数法测定菌株存活率；

5. 取标准胁迫菌悬液和对照菌悬液，接种至MRS培养基中，得到标准胁迫组和对照组，并静置培养，在所述标准胁迫菌悬液和对照菌悬液到达稳定期之前，间隔固定时间测定标准胁迫组和对照组乳酸菌发酵液的OD₆₀₀，得到标准胁迫组OD₆₀₀变化曲线和对照组OD₆₀₀变化曲线；

6. 根据公式：生物量比值=酸胁迫组OD₆₀₀/对照组OD₆₀₀，计算乳酸菌的生物量比值；得到不同培养时间的生物量比的变化曲线，以生物量比曲线最低点后第一个测定时间点作为取样时间点，得到取样时间点的生物量比值；

7．以不同标准胁迫时间制备的标准胁迫组取样时间点的生物量比值为横坐标，相对应胁迫时间的菌株存活率为纵坐标，绘制两者之间的关系曲线，如果线性回归方程相关系数大于0.99，得到胁迫标准方程；

8. 验证胁迫标准方程是否适用：将待测乳酸菌经胁迫至少2个时间后，分别用传统平板计数法方法测定得到菌株存活率值并计算取样时间点的生物量比值，将该生物量比值代入该胁迫标准方程，得到胁迫下拟合的菌株存活率值，若误差率均小于10%，所述胁迫标准方程适用于该胁迫菌株存活率的测定；

9. 若样品胁迫后取样时间点的生物量比值在该标准方程线性范围内，只需将所述取样时间点的生物量比值代入该标准方程即可得到该胁迫水平下的菌株存活率值。

Claims

1.一种快速测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法，其特征在于：所述快速测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法包括步骤：

采用传统稀释平板计数法测定所述菌悬液的菌株存活率并通过OD₆₀₀计算所述菌悬液取样时间点的生物量比值；

以不同盐酸溶液胁迫时间制备的标准胁迫菌悬液的取样时间点的生物量比值为横坐标，相对应胁迫时间的菌株存活率为纵坐标，绘制线性标准曲线，得到胁迫标准方程；

首次测定某胁迫菌株存活率，须选择至少两个不同胁迫时间处理的菌悬液，通过OD₆₀₀计算每个胁迫时间的取样时间点的生物量比值，并将该取样时间点的生物量比值代入该胁迫标准方程，得到该胁迫下拟合的菌株存活率值，并与传统平板计数法方法对比，若误差率均小于10%，所述胁迫标准方程适用于该胁迫菌株存活率的测定，计算待测胁迫任意条件的取样时间点的生物量比值，代入所述胁迫标准方程，得到待测胁迫条件下的菌株存活率；

2.根据权利要求1所述的快速测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法，其特征在于：所述述快速测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法具体为：

b. 将乳酸菌发酵液离心，取乳酸菌菌体沉淀，分别重悬于等量盐酸溶液中，37±1℃下胁迫培养15 ~180 min中至少5个时间，再次离心，得到经过不同胁迫时间的乳酸菌菌体，用等量生理盐水培养的为未经过酸胁迫的乳酸菌菌体；

f. 首次测定某胁迫菌株存活率，须选择至少两个不同胁迫时间处理的菌悬液，通过OD₆₀₀计算每个胁迫时间的取样时间点的生物量比值，并将该取样时间点的生物量比值代入该胁迫标准方程，得到该胁迫下拟合的菌株存活率值，并与传统平板计数法方法对比，若误差率均小于10%，所述胁迫标准方程适用于该胁迫菌株存活率的测定；

3.根据权利要求1或2所述的快速测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法，其特征在于：所述待测胁迫包括：酸胁迫，H₂O₂ 胁迫，NaCl胁迫，胆盐胁迫和冷冻胁迫。

4.根据权利要求1所述的快速测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法，其特征在于：所述所述盐酸溶液的pH值在2.2~2.8之间。

5. 根据权利要求2所述的快速测定乳酸菌胁迫菌株存活率的方法，其特征在于：所述所述离心条件是：离心转速10000 rpm，离心时间5 min。