CN101343657B - 一种酱油中菌落总数快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酱油中菌落总数快速检测方法。该方法包含以下步骤：A.利用膜分离技术分离富集菌体，去除影响菌体生长和发光体系的物质；B.利用培养基修复亚致死细菌，转化芽孢为营养体细胞，使细菌处于同步生长状态；C.菌悬液与ATP发光试剂发应，根据发光值检测得出菌落总数。本发明还公开了一种用于酱油菌落总数快速检测的培养基。本发明检测方法快速，在4小时内就能够准确检出菌落总数，具有快速准确的优点。
Description
技术领域
本发明涉及调味品技术领域，具体地说，本发明涉及一种酱油中菌落总数快速检测方法。
背景技术
酱油等调味品中菌落总数是食品卫生的一项重要指标。目前检测方法主要是利用平板计数方法，该方法检测需要48小时，往往存在滞后现象。在此基础上改进方法仍需要培养12小时以上，不能达到快速检测的目的。目前文献报道ATP生物方法快速检测菌落总数，该方法是利用菌体本身的ATP为检测对象，然而酱油等调味品经过巴氏杀菌，大部分不耐热菌被杀死，部分为亚致死状态，有些菌转变为芽孢状态，因此菌体生长状态不一致，同时酱油等调味品成分复杂，存在干扰ATP生物发光体系的物质，因此在利用该方法检测时往往与实际菌落总数存在很大差异。
发明内容
本发明克服了现有技术中的缺点和不足之处，提出了一种酱油中菌落总数快速检测方法。
发明人认为：针对复杂的酱油等调味品样品，应当解决样品中菌体分离富集和解决菌体生理状态问题，去除干扰物质；对菌体进行修复复壮，保证菌体生理状态一致性，从而保证ATP生物发光检测结果与菌落计数方法结果的一致性，保证ATP发光检测方法适用于酱油产品菌落总数的快速检测。
故而，本发明提出了以下技术方案：
一种酱油中菌落总数快速检测方法，包含以下步骤：
A.利用孔径为0.2-0.45μm滤膜分离富集菌体，去除影响菌体生长和发光体系的物质；
B.将分离的菌体悬浮于修复培养基中在35-37℃修复2-3小时，修复亚致死细菌，转化芽孢为营养体细胞，使细菌处于同步生长状态；
C.设置阳性样本，利用ATP发光方法测定菌悬液与阳性样本的发光值，根据菌落总数与发光值间的数学模型，得出菌落总数；
所述修复培养基由以下组分组成：每1000ml蒸馏水中含有牛肉浸出粉2-5g，酪蛋白水解物15-20g，可溶性淀粉0.5-3g，无水葡萄糖3-7g，L-丙氨酸0.5-1g，肌苷0.25-0.5g，L-天门冬素0.5-2g。
所述的分离富集菌体采用以下步骤：吸取一定量的待测样品，利用无菌生理盐水稀释5-40倍，再进行真空过滤，滤过0.2-0.45μm滤膜，最后以无菌生理盐水洗涤3-5次，去除干扰杂质。
所述的发光值检测，将修复的菌体悬液50-100μl与50-100μlBacTiter-GloTM检测试剂反应，利用发光光度计于530-590nm处检测发光值。
本发明还涉及一种用于调味品中菌落总数快速检测的培养基，该培养基由以下组分组成：每1000ml蒸馏水中含有牛肉浸出粉2-5g，酪蛋白水解物15-20g，可溶性淀粉0.5-3g，无水葡萄糖3-7g，L-丙氨酸0.5-1g，肌苷0.25-0.5g，L-天门冬素0.5-2g。
培养基提供细菌生长必需的-营养元素，同时添加促进芽孢萌发的化学物质和促进受伤细菌修复的修复因子，即：L-天门冬素、L-丙氨酸和肌苷。
本发明的优点在于：
本发明针对酱油等调味品成分复杂特点，利用菌体分离富集技术，富集菌体，去除干扰菌体生理状态、影响ATP生物发光的物质；筛选优化培养基，修复复壮菌体，促进芽孢转化为营养细胞，促使菌体处于正常一致的生理状态，将菌体与ATP发光检测试剂反应，利用发光检测仪检测发光值，设置阳性样本(已知菌落总数)，根据阳性样本菌落总数和发光值，建立发光值与菌落数间数学模型，根据已建模型推算出待测样品菌落总数。本发明检测方法快速，在4小时内就能够准确检出菌落总数，远快于国家标准方法(48小时)(GB/T4789.2-2003食品卫生微生物学检验菌落总数测定)，检测成本低廉。
