CN101491277B - 一种对酵母菌y7进行冷冻干燥的保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产酒味酸奶的复合发酵剂，它是由酵母菌和乳酸菌按菌体数量比为1～2:1～4组成，所述的酵母菌是由酵母菌Y2和酵母菌Y7菌体数量比为1:1组成；所述的乳酸菌是由乳酸菌X3、乳酸菌Lb、乳酸菌St三者按菌体数量比为1:1:1组成。该复合发酵剂的发酵性能优良，能够满足直投式纯种复合发酵剂的要求。

Description

一种对酵母菌Y7进行冷冻干燥的保护剂

技术领域

本发明属于生产酒工艺技术中发酵剂的应用领域，具体涉及一种生产酒味酸奶的复合发酵剂。 

背景技术

西藏灵菇，俗称“西藏雪莲”^[1]，是由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌在生长过程中产生的多糖和乳蛋白凝集而成的形似雪莲的共生体^[2，3]。由其发酵而成的乳制品兼具独特的乳酸发酵的酸味及酒精发酵的醇味。长期饮用西藏灵菇制品，具有防止肠道感染、降血糖、降血脂、防癌抗癌等多种保健功能^[4，5，6]。天然的西藏灵菇是一种多菌种共生的复合发酵体系，其中的微生物菌群分布会因地域、气候、环境等因素而发生变化，不利于获得品质稳定的发酵剂，同时，由于自然界存在的西藏灵菇数量极其有限，严重的制约了其在工业化生产中推广应用。 

[参考文献] 

[1]周剑忠，董明盛，江汉湖，等.藏灵菇发酵奶发酵特性的研究[J].食品科学，2006，27(8)：29-33. 

[2]杨希娟，樊明涛，师俊玲，等.西藏灵菇发酵乳中优势菌群的分离鉴定[J].中国酿造，2007，(6)：52-55. 

[3]周剑忠，董明盛，江汉湖.PCR-DGGE指纹技术与分离技术结合筛选藏灵菇奶发酵过程的优势菌[J].中国农业科学，2006，9(8)：1632-1638. 

[4]刘宇峰，王金英，曲晓军，等.西藏灵菇菌的菌相学的研究[J].中国乳品工业，2005，33(9)：35-39. 

[5]聂炎炎.西藏“雪莲”共生菌粒的分离鉴定与特性研究[D].广州：华  南理工大学，2005. 

[6]Diniz R O，Garla L K，Schneed J M，etal.Study of anti-inflammatoryactivity of Tibetan mushroom，a symbiotic culture of bacteria and fungiencapsulated into a polysaccharide matrix[J].Pharmacological Research，2003，47(1)：49-52. 

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷与不足，本发明的目的在于提供一种效果稳定且能够大规模工业化生产应用的酒味酸奶复合发酵剂。 

实现上述发明目的的技术方案是一种生产酒味酸奶的复合发酵剂，它是由酵母菌和乳酸菌按菌体数量比为1～2:1～4组成，所述的酵母菌是由酵母菌Y2和酵母菌Y7菌体数量比为1:1组成；所述的乳酸菌是由乳酸菌X3、乳酸菌Lb、乳酸菌St三者按菌体数量比为1:1:1组成。 

上述生产酒味酸奶的复合发酵剂的最佳比例为：酵母菌和乳酸菌按菌体数量比为1:2组成，所述的酵母菌是由酵母菌Y2和酵母菌Y7菌体数量比为1:1组成；所述的乳酸菌是由乳酸菌X3、乳酸菌Lb、乳酸菌St三者按菌体数量比为1:1:1组成。 

为了使生产酒味酸奶的发酵工艺更加简单化、效益化，本发明还有一个目的是提供一种能够满足直投式生产酒味酸奶的复合发酵剂，它是由酵母菌干粉和乳酸菌干粉按其中含有的活菌数量比为1～2:1～4组成，所述的酵母菌干粉是由酵母菌Y2干粉和酵母菌Y7干粉按其中含有的活菌数量比为1:1组成；所述的乳酸菌干粉是由乳酸菌X3干粉、乳酸菌Lb干粉、乳酸菌St干粉三者按其中含有的活菌数量比为1:1:1组成。

