CN113430246B - 一种用于蚝油灌装空间的空气微生物快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于蚝油灌装空间的空气微生物快速检测方法，包括以下步骤：S1按采样点布置图放置培养基，然后根据现场布置情况，使培养基暴露于空气中；S2将步骤S1采样的培养基置于恒温摇床振荡培养，培养至刚开始进入稳定期；S3移取步骤S2的培养液，离心，去上清液，重置于无菌生理盐水中混合均匀，移至计数平板上，涂布均匀，35‑37℃培养10‑12h。本发明的检测方法在采样阶段的培养基中采用了液体培养基，同时添加了蚝油，既可以提供蚝油灌装空间微生物生长的特性营养源，也可以缩短微生物代谢系统适应培养基环境的时间，使得空气中的微生物仅在2‑4h的暴露采样时间内提前适应环境，开始生长。

Description

一种用于蚝油灌装空间的空气微生物快速检测方法

技术领域

本发明属于空气微生物检测技术领域，具体涉及一种用于蚝油灌装空间的空气微生物快速检测方法。

背景技术

GB/T16294规定了医药工业洁净室和洁净区中沉降菌测试条件、测试方法，同样适用于无菌室或局部空气净化区域的沉降菌的测试和环境验证。目前食品行业大多参考此标准进行空间微生物的检测。

专利号200410026795.X公开了一种快速定量检测江河湖水、工业用水、生活饮用水及海水等水体中细菌总数、微藻细胞数量的检测方法和试剂，提高目前ATP生物发光法的灵敏度，消除样品中干扰酶反应的物质对测定体系的影响，但是检测方法较为复杂，且仅适用于水体检测。专利号201510937267.8提供了一种痕量微生物快速检测方法，把荧光标记、溶液过滤、滤膜激光扫描及信号探测和处理结为一体，通过设计自动检测系统简化操作步骤，缩短检测时间，提高检测精度，但是要求样品为溶液，涉及检测设备较多，也不适合空间微生物的检测。专利号201510366781.0公开了为微生物快速检测多环测试纸片、无菌培养基及其制备方法，有效保持培养基水分不流失，同时提供微生物生长所需的气体成分，简便快捷。专利号201610936062.2公开了一种微生物快速检测方法，在特异性液体培养基富集培养样品中的目标微生物，使用一种由有机硅材料和颜色指示剂溶液组成的传感器来检测目标微生物生长时所代谢的小分子产物，缩短检测时间，检测结果可靠。专利号201510666900.4公开了一种基于米氏散射和空间光调制器的微生物快速检测设备，通过计算机对接收到的微生物散射光电信号进行解析计算，实时监测当前微生物形态，实现采集过程中的信号实时采集、处理和分析。专利号201921776148.9公开了一种食品微生物快速检测装置，包括微生物快速检测仪、探头和消毒盒，方便对微生物检测仪进行校准，有效清理内侧残渣。

空间微生物的评判常以检测沉降菌的方式进行，目前沉降菌测试方法培养时间较长，一般采用大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)配制的培养皿经采样后，在30-35℃培养箱中培养，时间不少于2天；用沙氏培养基(SDA)配制的培养皿经采样后，在20-25℃培养箱中培养，时间不少于5天。

ATP生物发光技术是目前有望实现即时检测微生物的最快方法，但是由于灵敏度要求和酶反应的影响，会造成假阳性或假阴性。专利号CN1680805A公开了一种环境水体微生物快速检测方法及试剂，先用微孔滤膜去除水中干扰物，然后用细胞ATP释放剂EC释放出样品中的微生物细胞ATP，再进行发光检测，大大缩短了检测时间，但是检测要求较高，操作复杂，且不适用于空气微生物的检测，应用范围相当局限。

目前微生物检测方法主要为平板培养计数法、显微荧光计数法、流式细胞术。平板计数法成本低但检测速度慢，显微荧光计数法观测时易出现离焦情况、一次性观测区域小且手动计数准确度低，流式细胞术检测快、可多参数检测，但是要求被测浓度高且设备要求较高、检测成本较高。

虽然目前有很多的微生物检测方法，但是检测效率和精度、操作要求或应用范围相当受限，不能实现空气微生物的快速、便捷检测。

发明内容

为解决国标GB/T 16294规定的平板培养计数法培养时间较长，以及常规快检法操作复杂且检测成本较高的问题，本发明提供一种便捷高效的空气微生物快速检测方法，缩短检测时间，操作简单，设备要求相对较低，检测结果可靠，便于应用推广。

