CN102094068B - 一种蛋氨酸亚砜还原酶活性的检测方法及药物筛选试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋氨酸亚砜还原酶活性的检测方法及按照该方法研制的药物筛选试剂盒，通过测定反应体系的OD值，快速检测各种药物处理后细胞及组织中蛋氨酸亚砜还原酶活性。可用于蛋氨酸亚砜还原酶活性的批量检测和蛋氨酸亚砜还原酶活性调节剂的筛选，在酶工程、生物医药和药物开发领域有着较高的实际意义。样本用量极低，步骤简单，对环境友好，且无需复杂设备和特殊试剂，成本很低，在实验室和生物医药工业中具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药研究领域。具体包括：一种蛋氨酸亚砜还原酶活性的快速检测方法及药物筛选试剂盒，通过测定反应体系的OD值，快速检测各种药物处理后细胞及组织中蛋氨酸亚砜还原酶活性。
背景技术
蛋氨酸亚砜还原酶(methionine sulfoxide reductase，Msr)是目前发现的唯一可在生物体内还原逆转蛋白质蛋氨酸残基氧化结构变化和功能损伤的抗氧化酶系统。蛋氨酸亚砜还原酶包括蛋氨酸亚砜还原酶A和蛋氨酸亚砜还原酶B，其存在于很多生物体中，从进化上非常古老的古细菌大肠杆菌到植物和哺乳动物中均有发现，其抗氧化作用对于生物体的生存具有特别重要的意义。国外一系列研究表明，在低等生物如大肠杆菌中发现蛋氨酸亚砜还原酶基因的突变体对氧化损伤的敏感性要高于正常亲本菌株，而在酵母中转入酵母蛋氨酸亚砜还原酶基因并高效表达和在人T细胞株转入牛的蛋氨酸亚砜还原酶基因并高效表达，均可提高宿主细胞对氧化物的抗性，从而提示蛋氨酸亚砜还原酶是一种存在于生物体中的抗氧化修复因子。过表达蛋氨酸亚砜还原酶基因可以显著减轻氧化应激引起的人T细胞、人Lens细胞、PC12细胞和WI-38 SV40等细胞的损伤和凋亡。有研究认为，蛋氨酸亚砜还原酶与衰老及哺乳动物寿命密切相关。因此，调节蛋氨酸亚砜还原酶的基因表达，为治疗多种氧化相关的病理疾病提供了全新的视角和技术手段。
申请者所在实验室经过多年研究，发现蛋氨酸亚砜还原酶的还原功能可能和多种年龄相关的神经系统疾病密切相关。并首次利用Western Blotting技术，发现一些中草药成分可以上调组织细胞中蛋氨酸亚砜还原酶的表达和功能。这表明从中草药中筛选蛋氨酸亚砜还原酶调节剂是一种非常可行的寻找治疗衰老相关疾病药物的新思路。
目前国际上研究蛋氨酸亚砜还原酶活性的方法主要是两种：一是以放射性标记的蛋氨酸亚砜作为底物，通过使用液闪计数仪计算一定时间放射性蛋氨酸的生成量来计算酶活性；二是利用氨基酸衍生化和荧光高效液相相结合，通过衍生化反应，使体系中蛋氨酸亚砜和蛋氨酸均带上发光基团，再利用荧光高效液相检测这两种物质的含量，并计算单位时间蛋氨酸的生成量。方法一准确，样本处理简单，但是需要特殊的放射性试剂(很难获取)和特殊的实验条件(放射性检测)。方法二的实验仪器相对简单，但衍生化重复性差，生物样本处理复杂，操作复杂，尤其不适合筛选多个药物对于组织细胞中蛋氨酸亚砜还原酶活性的影响。本发明的目的是获取一种快速的检测蛋氨酸亚砜还原酶活性的方法和药物筛选技术。
发明内容
本发明的任务是提供一种蛋氨酸亚砜还原酶活性检测方法，使其具有快速简便、可用于大量样本检测的特点。
同时本发明还提供一种蛋氨酸亚砜还原酶调节剂的筛选试剂盒，并提供应用该试剂盒筛选蛋氨酸亚砜还原酶调节剂的方法。
实现本发明任务的技术方案是：
本发明提供的这种蛋氨酸亚砜还原酶活性的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：配制含反应试剂MgCl2、KCl、Tris.HCl和二硫苏糖醇的反应液，其终浓度分别为：MgCl2 10mM，KCl 30mM，Tris.HCl 25mM，二硫苏糖醇1-5mM，用盐酸调节PH到7.4，分别加入到96孔板的空白孔和反应孔；
