CN114369557A - 一种纯化学成分合成rv沙门氏菌增菌液体培养基及配制方法 - Google Patents

一种纯化学成分合成rv沙门氏菌增菌液体培养基及配制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种无动植物源性纯化学成分合成的RV沙门氏菌增菌液体培养基及其配制方法。其目的在于用氨基酸、无机盐及生长因子组分替代传统培养基中的植物源性成分大豆胨，研制结构清晰、成分明确、质量可控的纯化学成分合成RV沙门增菌液体培养基。该培养基对沙门菌具有较强的促生长能力，对非目标菌金黄色葡萄球菌、粪肠球菌具有抑制作用，可用于沙门菌的选择性増菌与分离。

Description

一种纯化学成分合成RV沙门氏菌增菌液体培养基及配制方法
技术领域
本发明设计专利公开一种纯化学成分合成的RV沙门菌增菌液体培养基及配制方法，旨在提供一种无动植物源性，成分明确、质量可控，可用于药品、食品、临床等不同领域的沙门菌选择性増菌培养基。
背景技术
传统培养基中常包含一些动物源性、植物源成分如大豆胨、牛肉膏等，这些物质为微生物生长提供必要的营养成分，但由于其来源的不同、组成的差异和工艺的复杂性，导致不同厂家生产的培养基品质参差不齐、质量不稳定，甚至还存在引入外源性污染的安全隐患。一直以来，我国药品检验用参比培养基中亦包含上述天然性成分，因其成分复杂、原料来源多样、追溯困难，不利于参比培养基的质量保持稳定。纯化学合成培养基使用化学成分替代组成复杂的生物性成分，成分明确，配方清晰，质量可控，对于构建客观、准确的培养基评价体系意义重大。
RV沙门菌增菌液体培养基(Rappaport-Vassiliadis Salmonella EnrichmentBroth，RVSEB)用于沙门菌的增菌培养和选择性分离，中国、美国、欧洲等药典中均采用了该培养基用于沙门菌的选择性增菌。RV沙门菌增菌液体培养基对沙门菌属具有较强的选择性，传统配方中大豆胨提供氮源和维生素，可促进沙门菌的生长，孔雀石绿及培养基高渗、低pH的特性可以抑制其他细菌的生长。目前，市售RV沙门菌增菌液体培养基中均含有植物源性成分大豆胨，其组成复杂，质量不易保证。采用纯化学试剂替代RV沙门菌增菌液体培养基中的大豆胨，研制纯化学成分合成的RV沙门菌增菌液体培养基，可以为RV沙门菌增菌液体培参比培养基的确立提供一定的参考依据。
发明内容
本发明公开一种无动植物源性纯化学成分合成的RV沙门菌增菌液体培养基及制备方法。通过解析大豆胨营养成分，以氨基酸、无机盐、生长因子组分作为氮源，替代传统RV沙门菌增菌液体培养基中的动植物源性成分——大豆胨。
本发明所述的一种纯化学成分合成的RV沙门菌增菌液体培养基，只含化学物质，包括多种氨基酸、无机盐、生长因子、染色剂；其中替代大豆胨的氮源由氨基酸组分、无机盐组分和生长因子组分构成，用于替代大豆胨的氨基酸、无机盐组分见表1，培养基中生长因子各组分终浓度见表2。
表1 培养基中替代大豆胨的氨基酸、无机盐组分及含量
Figure BDA0003525848610000011
Figure BDA0003525848610000021
氨基酸组分和无机盐组分在培养基中最终含量分别为4.35g/L,1.05g/L。
生长因子在培养基中的最终浓度如下：
表2 培养基中生长因子组分及含量
Figure BDA0003525848610000022
进一步的，用于替代大豆胨的氨基酸组分、无机盐组分如表3，培养基中生长因子组分终浓度如表4：
表3 培养基中替代大豆胨的氨基酸、无机盐组分及含量
Figure BDA0003525848610000023
Figure BDA0003525848610000031
表4 培养基中生长因子组分及含量
Figure BDA0003525848610000032
本发明所述的纯化学成分合成的RV沙门菌增菌液体培养基的制备方法：按照表1称量20种氨基酸组分，在涡旋仪上混匀30分钟以上。再精确称量5种无机盐，再次涡旋混匀30分钟以上，以确保充分混匀。按照RV沙门菌增菌液体培养基配方，以氨基酸和无机盐组分替代大豆胨，分别称取氨基酸组分3.45g，无机盐组分1.05g，氯化钠8.0g，磷酸氢二钾0.4g，磷酸二氢钾0.6g，六水合氯化镁29g，溶于900ML蒸馏水中，调节pH在25℃的pH值为5.2±0.2。加入孔雀石绿，115℃高压灭菌15min。灭菌后，以过滤除菌方式加入生长因子组分，使各成分终浓度如表2所示，最后加入灭菌蒸馏水，将体积补齐至1L。无菌操作分装培养基至每管10mL备用。
纯化学成分合成的RV沙门菌增菌液体培养基的应用，所述步骤如下：
(1)培养基的储藏：制备好的培养基应至2～8℃避光冷藏，并在3周内使用完。
(2)工作菌悬液的制备：肯塔基沙门氏菌CMCC50971、乌干达沙门氏菌CCMCC50958、斯坦利沙门氏菌CMCC50959、肠炎沙门氏菌CMCC50965、婴儿沙门氏菌CMCC50963、罗森沙门氏菌CMCC50966、乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、金黄色葡萄球菌CMCC26003、粪肠球菌ATCC29212接种至胰酪大豆胨液体培养基中过夜培养，将各沙门菌稀释至10～100cfu/100μL，金黄色葡萄球菌及粪肠球菌稀释至1000～10000cfu/100μL。