本发明采用以下技术方案：

一种用于蚝油灌装空间的空气微生物快速检测方法，包括以下步骤：

S1采样：按采样点布置图，逐个放置灭菌好的培养基，然后根据现场布置情况，沿着人员退出的路线逐个打开瓶盖，使培养基暴露于空气中；

S2适应性培养：将步骤S1采样的培养基置于恒温摇床振荡培养，培养温度30～37℃，培养时间10-12h，培养至刚开始进入稳定期；

S3平板计数：移取步骤S2的培养液，离心，去上清液，重置于无菌生理盐水中混合均匀，移至计数平板上，涂布均匀，35-37℃培养10-12h。

本发明针对国标GB/T 16294规定的平板培养计数法上进行了改进。更适用于蚝油灌装空间的空气微生物的检测，增加了适应性培养步骤，缩短了检测时间，且无需昂贵仪器，且操作简单，设备要求相对较低，检测结果可靠。

优选地，所述步骤S1使用的培养基通过以下方法制备而成：将质量百分比为5％-15％的蚝油、35％-45％的营养肉汤、40％-60％的LB液体培养基混合均匀后分装，灭菌，获得适应性培养基。本发明的适应性培养基用于缩短蚝油灌装空间的空气微生物在平板上的生长时间，使其在平板上能快速形成菌落，用于微生物平板计数。

优选地，所述步骤S1中灭菌的温度为121℃，灭菌时间为15min。

优选地，所述步骤S1中培养基暴露于空气中的时间为2～4小时。经试验研究证实采用本发明检测方法培养基暴露时间仅需2～4小时，即可达到与国标检测方法的准确性，无需更多的暴露时间，因此，大大缩短检测花费的时间。

优选地，所述步骤S2中摇床振荡培养的转速为80-400rpm/min。

优选地，所述步骤S3中离心步骤的参数为4000rpm离心5-10min。

优选地，所述步骤S3中计数平板由以下方法制备而成：将质量百分比为15％-25％的蚝油、35％-50％的LB液体培养基、20％-30％的营养肉汤、2％-5％的结冷胶、5％-8％的黄原胶混合均匀后，灭菌，在培养皿中倒入10～15ml的未凝固的培养基，待其凝固，获得本发明的计数平板。由于本发明的计数平板培养中添加了一定含量的蚝油，与一般现有的菌落计数平板相比，本发明的HY平板更适用于蚝油灌装空间的空气微生物生长。本发明中添加蚝油的用量为15-25％，是多次试验所得结果，添加过多蚝油会使培养基的渗透压过高不利于微生物生长，蚝油添加量不足，提供的营养物过低，微生物生长速度低。更优选的蚝油的用量为20％-25％。

另外，为了避免琼脂对微生物的毒害作用，还在HY平板中添加结冷胶和黄原胶，一方面利用结冷胶的透明性，方便识别菌落；另一方面充分利用黄原胶的保水性，确保培养期平板不开裂，提供适宜的水分。

本发明还提供了一种用于检测蚝油灌装空间的空气微生物的培养基，该培养基包括：质量百分比为5％-15％的蚝油、35％-45％的营养肉汤和40％-60％的LB液体培养基。

本发明还提供了一种用于检测蚝油灌装空间的空气微生物的培养基，该培养基包括：质量百分比为15％-25％的蚝油、35％-50％的LB液体培养基、20％-30％的营养肉汤、2％-5％的结冷胶和5％-8％的黄原胶。

本发明还提供了如上所述的两种培养基在检测蚝油灌装空间的空气微生物中的应用。本发明的培养基用于检测蚝油灌装空间的空气微生物数量，在培养过程中可缩短微生物形成菌落的时间，以至缩短整个检测过程的时间。

本发明的有益效果为：

1、本发明的检测方法在采样阶段的培养基中采用了液体培养基，同时添加了蚝油，既可以提供蚝油灌装空间微生物生长的特性营养源，也可以缩短微生物代谢系统适应培养基环境的时间，使得空气中的微生物仅在2-4h的暴露采样时间内提前适应环境，开始生长。

2、针对蚝油灌装空间的微生物生长特性，采用先适应性培养至微生物生长进入稳定期，液体培养基中的营养比例失调时，再将培养液转移至HY计数平板继续培养，既可以缩短培养时间，且检测结果可靠、操作简单便捷、方法易于推广。

3、本发明在HY平板中添加了结冷胶和黄原胶，避免琼脂对微生物的毒害作用，一方面利用结冷胶的透明性，方便识别菌落；另一方面充分利用黄原胶的保水性，确保培养期平板不开裂，提供适宜的水分。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1

1、培养基制备：称取5％蚝油、35％营养肉汤、60％LB液体培养基，混合均匀，然后分装锥形瓶，每瓶200mL，经121℃灭菌15min。

2、采样：按采样点布置图，逐个放置灭菌好的培养基，然后根据现场布置情况，沿着人员退出的路线逐个打开瓶盖，使培养基暴露于空气中，暴露时间4h。

3、适应性培养：将采样的培养基置于恒温摇床振荡培养，转速100rpm，培养温度35℃，培养时间12h。

4、平板计数培养：移取20mL上述培养液，4000rpm离心5min，去上清液，重置于2mL无菌生理盐水中混合均匀，移至特定HY计数平板上，涂布均匀，35℃培养12h。