步骤二：向反应孔加入蛋氨酸亚砜，至终浓度达到10-50mM，向空白孔和反应孔分别加入待测样本至反应液中，待测样本的体积不能超过总反应液的十分之一，于37℃反应60分钟后，加入显色液Ellman试剂(5，5’-二硫代-双-2-硝基苯甲酸)0.01M和NaOH 0.1M，使反应液PH到8.0-8.5，37℃反应5-10分钟，用酶标仪检测412nm处OD值，将不加反应物的背景液OD值和反应结束后的OD值，带入下述公式(Ⅰ)，计算得到酶活性：
公式(Ⅰ)：
酶活(U/ml)＝(OD酶背景-OD酶反应)*V体系*样品稀释倍数/反应时间*l*εTNB*V样品
式中：
OD酶反应为反应结束后反应孔的OD值，；
OD酶背景为反应结束后背景孔的OD值；
V体系为反应总体积；
V样品为样品总体积；
l为光程厚度(仪器常数)；
εTNB：为硫代-2-硝基苯甲酸的消光系数。
*为乘法运算符号。
l和εTNB的数值可以分别通过查找仪器说明书和查找化学手册方法得到。l和εTNB的乘积值也可通过标准曲线计算得到。标准曲线的制作方法：用缓冲液(MgCl2 10mM，KCl 30mM，Tris.HCl 25mM，PH＝7.4)配置不同浓度二硫苏糖醇(100μM-2000μM)，和DTNB甲醇溶液(0.01M)等体积在37℃反应10分钟，加入NaOH溶液(0.1M)调节PH到8.0-8.5，在412nm处读取OD值，将OD值和二硫苏糖醇浓度进行线性回归分析，可以算出l和εTNB的乘积值。
在上述本发明提供的蛋氨酸亚砜还原酶活性的检测方法中，反应液中二硫苏糖醇和蛋氨酸亚砜的终浓度浓度比为1∶10，并需要将反应液在37℃预热10min。显色液为甲醇配制的Ellman试剂(5，5’-二硫代-双-2-硝基苯甲酸，0.01M)。显色剂加入反应液，必须同时加入相当于反应液10％体积的0.1M的NaOH溶液，使反应液PH达到8.0-8.5。
本发明提供的蛋氨酸亚砜还原酶调节剂的筛选试剂盒，包括以下试剂：
试剂A 二硫苏糖醇(1-5mM，用试剂C配制)；
试剂B 蛋氨酸亚砜(10-50mM，用试剂C配制)；
试剂C 缓冲液(MgCl2 10mM，KCl 30mM，Tris.HCl 25mM，PH＝7.4)；
试剂D 显色液Ellman试剂(0.01M)；和
试剂E 显色液NaOH溶液(0.1M)。
该试剂盒还可以包括96孔板。
应用本发明蛋氨酸亚砜还原酶调节剂的筛选试剂盒筛选蛋氨酸亚砜还原酶调节剂的方法如下：
(1)使用不含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液或者超声破碎仪从细胞或组织中提取总蛋白样本，按考马斯亮蓝法测定蛋白浓度；
(2)向96孔板加入试剂A和试剂B各50μl作为反应孔；试剂A和试剂C各50μl作为背景孔，37℃预热10分钟；
(3)向反应孔及对应的背景孔分别加入等蛋白量(30-60μg)的蛋白提取液，37℃振摇反应60分钟；
(4)向反应孔及对应的背景孔分别加入20μl试剂E，37℃振摇5分钟；
(5)向反应孔及对应的背景孔分别加入100μl试剂D，37℃振摇5分钟；
(6)用酶标仪在412nm处读取数值，按前述公式(Ⅰ)计算酶活性：
酶活(U/ml)＝(OD酶背景-OD酶反应)*V体系*样品稀释倍数/反应时间*l*εTNB*V样品
式中：
OD酶反应为反应结束后反应孔的OD值，；
OD酶背景为反应结束后背景孔的OD值；
V体系为反应总体积；
V样品为样品总体积；
l为光程厚度(仪器常数)；
εTNB：为硫代-2-硝基苯甲酸的消光系数；
*为乘法运算符号。
l和εTNB的数值可以分别通过查找仪器说明书和查找化学手册方法得到。l和εTNB的乘积值也可通过标准曲线计算得到。标准曲线的制作方法：用缓冲液(MgCl2 10mM，KCl 30mM，Tris.HCl 25mM，PH＝7.4)配置不同浓度二硫苏糖醇(100μM-2000μM)，和DTNB甲醇溶液(0.01M)等体积在37℃反应10分钟，加入NaOH溶液(0.1M)调节PH到8.0-8.5，在412nm处读取OD值，将OD值和二硫苏糖醇浓度进行线性回归分析，可以算出l和εTNB的乘积值。