(3)接种：取稀释好的沙门菌菌悬液100μL，接种至待测培养基和RV沙门菌增菌液体对照培养基，平行接种2管(相当于每个菌种都分别接种两管)，30～35℃培养18h，观察生长情况(浊度变化)。取稀释好的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌菌悬液100μL，接种至待测培养基和RV沙门菌增菌液体对照培养基培养基，平行接种2管，30～35℃培养24h，观察生长情况(浊度变化)。
(4)结果解释：与对照培养基相比，目标菌在待测培养基中应生长良好，非目标菌应不生长。
传统RV沙门菌增菌液体培养基中的大豆胨成分复杂、结构模糊、来源多样，为培养基的质量控制带来很多不确定因素。因此，研制由分子结构清晰、可溯源的纯化学成分合成的微生物参比培养基，构建客观、准确、可操作性强的培养基评价体系势在必行。本发明所述培养基及制备方法为我国药品微生物检验相关参考体系的建立提供参考依据；消除传统RV沙门菌增菌液体培养基中，因大豆胨成分不明确、不稳定对培养基质量造成的影响，提高结果的准确性和重现性。
具体实施方式
下面结合表格对发明进行详细说明
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明公开一种纯化学成分合成的RV沙门菌增菌液体培养基及配制方法。称取氨基酸组分3.45g，无机盐组分1.05g，氯化钠8.0g，磷酸氢二钾0.4g，磷酸二氢钾0.6g，六水合氯化镁29g，溶于900mL蒸馏水中，调节pH在25℃的pH值为5.2±0.2。加入孔雀石绿，115℃高压灭菌15min。灭菌后，以过滤除菌方式加入生长因子组分，使各成分终浓度分别为：腺嘌呤10mg/L，黄嘌呤0.25mg/L，尿嘧啶10mg/L，吡哆醛盐酸盐1mg/L，VB120.2mg/L，烟酰胺0.2mg/L，核黄素0.2mg/L，硫胺盐酸盐0.2mg/L，叶酸0.01mg/L，生物素0.0002mg/L。最后加入灭菌蒸馏水，将体积补齐至1L。无菌操作分装培养基至每管10mL备用。
表3 培养基中替代大豆胨的氨基酸、无机盐组分及含量
Figure BDA0003525848610000041
Figure BDA0003525848610000051
1、材料与方法
1.1菌株
肯塔基沙门氏菌CMCC50971、乌干达沙门氏菌CCMCC50958、斯坦利沙门氏菌CMCC50959、肠炎沙门氏菌CMCC50965、婴儿沙门氏菌CMCC50963、罗森沙门氏菌CMCC50966、乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、金黄色葡萄球菌CMCC26003、粪肠球菌ATCC29212。
1.2工作菌悬液的制备
将1.1中菌株接种至胰酪大豆胨液体培养基中过夜培养。将各沙门菌稀释至10～100cfu/100μL，金黄色葡萄球菌及粪肠球菌稀释至1000～10000cfu/100μL。
1.3促生长能力测试
取稀释好的沙门菌菌悬液100μL接种至待测培养基和RV沙门菌增菌液体对照培养基，平行接种2管，30～35℃培养18h，观察生长情况(浊度)。所述RV沙门菌增菌液体对照培养基购自于中国食品药品检定研究院。
1.4抑制能力测试
取稀释好的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌菌悬液100μL，接种至待测培养基和RV沙门菌增菌液体对照培养基培养基，平行接种2管，30～35℃培养24h，观察生长情况(浊度)。
2、实验结果
2.1促生长能力测试结果
Figure BDA0003525848610000052
Figure BDA0003525848610000061
2.2抑制能力测试结果
测试菌株 测试结果
金黄色葡萄球菌CMCC26003 与对照培养基相比，未生长(澄清)
粪肠球菌ATCC29212 与对照培养基相比，未生长(澄清)
纯化学成分合成的RV沙门菌增菌液体培养基接种8株不同的沙门菌，在相应条件下培养后，与对照培养基相比均出现明显浑浊，说明其对沙门菌具有较强的促生长能力。接种金黄色葡萄球菌和粪肠球菌，在相应条件下培养后，培养基均保持澄清未变浑浊，表明其对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌均有较强的抑制作用。本发明所述培养基符合《中国药典》2020年版的要求，可用于沙门菌的选择性増菌和分离。
本发明用氨基酸、无机盐及生长因子组分替代传统培养基中的植物源性成分大豆胨，研制结构清晰、成分明确、质量可控的纯化学成分合成RV沙门增菌液体培养基。该培养基对沙门菌具有较强的促生长能力，对非目标菌金黄色葡萄球菌、粪肠球菌具有抑制作用，可用于沙门菌的选择性増菌与分离。