附图说明
图1是菌落总数与相对发光值的关系图。图1表明在研究的菌落总数范围内菌落总数与相对发光值具有良好的相关性(R＝0.9975)，方程为y＝2.14x-857。
具体实施方式
为了更好地理解发明的实质，下面用实施例来详细说明发明的技术内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
1.样品过滤用移液管移取10ml液体食品到90ml无菌生理盐水中，振荡摇匀，取10ml该稀释样品过0.2μm-0.45μm膜，收集菌体，对截留在膜上的菌体利用无菌生理盐水反复冲洗三次，去除酱油等调味品中影响细菌修复和干扰发光的物质。表1中列出数据阐述酱油中存在干扰发光的物质。
表1 去除干扰物前后对发光体系的影响
*菌悬液制备方法：吸取10ml酱油加入到90ml无菌水中，混匀，取10ml过0.45μm醋酸纤维素膜抽滤，再用1ml无菌水洗涤过滤膜，收集菌体，制备菌悬液。
表1 试验结果表明酱油成分严重干扰ATP发光，因此必需对样品过滤，分离富集菌体，排除干扰成分。
2.修复培养基组成与制备培养基配方：牛肉浸出粉3.5g，酪蛋白水解物17.5g，可溶性淀粉1.8g，无水葡萄糖5g，L-丙氨酸0.75g，肌苷0.35g，L-天门冬素1.25g，加蒸馏水1000ml。121℃灭菌15分钟，室温保存供使用。培养基分装在180mm×18mm试管中，每管10ml，121℃灭菌15分钟，供使用。
3.细菌修复将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有10ml修复细菌培养基的试管中，于35-37℃孵育2-3小时。表2中菌体修复前后对发光值的影响。
表2 菌体修复前后发光值的变化
表2结果表明分离富集的菌体在修复前无论菌落数高低其发光值均较低，且发光值与菌落总数没有明显的线性相关性，经过修复后的菌体发光值明显增加，且菌落数与发光值间存在良好的线性相关性，该培养基背景值较低。因此在菌落总数快速检测过程中为保证检测的准确性必需对菌体进行修复处理。
4.检测过程取孵育完毕的菌悬液100μl，置于96孔板中相应检测孔中，加入50μl检测试剂(包括ATP浸提液、缓冲液、荧光素底物、荧光素酶和相应金属离子)，在振荡器上摇匀振荡1分钟后，进行发光检测，发光检测的波长为560nm，检测积分时间为1分钟。测定样品的发光值。
5.利用已知菌落数的样品测定发光值，建立菌落总数与发光值间的数学模型。菌落总数利用国家标准方法-平板计数方法测定，其相应发光值利用ATP发光方法测定。图1表明在研究的菌落总数范围内菌落总数与相对发光值具有良好的相关性(R＝0.9975)，方程为y＝2.14x-857。该检测试剂中有生物酶，生物酶在放置过程中酶活性会下降，因此建立的数学模型-发光值与菌落总数之间的关系方程系数会有波动，在实际检测过程中应设置一个阳性样本(已知菌落总数的样品)，测定其发光值，利用单点法校正方程系数，确保检测结果准确性。
6.待测样品利用菌体分离富集技术富集菌体，修复，测定发光值，根据已经建立的数学模型计算出菌落总数。相对发光值均值为20934，菌落总数约为10183。
实施例2
1.分离菌体用天平无菌称取10g膏状食品到90ml无菌生理盐水中，振荡摇匀，静置15min，取上清20ml该稀释样品4℃离心600g-1000g/7min去除食物残渣，取上清液10ml过0.2μm-0.45μm混合纤维素酯微孔滤膜，收集菌体，对截留在膜上的菌体利用无菌生理盐水反复冲洗三次，去除食品中影响细菌修复和干扰发光的物质。
2.修复培养基组成与制备培养基配方：牛肉浸出粉2g，酪蛋白水解物20g，可溶性淀粉0.5g，无水葡萄糖7g，L-丙氨酸0.5g，肌苷0.5g，L-天门冬素0.5g，加蒸馏水1000ml。121℃灭菌15分钟，室温保存供使用。培养基分装在180mm×18mm试管中，每管10ml，121℃灭菌15分钟，供使用。