本发明的检测方法可用于蛋氨酸亚砜还原酶活性的批量检测和蛋氨酸亚砜还原酶活性调节剂的筛选，在酶工程、生物医药和药物开发领域有着较高的实际意义。酶活定义：每分钟由蛋氨酸亚砜还原成1μM蛋氨酸所需的酶量称为1U。
本发明的优点：
1.样本用量极低，步骤简单。
2.与放射性同位素方法相比，对环境友好，且无需复杂设备和特殊试剂。
3.与荧光衍生化-高效液相方法相比，大大节省了时间，降低了工作量。
4.与前两种方法相比，成本很低，在实验室和生物医药工业中具有很高的应用价值。
附图说明
图1为本发明检测方法的基本检测原理。
具体实施方式
以下结合实施例详细解释本发明的实施方式，这些实例不能用来限制本发明的范围。
实施例1 利用本发明的检测方法和试剂盒测定重组大鼠蛋氨酸亚砜还原酶A活性
(1)向96孔板加入试剂A和试剂B各50μl作为反应孔；试剂A和试剂C各50μl作为背景孔，37℃预热10分钟；
(2)向反应孔及对应的背景孔分别加入等蛋白量0.5μg，1μg和2μg的酶液，37℃振摇反应60分钟；
(3)向反应孔及对应的背景孔分别加入20μl试剂E，37℃振摇5分钟；
(4)向反应孔及对应的背景孔分别加入100μl试剂D，37℃振摇5分钟；
(5)用酶标仪在412nm处读取数值，按以下公式计算酶活性：
酶活(U/ml)＝(OD酶背景-OD酶反应)*V体系*样品稀释倍数/反应时间*l*εTNB*V样品
表一 反应体系OD值与酶活性
| 酶量(μg) | OD背景 | OD反应 | 酶活(U/g) |
| 2.5 | 0.707 | 0.54 | 612.89 |
| 4 | 0.556 | 0.3 | 587.2 |
| 8 | 0.936 | 0.463 | 542.4719 |
实施例2 利用本发明的检测方法和试剂盒测定转染大鼠蛋氨酸亚砜还原酶A基因CHO细胞和对照CHO细胞中蛋氨酸亚砜还原酶A活性
(1)分别提取稳定表达蛋氨酸亚砜还原酶A基因CHO细胞和对照CHO细胞的蛋白，超滤离心，加入适量试剂C，定蛋白至2.5μg/μl。
(2)向96孔板加入试剂A和试剂B各50μl作为反应孔；试剂A和试剂C各50μl作为背景孔，37℃预热10分钟；
(3)向反应孔及对应的背景孔分别加入等蛋白量的5μg，10μg和20μg的蛋白提取液，37℃振摇反应60分钟；
(4)向反应孔及对应的背景孔分别加入20μl试剂E，37℃振摇5分钟；
(5)向反应孔及对应的背景孔分别加入100μl试剂D，37℃振摇5分钟；
(6)用酶标仪在412nm处读取数值，按以下公式计算酶活性：
酶活(U/ml)＝(OD酶背景-OD酶反应)*V体系*样品稀释倍数/反应时间*l*εTNB*V样品
表二 反应体系OD值与酶活性
| 蛋白种类 | 蛋白量(μg) | OD背景 | OD反应 | 酶活(U/g) |
| 未转染 | 10 | 1.58 | 1.487 | 85.3275 |
| 未转染 | 40 | 1.698 | 1.456 | 55.50875 |
| 转染 | 20 | 1.823 | 1.498 | 149.0938 |
| 转染 | 40 | 1.663 | 0.876 | 180.5181 |
实施例3 利用本发明的检测方法和试剂盒测定大鼠脑组织中蛋氨酸亚砜还原酶活性
(1)提取大鼠皮层组织中的蛋白，超滤离心，加入适量试剂C，定蛋白至2.5μg/μl。
(2)向96孔板加入试剂A和试剂B各50μl作为反应孔；试剂A和试剂C各50μl作为背景孔，37℃预热10分钟。
(3)向反应孔及对应的背景孔分别加入等蛋白量的10μg，20μg和40μg的蛋白提取液，37℃振摇反应60分钟；
(4)向反应孔及对应的背景孔分别加入20μl试剂E，37℃振摇5分钟；
(5)向反应孔及对应的背景孔分别加入100μl试剂D，37℃振摇5分钟；
(6)用酶标仪在412nm处读取数值，按以下公式计算酶活性：
酶活(U/ml)＝(OD酶背景-OD酶反应)*V体系*样品稀释倍数/反应时间*l*εTNB*V样品
表三 反应体系OD值与酶活性
| 蛋白量(μg) | OD背景 | OD反应 | 酶活(U/g) |