特定HY计数平板制备方法：将质量百分比为20％的蚝油、50％的LB液体培养基、20％的营养肉汤、3％的结冷胶、7％的黄原胶混合均匀后，121℃灭菌15min，在培养皿中倒入10～15ml的未凝固的培养基，待其凝固，获得计数平板。

实施例2

1、培养基制备：称取10％蚝油、40％营养肉汤、50％LB液体培养基，混合均匀，然后分装锥形瓶，每瓶200mL，经121℃灭菌15min。

2、采样：按采样点布置图，逐个放置灭菌好的培养基，然后根据现场布置情况，沿着人员退出的路线逐个打开瓶盖，使培养基暴露于空气中。暴露时间3h。

3、适应性培养：将采样的培养基置于恒温摇床振荡培养，转速250rpm，培养温度36℃，培养时间11h。

4、平板计数培养：移取20mL上述培养液，4000rpm离心10min，去上清液，重置于2mL无菌生理盐水中混合均匀，移至特定HY计数平板上，涂布均匀，36℃培养11h。

特定HY计数平板制备方法：将质量百分比为15％的蚝油、45％的LB液体培养基、25％的营养肉汤、2％的结冷胶、8％的黄原胶混合均匀后，121℃灭菌15min，在培养皿中倒入10～15ml的未凝固的培养基，待其凝固，获得计数平板。“HY计数平板”为本发明所选的添加蚝油的复合计数平板的简称。

实施例3

1、培养基制备：称取15％蚝油、45％营养肉汤、40％LB液体培养基，混合均匀，然后分装锥形瓶，每瓶200mL，经121℃灭菌15min。

2、采样：按采样点布置图，逐个放置灭菌好的培养基，然后根据现场布置情况，沿着人员退出的路线逐个打开瓶盖，使培养基暴露于空气中。暴露时间2h。

3、适应性培养：将采样的培养基置于恒温摇床振荡培养，转速250rpm，培养温度37℃，培养时间10h。

4、平板计数培养：移取20mL上述培养液，4000rpm离心10min，去上清液，重置于2mL无菌生理盐水中混合均匀，移至特定HY计数平板上，涂布均匀，37℃培养10h。

特定HY计数平板制备方法：将质量百分比为25％的蚝油、35％的LB液体培养基、30％的营养肉汤、5％的结冷胶、5％的黄原胶混合均匀后，121℃灭菌15min，在培养皿中倒入10～15ml的未凝固的培养基，待其凝固，获得计数平板。

对比例

常规沉降菌检测：国标GB/T 16294

1、培养基为：大豆蛋白琼脂培养基(TSA)

2、采样方式及采样时间：动态测试时，培养皿暴露时间4h

3、培养条件及时间：平板倒扣培养，30-35℃，不少于2天

将上述实施例1～3与对比例1的检测方法进行对比，结果如表1所示：

表1：实施例1～3与对比例1的检测方法对比结果

注：表中“第一次、第二次、第三次”表示三次平行实验。

从表1中的结果可以看出，采用常规手段检测时间总长为52h(暴露时间+培养时间)，而本发明的检测时间总长仅为22h-28h(暴露时间+培养时间)，缩短了53％以上的时间。检测结果从均值和总数两方面来看，本发明的检测结果与常规手段得到的结果基本一致，说明采用本发明的检测方法获得的检测结果可靠。因此，本发明的检测方法在保障检测结果准确可靠的前提下，缩短了一半以上的检测时间。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种蚝油灌装空间的空气微生物快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1采样：按采样点布置图，逐个放置灭菌好的培养基，然后根据现场布置情况，沿着人员退出的路线逐个打开瓶盖，使培养基于空气中暴露2~4h；

S2适应性培养：将步骤S1采样的培养基置于恒温摇床振荡培养，培养温度30~37℃，培养时间10-12h，培养至刚开始进入稳定期；

S3平板计数：移取步骤S2的培养液，离心，去上清液，重置于无菌生理盐水中混合均匀，移至计数平板上，涂布均匀，35-37℃培养10-12h；

所述步骤S1使用的培养基通过以下方法制备而成：将质量百分比为5%-15%的蚝油、35%-45%的营养肉汤、40%-60%的LB液体培养基混合均匀后分装，灭菌，获得适应性培养基；

所述步骤S3中计数平板由以下方法制备而成：将质量百分比为15%-25%的蚝油、35%-50%的LB液体培养基、20%-30%的营养肉汤、2%-5%的结冷胶、5%-8%的黄原胶混合均匀后，灭菌，在培养皿中倒入10~15ml的未凝固的培养基，待其凝固，获得计数平板。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中灭菌的温度为121℃，灭菌时间为15min。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中摇床振荡培养的转速为80-400rpm/min。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中离心步骤的参数为4000rpm离心5-10min。