上述生产酒味酸奶的复合发酵剂的最佳比例为：它是由酵母菌干粉和乳酸菌干粉按其中含有的活菌数量比为1:2组成，所述的酵母菌干粉是由酵母菌Y2干粉和酵母菌Y7干粉按其中含有的活菌数量比为1:1组成；所述的乳酸菌干粉是由乳酸菌X3干粉、乳酸菌Lb干粉、乳酸菌St干粉三者按其中含有的活菌数量比为1:1:1组成。 

本发明还有一个目的是提供酵母菌Y2的冷冻保护剂，它是由浓度为8～12％脱脂乳、2～7％甘油、0.5～1.5％L-半胱氨酸、8～12％蔗糖、8～12％麦芽糖按等量组成。 

本发明还有一个目的是提供酵母菌Y7的冷冻保护剂，它是由浓度为8～12％脱脂乳、2～7％甘油、0.5～1.5％L-半胱氨酸、8～12％蔗糖、8～12％麦芽糖按等量组成。 

本发明还有一个目的是提供乳酸菌X3的冷冻保护剂，它是由浓度为8～12％脱脂乳、3～7％甘油、0.3～0.8％Vc、1.0～2.0％明胶、8～12％。 

本发明的复合发酵剂生产的酒味酸奶，不但具有独特的醇味，而且由于有益微生物乳酸菌和酵母菌的共同作用，使得产品具有调节肠道菌群、增加消化系统功能、稳定血压、抗菌消炎、促进新陈代谢、抗疲劳、提高免疫力，长期服用对于治疗胃病、胃癌具有很好功效。 

本发明的酒味酸奶的复合发酵剂，不仅可以保证酒味酸奶产品的性能稳定，而且还可以工业化生广泛应用。 

附图说明

图1是X3、Y2、Y7分别在MRS和YEPD培养基中培养时OD₆₀₀值随时间的变化曲线图。

具体实施方式

以下通过发明人给出的具体试验例和制备实施例来进一步说明本发明的有益效果。 

试验例1 

1材料与方法 

1.1材料 

1.1.1菌种 

乳酸菌X3(坚强肠球菌)、酵母菌Y2(克鲁维酵母属)，分离自天然的西藏灵菇，现保存于西北农林科技大学食品科学与工程学院食品生物工程教研室； 

酵母菌Y7(马克斯克鲁维酵母)，购买于中国发酵研究院菌种保藏研究所； 

乳酸菌Lb(保加利亚乳杆菌)、St(嗜热链球菌)，购买于杨凌妙味酸奶菌种室。 

1.1.2脱脂乳 

将由西北农林科技大学畜牧养殖厂采购的鲜牛乳在4000r/min条件下离心10min，去除上层脂肪而得。 

1.1.3培养基 

MRS琼脂培养基、YEPD培养基分别按文献所述方法配制。 

1.1.4主要试剂 

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸氢二钠、蔗糖、麦芽糖、L-半胱氨酸、Vc等均为分析纯；脱脂乳粉为食品级。 

1.1.5仪器设备 

ES-315全自动高压灭菌锅(广州东南科仪有限公司)；SPX-300B生化培养箱(上海跃进医疗器械厂)；HH.CP-T型CO2培养箱(上海福玛实验设备有限公司)；  AIR TECH超净工作台(苏净集团安泰公司制造)；pHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；HWS-380智能恒温恒湿箱(宁波海曙塞福实验仪器厂)；MCFD505型真空冷冻干燥机(美国SIM公司)；AUY220精密万分之一天平(日本SHIMADZU)。 

1.2试验方法 

1.2.1牛乳发酵工艺流程 

脱脂乳→过滤(八层纱布)→95℃杀菌20min(加入7％蔗糖)→冷却至40℃左右→按设定的比例、接种量接种乳酸菌和酵母菌→在设定的温度下保温静置发酵→冷却(4℃，12h)→产品→品质评价。 

