CN110452968A - 一种基于定量dna技术检测食品中维生素b12的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法；该方法通过制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液、微生物对食品中维生素B12的增值转换、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定、总DNA的提取与鉴定、DNA定量检测和计算检测结果六个步骤，实现维生素B12的含量检测，该方法可操作性强，反映的是基质中总的维生素B12含量，优于只能针对某种特定结构维生素B12的仪器分析方法。

Description

一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法
技术领域
本发明涉及食品及乳品中维生素B12测定技术领域，具体涉及一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法。
背景技术
维生素B12是迄今为止人类发现最晚的一种B族维生素，对它的研究任然不够充分。维生素B12是一类化合物的统称，具有多种存在形式，如氰钴胺素（cyanocobalamin）、羟钴胺素（hydroxocobalamine）、甲钴胺素（mecobalamine）和5′-脱氧腺苷钴胺素（5′-deoxyadenosy lcobalamin）等，由于维生素B12自身具有多种分子构造和差异化的生物效价，使得食品中维生素B12的检测成为技术上的难点，尤其在微量存在水平的食品中，使用人工合成或天然维生素B12均存在巨大的检测误差，严重影响了行业的发展与技术进步。国内外现有的测定方法都存在明显的技术局限,如文献报道的分光光度法、高效液相色谱/质谱法、电泳法、离子交换法和等离子发射光谱法等化学分析法，以有限的各别结构含量代表维生素B12总量，缺乏令人信服的理论支持；微生物检测法理论相对完整，但最终测量的是微生物代谢物产生的溶液混浊度，属于典型的模拟信号，导致即便微弱的色差或杂质就能干扰结果，可操作性极差。因此，维生素B12至今缺少实用完善的测定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，旨在解决现有维生素B12检测方法可操作性低、重复性差的缺点的问题。
为实现上述目的本发明采用的技术方案是：
一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，包括如下步骤：
（1）、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液；采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌，37 ℃厌氧培养，取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液；
（2）、微生物对食品中维生素B12的增值转换：将食品中维生素B12转化为特定营养因子添加于测定用培养基 ，取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液添加于灭菌后的试样溶液试管中，然后放入恒温培养箱内进行定时增值；
（3）、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定：对培养后的试样溶液进行灭活操作；
（4）、总DNA的提取与鉴定：取1ml试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000 r/min离心1 min，弃上清，采用细菌DNA提取试剂提取待测液的总DNA，并经超微量分光光度计检测浓度和纯度；
（5）、DNA定量检测：采用微滴式数字PCR进行结果分析，获得DNA拷贝数（y）；
（6）、计算检测结果；样品维生素B12含量（x）与DNA拷贝数（y）成线性关系，根据标准量维生素B12和对应DNA拷贝数获得的回归方程及线性相关系数计算出维生素B12含量。
进一步，所述步骤（2）中 ，莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液取25 μL 添加于121 ℃灭菌5min的试样溶液试管中，将试管放入恒温培养箱内，36 ℃ ± 1 ℃培养20 h。
进一步，所述步骤（3）中 ，灭活操作是将培养完毕的试样溶液试管迅速置于68℃± 1 ℃环境中，保温30min以后急速冷却到4℃± 1 ℃。
进一步，所述步骤（5）中，采用微滴式数字PCR进行结果分析按如下步骤完成：
1）、配置反应体系：10 μL ddPCR Master Mix（2X），上下游引物各1.0 μL，2.5 μL 探针，4.5μL dd H2O，1μL cDNA 模板，反应总体积为20 μL。并用去离子水代替模板作为阴性对照；
2）、生成微滴：将20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge微滴反应卡中，加入70ul微滴生成油（DG Oil），时长2分钟后生成微滴；
3）、微滴封膜密封：转移微滴进入96孔板内，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜密封，以防止油挥发，运行程序为：180℃，5s ；
4）、PCR反应 ：程序：37 ℃保温10 min，95 ℃预变性10 min，然后94 ℃变性30 s，55℃退火30 s，98 ℃延伸15 s，40个循环，最后98 ℃延伸5 min，降至室温；
