CN111607633A - 一种菌落总数计数卡片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种菌落总数计数卡片及其制备方法，属于微生物快速检测技术领域。本发明是利用培养基各种组分干粉，根据不同的目标微生物添加一定量相应的指示剂制作成微生物测试片，省略了传统配制培养基高压蒸汽灭菌和倒平皿等一系列繁琐的准备工作，制作过程简单，产品稳定，方便取用，无需专业操作人员和昂贵的仪器，可大大提高微生物检测人员的工作效率；采用适量的专一性酶显色指示剂，既保证了显色效果有保证了结果准确度；培养基的使用量较少，可大大降低检测成本。

Description

一种菌落总数计数卡片及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物快速检测技术领域，具体涉及一种菌落总数计数卡片及其制备方法。

背景技术

食品中菌落总数含量直接反应了有害微生物的含量，是卫生防疫部门的一项重要工作，也是食品生产厂家对产品自检的重要指标之一，直接涉及食品安全问题。对食品微生物污染情况测定的传统方法是平皿倾注法，依靠培养基目标微生物的方法来确定食品是否合格，在操作过程中，需要进行培养基配制，然后进行高压蒸汽灭菌，将培养基在热熔的状态下到平皿等一系列操作步骤，其操作繁琐、费时、费工；每个平皿需要至少15ml的培养基，浪费较大；随后进行微生物接种、培养，培养时间一般需要2天以上，且通过目视计算菌落数量，不仅费力耗时，误差也较大，质检不易控制。另外，在检测过程中对操作环境及操作人员的专业水平均有很高的要求，很难实现推广，食品卫生质量难以得到保证。

发展快速、准确、方便的微生物检测方法越来越受到人们的重视，目前大致可以分为三大类，一类是利用现代分子生物学技术和自动化分析仪器结合建立起来的微生物快速检测方法，如利用阻抗法建立起来的细菌技术系统，利用ATP荧光酶的生物打光快速检测仪，利用生化鉴定方法的全自动细菌自动鉴别系统，以及自动酶联荧光免疫分析法、金标分析方法、DNA探针和荧光定量PCR分析仪等，这一类技术和方法所需仪器设备都比较昂贵，需要专门的实验室和专业技术操作人员，因此，难以普及推广。另一类发展起来的微生物快速检测方法是把传统的培养方法与专一性酶显色反应相结合，并做成随时可用的一次性产品。在选择性培养基的基础上再加入目标微生物所特有的某种酶的显色剂，可以大大提高检测的专一性，原来需要几步的培养鉴定简化为一步完成，如法国的科玛嘉和生物梅里埃等公司研发出的相关系列产品，但这些产品的成本较高，需要检测人员加热消毒培养基和倒平皿。美国的3M公司、日本的CHISSO株式会社等研制出的一次性快速检测产品，这些产品的生产过程和技术都比较复杂，生产条件要求严格，且对生产设备的要求较高。国内的公司如广州绿洲生化研究中心、北京路桥技术有限公司和北京良润生物科技有限公司等研发的相关一次性检测产品，但这些产品在检测精确度和显色外观等方面稍有欠缺。

本发明是利用培养基各组分干粉，根据不同的目标微生物添加一定量相应的指示剂制作成微生物测试片，制作过程简单，产品稳定，检测效果理想。主要的产品形式及制作过程均不同于现有的任何一种方法。

发明内容

一种菌落总数计数卡片的制备方法，其特征在于，包括步骤：

第一步：载体上培养基的配制及附着：准确称取蛋白胨0.5-2g、酵母提取物0.1-0.5g、氯化钠 0.1-1g、海藻酸钠0.5g-1.0g、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠混合物4-9g、1%TTC水溶液100-250ul，加入100ml纯净水搅拌溶解均匀，将溶解均匀的培养基均匀平铺至10cm*10cm的白色合成纸上，并置于40℃-50℃以下的环境中烘干，备用；

第二步：透明聚酯膜上吸水凝胶的附着：先用刷子在透明聚酯膜上刷上一层不干胶，然后将聚丙烯酸钠干粉均匀涂布在透明聚酯膜上，压平即可；

第三步：将经第一步处理的合成纸载体及经第二步处理的透明聚酯膜裁剪成9cm*7cm大小，将附有聚丙烯酸钠的一面扣在附有培养基的载体上，用标签固定，并在聚酯膜另一面印上方格；