1.2.2单一发酵剂的制备 

酒母的制备：取两环斜面菌种接种到5ml灭菌牛乳(105℃下灭菌20min)中，28℃培养至大量气泡产生时(高泡期)，以2％～3％的接种量移入100ml灭菌牛乳中，28℃摇床振荡培养至菌数达到(6～7)×10⁷个/ml，作为酒母使用。 

乳酸菌发酵剂的制备：取3环乳酸菌穿刺保藏菌种接种于装有5ml灭菌牛乳试管中，在37℃培养活化至凝乳，再以1％～2％接种量接入100ml灭菌牛乳中，于37℃培养至牛乳凝固时即为乳酸菌发酵剂。 

发酵成熟的发酵剂，用平板计数法测定其活菌数，后置4℃下保存、备用。 

1.2.3菌种配比的优化组合 

参考有关开菲尔粒的研究结果，选定因素水平，按照L9(3⁴)正交表设计实验，各因素水平见表1所示。操作时，将前述制备的酒母和乳酸菌发酵剂按表1中所设水平进行混合和接种后，在设定的温度下发酵至凝乳，发酵结束后，对产品进行酸度、酒精度、凝乳时间测定及感官品质评定。 

表1  复合发酵剂制备因素水平表 

其中，酵母菌Y2:Y7＝1:1，乳酸菌X3:Lb:St＝1:1:1。 

1.2.4试验指标测定方法 

(1)发酵凝乳时间的测定：一般以肉眼观察乳变粘稠，呈凝胶状态，即已达到发酵终点。记录培养至乳凝固的时间。 

(2)酸度：NaOH滴定法。 

(3)乙醇含量的测定：蒸馏-比重法。 

(4)活菌数的测定：分别吸取培养好的不同酵母菌种的发酵液1mL，用生理盐水依次稀释至适宜浓度，每个稀释度取0.1mL分别涂布于YEPD培养基上，用平板计数法测定活菌数。 

(5)感官评定 

按国家标准GB16321-1996，对牛奶酒的感官品质进行评定。 

1.2.5真空冷冻干燥技术制备活菌粉 

Lb、St为商业菌粉，本文只针对菌种X3、Y2和Y7进行冻干保护剂的研究。 

1.2.5.1工艺流程 

纯种发酵液→离心→菌体沉淀物→加冷冻保护剂→预冻→冷冻干燥→冻干制剂。 

a.各菌种生长曲线的测定 

不同生长时期的菌体对冷冻干燥的抵抗能力有所不同，对数生长期末期、  稳定期前期的细胞在冻干后的存活率高于对数生长期初期和衰亡期的细胞^[10]，所以在冻干之前，测定菌种的生长曲线是必要的，这样有助于确定适宜的菌种收获期。 

方法：分别将各乳酸菌和酵母菌以3％的接种量接种到MRS、YEPD培养基中，每3h取样，测定其OD₆₀₀值的变化。 

b.接种扩培，离心收集菌体 

各菌种在相应的培养基中活化培养，收集对数期后期菌体，4000r/min离心20min，用生理盐水洗涤两次，备用。 

c.菌悬液的制备 

乳酸菌和酵母菌选择不同的单一保护剂，分别配制成相应浓度(见表3和表4)，灭菌(Vc、L-半胱氨酸过滤除菌，其余物质105℃，灭菌20min)，在收集的菌泥中加入上述各种单一保护剂(菌泥:保护剂＝1:3)，注入冻干管中，同时测定冻干前活菌数。 

d.真空冷冻干燥 

将装有菌悬液的冻干管置于—80℃超低温冰箱预冻3h，放真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，-54℃，5mtorr下冷冻24h，测定冻干后活菌数。 

不同类型的保护剂对菌体的保护机理不同，有研究证明，复合保护剂效果要比单一保护剂好，故本试验首先筛选出保护效果较优的单一保护剂，再加以复合，最终确定出较佳保护剂配方。 