5）、获取DNA拷贝数：将完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好并放入微滴读取仪中，打开QuantaSoft软件，对96孔板中样品信息进行Setup，进行QX200实验，得到DNA拷贝数（y）。
本发明的有益效果是：
本发明在微生物方法基础上引入定量DNA技术，最大程度延伸了微生物方法对具有生物活性的维生素B12高度灵敏的优势，同时规避了微生物法可操作性低、重复性差的缺点，本发明可操作性强，反映的是基质中总的维生素B12含量，优于只能针对某种特定结构维生素B12的仪器分析方法。
附图说明
图1为本发明中由维生素B12和对应工作菌株DNA含量构成的散点图。
具体实施方式
以下结合优选实施方式对本发明作进一步说明：
一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，包括如下步骤：
（1）、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液；采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌，37 ℃厌氧培养 ，取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液；相较于常规微生物检测维生素B12，由于无需采用现有微生物方法中的透光率检测原理，因此无需进行肉汤培养二次增值，可简化操作工艺。
（2）、微生物对食品中维生素B12的增值转换：将食品通过高温水解、沉淀和过滤等方法除去蛋白、脂肪和淀粉等干扰物质，保留的维生素B12作为特定营养因子用于莱士曼氏乳酸杆菌特异性增值培养，食品中维生素B12转化为特定营养因子后添加于测定用培养基；取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液25 μL 添加于121 ℃灭菌5 min的试样溶液试管中，将试管放入恒温培养箱内进行增值，恒温培养控制36 ℃ ± 1 ℃培养20 h；该菌的增值量与食品中维生素B12成对应关系。
（3）、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定：对培养后的试样溶液试管进行灭活操作；具体的灭活操作是将培养完毕的试样溶液试管迅速置于68℃环境中，保温30min以后急速冷却到4℃，或68℃± 1 ℃环境中保温30min以后急速冷却到4℃± 1 ℃；这样可使细菌停止生理活性避免后期数量波动，同时保持细胞线粒体中16S rDNA结构完整。
（4）、总DNA的提取与鉴定：取1ml试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000 r/min 离心1 min，弃上清，采用细菌DNA提取试剂提取待测液的总DNA，并经超微量分光光度计检测浓度和纯度；通过浓度和纯度可判定总DNA的提取是否成功。
（5）、DNA定量检测：采用微滴式数字PCR进行结果分析，获取DNA拷贝数（y）；具体实现步骤是：
1）、配置反应体系：10 μL ddPCR Master Mix（2X），上下游引物各1.0 μL，2.5 μL 探针，4.5μL dd H2O，1μL cDNA 模板，反应总体积为20 μL。并用去离子水代替模板作为阴性对照；其中leichmannii F：GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA，leichmannii R：ACTTAACCCAACATCTCACGACAC，leichmannii-probe：FAM-CTACGCATTCCACCGCTACACA-MGB；
2）、生成微滴：将20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge微滴反应卡中，加入70ul微滴生成油（DG Oil），时长2分钟后生成微滴；
3）、微滴封膜密封：转移微滴进入96孔板内，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜密封，以防止油挥发，运行程序为：180℃，5s；
4）、PCR反应：程序：37 ℃保温10 min，95 ℃预变性10 min，然后94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，98 ℃延伸15 s，40个循环，最后98 ℃延伸5 min，降至室温；
5）、获取DNA拷贝数：将完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好并放入微滴读取仪中，打开QuantaSoft软件，对96孔板中样品信息进行Setup，进行QX200实验，得到DNA拷贝数（y）。
（5）、计算检测结果；样品维生素B12含量（x）与DNA拷贝数（y）成线性关系，根据标准量维生素B12和对应DNA拷贝数获得的回归方程及线性相关系数计算出维生素B12含量。
其中，标准液获取的维生素B12含量和DNA拷贝数的回归方程可通过如下方式获得：
①、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液；采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌，37 ℃厌氧培养 ，取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液；