第四步：将制好的产品装入自封袋中，不要封口，放在气体灭菌器中灭菌数小时，灭菌后封好放入铝箔袋中，密封冷藏。

原理：细菌在测试片上生长后会显示红色斑点，选择菌落数适中（30～300个）的测试片进行计数，乘以稀释倍数后即为每毫升（或每克）样品中所含的细菌菌落总数。

本发明的有益效果：本发明省略了传统配制培养基高压蒸汽灭菌和和倒平皿等一系列繁琐的准备工作，方便取用，无需专业操作人员和昂贵的仪器，可大大提高微生物检测人员的工作效率；采用适量的专一性酶显色指示剂，既保证了显色效果有保证了结果准确度；培养基的使用量较少，可大大降低检测成本。

具体实施方式

一、一种菌落总数计数卡片的制备方法，包括步骤：

第一步：载体上培养基的配制及附着：准确称取蛋白胨1.2g、酵母提取物0.2g、氯化钠0.6g、海藻酸钠0.9g、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠混合物7g、1%TTC水溶液150ul，加入100ml纯净水搅拌溶解均匀，将溶解均匀的培养基均匀平铺至10cm*10cm的白色合成纸上，并置于40℃-50℃以下的环境中烘干，备用；

第二步：透明聚酯膜上吸水凝胶的附着：先用刷子在透明聚酯膜上刷上一层不干胶，然后将聚丙烯酸钠干粉均匀涂布在透明聚酯膜上，压平即可；

第三步：将经第一步处理的合成纸载体及经第二步处理的透明聚酯膜裁剪成9cm*7cm大小，将附有聚丙烯酸钠的一面扣在附有培养基的载体上，用标签固定，并在聚酯膜另一面印上方格；

第四步：将制好的产品装入自封袋中，不要封口，放在气体灭菌器中灭菌数小时，灭菌后封好放入铝箔袋中，密封冷藏。

二、菌落总数的检测方法：

1、样品处理：取样品25mL（或25g）放入含有225mL灭菌磷酸缓冲液稀释液（或生理盐水）的取样罐或均质杯内，制成1:10的样品匀液，必要时用一定浓度的NaOH或1mol/L HCl溶液调节样品匀液pH至6.6～7.2。用1mL灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，振摇后成为1:100的样品匀液，以此类推，做出1:1000等稀释度的样品匀液，每次需换新的吸管。2、接种：将菌落总数测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液慢慢均匀地滴加到卡片中心位置，然后再将上层膜缓慢盖下，可用一定的物件稍微压平，静置10s左右使培养基凝固，每个稀释度接种两片。同时做一片空白阴性对照。（一般食品选2～3个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品，如饮用纯水和矿泉水等，可直接吸取原液进行检测）3、培养：将测试片叠在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。一般食品培养温度为36℃±1℃，培养15～24h；水产品培养温度为30℃±1℃，培养48h。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种菌落总数计数卡片的制备方法，其特征在于，包括步骤：

第一步：载体上培养基的配制及附着：准确称取蛋白胨1.0-1.5g、酵母提取物0.1-0.3g、氯化钠 0.5-0.7g、海藻酸钠0.8g-1.0g、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠混合物6-9g、1%TTC水溶液100-250ul，加入100ml纯净水搅拌溶解均匀，将溶解均匀的培养基均匀平铺至10cm*10cm的白色合成纸上，并置于40℃-50℃的环境中烘干，备用；

第二步：透明聚酯膜上吸水凝胶的附着：先用刷子在透明聚酯膜上刷上一层不干胶，然后将聚丙烯酸钠干粉均匀涂布在透明聚酯膜上，压平即可；

第三步：将经第一步处理的合成纸载体及经第二步处理的透明聚酯膜裁剪成9cm*7cm大小，将附有聚丙烯酸钠的一面扣在附有培养基的载体上，用标签固定，并在聚酯膜另一面印上方格；

第四步：将制好的产品装入自封袋中，不要封口，放在气体灭菌器中灭菌数小时，灭菌后封好放入铝箔袋中，密封冷藏。

2.一种使用权利要求1所述方法制备的菌落总数计数卡片。