根据各菌种存活率挑选出相应较优保护剂，进行复合(各保护剂比例均为1:1)，重复上述步骤，将各菌种分别制成活性干菌粉，保藏在4℃冰箱，备用。 

1.2.5.2试验指标的测定

a.OD₆₀₀值：用721型分光光度计测定。 

b.活菌数测定：平板计数法。 

对冷冻干燥后的菌粉，用相应的保护剂复水20min，然后再进行活菌数测定。 

c.存活率计算： 

细胞存活率＝(冻干后1g样品中测得的活菌数×粉剂质量)/(冻干前1mL样品中测得的活菌数×混悬液体积)×100％ 

d.冻干菌粉发酵性能测定 

按照1.2.2确定的各发酵剂的活菌数以及1.2.3正交试验中确定的接种量，根据冻干后各菌粉的单位含菌量，分别称取相应量的干菌粉，加入到5mL灭菌脱脂乳中，复水活化20min，依据1.2.3确定的最佳发酵条件进行发酵，成品进行酸度、酒精度、凝乳时间测定以及感官评价。 

2结果与分析 

2.1最佳发酵条件的确定 

由表2可知：各因素对酸度的影响次序为B>C>A，即接种量>发酵温度>菌种比例，优组合为A3B2C3；各因素对酒精度的影响次序为C>B>A，即发酵温度>接种量>菌种比例，优组合为A3B2C2；各因素对凝乳时间的影响次序为C>B>A，即发酵温度>接种量>菌种比例，优组合为A₃B₃C₃；各因素对成品感官品质的影响次序为C>A>B，即发酵温度>菌种比例>接种量，优组合为A₃B₂C₂。因此，各因素的较优水平因评价指标不同而有所差异。综合考虑工艺过程和产品质量，对各因素水平的取舍分析如下： 

(1)酵母菌与乳酸菌比例(A)的影响 

由表2可知，酵母菌与乳酸菌的比例直接影响发酵剂中的菌相平衡，从而影响菌种间的共生关系及产品中的产物种类及其含量。从试验结果来看，对各  指标而言，A₃均为最佳水平，即确定西藏灵菇牛奶酒的最佳接种比例为1:2。 

(2)接种量(B)的影响 

表2 复合发酵剂正交试验结果 

注：其中酵母菌Y2:Y7＝1:1，乳酸菌X3:Lb:St＝1:1:1 

接种量对类西藏灵菇牛奶酒品质有较大影响。接种量过少，菌体增长缓慢，发酵时间延长，产品中的乙醇含量和酸度降低；接种量过大，发酵前期酸度上升过快，乳清析出较多，产品的组织状差。此外，接种量过大时，酵母菌增长量大，但乙醇含量较低；同时，由于酵母菌的早衰和菌体自溶，使产品带有苦味和酵母臭味。由表2可知，较优水平为B₂和B₃。考虑到产品感官质量的重要性，选取B₂为较优水平(5％)。 

(3)发酵温度(C)的影响 

发酵温度影响菌种的生长速度、代谢活力和代谢途经，从而影响最终产物的生成和产品的风味及品质。发酵温度较高时，产酸过快，从而容易导致乳清析出；同时，高温发酵容易出现酵母菌衰老及菌体自溶现象，从而导致产品苦味增加。较低的发酵温度虽然有利于酵母菌所产乙醇的保存，但乳酸菌生长缓慢，产酸能力较低。表2显示，较优水平为C₂和C₃，考虑到发酵温度对产品的酒精度和感官品质影响较为显著，故确定C₂(37℃)为其较优水平。 

综上所述，复合发酵剂发酵条件的最佳组合为A₃B₂C₂，即酵母菌(Y2:Y7＝1:1)：乳酸菌(X3:Lb:St＝1:1:1)为1:2，接种量5％，发酵温度37℃。 

采用上述最优组合进行发酵试验，所得产品凝乳时间为4.5h，酸度为105°T，酒精度为0.76％，产品的色泽呈均匀一致的乳白色，口感细腻杀口，甜度适中，酸而不涩，酯香浓郁，酒体醇厚，风味柔和。 

2.2真空冷冻干燥技术制备活菌粉 

2.2.1菌种生长曲线的测定 

由图1(图1是X3、Y2、Y7分别在MRS和YEPD培养基中培养时OD₆₀₀值随时间的变化)可知，菌种X3、Y2的对数生长期后期为6h，菌种Y7为3h。  据此，分别选择对数生长期末期的菌种进行冷冻干燥，制备纯种发酵剂。 