②、精密配制维生素B12标准品工作液, 加水稀释至含维生素B12质量浓度分别为0,0.0005, 0.001, 0.002, 0.004, 0.008, 0.016, 0.032, 0.064, 0.128 ng/m L的系列标准品溶液，取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液25 μL 添加于121 ℃灭菌5 min的上述标准品溶液的试管中，然后将试管放入恒温培养箱内进行增值，恒温培养控制36 ℃ ± 1 ℃培养20h；
③、吸取1ml标准品工作菌液于灭菌离心管中12000 r/min 离心1 min，弃上清，采用细菌DNA提取试剂提取溶液的总DNA，并经超微量分光光度计检测浓度和纯度；
④、按照上述步骤5）的操作方法进行DNA定量检测，并获取DNA拷贝数（含量）；维生素B12不同质量浓度下对应检测出的DNA拷贝数见下表；
VB12含量（x）ng/mL 0 0.001 0.002 0.004 0.008 0.016 0.032 0.064 0.128
DNA含量（y）copies/mL 86 170 298 674 1296 2660 5360 11360 23720
⑤、根据步骤④中表格实测数据，由Excel生成图谱及线性公式和对应R2；主要利用Excel生成x y（散点图），可获得回归方程为：y=184575x -160，线性相关系数R2 =0.999；具体详见说明书附图1。
本发明利用莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）对维生素B12的特异性和灵敏性，在测定用培养基中供给除维生素B12 以外的所有营养成分，这样微生物生长就会同待测食品中维生素B12 的含量相对应，通过PCR方法定量检测微生物含量，可计算出原食品中维生素B12 的含量。本发明采用DNA检测技术并利用标准量的维生素B12获取对用的DNA含量，进而获得回归方程及线性相关系数，其中线性相关系数R2可达到0.999，由此可见本发明方法具有更好的方法稳定性和准确性。

Claims (5)

1.一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）、制备莱士曼氏乳酸杆菌标准菌悬液；采用乳酸杆菌琼脂培养基一次性转种活化莱士曼氏乳酸杆菌，37 ℃厌氧培养，取24小时菌龄的多个单一菌落,直接制备0.50麦氏单位浊度的莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液；
（2）、微生物对食品中维生素B12的增值转换：将食品中维生素B12转化为特定营养因子添加于测定用培养基 ，取莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液添加于灭菌后的试样溶液试管中，然后放入恒温培养箱内进行定时增值；
（3）、莱士曼氏乳酸杆菌灭活固定：对培养后的试样溶液进行灭活操作；
（4）、总DNA的提取与鉴定：将试样溶液试管中的菌液于灭菌离心管中12000 r/min 离心1 min，弃上清，采用细菌DNA提取试剂提取待测液的总DNA，并经超微量分光光度计检测浓度和纯度；
（5）、DNA定量检测：采用微滴式数字PCR进行结果分析，获得DNA拷贝数（y）；
（6）、计算检测结果；样品维生素B12含量（x）与DNA拷贝数（y）成线性关系，根据标准量维生素B12和对应DNA拷贝数获得的回归方程及线性相关系数计算出维生素B12含量。
2.如权利要求1所述的一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，其特征在于，所述步骤（2）中 ，莱士曼氏乳酸杆菌菌悬液取25 μL 添加于121 ℃灭菌5 min的试样溶液试管中，将试管放入恒温培养箱内，36 ℃ ± 1 ℃培养20 h。
3.如权利要求1所述的一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，其特征在于，所述步骤（3）中 ，灭活操作是将培养完毕的试样溶液试管迅速置于68℃± 1 ℃环境中，保温30min以后急速冷却到4℃± 1 ℃。
4.如权利要求1所述的一种基于定量DNA技术检测食品中维生素B12的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，采用微滴式数字PCR进行结果分析按如下步骤完成：
1）、配置反应体系：10 μL ddPCR Master Mix（2X），上下游引物各1.0 μL，2.5 μL 探针，4.5μL dd H2O，1μL cDNA 模板，反应总体积为20 μL。
5.并用去离子水代替模板作为阴性对照；
2）、生成微滴：将20ul样品反应体系加入到DG8 cartridge微滴反应卡中，加入70ul微滴生成油（DG Oil），时长2分钟后生成微滴；
3）、微滴封膜密封：转移微滴进入96孔板内，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜密封，以防止油挥发，运行程序为：180℃，5s ；
4）、PCR反应 ：程序：37 ℃保温10 min，95 ℃预变性10 min，然后94 ℃变性30 s，55℃退火30 s，98 ℃延伸15 s，40个循环，最后98 ℃延伸5 min，降至室温；
5）、获取DNA拷贝数：将完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好并放入微滴读取仪中，打开QuantaSoft软件，对96孔板中样品信息进行Setup，进行QX200实验，得到DNA拷贝数（y）。
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