3.细菌修复将截留细菌的膜用无菌镊子夹取，放入装有10ml修复细菌培养基的试管中，于35-37℃孵育2-3小时。
4.检测过程取孵育完毕的菌悬液100μl，置于96孔板中相应检测孔中，加入50μl检测试剂(包括ATP浸提液、缓冲液、荧光素底物、荧光素酶和相应金属离子)，在振荡器上摇匀振荡1分钟后，进行发光检测，发光检测的波长为560nm，检测积分时间为1分钟。根据发光值确定菌落总数。
实施例3
1.分离菌体用天平无菌称取10g固体或膏状食品到90ml无菌生理盐水中，振荡摇匀，静置15min，取上清20ml该稀释样品4℃离心600g-1000g/7min去除食物残渣，取上清液10ml样品4℃离心6000g-10000g/7min，去除上清液，收集菌体，对菌体利用无菌生理盐水反复冲洗三次，去除食品中影响细菌修复和干扰发光的物质。
2.修复培养基组成与制备培养基配方：牛肉浸出粉5g，酪蛋白水解物15g，可溶性淀粉3g，无水葡萄糖3g，L-丙氨酸1g，肌苷0.25g，L-天门冬素2g，加蒸馏水1000ml。121℃灭菌15分钟，室温保存供使用。培养基分装在180mm×18mm试管中，每管10ml，121℃灭菌15分钟，供使用。
3.细菌修复将细菌利用培养基悬浮，于35-37℃孵育2-3小时。
4.检测过程取孵育完毕的菌悬液100μl，置于96孔板中相应检测孔中，加入50μl检测试剂(包括ATP浸提液、缓冲液、荧光素底物、荧光素酶和相应金属离子)，在振荡器上摇匀振荡1分钟后，进行发光检测，发光检测的波长为560nm，检测积分时间为1分钟。根据发光值确定菌落总数。
以上对本发明所提供的酱油等调味品中菌落总数快速检测方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核型心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (4)
1.一种酱油中菌落总数快速检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
A.利用孔径为0.2-0.45μm滤膜分离富集菌体，去除影响菌体生长和发光体系的物质；
B.将分离的菌体悬浮于修复培养基中在35-37℃修复2-3小时，修复亚致死细菌，转化芽孢为营养体细胞，使细菌处于同步生长状态；
C.设置阳性样本，利用ATP发光方法测定菌悬液与阳性样本的发光值，根据菌落总数与发光值间的数学模型，得出菌落总数；
所述修复培养基由以下组分组成：每1000ml蒸馏水中含有牛肉浸出粉2-5g，酪蛋白水解物15-20g，可溶性淀粉0.5-3g，无水葡萄糖3-7g，L-丙氨酸0.5-1g，肌苷0.25-0.5g，L-天门冬素0.5-2g。
2.根据权利要求1所述的酱油中菌落总数快速检测方法，其特征在于，所述的分离富集菌体采用以下步骤：吸取一定量的待测样品，利用无菌生理盐水稀释5-40倍，再进行真空过滤，滤过0.2-0.45μm滤膜，最后以无菌生理盐水洗涤3-5次，去除干扰杂质。
3.根据权利要求1所述的酱油中菌落总数快速检测方法，其特征在于：所述的发光值检测，将修复的菌体悬液50-100μl与50-100μlBacTiter-GloTM检测试剂反应，利用发光光度计于530-590nm处检测发光值。
4.一种用于酱油中菌落总数快速检测的培养基，其特征在于，由以下组分组成：每1000ml蒸馏水中含有牛肉浸出粉2-5g，酪蛋白水解物15-20g，可溶性淀粉0.5-3g，无水葡萄糖3-7g，L-丙氨酸0.5-1g，肌苷0.25-0.5g，L-天门冬素0.5-2g。
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