2.2.2优良保护剂的确定 

(1)乳酸菌保护剂的筛选 

由表3可以看出，各保护剂对乳酸菌X3均有不同程度的保护作用，结果都比空白组要好，其中，10％脱脂乳、5％甘油、0.5％Vc、1.5％明胶、10％蔗糖对乳酸菌X3的保护效果较为显著，故以其按比例配制成相应的复合保护剂对乳酸菌X3进行冷冻干燥。 

(2)酵母菌保护剂的筛选 

由表4可以看出，各保护剂对两种酵母菌Y2、Y7均有不同程度的保护作用，结果都比空白组要好，其中，10％脱脂乳、5％甘油、1％L-半胱氨酸、10％蔗糖、10％麦芽糖对酵母菌Y2、Y7的保护效果较为显著，故以其按比例配制成相应复合保护剂对酵母菌Y2、Y7进行冷冻干燥。 

表3 保护剂对乳酸菌X3冷冻干燥存活率的影响 

表4 保护剂对两种酵母菌冷冻干燥存活率的影响 

2.2.3各复合保护剂的保护效果 

利用上述确定出的复合保护剂对各菌种进行冷冻干燥，以确定复合保护剂的保护效果，结果见表5。 

由表5可知，各菌种复合保护剂保护效果均高于单一保护剂，说明所选复合保护剂是适宜的。 

表5 复合保护剂对各菌种的保护效果 

2.2.4冻干菌粉的发酵性能 

1.2.2试验中测定各发酵剂活菌数分别为X3为2～4×10⁹CFU/mL，Y2为6～7×10⁷CFU/mL，Y7为3～5×10⁸CFU/mL，Lb为2～4×10⁹CFU/mL，St为2～4×10⁹CFU/mL；按照各发酵剂的活菌数以及接种量，根据冻干后各菌粉的单位含菌量，分别计算所需干菌粉，结果如下。 

称取0.0015g酵母菌Y2、0.0029g酵母菌Y7、0.0126g乳酸菌X3的干菌粉以及0.008gLb和St混合菌粉，加入到5mL灭菌脱脂乳中，复水20min，倒入95mL灭菌脱脂乳中，37℃下发酵至凝乳，测定产品的凝乳时间为5h，酸度98°T，酒精度为0.60％，感官评价43分。 

对比2.1验证试验结果可知，冻干菌粉发酵制品与鲜菌种接种发酵制品品质相近，但接种量却小100倍以上，可以达到直投式发酵剂发酵酸奶接种量的要求。 

3结论 

(1)以西藏灵菇分离菌种乳酸菌X3和酵母菌Y2及工业菌种酵母菌Y7及乳酸菌Lb和St为基础菌种，进行组合发酵，确定出以上菌种发酵牛奶酒的最佳参数组合为酵母菌(Y2:Y7＝1:1)：乳酸菌(X3:Lb:St＝1:1:1)为1:2，接种量5％，发酵温度37℃。 

(2)乳酸菌X3的较佳冻干保护剂配方为10％脱脂乳、5％甘油、0.5％Vc、1.5％明胶、10％蔗糖；酵母菌Y2、Y7的较佳保护剂配方为10％脱脂乳、5％甘油、1％L-半胱氨酸、10％蔗糖、10％麦芽糖；乳酸菌和酵母菌的冻干菌粉发酵性能与冻干前相比变化不明显，接种量比鲜菌种小100倍以上，可以达到直投式发酵剂发酵酸奶接种量的要求。

实施例1 复合发酵剂 

由酵母菌和乳酸菌按菌体数量比为1～2:1～4组成，所述的酵母菌是由酵母菌Y2和酵母菌Y7菌体数量比为1:1组成；所述的乳酸菌是由乳酸菌X3、乳酸菌Lb、乳酸菌St三者按菌体数量比为1:1:1组成。 