Claims (5)

1.一种无动植物源性纯化学成分合成的RV沙门氏菌増菌液体培养基，其特征在于，所述培养基只含纯化学物质，包括多种氨基酸、无机盐、生长因子、染色剂；其中用于替代大豆胨的氨基酸组分、无机盐组分如下：
Figure FDA0003525848600000011
无机盐组分
Figure FDA0003525848600000012
氨基酸组分和无机盐组分在培养基中最终含量分别为4.35g/L,1.05g/L；生长因子在培养基中的最终浓度如下：
Figure FDA0003525848600000013
Figure FDA0003525848600000021
2.如权利要求1所述的一种无动植物源性纯化学成分合成的RV沙门氏菌増菌液体培养基，其特征在于，氨基酸组分及无机盐组分如下所示：
Figure FDA0003525848600000022
无机盐组分
Figure FDA0003525848600000023
氨基酸组分和无机盐组分在培养基中最终含量分别为4.35g/L,1.05g/L生长因子在培养基中的最终浓度如下：
Figure FDA0003525848600000024
Figure FDA0003525848600000031
。
3.一种无动植物源性纯化学成分合成的RV沙门菌增菌液体培养基的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的培养基组分：称量20种氨基酸组分，在涡旋仪上混匀30分钟以上；再精确称量5种无机盐，再次涡旋混匀30分钟以上，以确保充分混匀；按照RV沙门菌增菌液体培养基配方，以氨基酸和无机盐组分替代大豆胨，分别称取氨基酸组分3.45g，无机盐组分1.05g，氯化钠8.0g，磷酸氢二钾0.4g，磷酸二氢钾0.6g，六水合氯化镁29g，溶于900mL蒸馏水中，调节pH值在25℃为5.2±0.2，加入孔雀石绿，115℃高压灭菌15min；灭菌后，以过滤除菌方式加入生长因子组分，最后加入灭菌蒸馏水，将体积补齐至1L；无菌操作分装培养基至每管10mL备用。
4.一种无动植物源性纯化学成分合成的RV沙门菌增菌液体培养基的应用，其特征在于，包括工作菌悬液的制备：将肯塔基沙门氏菌CMCC50971、乌干达沙门氏菌CCMCC50958、斯坦利沙门氏菌CMCC50959、肠炎沙门氏菌CMCC50965、婴儿沙门氏菌CMCC50963、罗森沙门氏菌CMCC50966、乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50094、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、金黄色葡萄球菌CMCC26003、粪肠球菌ATCC29212接种至胰酪大豆胨液体培养基中过夜培养，将各沙门菌稀释至10～100cfu/100μL，金黄色葡萄球菌及粪肠球菌稀释至1000～10000cfu/100μL；取稀释好的沙门菌菌悬液100μL，接种至待测培养基和RV沙门菌增菌液体对照培养基，平行接种2管，30～35℃培养18h，观察生长情况；取稀释好的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌菌悬液100μL，接种至待测培养基和RV沙门菌增菌液体对照培养基培养基，平行接种2管，30～35℃培养24h，观察生长情况；所述待测培养基为权利要求3制备的培养基。
5.如权利要求4所述的一种无动植物源性纯化学成分合成的RV沙门菌增菌液体培养基的应用，结果解释：与对照培养基相比，目标菌应生长良好，即培养液明显浑浊，非目标菌应不得生长，即培养液保持澄清。
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