| 20 | 1.475 | 1.076 | 183.0413 |
| 40 | 1.675 | 0.726 | 217.6769 |
Claims (6)
1. 一种蛋氨酸亚砜还原酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：配制含反应试剂MgCl2、KCl、Tris.HCl和二硫苏糖醇的反应液，其终浓度分别为：MgCl2 10mM，KCl 30mM，Tris.HCl 25mM，二硫苏糖醇1-5mM，用盐酸调节PH到7.4，分别加入到96孔板的空白孔和反应孔；
步骤二：向反应孔加入蛋氨酸亚砜，至终浓度达到10-50mM，向空白孔和反应孔分别加入待测样本至反应液中，待测样本的体积不能超过总反应液的十分之一，于37℃反应60分钟后，加入显色液Ellman 试剂5，5’-二硫代-双-2-硝基苯甲酸0.01M和NaOH 0.1M，使反应液PH到8.0-8.5，37℃反应 5-10分钟，用酶标仪检测412nm处OD值，将不加反应物的背景液OD值和反应结束后的OD值，带入以下公式，计算得到酶活性：
酶活U/ml=（OD酶背景-OD酶反应）*V体系*样品稀释倍数/反应时间* l*εTNB*V样品 ，
式中：
OD酶反应为反应结束后反应孔的OD值；
OD酶背景为反应结束后背景孔的OD值；
V体系为反应总体积；
V样品为样品总体积；
l为光程厚度，仪器常数；
εTNB：为硫代-2-硝基苯甲酸的消光系数；
l和εTNB的数值分别通过查找仪器说明书和查找化学手册方法得到，或者通过标准曲线计算得到l和εTNB的乘积值；标准曲线的制作方法：用PH为7.4的由MgCl2 10mM，KCl 30mM，Tris.HCl 25mM组成缓冲液配置浓度范围为100μM-2000μM的不同浓度二硫苏糖醇，和0.01M的 DTNB甲醇溶液等体积在37℃反应10分钟，加入0.1M NaOH溶液调节PH到8.0-8.5，在412nm处读取OD值，将OD值和二硫苏糖醇浓度进行线性回归分析，算出l和εTNB的乘积值。
2.根据权利要求1所述的蛋氨酸亚砜还原酶活性的检测方法，其特征在于，反应体系中二硫苏糖醇和蛋氨酸亚砜的终浓度浓度比为1∶10，并需要将反应液在37℃预热10min。
3.根据权利要求1所述的蛋氨酸亚砜还原酶活性的检测方法，其特征在于，显色液Ellman试剂为甲醇配制的Ellman试剂。
4.根据权利要求1所述的蛋氨酸亚砜还原酶活性的检测方法，其特征在于，显色液Ellman试剂加入反应液，必须同时加入相当于反应液10％体积的0.1M的NaOH溶液，使反应液PH达到8.0-8.5。
5.一种蛋氨酸亚砜还原酶调节剂的筛选试剂盒，包括：
试剂A二硫苏糖醇1-5mM，用试剂C配制；
试剂B蛋氨酸亚砜10-50mM，用试剂C配制；
试剂C缓冲液MgCl2 10mM，KCl 30mM，Tris.HCl 25mM，PH＝7.4；
试剂D显色液Ellman试剂0.01M；和
试剂E显色液NaOH溶液0.1M。
6.根据权利要求5所述的蛋氨酸亚砜还原酶调节剂的筛选试剂盒，其特征在于包括96孔板。
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Citations (1)
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| David L. Ferguson等.A New Method of Measuring Protein-Methionine-S-Oxide Reductase Activity.《Plant Physiol.》.1992,第100卷第529-532页. * |
| 胡培蓉等.人类肤一甲硫氨酸亚飒还原酶的cDNA克隆、组织表达谱特征及染色体定位.《科学通报》.2000,第45卷(第12期),第1289-1296页. * |
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