实施例2 复合发酵剂 

由酵母菌和乳酸菌按菌体数量比为1:2组成，所述的酵母菌是由酵母菌Y2和酵母菌Y7菌体数量比为1:1组成；所述的乳酸菌是由乳酸菌X3、乳酸菌Lb、乳酸菌St三者按菌体数量比为1:1:1组成。 

实施例3 复合发酵剂 

由酵母菌和乳酸菌按菌体数量比为2:4组成，所述的酵母菌是由酵母菌Y2和酵母菌Y7菌体数量比为1:1组成；所述的乳酸菌是由乳酸菌X3、乳酸菌Lb、乳酸菌St三者按菌体数量比为1:1:1组成。 

实施例4 复合发酵剂 

由酵母菌和乳酸菌按菌体数量比为1:3组成，所述的酵母菌是由酵母菌Y2和酵母菌Y7菌体数量比为1:1组成；所述的乳酸菌是由乳酸菌X3、乳酸菌Lb、乳酸菌St三者按菌体数量比为1:1:1组成。 

实施例5 复合发酵剂 

由酵母菌和乳酸菌按菌体数量比为2:3组成，所述的酵母菌是由酵母菌Y2和酵母菌Y7菌体数量比为1:1组成；所述的乳酸菌是由乳酸菌X3、乳酸菌Lb、乳酸菌St三者按菌体数量比为1:1:1组成。 

实施例6 复合发酵剂 

由酵母菌Y2干粉、酵母菌Y7干粉、乳酸菌X3干粉、乳酸菌Lb干粉、乳酸  菌St干粉依次按其干粉中含有的菌体数量比为1：1：1：1：1组成。 

实施例7 复合发酵剂 

由酵母菌Y2干粉、酵母菌Y7干粉、乳酸菌X3干粉、乳酸菌Lb干粉、乳酸菌St干粉依次按其干粉中含有的菌体数量比为2：2：4：4：4组成。 

实施例8 复合发酵剂 

由酵母菌Y2干粉、酵母菌Y7干粉、乳酸菌X3干粉、乳酸菌Lb干粉、乳酸菌St干粉依次按其干粉中含有的菌体数量比为2：2：1：1：1组成。 

实施例8 复合发酵剂 

由酵母菌Y2干粉、酵母菌Y7干粉、乳酸菌X3干粉、乳酸菌Lb干粉、乳酸菌St干粉依次按其干粉中含有的菌体数量比为2：2：3：3：3组成。 

实施例9 复合发酵剂 

由酵母菌Y2干粉、酵母菌Y7干粉、乳酸菌X3干粉、乳酸菌Lb干粉、乳酸菌St干粉依次按其干粉中含有的菌体数量比为2：2：2：2：2组成。 

实施例10 复合发酵剂 

由酵母菌Y2干粉、酵母菌Y7干粉、乳酸菌X3干粉、乳酸菌Lb干粉、乳酸菌St干粉依次按其干粉中含有的菌体数量比为2：2：4:4：4组成。 

实施例11酵母菌Y2的冷冻干燥保护剂 

由浓度为8％脱脂乳、2％甘油、1.5％L-半胱氨酸、12％蔗糖、8％麦芽糖按等量组成。 

实施例12酵母菌Y2的冷冻干燥保护剂 

由浓度为10％脱脂乳、5％甘油、10％蔗糖、1％L-半胱氨酸、10％麦芽糖组成。 

实施例13酵母菌Y2的冷冻干燥保护剂

由浓度为12％脱脂乳、7％甘油、1.5％L-半胱氨酸、12％蔗糖、12％麦芽糖按等量组成。 

实施例14酵母菌Y7的冷冻干燥保护剂 

由浓度为8％脱脂乳、3％甘油、0.8％Vc、1.5％明胶、12％蔗糖按等量组成。 

实施例15乳酸菌X3的冷冻干燥保护剂 

由浓度为10％脱脂乳、5％甘油、5％VcO.、1.5％明胶、10％蔗糖按等量组成。

Claims (1)

1.一种对酵母菌Y7进行冷冻干燥的保护剂，其特征在于，它是由浓度为8％脱脂乳、3％甘油、0.8％Vc、1.5％明胶、12％蔗糖按等量组成。

Images